KR101697324B1 - 생체적합성 콜라겐 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생체적합성 콜라겐의 제조방법, 이 방법에 의해 제조된 생체적합성 콜라겐 및 본 발명의 생체적합성 콜라겐을 포함하는 의료용 생체 소재를 제공한다. 본 발명의 생체적합성 콜라겐은 면역거부 관련 유전자(α-gal)가 제거된 형질전환 돼지로부터 추출한 것으로 인체에 적용시 초급성급성혈관성 및 세포매개성 면역거부반응이 발생하지 않아 기존의 콜라겐 원료보다 생체에 안전하게 적용할 수 있다. 본 발명의 생체적합성 콜라겐은 높은 생체적합성을 갖고, 질병전파 가능성이 거의 없다. 본 발명에 따르면, 현재까지 장기만 사용될 뿐 전부 폐기되던 형질 전환된 돼지의 피부를 재활용할 수 있어 환경적인 오염원을 대폭 감소시킬 수 있다.
Description
본 발명은 생체적합성 콜라겐 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
지난 수십 년 동안 인간의 장기와 해부학적 구조 및 생리특성이 유사한 돼지의 장기를 이용하는 방안이 연구되고 있으나 면역체계가 인간과 상이하여 돼지의 장기를 그대로 이용할 수 없는 문제가 있다. 즉, 돼지의 장기가 사람의 체내에 들어가면 돼지 장기에서 항원성 단백질을 발현하여 사람의 면역반응을 활성화시켜 면역거부반응을 야기하게 된다. 이러한 문제를 해결하고자 유전자적증기술을 이용하여 돼지의 체세포에서 면역거부 관련 유전자(α-gal)를 제거하고, 유전자적증된 이 세포를 복제하여 태어난 돼지로부터의 장기는 사람의 체내에서 초급성 면역거부 현상을 나타내지 않는다. 이러한 면역거부반응의 제거는 이들로부터 얻어지는 장기를 인체에 보다 안전하게 이용하고자 하는 것이나, 이들로부터 얻어지는 콜라겐을 생체의료용으로 이용하고자 하는 연구는 전 세계적으로 전무한 실정이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 면역원성을 갖는 종래 콜라겐 원료의 문제점을 해결하기 위해 연구 노력한 결과, α-gal 유전자가 제거된 형질전환 돼지의 피부를 이용하여 기존 콜라겐 원료의 문제점인 인체 적용 시 불안한 요인들 즉 면역거부반응, 질병전파 가능성, 낮은 생체적합성을 개선시킨 생체적합성 콜라겐의 제조방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 생체적합성 콜라겐의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 방법에 의해 제조된 생체적합성 콜라겐을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 생체적합성 콜라겐을 포함하는 의료용 생체 소재를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 생체적합성 콜라겐 및 돼지 뼈 유래 저결정성(low crystallinity) 세라믹재를 포함하는 하이브리드 골이식재를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 생체적합성 콜라겐의 제조방법을 제공한다:
(a) 돼지 피부를 0.5 내지 1.5 M 농도의 아세트산에 담가 1-10℃ 온도조건에서 5-48시간 동안 팽윤시켜 상피층 및 피하지방을 제거하고 돼지 진피(dermis)를 수득하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)의 결과물로서 수득한 돼지 진피를 물로 세척하는 단계;
(c) 상기 진피를 0.3 내지 1.0 M 농도의 아세트산과 혼합하여 분쇄한 다음 단백질 분해효소를 처리하는 단계;
(d) 상기 단계 (c)의 결과물을 여과하는 단계;
(e) 상기 여과물에 염 용액을 처리하고 원심분리하여 콜라겐 침전물을 수득하는 단계; 및
(f) 상기 콜라겐 침전물을 동결건조 시키는 단계.
본 발명자들은 면역원성을 갖는 종래 콜라겐 원료의 문제점을 해결하기 위해 연구 노력한 결과, α-gal 유전자가 제거된 형질전환 돼지의 피부를 이용하여 기존 콜라겐 원료의 문제점인 인체 적용 시 불안한 요인들 즉 면역거부반응, 질병전파 가능성, 낮은 생체적합성을 개선시킨 생체적합성 콜라겐의 제조방법을 개발하였다.
본 발명의 방법의 기본적인 기술적 사상은 종래 방법의 문제점을 보완하기 위해 면역거부 관련 유전자(α-gal)를 제거시킨 형질전환 돼지의 피부를 이용하여 생체적합성 콜라겐을 제조함으로써 인간에 대한 초급성급성혈관성 및 세포매개성 면역거부 현상이 억제되도록 하는 생체적합성 콜라겐 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명은 생체적합성 콜라겐의 제조방법 및 그의 용도에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어“생체적합성(Biocompatible)”은 생체에 투여되어서 바람직하지 않은 장기적 효과를 유도하지 않는 것을 의미한다.
본 발명의 생체적합성 콜라겐의 제조방법을 각 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:
단계 (a): 돼지 진피(dermis)를 수득하는 단계
본 발명에 따르면, 우선 돼지의 피부를 준비한다.
본 발명에서 이용되는 돼지의 피부는 일반 돼지 또는 α-gal 유전자가 제거된 형질전환 돼지로부터 분리한 피부이고, 보다 바람직하게는 α-gal 유전자가 제거된 형질전환 돼지로부터 분리한 피부이다.
α-gal 항원기는 비 유인원계 포유류의 세포 표면에서 주로 발현되는 단백질로 돼지의 장기를 사람에게 이식하는 이종 이식 시 사람 혈액 내에 존재하는 항-Gal 항체와 작용하여 초급성 거부반응을 일으키는 주 물질이다. 본 발명에서 이용되는 형질전환 돼지는 α-gal 항원 유전자가 제거된 돼지로서 상기 형질전환 돼지로부터 수득한 피부를 가공하여 수득한 본 발명의 생체적합성 콜라겐은 α-gal 항원을 발현하지 않으므로 인간에 적용되었을 때, 면역반응을 일으키지 않는다.
α-gal 유전자가 제거된 형질전환 돼지는 전통적인 교배가 아니라 재조합 DNA 기술과 생식세포공학적 방법에 의하여 α-gal 유전자가 제거된 새로운 유전 형질을 얻게 된 돼지를 포함하는 것으로 보다 구체적으로는 체세포 형질전환, 즉 새로이 얻은 유전형질이 그 동물에서는 나타나지만 다음세대로는 전달되지 않는 것과 생식세포 형질전환, 즉 형질전환된 세포가 생식세포로 전이되도록 하여 새로운 유전형질이 당대뿐 아니라 후세까지 전달되도록 전환된 돼지를 의미한다. 따라서, 본 발명의 형질전환 돼지는 기존 돼지와는 다르게 인간에 대한 면역반응이 낮아지게 하는 모든 방법을 포함하여 형질 전환된 돼지를 의미한다.
본 발명에 따르면, 생체적합성 콜라겐을 제조하기 위해 이용되는 형질전환 돼지의 장기는 모든 부위의 장기가 이용될 수 있으며, 피부, 뼈, 연골, 인대, 위, 소장, 대장, 각막 및 방광이 이용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 가장 바람직하게는 형질전환 돼지의 피부가 이용된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, α-gal 유전자가 제거된 형질전환 돼지의 피부는 폭 3-7 cm, 길이 10-20 cm로 절단한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 절단한 돼지의 피부를 아세트산에 담가 팽윤
시켜 상피층 및 피하지방을 제거하고 돼지 진피(dermis)를 수득하며, 바람직하게는 0.5-1.5 M, 보다 바람직하게는 0.5-1.0 M, 가장 바람직하게는 1 M 농도의 아세트산을 이용하여 1-10℃ 온도조건에서 5-48시간 동안, 보다 바람직하게는 3-7℃ 온도조건에서 12-36시간 동안, 가장 바람직하게는 4℃ 온도조건에서 24시간 동안 팽윤시켜 돼지 진피를 수득한다.
본 발명에서 돼지 피부로부터 상피층 및 피하지방의 제거는 예를 들어, 칼이나 끌 등의 도구를 이용하거나 화학물질을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 이용되는 돼지 피부는 돼지로부터 1일 이내에 박피한 것으로 바람직한 것은 5시간 이내에 박피한 것이다.
단계 (b): 돼지 진피를 세척하는 단계
이어, 분리한 돼지의 진피를 멸균수로 세척한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (b)와 단계 (c) 사이에 상기 돼지 진피를 에탄올에 침지하여 소독 및 탈지하는 과정을 추가적으로 포함한다.
상기 소독 및 탈지는 세척한 돼지 진피를 99% 에탄올에 담궈 4℃에서 24시간 동안 실시한다.
단계 (c): 돼지 진피로부터 콜라겐을 수득하는 단계
상기 단계 (b)의 결과물인 돼지 진피를 아세트산과 혼합하여 분쇄한 다음 단백질 분해효소를 처리한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 돼지 진피 40-60 g 당 0.3-1.0 M 농도의 아세트산을 1.5-3 L 혼합하여 분쇄한 다음, 단백질 분해효소를 처리하고 1-10℃ 온도조건에서 5-48시간 동안 교반한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 돼지 진피 45-55 g 당 0.3-0.7 M 농도의 아세트산을 2-3 L 혼합하여 분쇄한 다음, 단백질 분해효소를 처리하고 3-7℃ 온도조건에서 12-36시간 동안 교반한다.
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 돼지 진피 50 g 당 0.5 M 농도의 아세트산을 2.5 L 혼합하여 분쇄한 다음, 단백질 분해효소를 처리하고 4℃ 온도조건에서 24시간 동안 교반한다.
본 발명에서 이용되는 단백질 분해효소는 당업계에 공지된 다양한 단백질 분해효소가 이용될 수 있으며, 가장 바람직하게는 펩신이 이용되나 이에 한정되는 것은 아니다.
단계 (d): 여과하는 단계
단백질 분해효소를 처리한 다음, 여과하는 단계를 실시한다. 상기 단백질 분해효소 처리 결과물에 대한 여과는 당업계에 공지된 다양한 여과방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 광목을 이용하여 진공여과하여 불순물을 제거한다.
단계 (e): 여과물에 염 용액을 처리하고 원심분리하여 콜라겐 침전물을 수득하는 단계
염 용액을 이용하여 콜라겐을 침전시킨다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 진공 여과한 용액 100 ㎖에 5 M NaCl을 17.5 ㎖ 첨가하고 4℃에서 12시간 교반한 후에 현탁액을 원심분리하여 침전물로서 콜라겐을 수득한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (e)와 단계 (f) 사이에 상기 콜라겐 침전물을 인산나트륨 완충액 및 에탄올 혼합물 또는 인산나트륨 완충액 및 부탄올 혼합물에 희석하고 셀룰로오스 투석막에 넣고 증류수로 투석하는 단계를 추가적으로 포함한다.
구체적으로는 콜라겐 침전물 50 ml을 인산나트륨 완충액(mixing & dilution solution with 0.2M NaH2PO4 and 0.2M Na2HPO4 , pH 7.4) 250 ml와 99% 에탄올 50 ml에 희석하거나, 펠렛:버퍼(Na2HPO4, pH 7):부탄올 7:7:3 비율 또는 6:6:4 비율로 희석한 다음 셀룰로오스 투석막에 튜빙하여 증류수 7 L에 24시간동안 투석하며, 증류수는 총 3회 교환한다. 투석 결과물은 원심분리하여 불순물을 제거한다.
단계 (f): 상기 원심분리 상층액을 동결건조 시키는 단계
상기 원심분리 상층액을 동결건조하여 탈수된 콜라겐을 수득한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조된 생체적합성 콜라겐을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 생체적합성 콜라겐을 포함하는 의료용 생체 소재를 제공한다.
본 발명의 방법에 제조된 생체적합성 콜라겐은 면역원성이 억제되어 의료용 생체 소재로서 다양하게 이용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어‘의료용 생체 소재’는 인체에 직접적으로 삽입되는 모든 재료를 포함할 뿐만 아니라, 인체에 직접적으로 삽입되지 않는 생체진단용 기기 및 용구 등까지 포함하는 의미로 사용된다.
본 발명의 생체적합성 콜라겐은 인공 각막, 인공 피부, 콜라겐 흡수성 창상피복재, 콜라겐 봉합사, 콜라겐 누점플러그, 조직 수복용 생체재료, 생체재료 이식용 뼈, 인공관절, 심장 밸브, 경막대용재, 윤상성형용고리, 생체재질 인공 심장판막, 심근용 인조포, 안과용 인조포, 콜라겐 사용 인공 혈관, 콜라겐 사용 연조직 접합용 접착제, 지혈약품, 치주조직 재생용 이식재, 차폐막, 세포 배양배지 등에 적용될 수 있으나 이에 한정되지는 않는다. 또한 본 발명의 다양한 실시예는 합성물질은 물론이고 섬유성 또는 막성(membrane) 필름, 주머니, 스폰지, 봉합사 및 수성 현탁액을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 어떠한 용도로도 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 생체적합성 콜라겐 및 돼지 뼈 유래 저결정성(low crystallinity) 세라믹재를 포함하는 하이브리드 골이식재를 제공한다.
본 발명에 따르면, 상기 돼지 뼈 유래 저결정성 세라믹재는 1.6-1.8 At%의 칼슘/인 비율, 105-130 m2/g의 비표면적 및 0.8-0.95 cm3/g·의 BJH 탈착(desorption) dV/dlog(D) 동공부피 값 및 X-선 회절 피크에 대한 FWHM(full width at half maximum) 값으로 (i) 002 지수를 갖는 X-선 회절 인덱스에서 0.3 내지 0.35; (ⅱ) 210 지수를 갖는 X-선 회절 인덱스에서 0.65 내지 0.75 (ⅲ) 211 지수를 갖는 X-선 회절 인덱스에서 0.9 내지 1.0; (ⅳ) 310 지수를 갖는 X-선 회절 인덱스에서 1.0 내지 1.1; (ⅴ) 222 지수를 갖는 X-선 회절 인덱스에서 0.6 내지 0.7; (ⅵ) 213 지수를 갖는 X-선 회절 인덱스에서 0.5 내지 0.6; 및 (ⅶ) 004 지수를 갖는 X-선 회절 인덱스에서 0.3 내지 0.4를 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “골이식재”는 골 사이의 공간을 메워주는 가교역할을 하는 물질을 의미하고, 골절이나 뼈의 결손 부분을 채워주어 골의 고정화 및 안정화시킴으로써 골치유에 중요한 역할을 하며 골형성을 촉진시킨다. 골이식재는 정형외과, 신경외과 및 치과 등에서 사용되며 예컨대, 디스크 수술 시 골 결손부위에 사용되어 골 재생을 유도하며, 임플란트 시술 및 구강 악 골결손 수복에도 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 생체적합성 콜라겐 및 돼지 뼈 유래 저결정성 세라믹재를 결합한 본 발명의 골이식재의 세포 친화도는 돼지 뼈 유래 저결정성 세라믹재 보다 높다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 생체적합성 콜라겐을 포함하는 의료용 생체 소재; (ii) 본 발명의 생체적합성 콜라겐을 포함하는 의료용 생체 소재 및 세라믹 분말(이종골 유래 및 합성골)의 혼합물; 또는 상기 (i)의 용액 또는 상기 (ii)의 혼합물에 고분자를 첨가하여 혼합한 혼합물 성분을 포함하는 의료용 생체 소재 및 산업용 소재를 제조할 수 있다.
상기 의료용 생체 소재 및 산업용 소재는 블록, 필름, 필라멘트, 섬유, 멤브레인, 메쉬, 직포, 부직포, 니트, 과립, 입자, 플레이트, 볼트, 너트, 못 또는 이들의 혼합체의 형태일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 의료용 생체 소재 및 산업용 소재는 3D 바이오프린팅 방법을 이용하여 인체의 인대, 건, 관절 연골, 귀 연골, 코 연골, 뼈로 제작할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 생체적합성 콜라겐의 제조방법, 이 방법에 의해 제조된 생체적합성 콜라겐 및 본 발명의 생체적합성 콜라겐을 포함하는 의료용 생체 소재를 제공한다.
(ⅱ) 본 발명의 생체적합성 콜라겐은 면역거부 관련 유전자(α-gal)가 제거된 형질전환 돼지로부터 추출한 것으로 인체에 적용시 초급성급성혈관성 및 세포매개성 면역거부반응이 발생하지 않아 기존의 콜라겐 원료보다 생체에 안전하게 적용할 수 있다.
(ⅲ) 본 발명은 기존의 추출공정을 단순화 하여 추출 시간을 단축하였으며, 화학처리 공정을 최소화 하여 콜라겐의 추출에 따른 화학물질의 잔류 및 폐수 등을 최소화 하는 경제적이며 친환경적인 공정이라 할 수 있다.
(ⅳ) 본 발명에 따르면, 현재까지 장기만 사용될 뿐 전부 폐기되던 형질 전환된 돼지의 피부를 재활용할 수 있어 환경적인 오염원을 대폭 감소시킬 수 있다.
도 1은 시판 콜라겐 제품인 Matrixen®과 상기 방법 1에 따라 형질전환(T 콜라겐) 및 일반 돼지(O 콜라겐)의 피부로부터 추출해 동결건조한 콜라겐 표면을 주사 전자 현미경(SEM)으로 관찰한 사진이다.
도 2는 대조군(Matrixen®형질전환돼지(T) 콜라겐, 일반돼지(O) 콜라겐의 분자량 측정 및 순도를 분석한 SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis) 결과이다.
도 3은 대조군(Matrixen®형질전환돼지(T) 콜라겐, 일반돼지(O)의 콜라겐이 1형 콜라겐임을 확인한 Western blot 결과이다.
도 4는 중성 지방 측정용 키트를 이용하여 대조군(Matrixen®형질전환돼지(T) 콜라겐, 일반돼지(O), buffer(B)에 남아있는 중성 지방량을 측정한 결과이다.
도 5는 형질전환돼지(T) 콜라겐, 일반돼지(O) 콜라겐이 PMA를 처리한 THP-1 세포에서 염증 반응에 미치는 효과를 관찰하기 위해 TNF-α, IL-1β, IL-12의 생성량을 측정한 ELISA 결과이다.
도 6은 대조군(Matrixen®(바이오랜드)과 Collagen®(다림티센)), 원심분리(C-collagen) 또는 초고속원심분리(U-collagen)하여 정제한 일반돼지 콜라겐의 분자량 측정 및 순도를 분석한 SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis) 결과이다.
도 7은 돼지 뼈로부터 제조된 세라믹 입자(P350C) 및 하이브리드 골이식재(Col-P350C)의 형태학적 특징을 주사전자현미경(SEM)으로 관찰한 사진이다.
도 8은 돼지 뼈로부터 제조된 세라믹 입자(P350C) 및 하이브리드 골이식재(Col-P350C)의 세포 친화도 평가를 위해 면역형광염색 및 CCK-8 분석 실시한 결과이다.
도 2는 대조군(Matrixen®형질전환돼지(T) 콜라겐, 일반돼지(O) 콜라겐의 분자량 측정 및 순도를 분석한 SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis) 결과이다.
도 3은 대조군(Matrixen®형질전환돼지(T) 콜라겐, 일반돼지(O)의 콜라겐이 1형 콜라겐임을 확인한 Western blot 결과이다.
도 4는 중성 지방 측정용 키트를 이용하여 대조군(Matrixen®형질전환돼지(T) 콜라겐, 일반돼지(O), buffer(B)에 남아있는 중성 지방량을 측정한 결과이다.
도 5는 형질전환돼지(T) 콜라겐, 일반돼지(O) 콜라겐이 PMA를 처리한 THP-1 세포에서 염증 반응에 미치는 효과를 관찰하기 위해 TNF-α, IL-1β, IL-12의 생성량을 측정한 ELISA 결과이다.
도 6은 대조군(Matrixen®(바이오랜드)과 Collagen®(다림티센)), 원심분리(C-collagen) 또는 초고속원심분리(U-collagen)하여 정제한 일반돼지 콜라겐의 분자량 측정 및 순도를 분석한 SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis) 결과이다.
도 7은 돼지 뼈로부터 제조된 세라믹 입자(P350C) 및 하이브리드 골이식재(Col-P350C)의 형태학적 특징을 주사전자현미경(SEM)으로 관찰한 사진이다.
도 8은 돼지 뼈로부터 제조된 세라믹 입자(P350C) 및 하이브리드 골이식재(Col-P350C)의 세포 친화도 평가를 위해 면역형광염색 및 CCK-8 분석 실시한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 형질전환 돼지의 피부로부터 생체의료용 콜라겐 추출
생체의료용 콜라겐 추출은 다음의 방법에 따라 실시하였다.
1) 돈피 채취
시료는 국립축산과학원이 보유하고 있는 α-gal 유전자가 제거된 형질전환 돼지 피부를 제공받아 사용하였다.
돼지의 등쪽 피부를 수술용 칼을 이용하여 채취한다. 박피된 피부는 신선한 피부, 즉 사용 전 1일 이내에 박피한 것으로 바람직한 것은 5시간 이내에 사용되는 것을 말한다.
2) 돈피 팽윤
채취된 피부 조직을 폭 5 cm, 길이 15 cm의 크기로 절단한 후 1 M(pH 2.3~2.4) 아세트산 용액에 담근 다음, 4℃에서 24시간 동안 팽윤(swelling)시켜 상피층 및 피하 지방을 제거한다.
3) 세척 및 보관
분리된 진피는 멸균 증류수로 세척한 후, 체에 걸러서 물기를 제거한 후에 50 g 씩 포장하여 80℃에서 보관한다.
4) 콜라겐 추출
냉동보관된 진피를 해동시킨 후, 99% 에탄올에 담궈 4℃에서 24시간 동안 소독 및 탈지한다. 진피(dermis)(50 g)와 아세트산(0.5 M, pH 2.5) 2.5 L를 준비하고, 분쇄기에 진피 조각과 0.5 M 아세트산을 혼합하여 분쇄한다. 그 후에 용액에 펩신(5 g, ≥400 units/mg)을 처리하고 4℃에서 24시간동안 교반한다.
5) 진공여과
30수 광목(7겹)에서 진공여과하여 불순물(털 등)을 제거한다.
6) 콜라겐 침전
진공여과한 용액 100 ㎖에 NaCl(5 M, 17.5 ㎖) 용액을 점적으로 첨가하고 4℃에서 12시간 교반 후에 콜라겐 침전물을 획득한다.
7) 원심분리
침전물을 7,000 rpm, 4℃에서 10분간 원심 분리하여 펠렛을 획득한다.
8) 셀룰로오스 투석
8-1) 에탄올 처리한 탈지
펠렛 50 ml를 인산나트륨 완충액(mixing & dilution solution with 0.2M NaH2PO4 and 0.2M Na2HPO4, pH 7.4) 250 ml와 99% 에탄올 50 ml에 희석한 후 셀룰로오스 투석막에 튜빙하여 증류수 7 L에 24시간동안 투석한다. 증류수는 총 3회 교환하도록 한다.
9-2) 부탄올 처리한 탈지
펠렛:버퍼(Na2HPO4, pH 7):부탄올 7:7:3 비율과 6:6:4 비율로 희석하여 셀룰로오스 투석막에 튜빙하여 증류수 7 L에 24시간동안 투석한다. 증류수는 총 3회 교환하도록 한다.
10) 동결건조
상기 방법으로 얻어진 투석 결과물을 12,500 rpm, 4℃에서 1시간 동안 원심분리한 후 상층액을 급속 동결시킨 후에 2-3일 동안 동결건조시킨다.
실시예 2: 일반 돼지의 피부로부터 생체의료용 콜라겐 추출 및 하이브리드 골이식재 제조
일반 돼지 생체의료용 콜라겐 추출은 다음의 방법에 따라 실시하였다.
1) 돈피 채취
박피된 피부는 신선한 피부, 즉 사용 전 1일 이내에 박피한 것으로 바람직한 것은 5시간 이내에 사용되는 것을 말한다.
2) 돈피 팽윤
채취된 피부 조직을 폭 5 cm, 길이 15 cm의 크기로 절단한 후 1 M(pH 2.3~2.4) 아세트산 용액에 담근 다음, 4℃에서 24시간 동안 팽윤(swelling)시켜 상피층 및 피하 지방을 제거한다.
3) 세척 및 보관
분리된 진피는 멸균 증류수로 세척한 후, 체에 걸러서 물기를 제거한 후에 50 g 씩 포장하여 80℃에서 보관한다.
4) 콜라겐 추출
냉동보관된 진피를 해동시킨 후, 99% 에탄올에 담궈 4℃에서 24시간 동안 소독 및 탈지한다. 진피(dermis)(50 g)와 아세트산(0.5 M, pH 2.5) 2.5 L를 준비하고, 분쇄기에 진피 조각과 0.5 M 아세트산을 혼합하여 분쇄한다. 그 후에 용액에 펩신(5 g, ≥400 units/mg)을 처리하고 4℃에서 24시간동안 교반한다.
5) 진공여과
30수 광목(7겹)에서 진공여과하여 불순물(털 등)을 제거한다.
6) 콜라겐 침전
진공여과한 용액 100 ㎖에 NaCl(5 M, 17.5 ㎖) 용액을 점적으로 첨가하고 4℃에서 12시간 교반 후에 콜라겐 침전물을 획득한다.
7) 원심분리
침전물을 7,000 rpm, 4℃에서 10분간 원심 분리하여 펠렛을 획득한다.
8) 셀룰로오스 투석
펠렛 50 ml를 인산나트륨 완충액(mixing & dilution solution with 0.2M NaH2PO4 and 0.2M Na2HPO4 , pH 7.4) 250 ml와 99% 에탄올 50 ml에 희석한 후 셀룰로오스 투석막에 튜빙하여 증류수 7 L에 24시간동안 투석한다. 증류수는 총 3회 교환하도록 한다.
10) 동결건조
상기 방법으로 얻어진 투석 결과물을 12,500 rpm, 1시간 동안 원심분리(또는 35,000 rpm, 4℃에서 30분 동안 초고속원심분리)한 후 상층액을 급속 동결시킨 후에 2-3일 동안 동결건조시킨다.
실시예
3: 콜라겐
하이브리드
골이식재
제조
콜라겐을 0.5 M 아세트산에 녹여 0.25 wt%의 농도로 맞추고 여과하여 용액에 있는 불순물을 제거한다. 24웰 플레이트에 돼지 뼈 유래 저결정성 세라믹재 1 g을 넣고 위의 콜라겐 용액을 500 ㎕ 씩 넣은 후 70℃의 급속 냉동고에 24시간 동안 보관 한 후, 그 다음 2일간 동결건조한다. 동결건조가 끝난 시료를 15분간 99% EtOH로 소독한 후 40% EtOHMES 버퍼에 30분 방치한다. EDC (5 ㎎/㎖)와 NHS (5 ㎎/㎖)가 섞인 40% EtOH-MES 버퍼에서 4시간 동안 반응시킨 후, 0.1 M Na2HPO4 용액에 넣어 1 시간 동안 세척한다. 1 M NaCl에 2시간 방치 후 48시간 동안 증류수를 이용하여 세척하고 3일간 동결건조한다.
돼지 뼈 유래 저결정성 세라믹재는 다음 방법을 이용하여 제조하였다:
(a) 돼지뼈를 절단하는 단계;
(b) 상기 절단된 돼지뼈로부터 피질골 및 혈액을 제거하여 해면골을 수득하는 단계;
(c) 상기 해면골을 물에 넣고 끓여(boiling) 지방질 및 단백질의 제1차 제거과정을 실시하는 단계;
(d) 상기 해면골을 건조하는 단계;
(e) 상기 해면골을 300-500℃에서 열처리하는 단계; 및
(f) 상기 열처리된 해면골을 분말화하여 저결정성 세라믹재를 수득하는 단계.
상기 방법에 의해 제조된 저결정성 세라믹재의 X-선 회절 피크에 대한 FWHM(full width at half maximum) 값은 (i) 002 지수를 갖는 X-선 회절 인덱스에서 0.3 내지 0.35; (ⅱ) 210 지수를 갖는 X-선 회절 인덱스에서 0.65 내지 0.75 (ⅲ) 211 지수를 갖는 X-선 회절 인덱스에서 0.9 내지 1.0; (ⅳ) 310 지수를 갖는 X-선 회절 인덱스에서 1.0 내지 1.1; (ⅴ) 222 지수를 갖는 X-선 회절 인덱스에서 0.6 내지 0.7; (ⅵ) 213 지수를 갖는 X-선 회절 인덱스에서 0.5 내지 0.6; 및 (ⅶ) 004 지수를 갖는 X-선 회절 인덱스에서 0.3 내지 0.4이다.
실험예
1
샘플에 전기 전도성을 부여하기 위해 백금 스퍼터 코팅(platinium sputter coating)을 실시한 후 주사 전자 현미경(FE-SEM, JSM-7500F, JEOL, 일본)을 이용하여 돼지 피부조직으로부터 추출한 콜라겐의 표면 형태를 분석하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 시판 콜라겐 제품인 Matrixen®과 상기 방법 1에 따라 형질전환(T) 및 일반 돼지(O)의 피부로부터 추출해 동결건조한 콜라겐 표면의 형태학적 특징을 주사 전자 현미경으로 관찰한 결과, 시판 콜라겐 제품의 특징적인 소섬유 망상체의 구조가 방법 1에 의해 추출한 콜라겐 표면에서도 관찰되며 또한 동결건조 과정에서 생긴 다공성 구조가 다양하게 분포하고 있는 것을 확인할 수 있었다(도 1).
실험예
2
콜라겐 순도는 SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 이용하여 분석하였다. 샘플과 조직 용해 버퍼 및 5x 샘플 버퍼와 혼합하여 100℃에서 5분간 열을 가한 후 10% SDS-PAGE 겔에 60 V에서 30분, 120 V에서 90분간 전기영동한 다음 Coomassie brilliant blue R250으로 염색하고 탈색하여 분석하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 형질전환돼지(T) 콜라겐, 일반돼지(O) 콜라겐의 분자량을 측정한 결과, 모두 Matrixen®과 동일한 110-130 kDa 크기의 두 개의 밴드를 나타내었다. 또한 그 밖에 다른 밴드들은 나타나지 않는 것으로 보아 불순물이 거의 함유되어 있지 않으므로 순도 높은 것을 확인할 수 있었다(도 2).
실험예
3
추출한 콜라겐의 타입을 확인하기 위하여 웨스턴 블롯을 실시하였다. 샘플과 조직 용해 버퍼 및 5x 샘플 버퍼와 섞어 100℃에서 5분간 열을 가한 후 10% SDS-PAGE 겔에 80 V에서 3시간 동안 전기영동한 다음 이모빌론-P-멤브레인에 250 mA에서 1시간 반 동안 이동시켰다. 그 후, 멤브레인은 일차항체 항-Col1A1, Col1A2 (Santa Cruz Biotechnology)와 냉장상태에서 16시간 동안 반응시켰고 그 다음 이차항체(Goat polyclonal antibody, Cell signaling Technology Inc.)와 상온에서 3시간 동안 각각 반응시켰다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 대조군(Matrixen®형질전환돼지(T) 콜라겐, 일반돼지(O) 콜라겐의 타입을 확인하기 위해 콜라겐 타입 1, α1 및 콜라겐 타입 1, α2에 대한 항체와 반응시킨 결과, 두 항체 모두와 반응하여 각 샘플마다 동일한 밴드가 나타났으며 이를 통해 대조군(Matrixen®형질전환(T) 콜라겐, 일반돼지(O) 콜라겐이 1형 콜라겐임을 확인할 수 있었다(도 3).
실험예
4
추출한 콜라겐을 증류수에 녹여 시험액을 만든 후 트리글리세리드 측정 시약을 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 다음 표준액의 흡광도와 비교하여 샘플에 있는 중성 지방량을 계산하였다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 상기 방법을 통해 콜라겐을 추출하였을 때 탈지가 제대로 이루어졌는지 확인하기 위해 형질전환돼지(T) 콜라겐과 일반돼지(O) 콜라겐에 남아있는 중성지방량을 측정하였을 때, T 콜라겐의 경우 434.17 mg/dL, O 콜라겐의 경우 88.33 mg/dL의 지방이 검출되었다. 이는 매우 낮은 수치로 추출한 콜라겐에 지방이 거의 남아있지 않다는 것을 의미하며 추출 과정에서 탈지가 제대로 이루어졌다고 할 수 있다(도 4).
실험예
5
추출한 콜라겐이 염증반응에 미치는 효과를 측정하기 위해 PMA (Phorbol myristate acetate)를 처리하지 않은 THP-1 세포와 PMA를 처리한 THP-1 세포에 5, 10, 50, 100 ㎍/㎖ 농도의 콜라겐 샘플을 48시간동안 반응시킨 후 상층액 100 ㎕를 회수하여 인간 TNF-α, 인간 IL-1β, 인간 IL-12 ELISA 키트를 사용하여 TNF-α, IL-1β, IL-12의 생성량을 계산하였다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 형질전환돼지(T) 콜라겐과 일반돼지(O) 콜라겐의 염증반응을 확인하기 위해 PMA를 처리해 THP-1 세포의 대식세포로의 분화를 유도한 후 T 콜라겐, O 콜라겐을 반응시키고 ELISA 키트를 이용하여 염증성 싸이토카인들을 측정하였다. 대식세포를 자극해 TNF-α, IL-12, IL-1β 같은 다양한 염증성 싸이토카인의 생성 및 분비를 유도하는 LPS와 비교했을 때 일반돼지(O) 콜라겐의 경우에는 소량의 TNF-α와 50 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 아주 미미한 수준의 IL-1β의 생성이 관찰되었으며 형질전환(T) 콜라겐은 염증성 싸이토카인의 생성이 전혀 관찰되지 않았다. 이를 통해 T 콜라겐은 염증 반응을 유발하지 않음을 확인하였다(도 5).
실험예
6
콜라겐 순도는 SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 이용하여 분석하였다. 추출된 콜라겐 샘플을 5x 샘플 버퍼와 혼합하여 100℃에서 10분간 열을 가한 후 8% SDS-PAGE 겔에 80 V에서 150분간 전기영동한 다음 Coomassie brilliant blue R250으로 염색하고 탈색하여 분석하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 원심분리(C-collagen) 또는 초고속원심분리(U-collagen)하여 정제한 일반돼지 콜라겐의 분자량을 측정한 결과, 모두 Matrixen® (바이오랜드) 및 Collagen® (다림티센)과 동일한 110-130 kDa 크기의 두 개의 밴드를 나타내었다. 또한 그 밖에 다른 밴드들은 나타나지 않는 것으로 보아 불순물이 거의 함유되어 있지 않으므로 순도 높은 것을 확인할 수 있었다(도 6).
실험예
7
샘플에 전기 전도성을 부여하기 위해 백금 스퍼터 코팅(platinium sputter coating)을 실시한 후 주사 전자 현미경(FE-SEM, JSM-7500F, JEOL, 일본)을 이용하여 돼지 뼈로부터 제조된 세라믹 입자(P350C) 및 하이브리드 골이식재(Col-P350C)의 형태학적 특징을 주사전자현미경(SEM)으로 관찰한 결과, 콜라겐 처리에 의해 표면의 형태학적 변화를 관찰할 수 있었다(도 7).
실험예
8
돼지 뼈로부터 제조된 세라믹 입자(P350C) 및 하이브리드 골이식재(Col-P350C)의 세포 친화도를 확인하기 위해 각각의 입자가 포함된 배양배지에서 MG63 세포를 배양한 후 CCK-8 분석 및 면역형광염색을 실시하였다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 면역형광염색 및 CCK-8 (cell counting kit-8; Dojindo molecular technologies Inc., USA) 분석을 실시한 결과 돼지 뼈로부터 제조된 세라믹 입자(P350C)에 비해 하이브리드 골이식재(Col-P350C)의 세포 친화도가 더 높은 것을 확인할 수 있었다(도 8).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (11)
- 다음 단계를 포함하는 생체적합성 콜라겐의 제조방법:
(a) 돼지 피부를 아세트산에 담가 1-10℃ 온도조건에서 5-48시간 동안 팽윤시켜 상피층 및 피하지방을 제거하고 돼지 진피(dermis)를 수득하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)의 결과물로서 수득한 돼지 진피를 물로 세척한 후, 에탄올에 침지하여 소독 및 탈지하는 단계;
(c) 상기 진피를 아세트산과 혼합하여 분쇄한 다음 단백질 분해효소를 처리하고 1-10℃ 온도조건에서 5-48시간 동안 교반하는 단계;
(d) 상기 단계 (c)의 결과물을 광목을 이용하여 진공여과함으로써 불순물을 제거하는 단계;
(e) 상기 여과물에 염 용액을 처리하여 4℃에서 교반한 다음, 1차 원심분리하여 콜라겐 침전물을 수득하는 단계;
(f) 상기 콜라겐 침전물을 인산나트륨 완충액 및 에탄올 혼합물 또는 인산나트륨 완충액 및 부탄올 혼합물에 희석하고 셀룰로오스 투석막에 넣고 증류수로 투석하는 단계; 및
(g) 상기 투석 결과물을 2차 원심분리하여 상층액을 동결건조 시키는 단계.
- 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 아세트산은 0.5-1.5 M 농도의 아세트산인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)는 돼지 진피 40-60 g 당 0.3-1.0 M 농도의 아세트산을 1.5-3 L 혼합하여 분쇄한 다음, 단백질 분해효소를 처리하고 1-10℃ 온도조건에서 5-48시간 동안 교반하여 실시하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, 상기 돼지 피부는 일반 돼지 또는 α-gal 유전자가 제거된 형질전환 돼지로부터 분리한 피부인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 삭제
- 삭제
- 제 1 항의 방법에 의해 제조된 생체적합성 콜라겐 및 돼지 뼈 유래 저결정성(low crystallinity) 세라믹재를 포함하는 하이브리드 골이식재로서 상기 돼지 뼈 유래 저결정성 세라믹재는 1.6-1.8 At%의 칼슘/인 비율, 105-130 m2/g의 비표면적 및 0.8-0.95 cm3/g·의 BJH 탈착(desorption) dV/dlog(D) 동공부피 값 및 X-선 회절 피크에 대한 FWHM(full width at half maximum) 값으로 (i) 002 지수를 갖는 X-선 회절 인덱스에서 0.3 내지 0.35; (ⅱ) 210 지수를 갖는 X-선 회절 인덱스에서 0.65 내지 0.75 (ⅲ) 211 지수를 갖는 X-선 회절 인덱스에서 0.9 내지 1.0; (ⅳ) 310 지수를 갖는 X-선 회절 인덱스에서 1.0 내지 1.1; (ⅴ) 222 지수를 갖는 X-선 회절 인덱스에서 0.6 내지 0.7; (ⅵ) 213 지수를 갖는 X-선 회절 인덱스에서 0.5 내지 0.6; 및 (ⅶ) 004 지수를 갖는 X-선 회절 인덱스에서 0.3 내지 0.4를 갖는 저결정성 세라믹재인 것을 특징으로 하는 하이브리드 골이식재.
- 삭제
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| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
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| X091 | Application refused [patent] | ||
| AMND | Amendment | ||
| X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
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