CN107188990A - 鲟鱼骨中提取硫酸软骨素的方法 - Google Patents

鲟鱼骨中提取硫酸软骨素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鲟鱼骨中提取硫酸软骨素的方法。其包括碱解：将预处理的粉料鲟鱼骨加入NaOH溶液，在20～50℃下反应2～3h得鲟鱼骨的碱解液；盐处理：将鲟鱼骨碱解液中加入NaCl，在30～50℃下间歇搅拌2～3h得鲟鱼骨的盐解液；双酶水解：所得盐解液调节pH值至8，加入胰蛋白酶与木瓜蛋白酶组成的双酶进行酶解，酶解完成后在沸水中灭活，离心分离取上清液。本发明碱解处理鲟鱼骨，在碱性条件下硫酸软骨素与蛋白质连接的糖肽键断裂，使硫酸软骨素从蛋白多糖中释放出来，缩短提取时间，提高硫酸软骨素的产率。盐处理鲟鱼骨，在一定的离子浓度下条件下，使得鲟鱼骨中的蛋白质与硫酸软骨素沉淀分离，提高硫酸软骨素产品纯度。

Description

鲟鱼骨中提取硫酸软骨素的方法
技术领域
本发明属于材料加工技术领域，具体涉及一种鲟鱼骨中提取分离硫酸软骨素的方法。
背景技术
鲟鱼类是起源最早的现存脊椎动物类群，鲟鱼资源极为丰富，全世界总共有27种鲟鱼，在我国便可以找到8种，目前，鲟鱼人工养殖业已经在许多国家先后兴起，而我国已经成为鲟鱼养殖第一大国，鲟鱼全身都是宝，然而粗放型的加工现状导致鲟鱼这种宝贵资源没有得到很好的利用。鲟鱼全身遍布软骨，从鲟鱼骨中提取硫酸软骨素，具有极高的经济价值与药用价值，对鲟鱼产业的深度加工具有极大的促进作用。
硫酸软骨素(Chondritin Sulfate，Chs)，有ChsA，C和D三种异构体，均由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基酸半乳糖组成，只是硫酸基团位置不同，ChsA在哺乳动物中的骨中含量很高，ChsC主要存在于鱼类骨中。硫酸软骨素是一种来源于动物骨骼组织的重要酸性粘多糖——糖胺聚糖，其钠盐为白色无定形吸湿粉未，无臭无味，易溶于水，其水溶液呈粘稠性可与阳离子形成多种金属盐而发生沉淀难溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙醇、丙酮和冰醋酸等有机溶剂。硫酸软骨素遇热不稳定，乙酰基易发生水解脱落，在酸性条件下更易水解成不同聚合度的低聚糖。
硫酸软骨素临床上主要用于治疗神经痛、关节炎、耳鸣以及促进溃疡愈合和防止高血脂症等。随着其生理功能及生化性质的深入研究,发现它具有凝血和防止血管硬化等活性，对冠心病、心肌梗塞等心血管病的防治有较好的疗效，对神经细胞、肾细胞等具有保护作用，因此在国外是很流行的保健品添加剂。还对多种细胞等具有保护作用还可活化脂解酶，使脂肪降解，因此是防止肥胖的有效物质还具有保水性、保胶性和高粘性，可与某些物质调制成化妆品用于保护皮肤的健美。硫酸软骨素是结缔组织中天然存在的成分，能够结合水分子用于润滑和支撑关节，使关节活动自如，减轻关节疼痛，在短期内服用没有明显的副作用。2002年国家卫生部颁布了硫酸软骨素原料以及其注射液、滴眼液、硫酸软骨素钠原料及其胶囊的国家药品标准。
目前硫酸软骨素的提取主要有中性盐法、碱法和酶法。中性盐法是在一定的离子强度下，骨中的蛋白质与硫酸软骨素发生分离而沉淀，中性盐法提取的硫酸软骨素产品各项指标符合国家标准，但是产率较低，造成原材料的浪费，对经济效益有影响；碱法是在碱性条件下，连接硫酸软骨素与蛋白质的O-糖苷键在强碱作用下发生β-消去反应，使糖肽键断裂，硫酸软骨素从蛋白多糖中释放出来，碱法提取的产品产率高，但是样品溶液混浊，耗时长，污染严重，产品纯度低；酶法是利用蛋白酶的特性，使胶原蛋白和蛋白聚糖中的核蛋白等水解成多肽、氨基酸，达到提取硫酸软骨素目的，酶法条件温和，产品纯度高，但单一酶无法实验硫酸软骨素的全部水解，产率略低于碱法。因此，产用碱-双酶结合法，其中碱提取过程是提高硫酸软骨素产率的关键，酶水解过程是提高硫酸软骨素产品纯度的关键。
鲟鱼骨是提取硫酸软骨素的理想材料，鲟鱼骨中硫酸软骨素的含量高于鲨鱼骨中硫酸软骨素的含量。从鲟鱼骨中提取硫酸软骨素是对鲟鱼骨的综合应用，能够极大的促进鲟鱼产业的发展。
发明内容
本发明目的在于提供一种鲟鱼骨中提取分离硫酸软骨素的方法，进一步提高硫酸软骨素的产率。
为达到上述目的，采用技术方案如下：
鲟鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，包括以下步骤：
1)鲟鱼骨的预处理：以鲟鱼骨切片为原料，放入水浴锅中翻煮，去除肌肉、残余组织，捞起用NaOH溶液浸泡然后洗至中性，接着用异丙醇溶液浸泡然后洗净，粉碎、干燥备用；
2)碱解：将预处理的粉料鲟鱼骨加入NaOH溶液，在20～50℃下反应2～3h得鲟鱼骨的碱解液；
3)盐处理：将鲟鱼骨碱解液中加入NaCl，在30～50℃下间歇搅拌2～3h得鲟鱼骨的盐解液；
4)双酶水解：所得盐解液调节pH值至8，加入胰蛋白酶与木瓜蛋白酶组成的双酶进行酶解，酶解完成后在沸水中灭活，离心分离取上清液；
5)三氯乙酸沉降蛋白：向上清液中加入三氯乙酸，混匀后低温静置，离心收集上清液，调节pH至7.5～8.0；
6)活性炭脱色：加入活性炭于吸附，抽滤，取滤液；
7)乙醇沉淀：将滤液中加入无水乙醇，有沉淀产生，低温静置，除去上层液，取沉淀；
8)透析、冷冻干燥：将沉淀溶蒸馏水中，透析，冷冻干燥得硫酸软骨素产品。
按上述方案，步骤1中用20倍量(v/w)0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h；用20倍量(v/w)10wt％的异丙醇溶液浸泡2h。
按上述方案，步骤2中NaOH溶液浓度为5wt％，料液比为1:6；35℃下反应2.5h得鲟鱼骨的碱解液。
按上述方案，步骤3中NaCl溶液浓度为6wt％，40℃下反应2.5h得鲟鱼骨的盐解液。
按上述方案，步骤4中酶解温度为40℃，酶解时间为2h，酶量为3wt％。
按上述方案，步骤5中加入60wt％的三氯乙酸；4℃条件下静置4h。
按上述方案，步骤6中加入1％(w/v)的活性炭于50℃条件下吸附30min。
按上述方案，步骤7中乙醇最终的体积分数为70％。
相对于现有技术，本发明有益效果如下：
利用本发明方法从鲟鱼骨中提取硫酸软骨素，方法简单，提高了硫酸软骨素产品的产率与纯度，为鲟鱼的综合利用提供指导，具有极大的经济效益与社会效益。
碱解处理鲟鱼骨，在碱性条件下硫酸软骨素与蛋白质连接的糖肽键断裂，使硫酸软骨素从蛋白多糖中释放出来，缩短提取时间，提高硫酸软骨素的产率。
盐处理鲟鱼骨，在一定的离子浓度下条件下，使得鲟鱼骨中的蛋白质与硫酸软骨素沉淀分离，提高硫酸软骨素产品纯度。
双酶水解处理鲟鱼骨，利用蛋白酶水解蛋白质的特性，使与硫酸软骨素连接的蛋白质水解成多肽和氨基酸，进一步提高硫酸软骨素的纯度。
三氯乙酸沉降蛋白能将游离的蛋白质、短肽、酶沉降分离，提高硫酸软骨素产品的纯度。
透析能将剩余的小分子蛋白质、盐等物质除掉，进一步提高了硫酸软骨素产品的纯度。
具体实施方式
以下实施例进一步阐释本发明的技术效果，但不作为对本发明保护范围的限制。
实施例1
(1)鲟鱼骨预处理：以冷冻的鲟鱼脊骨切片为原料，解冻后将其放入水浴锅中80℃煮20min，去除肌肉等残余的组织，用20倍量(v/w)0.1mol的NaOH溶液浸泡2h后洗至中性，用20倍量(v/w)10％的异丙醇溶液浸泡2h后洗净，组织捣碎机粉碎鲟鱼骨样品，干燥备用。
(2)碱解：将(1)中预处理的鲟鱼骨按料液比1:6(w/v)加入4％～6％的NaOH溶液，在30℃～40℃条件下反应3～4h，反应结束后得鲟鱼骨的碱解液。
(3)盐处理：将(2)中鲟鱼骨的碱解液中加入NaCl至其浓度为4wt％～8wt％，在30～50℃下间歇搅拌2～3h得鲟鱼骨的盐解液。
(4)双酶水解：将步骤(3)中的盐解液，用2mol/L的HCl调节pH＝7.5～8.5，向溶液中加入有胰蛋白酶与木瓜蛋白酶比为2:1或1:1或1:2(w:w)组成的双酶进行酶解，酶解完成后在沸水浴中灭酶活10min，离心分离取上清液。
(5)三氯乙酸沉降蛋白：将步骤(4)中的上清液中加入60％的三氯乙酸至其浓度为8％～12％，混匀后于4℃条件下静置4h，离心收集上清液，上清液用5％的NaOH调节pH至7.0～8.0。
(6)活性炭脱色：将(5)中溶液加入1％(w/v)的活性炭于50℃条件下吸附吸附30min，抽滤，取滤液。
(7)乙醇沉淀：将步骤(6)中的溶液中加入无水乙醇，至其乙醇的体积分数为65％～75％，有沉淀产生，在4℃的条件下静止过夜，除上层液，取沉淀。
(8)透析，冷冻干燥：将步骤(7)中的沉淀溶于2倍量的蒸馏水中，用截留分子量为3000Da～4000Da的透析袋进行透析，冷冻干燥得硫酸软骨素产品。
(9)实施例1中，5g干燥鲟鱼骨为原料，得到呈纯白色的硫酸软骨素产品1.35g，产率为27％，纯度为91.26％。
对比例1
(1)鲟鱼骨预处理：以冷冻的鲟鱼脊骨切片为原料，解冻后将其放入水浴锅中80℃煮20min，去除肌肉等残余的组织，用20倍量(v/w)0.1mol的NaOH溶液浸泡2h后洗至中性，用20倍量(v/w)10％的异丙醇溶液浸泡2h后洗净，组织捣碎机粉碎鲟鱼骨样品，干燥备用。
(2)碱解：将(1)预处理的鲟鱼骨按料液比1:6(w/v)加入4％～6％的NaOH溶液，在30℃～40℃条件下反应3～4h，反应结束后得鲟鱼骨的碱解液。
(3)双酶水解：将步骤(2)中的碱解液，用2mol/L的HCl调节pH＝7.5～8.5，向溶液中加入有胰蛋白酶与木瓜蛋白酶比为2:1或1:1或1:2(w:w)组成的双酶进行酶解，酶解完成后在沸水浴中灭酶活10min，离心分离取上清液。
(4)三氯乙酸沉降蛋白：将步骤(3)中的上清液中加入60％的三氯乙酸至其浓度为8％～12％，混匀后于4℃条件下静置4h，离心收集上清液，上清液用5％的NaOH调节pH至7.0～8.0。
(5)活性炭脱色：将(4)中溶液加入1％(w/v)的活性炭于50℃条件下吸附吸附30min，抽滤，取滤液。
(6)乙醇沉淀：将步骤(5)中的溶液中加入无水乙醇，至其乙醇的体积分数为65％～75％，有沉淀产生，在4℃的条件下静止过夜，除上层液，取沉淀。
(7)透析，冷冻干燥：将步骤(6)中的沉淀溶于2倍量的蒸馏水中，用截留分子量为3000Da～4000Da的透析袋进行透析，冷冻干燥得硫酸软骨素产品。
(8)对比例1中，5g鲟鱼骨为原料，得到呈白色的硫酸软骨素产品1.36g，产率为27.2％，纯度为86.15％。与实施例1对比，硫酸软骨素产品产率略高，而产品纯度下降。
对比例2
(1)鲟鱼骨预处理：以冷冻的鲟鱼脊骨切片为原料，解冻后将其放入水浴锅中80℃煮20min，去除肌肉等残余的组织，用20倍量(v/w)0.1mol的NaOH溶液浸泡2h后洗至中性，用20倍量(v/w)10％的异丙醇溶液浸泡2h后洗净，组织捣碎机粉碎鲟鱼骨样品，干燥备用。
(2)盐处理：将(1)预处理的鲟鱼骨按料液比1:6(w/v)加入4wt％～8wt％的NaCl溶液，在30～50℃下间歇搅拌2～3h得鲟鱼骨的盐解液。
(3)双酶水解：将步骤(2)中的盐解液，调节pH＝7.5～8.5，向溶液中加入有胰蛋白酶与木瓜蛋白酶比为2:1或1:1或1:2(w:w)组成的双酶进行酶解，酶解完成后在沸水浴中灭酶活10min，离心分离取上清液。
(4)三氯乙酸沉降蛋白：将步骤(3)中的上清液中加入60wt％的三氯乙酸至其浓度为8％～12％，混匀后于4℃条件下静置4h，离心收集上清液，上清液用5％的NaOH调节pH至7.0～8.0。
(5)活性炭脱色：将(4)中溶液加入1％(w/v)的活性炭于50℃条件下吸附吸附30min，抽滤，取滤液。
(6)乙醇沉淀：将步骤(5)中的溶液中加入无水乙醇，至其乙醇的体积分数为65％～75％，有沉淀产生，在4℃的条件下静止过夜，除上层液，取沉淀。
(7)透析，冷冻干燥：将步骤(6)中的沉淀溶于2倍量的蒸馏水中，用截留分子量为3000Da～4000Da的透析袋进行透析，冷冻干燥得硫酸软骨素产品。
(8)对比例2中，5g鲟鱼骨为原料，得到呈白色的硫酸软骨素产品0.79g，产率为15.8％，纯度为90.42％。与实施例1对比，硫酸软骨素产品产率明显下降，而产品纯度略低。
实施例2
(1)鲟鱼骨预处理：以冷冻的鲟鱼头骨切片为原料，解冻后将其放入水浴锅中80℃煮20min，去除肌肉等残余的组织，用20倍量(v/w)0.1mol的NaOH溶液浸泡2h后洗至中性，用20倍量(v/w)10％的异丙醇溶液浸泡2h后洗净，组织捣碎机粉碎鲟鱼骨样品，干燥备用。
(2)碱解：将(1)将预处理的鲟鱼骨按料液比1:6(w/v)加入4％～6％的NaOH溶液，在30℃～40℃条件下反应3～4h，反应结束得鲟鱼骨的碱解液。
(3)盐处理：将(2)中鲟鱼骨的碱解液中加入NaCl至其浓度为4wt％～8wt％，在30～50℃下间歇搅拌2～3h得鲟鱼骨的盐解液。
(4)双酶水解：将步骤(2)中的碱解液，用2mol/L的HCl调节pH＝7.5～8.5，向溶液中加入有胰蛋白酶与木瓜蛋白酶比为2:1或1:1或1:2(w:w)组成的双酶进行酶解，酶解完成后在沸水浴中灭酶活10min，离心分离取上清液。
(5)三氯乙酸沉降蛋白：将步骤(3)中的上清液中加入60％(w％)的三氯乙酸至其浓度为8％～12％，混匀后于4℃条件下静置4h，离心收集上清液，上清液用5％(w％)的NaOH调节pH至7.0～8.0。
(6)活性炭脱色：将(4)中溶液加入1％(w/v)的活性炭于50℃条件下吸附吸附30min，抽滤，取滤液。
(7)乙醇沉淀：将步骤(5)中的溶液中加入无水乙醇，至其乙醇的体积分数为65％～75％，有沉淀产生，在4℃的条件下静止过夜，除上层液，取沉淀。
(8)透析，冷冻干燥：将步骤(6)中的沉淀溶于2倍量的蒸馏水中,用截留分子量为3000Da～4000Da的透析袋进行透析，冷冻干燥得硫酸软骨素产品。
(9)实施例2中，5g鲟鱼骨为原料，得到呈白色的硫酸软骨素产品1.37g，产率为27.4％，纯度为91.71％。
实施例3
(1)鲟鱼骨预处理：以冷冻的鲟鱼脊骨切片为原料，解冻后将其放入水浴锅中80℃煮20min，去除肌肉等残余的组织，用20倍量(v/w)0.1mol的KOH溶液浸泡2h后洗至中性，用20倍量(v/w)10％的正丁醇溶液浸泡2h后洗净，组织捣碎机粉碎鲟鱼骨样品，干燥备用。
(2)碱解：将(1)将预处理的鲟鱼骨按料液比1:6(w/v)加入4％～6％的KOH溶液，在30℃～40℃条件下反应3～4h，反应结束得鲟鱼骨碱解液。
(3)盐处理：将(2)中鲟鱼骨的碱解液中加入NaCl至其浓度为4wt％～8wt％，在30～50℃下间歇搅拌2～3h得鲟鱼骨的盐解液。
(4)双酶水解：将步骤(2)中的碱解液，用2mol/L的乙酸调节pH＝7.5～8.5，向溶液中加入有胰蛋白酶与木瓜蛋白酶比为2:1或1:1或1:2(w:w)组成的双酶进行酶解，酶解完成后在沸水浴中灭酶活10min，离心分离取上清液。
(5)三氯乙酸沉降蛋白：将步骤(3)中的上清液中加入60％(w％)的三氯乙酸至其浓度为8％～12％，混匀后于4℃条件下静置4h，离心收集上清液，上清液用5％的KOH调节pH至7.0～8.0。
(6)活性炭脱色：将(4)中溶液加入1％(m/v)的活性炭于50℃条件下吸附吸附30min，抽滤，取滤液。
(7)乙醇沉淀：将步骤(5)中的溶液中加入无水乙醇，至其乙醇的体积分数为65％～75％，有沉淀产生，在4℃的条件下静止过夜，除上层液，取沉淀。
(8)透析，冷冻干燥：将步骤(6)中的沉淀溶于2倍量的蒸馏水中,用截留分子量为3000Da～4000Da的透析袋进行透析，冷冻干燥得硫酸软骨素产品。
(9)实施例3中，5g鲟鱼骨为原料，得到呈纯白色硫酸软骨素产品1.33g，产率为26.6％，纯度为92.13％。
在碱提取部分综合利用单因素实验与正交试验优化碱提取部分工艺，考察碱液浓度、料液比、提取时间、提取温度对硫酸软骨素提取效果的影响，以硫酸软骨素的产率为考察指标，得到影响硫酸软骨素提取率的主次因素为：料液比＞提取时间＞碱液浓度＞提取温度。优化最佳的碱提取部分的最佳工艺为：料液比为1:6，提取时间为2.5h，碱液浓度为5％，提取温度为35℃。
在双酶提取部分综合利用单因素实验与正交试验优化双酶提取部分工艺，考察酶量、酶解温度、pH、酶解时间对硫酸软骨素提取效果的影响，以硫酸软骨素额产率与纯度为考察指标，以硫酸软骨素产品的纯度为主要的考察指标，得到影响硫酸软骨素提取效果的主次因素为：酶解温度＞酶解时间＞pH＞酶量。优化最佳的双酶提取部分的最佳工艺为：酶解温度为40℃，酶解时间为2h，pH为8.0，酶量为3％。

Claims (8)

1.鲟鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)鲟鱼骨的预处理：以鲟鱼骨切片为原料，放入水浴锅中翻煮，去除肌肉、残余组织，捞起用NaOH溶液浸泡然后洗至中性，接着用异丙醇溶液浸泡然后洗净，粉碎、干燥备用；
2)碱解：将预处理的粉料鲟鱼骨加入NaOH溶液，在20～50℃下反应2～3h得鲟鱼骨的碱解液；
3)盐处理：将鲟鱼骨碱解液中加入NaCl，在30～50℃下间歇搅拌2～3h得鲟鱼骨的盐解液；
4)双酶水解：所得盐解液调节pH值至8，加入胰蛋白酶与木瓜蛋白酶组成的双酶进行酶解，酶解完成后在沸水中灭活，离心分离取上清液；
5)三氯乙酸沉降蛋白：向上清液中加入三氯乙酸，混匀后低温静置，离心收集上清液，调节pH至7.5～8.0；
6)活性炭脱色：加入活性炭于吸附，抽滤，取滤液；
7)乙醇沉淀：将滤液中加入无水乙醇，有沉淀产生，低温静置，除去上层液，取沉淀；
8)透析、冷冻干燥：将沉淀溶蒸馏水中，透析，冷冻干燥得硫酸软骨素产品。
2.如权利要求1所述鲟鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，其特征在于步骤1中用20倍量(v/w)0.1mol/L的NaOH溶液浸泡2h；用20倍量(v/w)10wt％的异丙醇溶液浸泡2h。
3.如权利要求1所述鲟鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，其特征在于步骤2中NaOH溶液浓度为5wt％，料液比为1:6；35℃下反应2.5h得鲟鱼骨的碱解液。
4.如权利要求1所述鲟鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，其特征在于步骤3中NaCl溶液浓度为6wt％，40℃下反应2.5h得鲟鱼骨的盐解液。
5.如权利要求1所述鲟鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，其特征在于步骤4中酶解温度为40℃，酶解时间为2h，酶量为3wt％。
6.如权利要求1所述鲟鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，其特征在于步骤5中加入60wt％的三氯乙酸；4℃条件下静置4h。
7.如权利要求1所述鲟鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，其特征在于步骤6中加入1％(w/v)的活性炭于50℃条件下吸附30min。
8.如权利要求1所述鲟鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，其特征在于步骤7中乙醇最终的体积分数为70％。
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