JP2007524582A

JP2007524582A - 薬剤製品のための抽出プロセス

Info

Publication number: JP2007524582A
Application number: JP2006504030A
Authority: JP
Inventors: マニックアバサガム，バヌー
Original assignee: ノリカホールディングスピーティーワイリミテッド
Priority date: 2003-05-01
Filing date: 2004-04-30
Publication date: 2007-08-30
Also published as: WO2004096834A1; AU2003902066A0; EP1625145A1; NZ543582A; CA2525488A1; AU2004234022A1; EP1625145A4; US20070179283A1

Abstract

海洋無脊椎動物から可溶天然コラーゲンを単離する一つのプロセスであって、以下のステップ、１）天然コラーゲン原線維を可溶化するために、海洋無脊椎動物のコラーゲン含有部分を弱酸液で処理し、２）組織微粒子を除去するために生成スラリーを遠心分離し、３）塩基の追加でコラーゲンを沈殿させるために上澄のｐＨを調節し、４）沈殿コラーゲンを収集し、５）沈殿コラーゲンを再懸濁し、また、６）限外濾過膜を使用して水に対する緩衝液交換を実施する、ことより成るプロセス。

Description

本発明は、海洋無脊椎動物から抽出を通じて天然コラーゲンを得るプロセスに関する。可溶天然コラーゲンが得られるが、それは現在ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）すなわち狂牛病に対する懸念に帰因して陸上動物コラーゲンの代替製品として薬剤用途にとりわけ適しているが、陸上動物コラーゲンに代替し、同じく加熱によりゼラチンに転化される他の用途にも向けられる。

ＢＳＥは、家畜用飼料濃縮物で感染する牛肉と骨粉から由来するものと見做される家畜の極めて重い疾病である。ＢＳＥは、家畜で媒介され、最初は英国で１９８６年に確認された。それが致死的であることは避けられない事実である。その治療法は存在せず、またその検出も困難である。最近の研究では、感染牛を食した人は、家畜病のヒト等価物であるクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）を進行させたことが示されている。英国において少なくとも１０人の患者が、牛肉を食することで狂牛病にかかったものと考えられている。ＣＪＤを進行させた人は年齢が５０歳と７０歳の間にある。

今日では、家畜群を保護するために、英国やヨーロッパにおいては家畜の間引きがもっとも重要である。にも拘らず、ヒトおよび動物用飼料消費のための牛肉および乳製品の将来の供給、薬剤、医療および化粧品産業で使用される重要なウシ副産物の供給などに対し、ＢＳＥは重大な脅威を与える。現在、日本、英国およびヨーロッパその他の国の薬物製造業者は、薬剤、医薬品および化粧品の製造で、ヒトへの「狂牛」病の蔓延を防ぐために、英国産ウシおよびウシ製品の使用を停止している。英国牛の産物を含む医薬および化粧品の輸入も停止した。

もっとも広範に使用されるウシ製品は、コラーゲンである。コラーゲンは線維性タンパク質であり、それは哺乳類の結合組織、とりわけ皮膚、腱骨および筋肉にある大抵の白筋線維を含む。数多くの異なる脊椎動物コラーゲンが確認されており、これまでには１９グループまでのものが脊椎動物で確認され（プロコップおよびキフィリッコ，１９９５年）、この中でもＩ型、II型およびIII型がもっとも広範に分布する型を表している。コラーゲンは、哺乳類で全有機物の約３０％を含み、またタンパク質含有量の約６０％近くを含んでいる。コラーゲンは急速な成長期に急速に沈着し、その合成割合は年齢と共に、とりわけ作り直しを殆んどしない皮膚で低下する。

コラーゲン分子は、立体配座でヘリックス（らせん）である３個のペプチド鎖から構築される。このヘリックスは、鎖あたり１０１４残基まで伸長する（ホッフマン他，１９８０年）。三重らせんドメインの末端では、短い非ヘリックス鎖、すなわち非反復配列を持ち、９乃至２５残基に広がるテロペプチドが、各鎖の両端から三重らせんを越えて伸長する（ホッフマン他，１９８０年）。天然コラーゲンのテロペプチド部分は、その免疫原性の主要部位であると考えられ、原線維形成に指向するのに重要な役割を果たしたことを示してきた（ヘルセスおよびヴァイス，１９８１年）。分子のヘリックスの長さ、および非らせん部分の物性と大きさは型から型へと変化する。コラーゲン分子の三重らせん構造が熱で破壊される場合には、ポリペプチドの性質は同じ化学的組成物を有しているにも拘らず、完全に変化する。

皮膚においては、コラーゲンは線維束を構成する網状構造に織り込まれる線維として存在し、この線維は、原線維間接合による束に維持される。コラーゲン原線維は、典型的には、約２ｍｍの長さであり、一方線維は、本来的により長く、より大きい径のものである。

脊椎動物のコラーゲンは、３００，０００ダルトンの分子量を持つ。三重らせんの各鎖は約１００，０００ダルトンの分子量であり、左巻きらせん立体配置をとるものと仮定される（レーニンジャー，１９７５年）。大抵の脊椎動物コラーゲンは、皮膚，腱，筋肉に存在し、骨は［（α１）_２α２］により示される２個の同一および１個の異なるα鎖で構成される（ピエズ他，１９６３年；ルイスおよびピエズ，１９６４年；ミラー他，１９６７年；マックレーン他，１９７０年）が、タラの皮膚とひな鳥の骨は３個の異なる鎖［（α１）（α２）（α３）］を含み、異なっている（ピエズ，１９６５年；フランソワおよびグリンシェ，１９６７年）。軟骨コラーゲンは、鎖組成物［α１（II）_３］で構成される分子を持つ（ミラー，１９７１年；トレルスタッド，１９７０年）。α１（II）鎖はα１鎖とは明らかに異なり、後者はそのグリコシル化ヒドロキシリシンの高い含有量でα１（II）と比較した時にのみα１（Ｉ）と示される。コラーゲンは基底膜に存在し（ケファライズ，１９７１年）、またイソギンチャク体壁（カッツマンおよびカン，１９７２年）は、同じα鎖より成ることが確認されている。

コラーゲンは、大量のヒドロキシプロリンを含有する唯一の哺乳類タンパク質であり、それはグリシン（約３０％）とプロリンが異常に多い。ヒドロキシプロリンは、ヒドロキシル基およびペプチド鎖を通じて水素結合ウォーターブリッジの形成に必須であり、これにより三重らせんを安定させる。可溶コラーゲンでは、分子間結合は切断されるが、三重らせんは無傷のまま残る。

コラーゲンＩ型、とりわけウシ皮膚コラーゲンは、食品と飲料、化粧品と医薬品に利用されてきている。精製成熟ウシコラーゲンは、止血鉗子、角膜シールド、および軟組織増強などの各種の医療用具で使用される。コラーゲンゲルは、これらの用具の調整の際に、しばしば中間生成物となり、またある場合には、ゲルは最終医療製品ともなる。更に、治療用および化粧品目的の両方で皮膚に使用されることを意図したコラーゲンマスクまたはフェースパックもある。精製コウシ皮膚コラーゲンは、人工器官、人工組織、人工器官のための構造部材および薬剤担体としていくつかの装置にも使用される重要な生体適合物質であるが、それはコラーゲン分子が生体に無毒であり、かつ高い機械強度を持つためである。それはまた同じ理由で、化粧品組成物で有用である。

生体臨床医療分野では、天然繊維が縫合糸や結紮糸に使用される。結紮糸は、止血している血管のために腕をしばるために使用される糸であり、一方縫合糸は、創傷を縫合するために使用される。創傷は内部で起こることもあり、または露出することもある。内部の創傷を閉じるために使用される縫合糸は、た易く取り除かれない。かくして吸収性（または生物分解性）物質が、顕著な利益を提供する。

コラーゲンが著しく架橋結合されるようになったために、それは吸湿性が少なくなる。哺乳類が老化する影響の一つは、コラーゲン分子の架橋の増加である。架橋が増加するにつれて、それは哺乳源からのトロポコラーゲンを抽出することがより一層困難になる。未架橋トロポコラーゲンが化粧品に使用されているが、それはしわののびた皮膚と会合するためである。

脊椎動物コラーゲンは、すべての非コラーゲン性汚染構造を取り除くために、広範囲に精製されねばならない。大抵のコラーゲン分離および精製手順の最終製品は、主として結合組織の非コラーゲン成分の酵素分解より成るが、それは単量体コラーゲン分子である。これらの桿状体がフィルム、膜、またはスポンジに再構築される時に、それは最終構造の機械強度に殆んど貢献しないであろう。コラーゲン線維と原線維の天然構造を保持することが望ましい。これらの高純度コラーゲン線維の長さ（２−１０ｃｍ）と厚み（４０μｍ）の故で、それらは更に糸、縫合糸、または不織布フリース層に加工することができるし、また、編布や織物にもすることができる。

従来のやり方で脊椎動物の高架橋コラーゲン組織を可溶化するために、２種の方法が適用された。それらは、（１）タンパク質分解酵素での消化、および（２）アルカリでの処理である。

ペプシンなどの酵素でのタンパク質分解消化は、コラーゲンの架橋がた易くこわれるなどの故でよく使用される。ペプシンはもっとも一般的に使用される酵素であるが、それは商業的ルートで純粋形態で利用でき、また、モノマー分子で容易に溶解する酸性溶媒で利用できるからである。ペプシンでの限定されたタンパク質分解が数多くの動物および人間の組織から、基本的にモノマー形態にある各種のコラーゲンの相対的に大きな量を調製するのに極めて有用ではあったけれども、手順それ自体には制約がある。例えば分子は変性された非らせん限界物で得られ、これは効果的にこれら領域の構造と機能を評価するよう設計されたその後の研究を排除する。更に酵素溶解性コラーゲンはモノマーコラーゲンが豊富にあるがテロペプチドがないということから、コラーゲン原線維の再構築は大きく阻害され、また再構築原線維はテロペプチドを持つ可溶性コラーゲンに比べて低い熱安定性を示す。

ペプチドを形成するために酵素加水分解により天然コラーゲンから調製されたコラーゲン加水生成物は、１，０００乃至１０，０００ダルトンの分子量を示す。脊椎動物組織においては、本プロセスは４℃での完全抽出のために少なくとも３−４日を要する。

アルカリ処理は、安定剤として硫酸ナトリウムとアミンを含む２−５％水酸化ナトリウムと求核試薬にそれぞれコラーゲン組織を４−２０℃で数日浸して通常行われる。組織は次いで酸で処理される。これは環境温度に依存して数ヶ月にもわたる時間のかかるプロセスである。伝統的には、ウシ皮革は数週間もかかるアルカリ中和プロセスでコンディショニングされてきた。アルカリ処理は、アミンとアミド基を部分的に除去してタンパク質を修飾する。アミド基の膨張と加水分解の殆どは中和の初期の段階で起こり、等電点がｐＨ５近くまで降下するにつれて、アンモニアの著しい発生が存在する。

国際公開番号第ＷＯ０２／１０２８３１は、コラーゲン誘導タンパク質画分を可溶化するために、そのコラーゲン含有部分を弱酸液で処理することを通して海洋無脊椎動物からコラーゲン誘導タンパク質画分を単離する方法を記載している。天然コラーゲンは、０．３Ｍの塩化ナトリウムで塩析することにより、弱酸液から沈殿する。次いで沈殿物は、脱イオン水に対する透析により過剰塩化ナトリウムを除去するために処理されねばならない。それは次いでｐＨを調節するために弱酸液に対して透析され、固形産物は凍結乾燥により単離される。このプロセスの結果として得られた産物は、品質が大きく変化することが確認された。

一般に、可溶天然コラーゲンを産生するために、とりわけコラーゲンが高度に架橋している組織から天然不溶コラーゲン原線維を精製する満足な方法は存在していない。

本発明は、その内容がここに組み込まれている国際公開番号第ＷＯ０２／１０２８３１号に記載のプロセスの変更が、可溶天然コラーゲンを生じるという予期しない発見に基づくものである。それは、コラーゲンが塩析に代ってｐＨの変化で沈殿し、緩衝液交換の続くステップで可溶天然コラーゲンを得るということが意外にも発見されたことであった。

従って、最初の見地において、本発明は以下のステップ、
１）天然コラーゲン原線維を可溶化するために、海洋無脊椎動物のコラーゲン含有部分を弱酸液で処理し、
２）組織微粒子を除去するために生成スラリーを遠心分離し、
３）塩基の追加でコラーゲンを沈殿させるために上澄のｐＨを調節し、
４）沈殿コラーゲンを収集し、
５）沈殿コラーゲンを再懸濁し、および、
６）限外濾過膜を使用して水に対する緩衝液交換を実行する、
ステップを含む海洋無脊椎動物から可溶天然コラーゲンを分離するプロセスを提供する。

このｐＨ沈殿プロセスは、塩析により分離されたものとは著しく異なる触感の沈殿物を生じることが観察される。理論によりしばられることは一方では望まないものの、より均一な性質の沈殿物がより完全な緩衝液交換を可能にし、従って不溶性に貢献する塩類のよりよい除去をも可能にするものと考えられる。

弱酸液は酢酸溶液、それも典型的には３％溶液が望ましい。弱酸は水溶液で１．０×１０^−５から１．０×１０^−２までの間の解離定数を持つ酸であり、また当業者により容易に確認されるものであり、しかし、乳酸、酪酸、ギ酸、プロピオン酸およびイエン酸を含む。

望ましくは、ｐＨ調節は、コラーゲン含有部分が冷蔵室で１日乃至２０日、望ましくは３日乃至６日、もっとも望ましくは６日、弱酸液と接触した後にこの調節が行われることである。

典型的には、弱酸液は、前記の抽出プロセスの間にある形態の攪拌を受ける。望ましくはコラーゲン含有部分は弱酸液で縣濁され、この縣濁液はよい収穫をあげ高品質の産物が得られるように攪拌される。

典型的には、海洋無脊椎動物は、コラーゲン含有部分の機械的分断により抽出されるよう準備される。

有利なことに、コラーゲン含有部分は筋組織であり、それは望ましくは色素を除かれていた。これは無傷筋組織を弱酸液に浸漬して達成することができる。弱酸液は典型的には酢酸溶液であり、望ましくは０．２Ｍの溶液である。

本発明のとりわけ望ましい実施例において、海洋無脊椎動物はアワビである。望ましくはアワビは商業的な種のものであり、ブラックリップアワビ（Ｈａｌｉｏｔｉｓｒｕｂｅｒ），ブラウンリップアワビ（Ｈａｌｉｏｔｉｓｃｏｎｉｃｏｐｏｒａ），およびグリーンリップアワビ（Ｈａｌｉｏｔｉｓｌａｅｖｉｇａｔａ），またはロウズアワビ（Ｈａｌｉｏｔｉｓｒｏｅｉ）を含む。

有利なことに、コラーゲン含有部分は遠心分離で回転され、天然コラーゲンは上澄みから沈殿される。望ましければ、追加のコラーゲンがペレットから抽出される。上澄みからの望ましい収集プロセスにおいて、十分な塩基、典型的には１ＭのＮａＯＨが加えられ、コラーゲン原線維を沈殿させるために上澄みのｐＨは４．５まで下がる。

有利なことに、コラーゲン沈殿は冷蔵室で１時間乃至１０時間、望ましくは２時間乃至６時間、もっとも望ましくは３時間の間で行われる。典型的に混合物は沈殿の間連続攪拌される。

沈殿コラーゲンは、典型的には遠心分離で収集される。

沈殿コラーゲンは脱イオン水で、典型的にはいずれかの適切な酸で３．５までのｐＨ調節で再縣濁される。再縣濁コラーゲン沈殿物は、限外濾過膜、典型的には１００キロダルトンのＮＭＣＯ限外濾過膜を用いて、水、典型的には脱イオン水に対して緩衝液交換される。

有利なことに、緩衝液交換産物は、固形形態で可溶天然コラーゲンを収集するために凍結乾燥される。

ゼラチンは、コラーゲンから誘導されるタンパク質である。コラーゲンがある温度で加熱されると、コラーゲン分子はヘリックスコイル転移を受ける。ヘリックスは開き、コラーゲンはよりた易く可溶になる。これが起こる温度は、α鎖のプロリンとヒドロキシプロリンの量に依存し、この温度は変性点となる。海洋冷水魚にとってこの温度は約１５℃であるが、ウシコラーゲンではそれは約４０℃である。ある温度で未加工皮膚にあるコラーゲンは弛緩し、皮膚は収縮するであろう（収縮温度）。イミノ酸、プロリンおよびヒドロキシプロリンの量は、収縮温度および変性温度を決定する。本発明のコラーゲンを加熱することにより、ゼラチンを産生することができる。

本発明のポリペプチドは、コラーゲン自身の用途を通じて、あるいはゼラチンへの転換などの続く処理に従って、陸上脊椎動物から分離されるコラーゲンに代って使用されることが提案される。コラーゲンはその天然形態または一度処理された形で広い範囲の分野で有用である。例えば、コラーゲンは化粧成分として、注射可能コラーゲン形態で、生体臨床医療用具で、薬剤物質として、および食品産物ならびに飲料で使用することができる。とりわけコラーゲンは、細胞培養で表面処理剤としての使用を見出す。本発明で調製されるコラーゲンは、陸上動物コラーゲンの直接の代替物として使用することができ、これらの分野でのそれぞれの使用のやり方は、当業者にとっては十分に理解できるものである。ゼラチンは、少なくとも食用ゼラチンの形態で、また飲料で凝集薬剤として、またＰＶＣパイプ、にかわおよびノーカーボン紙の製造などの産業用分野で、エマルジョン調合のための写真用ゼラチンとして、薬剤のカプセル剤皮および化粧品の成分として、陸上動物から得られるゼラチンと似たやり方で有用である。これらのコラーゲンまたはその処理から誘導される産物は、対応する陸上動物コラーゲンと同等またはより優れた性能を持つことが期待される。例えばアワビ培養基で成長した細胞は、ウシコラーゲンで成長したものよりも適度に高い成長率を示し、より大きな組織化を示すように見える。従ってアワビコラーゲンを細胞培養基の表面処理剤として使用することは、とりわけ望ましい。

［発明を実施するための形態（モード）］
実施例１
分離と精製
第１次抽出
ステップ１．生きたアワビが獲得され、１０℃に制御された保存タンクに移された。

ステップ２．必要に応じてアワビがタンクから取り出された。

ステップ３．殻取り前にアワビは流水で洗浄された。まな板で作業する際に、アワビはへらで殻取りし貝殻から中身を取り出された。貝殻は後での使用のために保管された。

ステップ４．消化管は解体用メスで脚部の上端の周囲を注意深く切断して除去され、後での使用のために保管された。

ステップ５．口腔域は解体用メスで切り取られ、後での使用のために保管された。

ステップ６．脚部域を用殻筋域からの着色部分は０．２Ｍの酢酸で緩やかに攪拌しながら一晩浸漬して除去され、次いで流水下で剛毛ブラシでこすり落とされた。

ステップ７．全筋組織は、解体用メスまたはナイフを用いて１”−２”片に切断された。

ステップ８．組織はコミトロール３６００を通す通路により混合された。コミトロール３６００は、抽出前の原料の粉砕のために使用される。これは静止円筒スクリーンまたは三枚刃ローターを持つカッタヘッドに材料を押し進めることで作動する。カッタヘッドは、０．０３インチ厚の刃を持ち、０．０６インチの間隔で離れている。カッタヘッド内のホールドアップは、数個の角氷で排出された。混合組織は重量測定された。

ステップ９．混合組織は、３％酢酸液（ｐＨ３．０）に投入された。酢酸液の量は、混合組織の１２ｍｌ／ｇであった。

ステップ１０．天然コラーゲン原線維を抽出するために、スラリーは６日間冷蔵室で攪拌された。

ステップ１１．組織微粒子を除去するために、スラリーは３，５００ｇ，４℃で２０分遠心分離された。ペレット化された組織が保存された。

ステップ１２．コラーゲンを沈殿させるために、上澄みのｐＨは１ＭのＮａＯＨの追加により４．５まで徐々に調節された。混合物は、冷蔵室で絶えず攪拌しながら３時間保存された。

ステップ１３．沈殿コラーゲンは５０００ｇ，４℃で１０分間の遠心分離により収集された。

ステップ１４．沈殿コラーゲンに最小量の脱イオン水と１ＭのＨＣｌで３．５まで低下したｐＨで再縣濁された。

ステップ１５．コラーゲン縣濁液は、１／２または１：１の脱イオン水で希釈され、１００キロダルトンのＮＭＣＯ限外濾過膜を用いて２量脱イオン水に対して緩衝液交換された。

ステップ１６．緩衝液交換コラーゲンは、凍結乾燥機に置かれた凍結乾燥トレーに注がれ凍結乾燥棚の冷凍で−２０℃までに凍結された。

ステップ１７．コラーゲンは２０度の最終製品温度まで凍結乾燥された。これには約４８時間を要した。

ステップ１８．凍結乾燥コラーゲンはコミトールを使用して粉砕された。

ステップ１９．粉砕コラーゲンは分析のために保管された。

第２次抽出
第１次抽出のステップ１１で得られたペレット組織は再抽出のために３％の酢酸溶液（ｐＨ３．０）に加えられた。酢酸液の量はペレット組織の５ｍｌ／ｇであった。

スラリーは冷蔵室で３日間攪拌された。次いで再抽出が第１次抽出のステップ１１から進められる。

凍結乾燥コラーゲンの分析
１．外観
視覚検査による物質の色彩、香り、表面の触感についての記録がとられた。

２．可溶性
凍結乾燥物質の可溶性が、室温で０．１Ｍ酢酸で０．１％の濃度で試験された。３時間攪拌後の溶液の透明度が観察された。

３．分子量、純度および鎖型組成物
アワビコラーゲンの分子量、純度および鎖型組成物がドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で評価される。１２％のグラジポア・イーゲル・プレキャスト・トリスグリシンゲルが使用された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥはレームリの方法（１９７０年）に従って実行された。

凍結乾燥アワビコラーゲンは１ｍｇ／ｍｌの０．１Ｍ酢酸に溶解された。試料はグラジポア・グリシン試料緩衝液で、１／２に希釈され、１ＭのＮＡＯＨでｐＨ調節された。

試料は次いで沸騰水浴に３分置かれ、更に冷却された。ゲルはバイオラッド・ミニ−プロティーン３電気泳動セルに集められた。内部室はＳＤＳグリシン運転緩衝液で充填され、また、試料はオートピペターで標準イエローチップを負荷された。ウエル当り全タンパク質負荷は２μｇであった。分子量マーカー（バイオラッド広範囲前染色マーカー）が各ゲルで実行された。外部室では、ウエルの水準まで運転緩衝液で充填された。

運転条件は、５０ｍＡのおおよその起動電流で６０分にわたり、１５０Ｖの定電圧であった。ゲルは次いでケーシングから除去され、水で約３０分洗浄された。ゲルは約５０ｍｌのグラジポア・グラジピュア染料（コロイド状Ｇ−２５０クーマシーブルーによるもの）で一晩緩やかなふりまぜで染色された。ゲルは水の頻繁な交換で脱色された。５分後に帯は一般的に可視であったし、完全な脱色にはまる１日を必要とした。

ゲルの恒久的な保管は、セロファンシートの間で乾燥して達成された。脱色されたゲルは２０％のメタノールと２％のグリセロールの乾燥液に浸漬され、１５分ゆっくり振りまぜされた。ゲル当り２枚のセロファンシートは、約３０秒間乾燥液で湿らされた。手入れされたゲルは、乾燥フレームでセロファンシートの間にはさまれ、室温で２日間オープンコンテナーに置かれたままであった。ゲルは次いで巻き上がらないように、多くの日数でプレスされた。

ログ図面が分子量対分子量基準に対するゲルから下方に移行する距離から作成され、線形傾向線がＭＳエクセルを用いて決定された。生成された式は、その移動距離に従ってサンプル帯の分子量を計数するのに使用することができる。

結果
１．凍結乾燥天然アワビコラーゲンの外観−（表１）

２．凍結乾燥天然アワビコラーゲンの可溶性−（表２）

３．天然アワビコラーゲンの分子量，純度および鎖型組成物−（表３）

実施例２−細胞培養
ステップ１．凍結乾燥１型コラーゲンは、０．１Ｍ酢酸に１−２ｍｇ／ｍｌで溶解された。

ステップ２．コラーゲン溶液は、混合させずに底部の１０％量のクロロホルムに層としてゆっくり重ね、一晩冷蔵室にそのまま置いて殺菌された。

ステップ３．上部（コラーゲン）層は無菌で除去され、無菌容器に移された。

ステップ４．培養容器（２４−ウエル平板）の成長表面は、無菌濾過された０．２ｇ／１ＥＤＴＡ．４Ｎａ，０．１ｍｌ／ｃｍ^２（２００μｌ）で洗浄された。

ステップ５．ウエルはコラーゲン溶液の１０μｇ／ｃｍ^２で被覆され、ピペットチップでの反覆吸引により、成長表面を覆うように広げられた。

ステップ６．ウエル６の一つの列は対照として被覆されないまま残り、一方他の列は、それぞれアワビコラーゲンとコウシ皮膚コラーゲンで被覆された。

ステップ７．被覆平板は３７℃で４−５時間培養され、次いで紫外線下で一晩置かれて殺菌衛生化された。

ステップ８．過剰被覆液は吸引され、ウエルは基本培地（ハム栄養混合培地Ｆ１２）で洗浄された。

ステップ９．継代培養哺乳類細胞（ＣＨＯＫ１）は、Ｆ１２＋１０％ＦＣＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシンに再縣濁され、トリパンブルー排除試験での生存で血球計算器で計数された。

ステップ１０．細胞は、約５×１０^４細胞／ｍｌで播種され、５％ＣＯ_２の下で３７℃で保温培養された。

ステップ１１．培養物は倒立顕微鏡を用いて形態学的差異を毎日検討された。写真の記録がデジタルカメラで行われた。

ステップ１２．培養物の成長は、毎日細胞を収穫し、血球計で計数することで測定された。

ステップ１３．対照ウエルからの細胞の収穫はトリプシン消化によるものであった。培養培地は除去され、ウエルは０．１５ｍｌ／ｃｍ^２（３００μｌ）の基本培地ですすぎ洗いされた。０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液の等量のものが細胞を分離するのに使用された。培養は４分室温で行われた。細胞は基本培地を使って最終了１ｍｌになるように縣濁され、直ちに計数された。

ステップ１４．被覆ウエルからの細胞の収穫は、（基本培地で０．１％の）コラゲナーゼでの培養によるものであった。培養培地は除去され、ウエルは基本培地０．２ｍｌ／ｃｍ^２（４００μｌ）ですすぎ洗いされた。等量のコラゲナーゼがウエルに加えられ、ピペットチップを用いて反覆吸引で混合された。平板は、次いで交互に３７℃で１０分培養され、５分混合され、３７℃で１０分培養され、５分混合され、次いで３７℃で２０分培養された。再縣濁細胞は、係数のために１ｍｌの量まで基本培地で希釈された。

選択肢として、０．３％のコラゲナーゼが単一室温培地８分で使用され、次いで再縣濁の前にウエル当り１分混合された。

公開されたコラゲナーゼプロトコルは、条件が対象となる細胞系に最適のものにされなければならないという条件下で、コラゲナーゼの濃度を変える単一短時間培養を典型的に示唆している。

結果
毎日の細胞数計数により測定される培養物の成長は図１で図により示される。対照細胞（未被覆プラスチック上で成長したもの）はより遅く、しかし、より線形の成長を示し、より高い細胞数に到達する。コラーゲン被覆表面での成長は、当初は分化の開始であったためにより急速であった。

被覆表面上の細胞は、付着と関連する平な外観を速やかに示し、またより大きな度合の組織化を提示し、更に細胞は帯状構造に整列される（図２）。未被覆表面上の細胞は、全体が平になるまで時間がかかり、また無作為に配列されたように見えた。

長期にわたる細胞培養に続き、コラーゲン被覆表面上の細胞は、より高い数のものとなり、しかもなお平な外観のものであった。未被覆表面上の細胞はより少なくなり、しかも円形化した（図３）。細胞の生存能力と分化は、コラーゲン被覆表面上でより長く保持された。

アワビコラーゲンで成長する細胞は、ウシコラーゲンのそれよりも測定上より高い成長率を示し、より高い組織化を提示する。

引用例
下記のリストによる引用例は、その開示をここで引用例として本出願に組み込まれたものである。

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カッツマン，Ｒ．Ｌ．，およびカン，Ａ．Ｈ．（１９７２年），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４７巻，５４８６ページ
ケファライズ，Ｎ．Ａ．（１９７１年），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．４６巻，２２６ページ
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ローレン，Ｇ．，デルビンコート，Ｔ．，およびスツィマノビッチ，Ａ．Ｇ．（１９８０年），ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒ，１２０巻，４４−４８ページ
ルイス，Ｍ．Ｓ．，およびピエズ，Ｋ．Ａ．Ｊ．，（１９６４年）Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．，２３９巻，３３６ページ
マクレーン，Ｐ．Ｅ．，クリード，Ｇ．Ｊ．，ワイリー，Ｅ．Ｒ．およびゲリッツ，Ｒ．Ｊ．，（１９７０年），Ｂｉｏｃｈｉｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２２１巻，３４９ページ
ミラー，Ｅ．Ｊ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７１年），１０巻，１６５２ページ
ミラー，Ｅ．Ｊ．，マーチン，Ｇ．Ｒ．，ピエズ，Ｋ．Ａ．，およびパワーズ，Ｍ．Ｊ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９６７年），２４２巻，５４８１ページ
ピエズ，Ｋ．Ａ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９６５年），４巻，２５９０ページ
ピエズ，Ｋ．Ａ．，アイガー，Ａ．，およびルイス，Ｍ．Ｓ．，（１９６３年），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２巻，５８号
ピエズ，Ｋ．Ａ．，（１９８４年），コラーゲンの分子構造と全体構造「細胞外マトリックス生化学」所収（ピエズ，Ｋ．Ａ．，およびレッディ，Ａ．Ｈ．編），１−３９ページ，エルスヴィア，ニューヨーク
プロコップ，Ｄ．Ｊ．，およびキビリッコ，Ｋ．Ｉ．（１９９５年），Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅ．，６４巻，４０３−４３４ページ
トレルスタッド，Ｒ．Ｉ．，カン，Ａ．Ｈ．，五十嵐，Ｓ．およびグロス，Ｊ．（１９７０年），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９巻４９９３ページ

コラーゲン被覆表面と未被覆プラスチック対照表面の上での細胞培養物の成長が生じる細胞数対時間の関係を示す図細胞培養成長について位相差顕微鏡により算出されたイメージを示す図上部から底部−第１日乃至第４日左部から右部−Ｃ，対照；ＢＶ，ウシコラーゲン；ＡＢ，アワビコラーゲン、および、長期細胞培養成長（２３日）についての位相差顕微鏡からのイメージを示す図左部から右部−Ｃ，対照；ＡＢ，アワビコラーゲン

Claims

海洋無脊椎動物から可溶天然コラーゲンを単離する一つのプロセスであって、以下のステップ、
１）天然コラーゲン原線維を可溶化するために、海洋無脊椎動物のコラーゲン含有部分を弱酸液で処理し、
２）組織微粒子を除去するために生成スラリーを遠心分離し、
３）塩基の追加でコラーゲンを沈殿させるために上澄のｐＨを調節し、
４）沈殿コラーゲンを収集し、
５）沈殿コラーゲンを再懸濁し、および、
６）限外濾過膜を使用して水に対する緩衝液交換を実行する、
ステップを含むことを特徴とするプロセス。
請求項１記載のプロセスであって、ここでｐＨ調節が、コラーゲン含有部分を１日乃至２０日弱酸液と接触させた後に行われることを特徴とするプロセス。
請求項２記載のプロセスであって、ここでｐＨ調節が、３日乃至６日後に行われることを特徴とするプロセス。
請求項３記載のプロセスであって、ここでｐＨ調節が、６日後に行われることを特徴とするプロセス。
請求項１乃至４のいずれか１項記載のプロセスであって、ここでｐＨ調節が、強塩基の徐々の追加により行われることを特徴とするプロセス。
請求項５記載のプロセスであって、ここでｐＨ調節が、１Ｍの水酸化ナトリウムの徐々の追加により行われることを特徴とするプロセス。
請求項５または６に記載のプロセスであって、ここでｐＨ調節が、１時間乃至１０時間にわたり冷蔵室で行われることを特徴とするプロセス。
請求項７記載のプロセスであって、ここでｐＨ調節が、２時間乃至６時間にわたり行われることを特徴とするプロセス。
請求項８記載のプロセスであって、ここでｐＨ調節が、３時間にわたり行われることを特徴とするプロセス。
請求項７乃至９のいずれか１項記載のプロセスであって、ここでｐＨ調節が、連続攪拌を伴い行われることを特徴とするプロセス。
請求項１乃至１０のいずれか１項記載のプロセスであって、ここで海洋無脊椎動物が、アワビであることを特徴とするプロセス。
請求項１１記載のプロセスであって、ここで海洋無脊椎動物が、（オキナエビス亜目ミミガイに属する）ブラックリップアワビ（Ｈａｌｉｏｔｉｓｒｕｂｅｒ），ブラウンリップアワビ（Ｈａｌｉｏｔｉｓｃｏｎｉｃｏｐｏｒａ），およびグリーンリップアワビ（Ｈａｌｉｏｔｉｓｌａｅｖｉｇａｔａ），またはロウズアワビ（Ｈａｌｉｏｔｉｓｒｏｅｉ）より成るグループから選択されることを特徴とするプロセス。
請求項１乃至１２のいずれか１項記載のプロセスにより調製される場合のコラーゲン。
請求項１３記載のコラーゲンを加熱することを含むゼラチンを調製するためのプロセス。
陸上脊椎動物から単離されるコラーゲン、または陸上脊椎動物のコラーゲンから調製されるゼラチンに替えての請求項１３記載のコラーゲンの使用法。
化粧用成分として、注射可能コラーゲンの形態で、生体臨床医療用具で、薬剤物質として、細胞培養の表面処理剤として、および食料品と飲料において、請求項１５で請求された使用法。
請求項１３に基づくコラーゲンでコートされたことを特徴とする細胞培養容器。
請求項１３に基づくコラーゲンを含むことを特徴とする化粧品組成物。
請求項１３に基づくコラーゲンを含むことを特徴とする生体臨床医療用具。
請求項１３に基づくコラーゲンを含むことを特徴とする薬剤組成物。
請求項１３に基づくコラーゲンを含むことを特徴とする食品。
清澄剤として請求項１３に基づくコラーゲンを使用して調製されることを特徴とする飲料。
請求項１４に記載のプロセスにより調製される場合のゼラチン。
請求項２３に基づくゼラチンを含むことを特徴とする薬剤用カプセル。