CN105131109A - 一种胶原蛋白的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明实施例提供了一种胶原蛋白的提取方法，涉及生物工程技术领域，用以获取具有胶原蛋白活性、纯度高的Ⅰ型胶原蛋白，包括：对预处理后的原料利用酸性溶液进行至少一次抽提，获取抽提混合液；将获取的所述抽提混合液进行至少两次盐析纯化，获取胶原蛋白盐析沉淀；将所述胶原蛋白盐析沉淀、透析、冻干，得到所述胶原蛋白，本发明实施例应用于生物工程技术领域。

Description

一种胶原蛋白的提取方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种胶原蛋白的提取方法。

背景技术

胶原蛋白(Collagen)是由成纤维细胞(fibroblast)合成的一种生物性高分子物质，是哺乳动物体内含量丰富的蛋白质，约占人体或其他哺乳动物体内总蛋白质的20％～30％。胶原蛋白主要分布于软骨、皮肤及肌腱等组织中，用以支持、保护及连接各组织器官的形态，已确认的胶原蛋白有20多种，其中Ⅰ型胶原蛋白占全部胶原蛋白的90％以上。由于胶原蛋白具有良好的生物相容性、无毒、弱抗原性、可降解性及安全性等优点，因此可以作为天然生物材料应用在生物医学领域中，例如，根据胶原蛋白的止血作用，可将其制作成海绵状的敷料贴类产品用于止血，也可以用来敷裹伤口；根据它的可降解性可以将其用作手术缝线，也可以将其作为支架材料用于组织工程医学领域，引导组织再生，促进伤口修复愈合。

目前，可以从动物的软骨、皮肤及肌腱等组织中提取胶原蛋白，例如，申请号为200810045400.9的专利提供了“从动物皮或/和腱提取未变性天然胶原蛋白的方法”，包括以下步骤：去除油脂和杂质并经丙酮浸泡预处理后的健康的猪、牛或羊的皮或/和腱原料屑，将所述原料屑经醋酸浸泡后加入胃蛋白酶进行酶解处理，制得酶解液；稀释所述酶解液并分离去除酶解液中未酶解完全的部分，得到胶原蛋白粗溶液；将胶原蛋白粗溶液进行盐析，得到盐析悬浊液；分离所述盐析悬浊液，将得到的胶原蛋白盐析物用蒸馏水搅拌透析；用冷冻干燥机将透析后的产物冻干，即得到胶原蛋白。

现有技术中公开的“从动物皮或/和腱提取未变性天然胶原蛋白的方法”由于在对原料屑进行酶解处理时加入胃蛋白酶使得到的胶原蛋白中有胃蛋白酶等蛋白水解酶残留。

发明内容

本发明的实施例提供一种胶原蛋白的提取方法，用以获取具有胶原蛋白活性、无胃蛋白酶等蛋白水解酶残留的纯度高的Ⅰ型胶原蛋白。

为达到上述目的，本发明的实施例采用如下技术方案：

第一方面，本发明实施例提供了一种胶原蛋白的提取方法，包括：

对预处理后的原料利用酸性溶液进行至少一次抽提，获取抽提混合液；

将获取的所述抽提混合液进行至少两次盐析纯化，获取胶原蛋白盐析沉淀；

将所述胶原蛋白盐析沉淀透析、冻干，得到所述胶原蛋白。

在第一方面的第一种可能的实现方式中，所述抽提次数为两次，分别为第一次抽提和第二次抽提；其中，

所述第一次抽提包括：按照所述预处理后的原料与所述酸性溶液的体积比为1:(10-20)将所述预处理后的原料溶解于所述酸性溶液中，离心收集上清液一和原胶原蛋白沉淀二；

所述第二次抽提包括：将所述原胶原蛋白沉淀二溶解于与第一次抽提等量的酸性溶液中，离心收集上清液二；

将所述上清液一和所述上清液二混合，得到所述抽提混合液。

在第一方面或第一方面的第一种可能的实现方式中，还提供了第一方面的第二种可能的实现方式，所述酸性溶液为体积浓度为0.5-5％的乙酸溶液。

在第一方面的第三种可能的实现方式，所述盐析纯化次数为三次，分别为第一次盐析，第二次盐析和第三次盐析；其中，

所述第一次盐析包括：向所述抽提混合液中加入无机盐至所述无机盐溶液的质量浓度为4-6％，静置，离心收集胶原沉淀一；

按照胶原沉淀一与缓冲液的体积比为1:20-1:30将所述胶原沉淀一溶解于所述缓冲液中，获取原胶原蛋白溶液；

所述第二次盐析包括：向所述原胶原蛋白溶液中加入无机盐至所述无机盐溶液的质量浓度为1.5-1.8mol/L，静置，离心收集上清液；

所述第三次盐析包括：向所述上清液中加入无机盐至所述无机盐溶液的质量浓度为2.0-3.0mol/L，静置，离心收集所述上清液的沉淀，得到所述胶原蛋白盐析沉淀。

在第一方面或第一方面的第三种可能实现方式，还提供第一方面的第四种可能实现方式，其中，所述静置的时间为18-30h，静置所处的温度为2-6℃。

在第一方面或第一方面的第三种可能实现方式，还提供第一方面的第五种可能实现方式，所述无机盐为氯化钠。

在第一方面的第六种可能实现方式，所述将所述胶原蛋白盐析沉淀透析、冻干，得到所述胶原蛋白，包括：

将所述胶原蛋白盐析沉淀溶解于酸性溶液中，获取胶原蛋白溶液；

将所述胶原蛋白溶液经过超滤系统等倍透析，去除所述胶原蛋白溶液中的杂质及小分子胶原蛋白；

将所述去除杂质及小分子胶原蛋白的胶原蛋白溶液冻干，得到所述胶原蛋白。

在第一方面及第一方面的第六种可能方式中，还提供第一方面的第七种可能实现方式，所述酸性溶液的体积浓度为0.3-1.0％，所述酸性溶液为乙酸溶液。

在第一方面的第八种可能实现方式中，所述原料为猪、牛或羊的皮或/和腱，在所述对预处理后的原料利用酸性溶液进行至少一次抽提，获取抽提混合液之前，所述方法还包括：

将猪、牛或羊的皮或/和腱清洗灭菌剔除外表皮皮毛和皮下组织后，绞切成颗粒；

向所述颗粒中加入中性清洗溶液，离心清洗2-5次，收集沉淀，获得所述预处理后的原料。

在第一方面和第一方面的第八种可能实现方式中，所述中性清洗液的重量为所述预处理后的原料的重量的2-3倍。

本发明实施例提供一种胶原蛋白的提取方法，对预处理后的原料利用酸性溶液进行至少一次抽提，获取抽提混合液；将获取的所述抽提混合液进行至少两次盐析纯化，获取胶原蛋白盐析沉淀；将所述胶原蛋白盐析沉淀透析、冻干，得到所述胶原蛋白。在对预处理后的原料利用酸性溶液进行抽提能够保证预处理后的原料中的胶原蛋白的产率，对抽提混合液采用至少两次盐析纯提取出的胶原蛋白为具有胶原蛋白活性的高纯度Ⅰ型胶原蛋白，且由于本发明采用抽提而非酶解处理预处理后的原料，故所获得的胶原蛋白中无胃蛋白酶等蛋白水解酶残留，采用透析，去除了胶原蛋白中杂质及非Ⅰ型胶原蛋白蛋白质，最终所得胶原蛋白的纯度不低于95％，采用本发明实施例的胶原蛋白提取方法提取的胶原蛋白由于其具有良好的生物相容性、无毒、弱抗原性、可降解性及安全性等优点，可作为天然生物材料用于生物医学领域。更重要的是可以作为支架材料用于组织工程医学领域，引导组织再生，促进伤口修复愈合。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的一种胶原蛋白的提取方法的流程示意图一；

图2为本发明实施例提供的一种胶原蛋白的提取方法的流程示意图二；

图3为本发明实施例提供的一种胶原蛋白的提取方法的流程示意图三；

图4为本发明实施例提供的一种胶原蛋白的提取方法的流程示意图四。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限定本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例所涉及的材料均可以通过商业途径或通过申请人获取。

一方面，本发明实施例提供了一种胶原蛋白的提取方法，如图1所示，包括：

S1、对预处理后的原料利用酸性溶液进行至少一次抽提，获取抽提混合液；

S2、将获取的所述抽提混合液进行至少两次盐析纯化，获取胶原蛋白盐析沉淀；

S3、将所述胶原蛋白盐析沉淀透析、冻干，得到所述胶原蛋白。

本发明实施例提供一种胶原蛋白的提取方法，对预处理后的原料利用酸性溶液进行至少一次抽提，获取抽提混合液；将获取的所述抽提混合液进行至少两次盐析纯化，获取胶原蛋白盐析沉淀；将所述胶原蛋白盐析沉淀透析、冻干，得到所述胶原蛋白，对预处理后的原料利用酸性溶液进行抽提能够保证预处理后的原料中的胶原蛋白的产率，对抽提混合液采用至少两次盐析纯提取出的胶原蛋白为具有胶原蛋白活性的高纯度Ⅰ型胶原蛋白，且由于本发明采用抽提而非酶解处理原料，故所获得的胶原蛋白中无胃蛋白酶等蛋白水解酶残留，采用透析，去除了胶原蛋白中杂质及非Ⅰ型胶原蛋白蛋白质，所得胶原蛋白的纯度不低于95％，采用本发明实施例的胶原蛋白提取方法提取的胶原蛋白由于其具有良好的生物相容性、无毒、弱抗原性、可降解性及安全性等优点，可作为天然生物材料用于生物医学领域。更重要的是可以作为支架材料用于组织工程医学领域，引导组织再生，促进伤口修复愈合。

其中，本发明实施例的原料采用猪、牛或羊的皮或/和腱，优选的本发明实施例采用牛皮作为原料。

为了去处原料中的皮下组织和腥味，使得最终获得的胶原蛋白产品的纯度较高，无异味。在本发明的一优选实施例中，在S1之前还包括：

将猪、牛或羊的皮或/和腱清洗灭菌剔除外表皮皮毛和皮下组织后，绞切成颗粒；

向所述颗粒中加入中性清洗溶液，离心清洗2-5次，收集沉淀，获得所述预处理后的原料。

其中，对所述中性清洗液的配制不做限定，只要可以在经过中性清洗后使得原料中的皮下组织和腥味减少即可，可选的，在对原料进行清洗时，中性清洗液的重量为所述原料重量的2-3倍，优选的，中性清洗液的重量为所述原料重量的2.5倍。

为了使得获取的胶原蛋白的纯度较高，生产周期较短，本发明实施例对原料进行离心处理，这样可以避免在提取过程中将杂质引入，且减少了过滤周期，本发明实施例对离心处理的方式不进行限定，只要离心处理后能够获取产量和利用率较高的预处理后的原料即可。

其中，为了确保获取的胶原蛋白的纯度，在对清洗后的原料进行抽提之前需要严格灭菌处理，本发明实施例对原料清洗后的灭菌处理方式不做限定，只要经过灭菌处理后能够使得原料无菌即可。

为了提高从预处理后的原料中抽提胶原蛋白的产率并保留胶原蛋白典型的三螺旋结构，且提取的胶原蛋白为具有胶原蛋白活性的高纯度Ⅰ型胶原蛋白，可以对S1中的预处理后的原料利用酸性溶液进行一次抽提，也可以进行两次或两次以上的抽提，得到抽提混合液，从预处理的原料中进行多次抽提，可以提高后续从预处理后的原料中提取胶原蛋白的产率，本发明实施例对此不进行具体限定。本发明实施例仅以通过两次抽提为例进说明。

如图2所示，本发明的一优选实施例中，S1可以通过以下方式具体实现：

S11、所述第一次抽提包括：按照所述预处理后的原料与所述酸性溶液体积比为1:(10-20)将所述预处理后的原料溶解于酸性溶液中，离心收集上清液一和原胶原蛋白沉淀二；

S12、所述第二次抽提包括：将所述原胶原蛋白沉淀二溶解于与第一次抽提等量的酸性溶液中，离心收集上清液二；

S13、将所述上清液一和所述上清液二混合，得到所述抽提混合液。

其中，抽提又称萃取，是指用酸性溶液浸泡预处理后的原料使预处理后的原料中的胶原蛋白溶于酸性溶液中；优选的，本发明实施例的抽提所采用的酸性溶液为体积浓度为0.5-5％的乙酸溶液，通过乙酸溶液进行抽提预处理后的原料中的胶原蛋白，与现有技术中采用酶解处理原料相比，可以使所获得的胶原蛋白中无胃蛋白酶等蛋白水解酶残留。

需要说明的是，对预处理后的原料进行一次抽提和两次以上的抽提方式与上述进行两次抽提的方式相同，本发明再次不再赘述。

为了确保所述预处理后的原料可以完全溶解于所述酸性溶液中，且酸性溶液不会破坏预处理后的原料中的胶原蛋白，优选的，按照所述预处理后的原料与所述酸性溶液体积比为1:15将所述预处理后的原料溶解于酸性溶液中。

为了保证所提取的胶原蛋白中Ⅰ型胶原蛋白纯度不低于95％，可以对S2中的抽提混合液进行两次及两次以上的盐析纯化，得到胶原蛋白盐析沉淀，其中，盐析纯化是指利用胶原蛋白在不同浓度的无机盐溶液中形成沉淀的原理，分别采用不同浓度无机盐溶液处理去除I型胶原蛋白中的杂质及除Ⅰ型胶原蛋白以外的其他蛋白质，优选的，本发明实施例无机盐为氯化钠。

将获取的抽提混合液中进行多次盐析纯化，可保证所提取的胶原蛋白中Ⅰ型胶原蛋白纯度不低于95％，本发明实施例对此不进行具体限定。本发明实施例仅以通过三次盐析纯化为例进说明。

如图3所示，本发明的一优选实施例中，S2可以具体通过以下方式实现：

S21、所述第一次盐析包括：向所述抽提混合液中加入无机盐至所述无机盐溶液的质量浓度为4-6％，静置，离心收集胶原沉淀一；

通过第一次盐析，可以对所述抽提混合液中的I型胶原蛋白进行初步纯化，将所述抽提混合液中的非胶原物质分离出来，得到胶原物质(胶原沉淀一)。

优选的，本发明实施例第一次盐析时，向所述抽提混合液中加入无机盐至所述无机盐溶液的质量浓度为4-6％。这样，可以防止所述抽提混合液中的非胶原析出，提高最终获得的I型胶原蛋白的产率纯度，又可以使得所述抽提混合液中的胶原尽可能多的析出，提高最终获得的I型胶原蛋白的产率，并且可以减少最终获得的胶原蛋白中由于盐析纯化所带入的无机盐杂质。进一步优选的，向所述抽提混合液中加入无机盐至所述无机盐溶液的质量浓度为5％。

S22、按照胶原沉淀一与缓冲液的体积比为1:20-1:30将所述胶原沉淀一溶解于所述缓冲液中，获取原胶原蛋白溶液。

为了使得胶原沉淀一可以完全溶解于所述缓冲液中，优选的，胶原沉淀一与缓冲液的体积比为1:25。

S23、所述第二次盐析包括：向所述原胶原蛋白溶液中加入无机盐至所述无机盐溶液的质量浓度为1.5-1.8mol/L，静置，离心收集上清液。

通过第二次盐析，可以对所述抽提混合液中的I型胶原蛋白进行进一步纯化，将所述胶原沉淀一中的除I型胶原和Ш型胶原之外的胶原分离出来，得到I型胶原和Ш型胶原(胶原沉淀二)。

优选的，本发明实施例第二次盐析时，向所述原胶原蛋白溶液中加入无机盐至所述无机盐溶液的质量浓度为1.5-1.8mol/L。这样，可以防止所述原胶原蛋白溶液中除I型胶原和Ш型胶原之外的胶原析出，提高最终获得的I型胶原蛋白的纯度，又可以使得所述原胶原蛋白溶液中I型胶原和Ш型胶原尽可能多的析出，提高最终获得的I型胶原蛋白的产率，并且可以减少最终获得的胶原蛋白中由于盐析纯化所带入的无机盐杂质。进一步优选的，向所述原胶原蛋白溶液中加入无机盐至所述无机盐溶液的质量浓度为1.7mol/L。

S24、所述第三次盐析包括：向所述上清液中加入无机盐至所述无机盐溶液的质量浓度为2-3mol/L，静置，离心收集所述上清液的沉淀，得到所述胶原蛋白盐析沉淀。

通过第三次盐析，可以对所述抽提混合液中的I型胶原蛋白进行最终纯化，将所述胶原沉淀二中的Ш型胶原分离出来，得到I型胶原(胶原沉淀三)。

优选的，本发明实施例第三次盐析时，向所述上清液中加入无机盐至所述无机盐溶液的质量浓度为2-3mol/L。这样，可以防止所述上清液中的Ш型胶原析出，提高最终获得的I型胶原蛋白的纯度，又可以使得所述上清液中的I型胶原尽可能多的析出，提高最终获得的I型胶原蛋白的产率，并且可以减少最终获得的胶原蛋白中由于盐析纯化所带入的无机盐杂质。进一步优选的，向所述上清液中加入无机盐至所述无机盐溶液的质量浓度为2.5mol/L。

需要说明的是，对抽提混合液进行三次以上的盐析纯化方式与上述进行三次盐析纯化的方式相同，本发明实施例在此不再赘述。

为了保证胶原蛋白的活性，在步骤S21、S23、S24中进行盐析纯化时，盐析纯化后的静置温度为2-6℃，为了保证盐析纯化后胶原蛋白能够完全溶解，便于获取沉淀和上清液，本发明盐析纯化所静置的时间为18-30h，优选的，该盐析纯化所静置的时间为24h。

进一步的，为了获取纯度更高的胶原蛋白，本发明实施例步骤S2中的至少两次盐析纯化可以采用无机盐，优选的，本发明实施例的无机盐采用氯化钠，经过氯化钠的多次盐析纯化，可使所得胶原蛋白的纯度为不低于95％的具有胶原蛋白活性的高纯度Ⅰ型胶原蛋白。

如图4所示，本发明的一优选实施例中，S3可以具体通过以下步骤实现：

S31、将所述胶原蛋白盐析沉淀溶解于酸性溶液中，获取胶原蛋白溶液；

S32、将所述胶原蛋白溶液经过超滤系统等倍透析，去除所述胶原蛋白溶液中的杂质及小分子胶原蛋白；

S33、将所述去除杂质及小分子胶原蛋白的胶原蛋白溶液冻干，得到所述胶原蛋白。

为了减少所得胶原蛋白中的杂质及小分子胶原蛋白，同时也可缩短获取胶原蛋白的周期。在实际操作中按照胶原蛋白盐析沉淀与乙酸溶液体积比为1:(5-15)的比例将所述胶原蛋白盐析沉淀溶解于所述乙酸溶液中，优选的，可以胶原蛋白盐析沉淀与乙酸溶液体积比1：10，可选的，步骤S31中的酸性溶液可以采用乙酸溶液，乙酸溶液的体积浓度为0.3-1.0％，优选的，步骤S31中的酸性溶液可以采用体积浓度为0.5％的乙酸溶液。

为了去处抽提过程中多余的酸性物质及盐析纯化过程中的无机盐杂质或者其他小分子物质，本发明实施例通过超滤系统进行等倍透析，其中，等倍透析是指将NL的提取液进行透析，在透析过程中会加入NL透析液，在透析完成后，所得溶液仍为NL，保证透析前后提取液的体积不变。

需要说明的是，本发明实施例对透析液的体积不进行限定，可以在实际操作过程中根据需要进行选择，只要使得最终获取的提取液的体积与透析之前的体积一致即可。

需要说明的是，采用本发明实施例的胶原蛋白提取方法提取的胶原蛋白由于其具有良好的生物相容性、无毒、弱抗原性、可降解性及安全性等优点，可广泛应用于化妆品或生物医药。

例如，可将含该胶原蛋白的活性胶原蛋白溶液与纯棉无纺布复合制成敷料贴类产品敷于脸部，能够将活性胶原蛋白能直接渗入肌肤底层，与周围组织的亲和性好，可加快胶原蛋白的生成速度，促进皮肤细胞正常生长。

此外，该胶原蛋白作为生物医药，具有引导上皮细胞迁入缺损区的能力，诱导产生趋化因子如血小板生长因子和纤维连接蛋白等，对细胞的生长有趋化作用，对细胞的分化、运动、化学趋向性结缔组织的修复等均起重要作用，从而改善表皮细胞微环境和促进皮肤组织新陈代谢，达到消炎和更新肌肤的作用。进而起到缩短术后恢复时间的效果。

具体实施方式

以下，将参照本发明的实施例详述本发明。这些实施例仅是为了具体说明本发明而提出的示例，本领域技术人员可以知道的是本发明的范围不受这些实施例的限定。

在所述实施例中，原料选用牛皮。

实施例1

预处理原料：将牛皮解冻清洗后剔除牛毛和皮下组织，绞切成牛皮颗粒，按照中性清洗液与牛皮颗粒体积重量比为2.5的比例向牛皮颗粒中加入中性清洗液，离心清洗牛皮颗粒3次，收集沉淀，获取预处理的原料；

抽提：按照所述预处理后的原料与所述酸性溶液的体积比为1:15将所述预处理后的原料沉淀溶解于体积浓度为3％的酸性溶液中，搅拌均匀后6℃条件下，静置48h，离心收集上清液一和原胶原蛋白沉淀二，将所述原胶原蛋白沉淀二溶解于与第一次抽提等量的体积浓度为3％的酸性溶液中，在6℃条件下，静置48h进行重复抽提，抽提结束后离心收集上清液二，将所述上清液一和所述上清液二混合，得到所述抽提混合液；

盐析纯化：向所述抽提混合液中加入氯化钠至所述氯化钠溶液中的质量浓度为5％，在2℃条件下，静置24h，离心收集胶原沉淀一；按照胶原沉淀一与缓冲液的体积比为1:25将所述胶原沉淀一溶解于所述缓冲液中，获取原胶原蛋白溶液；向所述原胶原蛋白溶液中加入氯化钠至所述氯化钠溶液的质量浓度为1.7mol/L，在5℃下静置24h，离心收集上清液；向所述上清液中加入氯化钠至所述氯化钠溶液的质量浓度为2.5mol/L，在2℃条件下，静置24h，离心收集所述上清液的沉淀，得到所述胶原蛋白盐析沉淀；

等倍透析：按照所述胶原蛋白盐析沉淀与所述乙酸溶液的体积比为1:10的比例将所述胶原蛋白盐析沉淀溶解于体积浓度为0.5％酸性溶液中，获取胶原蛋白溶液，将所述胶原蛋白溶液经过8个洗滤体积的超滤系统等倍透析，去除所述胶原蛋白溶液中的杂质及小分子胶原蛋白；将所述去除杂质及小分子胶原蛋白的胶原蛋白溶液冻干，得到所述胶原蛋白。

本发明实施例提供一种胶原蛋白的提取方法，在对预处理后的原料利用酸性溶液进行抽提能够保证预处理后的原料中的胶原蛋白的产率，对抽提混合液采用至少两次盐析纯提取出的胶原蛋白为具有胶原蛋白活性的高纯度Ⅰ型胶原蛋白，所得胶原蛋白的纯度为95％，采用超滤法去除胶原蛋白中杂质及非Ⅰ型胶原蛋白蛋白质，在缩短生产周期的同时降低了冻干成本，采用本发明实施例提取的胶原蛋白由于其具有良好的生物相容性、无毒、弱抗原性、可降解性及安全性等优点，可作为天然生物材料用于生物医学领域。更重要的是可以作为支架材料用于组织工程医学领域，引导组织再生，促进伤口修复愈合。

实施例2

预处理原料：将牛皮解冻清洗后剔除牛毛和皮下组织，绞切成牛皮颗粒，按照中性清洗液与牛皮颗粒体积重量比为3的比例向牛皮颗粒中加入中性清洗液，离心清洗牛皮颗粒5次，收集沉淀，获取预处理的原料；

抽提：按照所述预处理后的原料与所述酸性溶液的体积比为1:10将所述预处理后的原料沉淀溶解于体积浓度为0.5％的酸性溶液中，搅拌均匀后2℃条件下，静置48h，离心收集上清液一和原胶原蛋白沉淀二，将所述原胶原蛋白沉淀二溶解于与第一次抽提等量的体积浓度为0.5％的酸性溶液中，在2℃条件下放置48h进行重复抽提，抽提结束后离心收集上清液二，将所述上清液一和所述上清液二混合，得到所述抽提混合液；

盐析纯化：向所述抽提混合液中加入氯化钠至所述氯化钠溶液的质量浓度为4％，在2℃条件下，静置30h，离心收集胶原沉淀一；按照胶原沉淀一与缓冲液的体积比为1:20所述胶原沉淀一溶解于所述缓冲液中，获取原胶原蛋白溶液；向所述原胶原蛋白溶液中加入氯化钠至所述氯化钠溶液的质量浓度为1.5mol/L，在6℃下静置18h，离心收集上清液；向所述上清液中加入氯化钠至所述氯化钠溶液的质量浓度为2mol/L，在5℃条件下，静置15h，离心收集所述上清液的沉淀，得到所述胶原蛋白盐析沉淀；

等倍透析：按照所述胶原蛋白盐析沉淀与所述乙酸溶液的体积比为1:5的比例将所述胶原蛋白盐析沉淀溶解于体积浓度为0.3％酸性溶液中，获取胶原蛋白溶液，将所述胶原蛋白溶液经过10个洗滤体积的超滤系统等倍透析，去除所述胶原蛋白溶液中的杂质及小分子胶原蛋白；将所述去除杂质及小分子胶原蛋白的胶原蛋白溶液冻干，得到所述胶原蛋白。

本发明实施例提供一种胶原蛋白的提取方法，在对预处理后的原料利用酸性溶液进行抽提能够保证预处理后的原料中的胶原蛋白的产率，对抽提混合液采用至少两次盐析纯提取出的胶原蛋白为具有胶原蛋白活性的高纯度Ⅰ型胶原蛋白，所得胶原蛋白的纯度为95％,采用超滤法去除胶原蛋白中杂质及非Ⅰ型胶原蛋白蛋白质，在缩短生产周期的同时降低了冻干成本，采用本发明实施例提取的胶原蛋白由于其具有良好的生物相容性、无毒、弱抗原性、可降解性及安全性等优点，可作为天然生物材料用于生物医学领域。更重要的是可以作为支架材料用于组织工程医学领域，引导组织再生，促进伤口修复愈合。

实施例3

预处理原料：将牛皮解冻清洗后剔除牛毛和皮下组织，绞切成牛皮颗粒，按照中性清洗液与牛皮颗粒体积重量比为2的比例向牛皮颗粒中加入中性清洗液，离心清洗牛皮颗粒2次，收集沉淀，获取预处理的原料；

抽提：按照所述预处理后的原料与所述酸性溶液的体积比为1:20将所述预处理后的原料沉淀溶解于体积浓度为5％的酸性溶液中，搅拌均匀后4℃条件下，静置48h，离心收集上清液一和原胶原蛋白沉淀二，将所述原胶原蛋白沉淀二溶解于与第一次抽提等量的体积浓度为5％的酸性溶液中，在5℃条件下放置48h进行重复抽提，抽提结束后离心收集上清液二，将所述上清液一和所述上清液二混合，得到所述抽提混合液；

盐析纯化：向所述抽提混合液中加入氯化钠至所述抽氯化钠溶液的质量浓度为6％，在2℃下静置30h，离心收集胶原沉淀一；按照胶原沉淀一与缓冲液的体积比为1:30将所述胶原沉淀一溶解于所述缓冲液中，获取原胶原蛋白溶液；向所述原胶原蛋白溶液中加入氯化钠至所述氯化钠溶液的质量浓度为1.8mol/L，在4℃条件下，静置24h，离心收集上清液；向所述上清液中加入氯化钠至所述氯化钠溶液的质量浓度为3.0mol/L，在5℃条件下，静置24h，离心收集所述上清液的沉淀，得到所述胶原蛋白盐析沉淀；

等倍透析：按照所述胶原蛋白盐析沉淀与所述乙酸溶液的体积比为1:15的比例将所述胶原蛋白盐析沉淀溶解于体积浓度为1.0％酸性溶液中，获取胶原蛋白溶液，将所述胶原蛋白溶液经过12个洗滤体积的超滤系统等倍透析，去除所述胶原蛋白溶液中的杂质及小分子胶原蛋白；将所述去除杂质及小分子胶原蛋白的胶原蛋白溶液冻干，得到所述胶原蛋白。

本发明实施例提供一种胶原蛋白的提取方法，在对预处理后的原料利用酸性溶液进行抽提能够保证预处理后的原料中的胶原蛋白的产率，对抽提混合液采用至少两次盐析纯提取出的胶原蛋白为具有胶原蛋白活性的高纯度Ⅰ型胶原蛋白，所得胶原蛋白的纯度为95％,采用超滤法去除胶原蛋白中杂质及非Ⅰ型胶原蛋白蛋白质，在缩短生产周期的同时降低了冻干成本，采用本发明实施例提取的胶原蛋白由于其具有良好的生物相容性、无毒、弱抗原性、可降解性及安全性等优点，可作为天然生物材料用于生物医学领域。更重要的是可以作为支架材料用于组织工程医学领域，引导组织再生，促进伤口修复愈合。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种胶原蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

对预处理后的原料利用酸性溶液进行至少一次抽提，获取抽提混合液；

将获取的所述抽提混合液进行至少两次盐析纯化，获取胶原蛋白盐析沉淀；

将所述胶原蛋白盐析沉淀透析、冻干，得到所述胶原蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抽提次数为两次，分别为第一次抽提和第二次抽提；其中，

所述第一次抽提包括：按照所述预处理后的原料与所述酸性溶液的体积比为1:(10-20)将所述预处理后的原料溶解于所述酸性溶液中，离心收集上清液一和原胶原蛋白沉淀二；

所述第二次抽提包括：将所述原胶原蛋白沉淀二溶解于与第一次抽提等量的酸性溶液中，离心收集上清液二；

将所述上清液一和所述上清液二混合，得到所述抽提混合液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述酸性溶液为体积浓度为0.5％-5％的乙酸溶液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述盐析纯化次数为三次，分别为第一次盐析，第二次盐析和第三次盐析；其中，

所述第一次盐析包括：向所述抽提混合液中加入无机盐至所述无机盐溶液的质量浓度为4-6％，静置，离心收集胶原沉淀一；

按照胶原沉淀一与缓冲液的体积比为1:20-1:30将所述胶原沉淀一溶解于所述缓冲液中，获取原胶原蛋白溶液；

所述第二次盐析包括：向所述原胶原蛋白溶液中加入无机盐至所述无机盐溶液的摩尔浓度为1.5-1.8mol/L，静置，离心收集上清液；

所述第三次盐析包括：向所述上清液中加入无机盐至所述无机盐溶液的摩尔浓度为2.0-3.0mol/L，静置，离心收集所述上清液的沉淀，得到所述胶原蛋白盐析沉淀。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，其中，所述静置的时间为18-30h，静置所处的温度为2-6℃。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述无机盐为氯化钠。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将所述胶原蛋白盐析沉淀透析、冻干，得到所述胶原蛋白，包括：

将所述胶原蛋白盐析沉淀溶解于酸性溶液中，获取胶原蛋白溶液；

将所述胶原蛋白溶液经过超滤系统等倍透析，去除所述胶原蛋白溶液中的杂质及小分子胶原蛋白；

将所述去除杂质及小分子胶原蛋白的胶原蛋白溶液冻干，得到所述胶原蛋白。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述酸性溶液的体积浓度为0.3-1.0％，所述酸性溶液为乙酸溶液。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述原料为猪、牛或羊的皮或/和腱，在所述对预处理后的原料利用酸性溶液进行至少一次抽提，获取抽提混合液之前，所述方法还包括：

将猪、牛或羊的皮或/和腱清洗灭菌剔除外表皮皮毛和皮下组织后，绞切成颗粒；

向所述颗粒中加入中性清洗溶液，离心清洗2-5次，收集沉淀，获得所述预处理后的原料。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述中性清洗液的重量为所述预处理后的原料的重量的2-3倍。