CN115245586A - 含海洋生物源的胶原蛋白-基材料及其制备方法 - Google Patents
含海洋生物源的胶原蛋白-基材料及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及包含海洋生物源如鱼源的胶原蛋白‑基材料以及包含海洋生物源如鱼源的胶原蛋白‑基材料的制备方法。本发明还涉及包含本发明胶原蛋白‑基材料的组合物,及其用途。
Description
技术领域
本发明属于医学生物材料技术领域,特别涉及包含海洋生物源如鱼源的胶原蛋白-基材料以及包含海洋生物源如鱼源的胶原蛋白-基材料的制备方法。本发明还涉及包含本发明胶原蛋白-基材料的组合物,及其用途。
背景技术
胶原蛋白,是一组由多糖蛋白分子组成的生物性高分子物质。其广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物的结缔组织(皮肤,骨骼,肌腱,韧带,巩膜等)中,主要起到结构支撑作用,是动物体内含量最丰富的功能性蛋白质,约占机体蛋白质总量的30%。
现阶段,胶原蛋白多来源于陆生动物的组织提取物,如CN105983094A公开了一种具有生物活性的无菌胶原液和无菌胶原贴敷料的制备方法,使用了牛筋腱作为原料,具有较高的免疫原性风险和人畜共患病毒传播风险。目前,绝大部分现用产品源自猪、牛等陆地哺乳动物源,携带疯牛病、蓝耳病等人畜共患性传染病毒的风险较高,严重影响了胶原蛋白-基产品的生物安全性。各国均将疯牛病高风险区的医用胶原蛋白产品列入最高等级风险监控产品予以监管,甚至严格限制其进出口。
自然界动物体中约有500亿吨以上的胶原,含量极为丰富,而其中海洋生物如鱼类就是胶原重要的来源之一。源自海洋生物的胶原蛋白来源于海洋水生生物,相较于陆地生物污染小、安全性更高,目前主要用于化妆品、食品和保健品领域。迄今尚无鱼类病毒与人畜共患或传播的报道,因此其病毒传播风险更低,临床使用安全性更高。体内和体外生物相容性研究显示,鱼胶原蛋白凝胶提取物无菌检验为阴性,且细胞毒性、致敏作用、染色体畸变、皮内反应、急性系统性毒性、热原反应和溶血反应均为阴性,是用于生物医药领域合适的新型胶原。
我国是水产大国,每年产生上万吨水产加工废弃物,主要包括海洋生物如鱼类的鳞、皮、鳍、骨等,不仅污染环境而且造成资源浪费。例如,鱼胶原主要来源于鱼皮、鱼鳞等组织,其中,鱼鳞中胶原含量约为20~40%,鱼皮中粗胶原的含量甚至高达80~90%,由此可见,鱼胶原来源广泛、资源丰富、价格低廉,还可同时解决水产加工废弃物的环境污染问题,具备作为新型胶原来源的工业化基础。
胶原在生物进化上高度保守,不同种类动物的胶原其核心区氨基酸序列基本相似,因此,鱼胶原与陆地哺乳动物源性胶原的结构基本相似。但不同于陆地哺乳动物源胶原,鱼胶原的免疫原性更低,不会引起明显的过敏反应,是一种安全性高的生物材料。胶原蛋白支架材料具有良好的亲水与吸水性,是制备止血材料使用最多的材料之一。其中,胶原蛋白海绵作为可吸收止血材料,在临床上已被广泛应用。
在止血性能上,胶原蛋白海绵的孔径大小起着重要的作用:孔径太小会导致总液体蓄存能力不足,孔径太大会导致液体直接透过材料无法被蓄存。胶原蛋白孔径大小受胶原溶液中的离子类型和离子浓度影响。不同的离子能够促使胶原自组装形成网状、纤维状、片状或团簇状的微纤维,最终影响海绵的液体蓄存能力。专利CN102363798A公开了一种胶原蛋白海绵的制备工艺,其采用超声波处理和双氧水处理材料以提高胶原提取率和纯度,然而较高的超声波频率和较高浓度的双氧水会破坏胶原结构,导致最终形成的海绵孔径大小不均,影响产品性能。专利CN104558675A公开了一种制备微纤维止血胶原海绵的方法,其虽利用了胶原自组装特性,但在中性盐溶液和较高的温度孵育下会形成粗大的胶原纤维,冻干后支架材料硬度高、孔径较小,液体蓄存能力不如网状和细纤维状胶原,经检测该方法制得的海绵吸水率不足海绵自重的40倍。在抗消化性和稳定性上,由于医用胶原去除了端肽,分子间和分子内的交联水平较低,因而其抗消化性和稳定性都较差,在体内植入后可能因过快消化降解导致止血性能大打折扣。如专利CN1915437A公开了一种胶原蛋白海绵的制备工艺,其所制得的海绵为纯胶原,抗消化性弱,不适合临床的长期植入。鱼胶原在稳定性上一般弱于哺乳动物源胶原,因此更需采用适当工艺提升其交联度,使其在植入后能够长期稳定。长期植入的海绵由于需长时间和机体组织接触,必然会伴有持续的炎症反应,有效降低炎症水平能够减少因与材料接触对周围组织的不利影响。专利CN108498848A公开了一种胶原蛋白海绵及其制备方法,其虽使用谷氨酰胺转氨酶作为海绵交联剂提高海绵的稳定性,但并没有通过工艺去除可能残留的酶,残留的酶在产品最终使用中可能通过血液影响患者的肝脏功能,且该海绵在临床应用中也无法降低对周围组织的炎症反应。
在对组织力学补强应用上,胶原蛋白的膜的力学性能起着重要作用:提供力学支撑和保护性,避免组织的再次损伤。专利CN114058068A公开了一种组织引导再生胶原膜及其制备方法,其所制得的胶原膜抗拉强度仅有3~10 MPa,在较多引用场景适用性差。较低的力学性能通常会让材料在软组织运动中破裂,失去对软组织的保护支撑作用,加大了术后复发的风险。
发明内容
针对上述现有技术的不足,本发明旨在提供包含海洋生物源如鱼源的胶原蛋白-基材料(例如鱼胶原蛋白海绵或鱼胶原蛋白膜)、其制备方法及其制备获得的产品如敷料或生物膜,及其在皮肤屏障或体内软组织的保护支撑,创面的修复、愈合、伤口护理如止血、抗炎等处理中的应用,能够实现皮肤屏障、软组织保护或创面快速有效的恢复,且具有较低的安全性风险。本申请材料或产品能够有效调控胶原自组装后的状态,提升终产品的蓄液能力,同时还能够增强材料的稳定性,降低材料和机体组织长期接触过程中的炎症反应水平,使制得的胶原蛋白-基产品安全、有效。
本申请的包含海洋生物源如鱼源的胶原蛋白-基材料是指基于胶原蛋白获得的材料,特别地胶原蛋白包含海洋生物源如鱼源的胶原蛋白。该胶原蛋白-基材料可以是由胶原蛋白制备获得,例如由胶原蛋白通过交联制备获得。
根据本申请的一个具体实施方案,本申请胶原蛋白-基材料(如胶原蛋白海绵或膜)具有的平均孔径大小为50~250 μm,优选60~200 μm,更优选80~120 μm。
根据本申请的另一个具体实施方案,本申请胶原蛋白-基材料(如胶原蛋白海绵或膜)的吸水率为自身质量的至少65倍,优选至少70倍,更优选至少80倍。
根据本申请的另一个具体实施方案,本申请胶原蛋白-基材料(如胶原蛋白海绵或膜)具有的孔隙率为85~99%,优选90~98%,更优选92~96%。
根据本申请的另一个具体实施方案,本申请胶原蛋白-基材料(如胶原蛋白海绵或膜)可以任选地具有至少二种类型表面,其中一种表面为粗糙表面,其中一种表面为光滑表面。粗糙表面与液体接触后吸附性好,光滑表面可避免胶原蛋白-基材料所接触的组织发生黏连。根据本申请的另一个具体实施方案,本申请胶原蛋白-基材料(如胶原蛋白海绵或膜)具有抗炎活性,炎症因子TNF-α的抑制率为15~80%,优选20~60%,更优选23~40%。
根据本申请的另一个具体实施方案,本申请胶原蛋白-基材料(如胶原蛋白海绵或膜)在大鼠肝脏创面的止血时间为35~120s,,优选40~100 s,更优选53.3~97.5 s,出血量为0.20~3g,优选0.3~2g,更优选0.50~1.66 g。
根据本申请的另一个具体实施方案,本申请胶原蛋白-基材料,如胶原蛋白膜的情况,其具有5.0至30.0 MPa的断裂强力,优选10至25.0 MPa ,更优选15.0至20.0 MPa 。
根据本申请的另一个具体实施方案,本申请胶原蛋白-基材料(如胶原蛋白海绵或膜)可以由下述制备方法获得,包括以下步骤:
(a)提供第一胶原液的步骤,其中将原料胶原形成胶原液并然后经由离子处理形成第一胶原液;
(b)提供第二胶原液的步骤,其中将原料胶原液加入一种或多种蛋白酶处理形成第二胶原液;
(c)提供第三胶原液的步骤,其中将第一胶原液与第二胶原液混合;
(d)交联步骤,其中将第一胶原液与第二胶原液混合后的第三胶原液进行交联,
(e)任选地后处理步骤。
根据本申请的另一个具体实施方案,本申请胶原蛋白-基材料(如胶原蛋白海绵或膜)制备方法的步骤(a)包括:将原料胶原的一部分溶于酸溶液(如盐酸、醋酸、柠檬酸或磷酸溶液)形成A液,向该A液中加入盐离子物质,任选地搅拌均匀并静置,形成第一胶原液。优选地,盐离子物质不包括中性的磷酸盐离子。根据本申请的另一个具体实施方案,本申请胶原蛋白-基材料(如胶原蛋白海绵或膜)制备方法的步骤(a)中,离子处理包括:所述盐离子物质在低温(如1-10℃,优选2~8℃,更优选3-6℃)情况下被加入所述A液中。
根据本申请的另一个具体实施方案,本申请胶原蛋白-基材料(如胶原蛋白海绵或膜)制备方法的步骤(b)包括:将原料胶原的另一部分溶于水形成B液,向该B液中加入蛋白酶,进行水浴反应;反应后的溶液任选地依次煮沸过滤、超滤,形成第二胶原液。
根据本申请的另一个具体实施方案,本申请胶原蛋白-基材料(如胶原蛋白海绵或膜)制备方法的步骤(b)包括:所述B液用均质机均质后再被加入蛋白酶。均质时间为2-30min,优选5-20 min,更优选10-15 min。
根据本申请的另一个具体实施方案,本申请胶原蛋白-基材料(如胶原蛋白海绵或膜)制备方法的步骤(b)包括:反应后的溶液的煮沸时间为1-30分钟,优选2-20分钟 ,更优选3-10分钟,特别地约5分钟。
根据本申请的另一个具体实施方案,本申请胶原蛋白-基材料(如胶原蛋白海绵或膜)制备方法的步骤(d)包括:将第一胶原液与第二胶原液混合后的第三胶原液进行低温(优选1-10℃,优选2~8℃,更优选3-6℃)交联。
根据本申请的另一个具体实施方案,本申请胶原蛋白-基材料(如胶原蛋白海绵或膜)制备方法的步骤(d)包括:将第二胶原液在10~20℃的环境下散热或恒温60分钟,调节第一胶原液与第二胶原液混合后的第三胶原液,用如HCl或NaOH调节pH至5~6.9,优选5.2~6.6,更优选5.5~6.5;然后冻结所获得的第三胶原液并冻干除去液体组分,冻干固体浸于交联液中于低温如1-10℃,优选2~8℃,更优选3-6℃的情况下进行交联。
根据本申请的另一个具体实施方案,本申请胶原蛋白-基材料(如胶原蛋白海绵或膜)制备方法的任选步骤(e)包括:用纯化水清洗步骤(d)所获得的交联后的胶原材料,并经冻干、辐照,例如,形成本申请胶原蛋白-基材料(如胶原蛋白海绵或膜)。
根据本申请的另一个具体实施方案,所述的鱼源胶原提取自淡水或海水鱼类的鱼皮、鱼鳞或鱼骨。
根据本申请的另一个具体实施方案,所述的酸溶液为乙酸、磷酸、乳酸、盐酸中的一种,酸浓度为0.1%~2.0%。
根据本申请的另一个具体实施方案,所述的A液胶原蛋白浓度为0.8%~3.5%(w/v),B液胶原蛋白浓度为0.3%~2.0%(w/v)。
根据本申请的另一个具体实施方案,所述盐离子选自阳离子和/或阴离子,阳离子选自一价或二价阳离子,如Co2+、Na+、Li+、NH4 +、K+中的一种或多种,阴离子选自一价或二价阴离子,如为CH3COO-(Ac)、Cl-、SO4 2-、F-中的一种或多种,阴离子或阳离子的浓度为20 mM~400 mM。优选地,盐离子物质不包括中性的磷酸盐离子。
根据本申请的另一个具体实施方案,所述静置时间为24~60 h。
根据本申请的另一个具体实施方案,所述的蛋白酶为木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶中的一种或多种,优选地,反应pH为该酶的最适pH,反应温度为该酶的最适温度,优选地,反应时间为0.5~20h,优选0.5~15h,更优选1~10 h,特别地1~6 h。
根据本申请的另一个具体实施方案,蛋白酶与底物比为1000 U/mg~5000 U/mg。
根据本申请的另一个具体实施方案,所述的超滤为3000 Da的滤膜超滤。
根据本申请的另一个具体实施方案,所述的混合比例为1:1~20:1(A:B,v:v)。
根据本申请的另一个具体实施方案,所述的交联液溶质选自1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、戊二醛、京尼平、己二异氰酸酯、环氧乙烷、环氧丙烷、1,4-二(3,4-羟基苯)-2,3-二甲基丁烷(NDGA)、谷氨酰胺转氨酶中的一种或多种,溶剂为含1-5% (NH4)2SO4浓度(w/w)的盐溶液,甚至不超过4% (NH4)2SO4浓度(w/w)的盐溶液,特别地3% (NH4)2SO4浓度(w/w)的盐溶液,交联液浓度为0.01%~2.0%。
根据本申请的另一个具体实施方案,所述交联时间为4~72h,优选8~65 h,更优选10~62 h,甚至24~48h。
经过上述步骤制得的交联后的胶原材料如胶原蛋白海绵一面为粗糙面,适合于创面吸附;一面为光滑面,可避免组织发生黏连。
经过上述步骤制得的交联后的胶原材料如胶原蛋白海绵在体外酶消化一定时间后,或在机体内消化降解一定时间,能检测到具有特殊序列的多肽,其序列为N1-N2-N3……C3-C2-C1。该多肽由3个或以上的氨基酸残基组成,超过半数氨基酸残基为疏水性氨基酸残基。N1或C1的肽末端至少有一个为疏水性氨基酸残基,N2、N3、C2以及C3位点至少含有一个芳香族氨基酸残基。
根据本申请的另一个具体实施方案,可以用于本发明中使用的源自海洋生物的胶原蛋白可以是源自海洋生物的胶原蛋白,尤其地选自源自海洋动物(包括无脊椎动物和脊椎动物)的胶原蛋白,如选自源自下述海洋生物的胶原蛋白:鱼;海洋哺乳动物如鲸,海豹,海狮;爬行动物如海蛇,海龟;节肢动物,软体动物如海星,海参;腔肠动物如水母,无脊椎动物等,优选源自鱼。
根据本申请的另一个具体实施方案,可以用于本发明中使用的源自海洋生物的胶原蛋白可以是变性鱼胶原蛋白如胶原蛋白明胶或胶原蛋白多肽、以及非变性鱼胶原蛋白。根据本申请的另一个具体实施方案,可以用于本发明中使用的鱼胶原蛋白主要来源于:
- 鱼皮、鱼鳞等组织(Ⅰ型),其属于非变性鱼胶原蛋白,其分子量低于猪、牛胶原蛋白,由于分子间交联度低,非变性鱼胶原蛋白在低温下也易溶于水或弱酸溶液,可操作性优于哺乳动物源性胶原蛋白,
- 软骨(Ⅱ 型),
- 鱼肠(Ⅲ 型),
- 肌肉(Ⅴ 型)等组织。
此外,鱼胶原蛋白多肽的抗氧化作用优于猪、牛胶原蛋白多肽。另外,鱼胶原蛋白多肽可有效促进细胞的体外黏附,对表皮细胞的增殖以及成纤维细胞的蛋白分泌均有一定促进作用。
根据本申请的另一个具体实施方案,所述的源自海洋生物的胶原蛋白为从海洋生物的鱼皮、鱼鳞、鱼鳔、软骨、肌肉等组织中提取得到的胶原蛋白。
根据本申请的另一个具体实施方案,所述的源自海洋生物的胶原蛋白为从海洋软体动物或脊索动物组织中提取得到的胶原蛋白。
根据本申请的另一个具体实施方案,所述的源自海洋生物的胶原蛋白为从海洋软体动物或脊索动物的皮、鳞、鳔、软骨、肌肉中的一种或其混合物中提取得到的胶原蛋白。
根据本申请的另一个具体实施方案,所述的源自海洋生物的胶原蛋白为从鲑鱼、鳕鱼、黄鱼、鲳鱼、金枪鱼、马鲛鱼、带鱼、鳗鱼、罗非鱼、乌贼、鱿鱼、水母的皮、鳞、鳔、软骨、肌肉中的一种或其混合物中提取得到的胶原蛋白。
根据本申请的另一个具体实施方案,本申请胶原蛋白-基材料(如胶原蛋白海绵或膜)可包括保湿剂,保湿剂可选自:透明质酸或透明质酸钠,聚谷氨酸,甘油,和/或多元醇类如戊二醇,丁二醇,丙烯乙二醇,山梨醇,或乳酸,角鲨烷,海藻糖,明胶,尿素,乳酸钠,吡咯烷酮羧酸类,神经酰胺类及植物提取物,维他命类等。
根据本申请的另一个具体实施方案,所述的源自海洋生物的胶原蛋白的杂蛋白总量应在总蛋白的1%以下。
根据本申请的另一个具体实施方案,所述的源自海洋生物的胶原蛋白应不含有色氨酸。
根据本申请的另一个具体实施方案,所述的源自海洋生物的胶原蛋白含量不小于其质量的90%。
根据本申请的另一个具体实施方案,所述的源自海洋生物的胶原蛋白的灰分不大于其质量的1%。
根据本申请的另一个具体实施方案,所述的源自海洋生物的胶原蛋白的重金属含量不大于10 μg/g。
根据本申请的另一个具体实施方案,本申请胶原蛋白-基材料(如胶原蛋白海绵或膜)还可包括与之配合使用的载体,其可以是本领域使用的载体,如膜材或凝胶,其中载体可以是由纤维制成的载体,如纱布、无纺布,纤维素、海藻酸等材料制成的膜布,或凝胶。
根据本申请的另一个具体实施方案,本申请胶原蛋白-基材料(如胶原蛋白海绵或膜)可进一步包含其他多种药物,任选地其他药物可以是抗菌药、镇痛药中的至少一种或者有利于伤口愈合的药物,如止血剂等。
根据本申请的另一个具体实施方案,本申请胶原蛋白-基材料(如胶原蛋白海绵或膜)可以以敷料形式提供,还可以以薄膜形式提供,并可以用于医疗、美容和化妆领域,例如用于外科伤口处理,如止血等;用于美容整形术后伤口及皮肤护理;用于日常皮肤保养,护理,为整容整形伤口及皮肤提供积极的舒润环境及必要营养,并可起到促进伤口愈合,减少疤痕的作用;用于皮肤护理,为皮肤提供水分和丰富营养,起到营养、美白、补水、护肤的作用。
本申请胶原蛋白-基材料(如胶原蛋白海绵或膜)在皮肤屏障修复、伤口护理中的应用,例如但不限于伤口处理如止血、注射填充和激光治疗的术后护理、烫伤伤口护理中的应用。
本申请胶原蛋白-基材料(如胶原蛋白海绵或膜)与现有技术相比,优点在于提供一种具有合适的孔径大小、有抗消化性以及免疫调节功能的胶原蛋白-基材料(如胶原蛋白海绵或膜),及其制备方法,该方法制得的胶原蛋白-基材料(如胶原蛋白海绵或膜)具有高吸水率以及高TNF-α抑制率。
本发明通过离子效应改变胶原蛋白自组装结构,依据离子与胶原相互作用特点,在酸环境下构建稳定的胶原蛋白网状空间结构。通过调节离子浓度,以达到控制胶原蛋白孔径的目的。本发明的B液为有免疫调节功能的胶原蛋白肽,具有良好的炎症抑制活性。通过调节A、B混合液的pH,使胶原蛋白和胶原蛋白肽因静电作用结合,再通过冻干工艺除去液体成分,将整体结构固定。胶原蛋白海绵在植入患者体内后,随着海绵降解,具有免疫调节功能的胶原蛋白肽被释放,促使组织周围的炎症反应水平降低以及受损大分子的修复。低温状态下的交联能有效控制胶原分子内和分子间的交联程度,而(NH4)2SO4的盐溶液环境下可促使胶原蛋白分子稳定,避免在交联过程中胶原结构发生改变。
本发明胶原蛋白-基材料(如胶原蛋白海绵或膜)的制备方法,摒弃了常规在胶原蛋白提取过程中进行单一物理化学干预的传统海绵或膜的制备方式,通过利用胶原自身的结构特点,使所制海绵或膜在止血功能性、植入抗消化性和植入后安全性上得到保证,满足临床对止血材料的核心要求。
具体地,本发明进一步地包括下述技术方案及其组合:
1.一种胶原蛋白-基材料,其具有吸水率为自身质量的至少60倍。
2.根据前述项1所述的胶原蛋白-基材料,其具有下述特性的一种或多种:
- 平均孔径大小为50~250 μm,优选60~200 μm,更优选80~120 μm;
- 吸水率为自身质量的至少65倍,优选至少70倍,更优选至少80倍;
- 孔隙率为85~99%,优选90~98%,更优选92~96%;
- 任选地具有至少二种类型表面,其中一种表面为粗糙表面,其中一种表面为光滑表面;粗糙表面与液体接触后吸附性好,光滑表面可避免胶原蛋白-基材料所接触的组织发生黏连;
- 具有5.0至30.0 MPa的断裂强力,优选10.0至25.0 MPa ,更优选15.0至20MPa。
3. 根据前述项任一项所述的胶原蛋白-基材料,其特征在于:
- 抗炎活性,炎症因子TNF-α的抑制率为15~80%,优选20~60%,更优选23~40%;
- 在大鼠肝脏创面的止血时间为35~120s,优选40~100 s,更优选53.3~97.5 s;
- 出血量为0.20~3g,优选0.3~2g,更优选0.50~1.66 g。
4. 根据前述项任一项所述的胶原蛋白-基材料,其特征在于,所述胶原蛋白-基材料为胶原蛋白海绵或膜。
5. 一种制备根据前述项任一项所述的胶原蛋白-基材料的方法,包括以下步骤:
(a)提供第一胶原液的步骤,其中将原料胶原形成胶原液并然后经由离子处理形成第一胶原液;
(b)提供第二胶原液的步骤,其中将原料胶原液加入一种或多种蛋白酶处理形成第二胶原液;
(c)提供第三胶原液的步骤,其中将第一胶原液与第二胶原液混合;
(d)交联步骤,其中将第一胶原液与第二胶原液混合后的第三胶原液进行交联,
(e)任选地后处理步骤。
6. 根据前述项5所述的方法,其中步骤(a)包括:将原料胶原的一部分溶于酸溶液形成A液,向该A液中加入盐离子物质,任选地搅拌均匀并静置,形成第一胶原液。
7. 根据前述项5或6所述的方法,其中步骤(a)中,离子处理包括:所述盐离子物质在低温情况下被加入所述A液中。
8. 根据前述项5-7任一项所述的方法,其中步骤(a)中,离子处理的温度为1-10℃,优选2~8℃,更优选3-6℃。
9. 根据前述项6所述的方法,其中酸溶液选自无机酸或有机酸的溶液,如盐酸、醋酸、柠檬酸或磷酸的溶液。
10. 根据前述项5-9任一项所述的方法,其中步骤(b)包括:将原料胶原的另一部分溶于水形成B液,向该B液中加入蛋白酶任选地通过水浴进行反应,;反应后的溶液任选地进行后处理,如依次煮沸过滤、超滤,形成第二胶原液。
11. 根据前述项5-10任一项所述的方法,其中蛋白酶选自木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶或胃蛋白酶。
12. 根据前述项5-11任一项所述的方法,其中步骤(b)的反应时间为0.5~20h,优选0.5~15h,更优选1~10 h,特别地1~6 h。
13. 根据前述项5-12任一项所述的方法,其中步骤(d)包括:将第一胶原液与第二胶原液混合后的第三胶原液进行低温交联。
14. 根据前述项5-13任一项所述的方法,其中步骤(d)中,交联温度为1-10℃,优选2~8℃,更优选3-6℃。
15. 根据前述项5-14任一项所述的方法,其中步骤(d)包括:将第二胶原液在10~20℃的环境下散热或恒温60分钟,调节第一胶原液与第二胶原液混合后的第三胶原液pH至5~6.9,优选5.2~6.6,更优选5.5~6.5;然后冻结所获得的第三胶原液并冻干除去液体组分,冻干固体浸于交联液中于低温如1-10℃,优选2~8℃,更优选3-6℃的情况下进行交联。
16. 根据前述项5-15任一项所述的方法,其中所述的酸溶液选自乙酸、磷酸、乳酸、盐酸,优选地,酸浓度为0.1%~2.0%。
17. 根据前述项5-16任一项所述的方法,其中A液胶原蛋白浓度为0.8%~3.5%(w/v)。
18. 根据前述项5-17任一项所述的方法,其中B液胶原蛋白浓度为0.3%~2.0%(w/v)。
19. 根据前述项5-18任一项所述的方法,其中所述盐离子选自一种或多种阳离子和/或阴离子,例如阳离子选自一价或二价阳离子,如Co2+、Na+、Li+、NH4 +、K+,例如阴离子选自一价或二价阴离子,如为CH3COO-(Ac)、Cl-、SO4 2-、F-。
20. 根据前述项5-19任一项所述的方法,其中阴离子或阳离子的浓度为20 mM~400 mM。优选地,所述盐离子不包括接近中性的磷酸盐离子。
21. 根据前述项5-20任一项所述的方法,其中所述的蛋白酶选自木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶中的一种或多种。
22. 根据前述项5-21任一项所述的方法,其中蛋白酶与底物比为1000 U/mg~5000U/mg。
23. 根据前述项5-22任一项所述的方法,其中所述的超滤为3000 Da的滤膜超滤。
24. 根据前述项5-23任一项所述的方法,其中所述第一胶原液与第二胶原液的混合比例为1:1~20:1,以体积比表示。
25. 根据前述项5-24任一项所述的方法,其中所述的交联液溶质选自1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、戊二醛、京尼平、己二异氰酸酯、环氧乙烷、环氧丙烷、1,4-二(3,4-羟基苯)-2,3-二甲基丁烷(NDGA)、谷氨酰胺转氨酶中的一种或多种。
26. 根据前述项5-25任一项所述的方法,其中溶剂为含1-5% (NH4)2SO4浓度(w/w)的盐溶液,特别地为含3% (NH4)2SO4浓度(w/w)的盐溶液。
27. 根据前述项5-26任一项所述的方法,其中交联液浓度为0.01%~2.0%(w/v)。
28. 根据前述项5-27任一项所述的方法,其中盐离子物质不包括接近中性的磷酸盐离子。
29. 产品,其包含根据前述项1-4任一项所述的胶原蛋白-基材料和由根据前述项5-28任一项所述的方法获得的胶原蛋白-基材料。
30. 根据前述项1-4任一项所述的胶原蛋白-基材料或由根据前述项5-28任一项所述的方法获得的胶原蛋白-基材料或前述项29的产品在制备用于皮肤屏障修复、伤口护理的产品中的应用,例如但不限于伤口处理如止血、注射填充和激光治疗的术后护理、烫伤伤口护理中的应用。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述:
I. 本申请实施例中所涉及的孔隙率由下述方法测试方法获得:
选用一个容积为10 mL的塑料瓶,倒满乙醇称重Wl,把重为WS的海绵浸入乙醇中,超声波震荡一段时间,时间的长短依据海绵的形状及大小,充分脱除海绵孔隙中的空气,使乙醇充满于海绵的孔结构之中,然后向瓶中加乙醇直至充满,称重为W2,将已经吸满乙醇的样品取出,称剩余的乙醇与塑料瓶的质量为W3,计算孔隙率θ,每个样品测试5次,最后求平均值。
θ=(W2-W3-WS)/(W1-W3)。
II. 本申请所涉及的胶原蛋白海绵降解液对LPS诱导的巨噬细胞分泌TNF-α的影响的实验方法如下:
1. 实验试剂
DMEM培养液、LPS、牛血清蛋白、TNF-α检测试剂盒、胶原蛋白酶、0.01 mol/L PBS。
2. 实验设备
酶标仪、CO2培养箱、倒置显微镜。
3. 实验方法
3.1 巨噬细胞培养
小鼠巨噬细胞以DMEM(1%双抗、10%胎牛血清)完全培养基培养培养。细胞于5 %CO2,90%湿度,37℃条件下的CO2恒温培养箱培养,每24 h于倒置显微镜下观察,当密度达到80%左右时进行传代。用于实验的细胞代数在15代以内。
3.2 巨噬细胞传代
通过显微镜观察细胞的生长,当细胞生长超过80%时,对巨噬细胞进行传代培养。将传代后的细胞用PBS洗涤3次,并用移液枪吸去培养皿中残留的PBS,后沿壁加入培养基,放于CO2培养箱中培养。
3.3 巨噬细胞的冻存和复苏
取出细胞上清液,加入1-2 mL冻存液后移入冻存管中,封口后放入-20℃冰箱30min后,于-80 °C环境下冻存。复苏巨噬细胞时,先将适量的完全培养基加入离心管中,再从-80℃环境中取出冻存的细胞,置于37℃水浴锅中使细胞快速溶解,后将溶解的细胞转入含DMEM离心管中,按上述步骤加入培养基,放于CO2培养箱中培养。
3.4 胶原蛋白海绵降解液制备
向PBS缓冲液中加入胶原蛋白酶至其终浓度为0.3 U/mL,制得降解液。取海绵0.1g加入100 mL的降解液中,于37℃恒温箱下静置2 h,用10 kDa的超滤膜包超滤得到海绵降解液。
3.5 海绵降解液对LPS诱导的巨噬细胞分泌TNF-α的影响
取对数生长期增殖活跃的巨噬细胞,接种于6孔板中,设置正常组,模型组,实验组。正常组换入2 mL无血清培养液,模型组加入2 mL含LPS的无血清培养液(LPS 浓度为100ng/mL)刺激24 h,实验组预先加入2 mL 含海绵降解液的无血清培养液作用24 h,之后再加入浓度为100 ng/mL 的LPS刺激24 h。用EP管收集细胞培养液,低温高速离心机中以4 ℃、3000 rmp 离心5 min,用移液器小心抽取上清液,用相应的ELISA试剂盒,参照操作说明书,检测细胞培养液中TNF-α的浓度。其中TNF-α的抑制率通过以下公式计算:
TNF-α抑制率(%)= 1-(A2-A1)/A2× 100%
其中:A1为实验组中TNF-α浓度;A2为模型组中TNF-α浓度。
实施例1:
本实施例考察在本发明所述的方法下,不同离子处理工艺对鱼源胶原蛋白海绵平均孔隙大小和吸水率的影响。海绵制备方法如下。
取鳕鱼鱼皮胶原溶于0.1%的乙酸溶液,配置胶原浓度为1.3%的A液。另取该胶原溶于水中,配置胶原浓度为0.8%的B液。在4℃环境下,向A液加入盐离子,盐离子类型和浓度如表1所示。加盐后将A液搅拌均匀并置于4℃下静置30 h。用均质机混匀B液,以2500 U/mg的酶与底物比向其加入碱性蛋白酶,调节B液pH至9.0,置于55℃水浴下酶解3 h。将酶解液煮沸5 min后过滤,随后用3000 Da超滤膜包进行超滤,收集滤出液在15℃恒温60 min。将A液与滤出液以10:1的体积比混合,并用NaOH调节混合液的pH至6.0。把装载混合液的容器迅速浸入液氮中,直至混合液凝固完全后取出,用冻干机冻干。冻干的固体随后在4℃下用交联剂浸泡24 h,交联剂浓度为0.5%,其溶质为京尼平,溶剂为3% 的(NH4)2SO4。交联后的固体用纯化水洗净,并经冻干、辐照后得到鱼源胶原蛋白海绵。
对比例1.1:本对比例考察在不使用离子处理工艺时的胶原蛋白平均孔隙大小和胶原蛋白海绵的吸水率。除去未使用离子处理工艺外,其余工艺流程与实施例1相同。
对比例1.2:本对比例考察专利CN104558675A公开方法制得海绵的平均孔隙大小和吸水率。
在4℃环境下,将鱼源胶原用0.1%的乙酸溶液配置1.3%的胶原溶液。加入该溶液1/8体积的0.09M磷酸盐缓冲液混匀,再用NaOH调节pH至6。溶液在35℃水浴锅自组装24 h。随后将固化的胶原液在5000 rpm条件下离心10 min,沉淀透析2天。透析后的胶原蛋白冻干即得胶原蛋白海绵。
将实施例1、对比例1.1和对比例1.2所制得的胶原蛋白海绵用标准YY/T 0954-2015中的液体吸收性试验对样品吸水率进行表征,蛋白孔径大小用扫描电镜检测表征,孔隙率用附录A方法进行表征,测试结果均列于表1中。结果显示,相较于对比例1.1,本发明的工艺方法(实施例1)能提升海绵平均孔径大小,并提高海绵的吸水率以及孔隙率;对比例1.2所制得的胶原结构为纤维状,海绵平均孔径更小,相较实施例1的吸水率和孔隙率也更低。
表1离子处理工艺对鱼源胶原蛋白海绵平均孔径和吸水率的影响
实施例2:
本实施例考察在本发明所述的方法下,不同低温交联工艺对鱼源胶原蛋白海绵体外抗消化性能的影响。海绵制备方法如下。
取鱼胶原溶于0.3%的盐酸溶液,配置胶原浓度为1.8%的A液。另取鱼胶原溶于水中,配置胶原浓度为1.0 %的B液。向A液加入80 mM的K2SO4,加盐后将A液搅拌均匀并置于4℃下静置48 h。用均质机混匀B液,以2000 U/mg的酶与底物比向其加入木瓜蛋白酶,调节B液pH至7.0,置于50℃水浴下酶解4 h。将酶解液煮沸5 min后过滤,随后用3000 Da超滤膜包进行超滤,收集滤出液。将A液与滤出液以15:1的体积比混合,并调节混合液的pH至6.5。把装载混合液的容器迅速浸入液氮中,直至混合液凝固完全后取出,用冻干机冻干。冻干的固体随后用交联剂浸泡交联,交联剂信息如表2所示。交联后的固体用纯化水洗净,并经冻干、辐照后得到鱼源胶原蛋白海绵。
对比例2.1:本对比例考察在不使用低温交联工艺时的体外抗消化性能。除去未使用低温交联工艺外,其余工艺流程与实施例2相同。
体外降解性能表征试验:配置0.1 mol/L的Tris-HCl缓冲液,加入胶原蛋白酶至其终浓度为0.3 U/mL,加入氯化钙至其终浓度为0.05 mol/L,制得降解液。取样品0.1 g加入100 mL的降解液中,于37℃恒温箱下静置2 h。静置后将样品从液体取出,置于105℃烘箱中恒温烘干30 min,称重,计算质量损失率即为水解率。
从表2结果来看,相较于未使用交联工艺的对比例2.1,使用低温交联工艺的实施例2在经消化一段时间后质量损失率较低,能在一定程度上防止胶原蛋白海绵过于迅速的被水解。未经交联的鱼源胶原蛋白海绵,经消化后近乎完全降解,这与鱼源胶原本身在结构上稳定性较弱不无关系。
表2 低温交联工艺对鱼源胶原蛋白海绵抗消化性能的影响
实施例3:
本实施例考察在本发明所述的方法下,B液组分对鱼源胶原蛋白海绵引发炎症反应的影响。
海绵制备方法如下。
取鱼胶原溶于0.5%的磷酸溶液,配置胶原浓度为2.0%的A液。另取鱼胶原溶于水中,配置胶原浓度为0.5 %的B液。向A液加入125 mM的Na2SO4,加盐后将A液搅拌均匀并置于4℃下静置24 h。用均质机混匀B液,B液的酶解条件详见表3。以1200 U/mg的酶与底物比向其加入胃蛋白酶,调节B液pH至2.0,置于37℃水浴下酶解5 h。将酶解液煮沸5 min后过滤,随后用3000 Da超滤膜包进行超滤,收集滤出液。将A液与滤出液以6:1的体积比混合,并调节混合液的pH至6.0。把装载混合液的容器迅速浸入液氮中,直至混合液凝固完全后取出,用冻干机冻干。冻干的固体随后在4℃下用交联剂浸泡12 h,交联剂浓度为1.0%,其溶质为EDC,溶剂为3% 的(NH4)2SO4。交联后的固体用纯化水洗净,并经冻干、辐照后得到鱼源胶原蛋白海绵。
对比例3.1:本对比例考察在不制备B液情况下鱼源胶原蛋白海绵对炎症因子的影响。除去不制备B液外,其余工艺流程与实施例3相同。
免疫调节活性评价使用鱼源胶原蛋白海绵在常温环境(25±3℃)条件下的降解液为原料,指标选用脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞分泌的肿瘤坏死因子α(TNF-α),以海绵降解液对TNF-α水平的影响进行表征,表征结果如表3所示,具体的试验方法详见附录B。从表3可知,含有B液组分的胶原蛋白海绵降解液具有一定的TNF-α抑制作用,即表明实施例3制得的海绵有免疫调节功能。对比例3.1对TNF-α抑制作用弱,其抑制作用可能来源于降解胶原蛋白的肽段。
表3 鱼胶原蛋白海绵对TNF-α水平的影响
实施例4:
本实施例选择上述实施例的一优选方案进行动物实验。
试验选取雄性成年大鼠,术前1天禁食、不禁水,共分三组:试验组(本发明海绵)、对照组1(医用胶原蛋白海绵)、对照组2(无菌医用纱布)。将大鼠用 3%戊巴比妥钠 30mg/kg经腹腔注射麻醉,俯卧位固定于解剖台上,剪去大鼠腹部毛发,碘伏消毒液消毒,铺巾。正中切口,用无菌纱布吸干腹腔、腹壁上的组织液和血液,将肝脏置于腹腔外,用手术刀在肝尖处形成创口。用镊子将尺寸为 1 cm×0.2 cm×0.5 cm 的样品材料植入到肝脏创口内部,使得植入材料被肝脏组织完全包裹。随后再将尺寸为 2 cm×1 cm×0.5 cm的样品材料敷在肝脏切口表面并轻压止血,开始记录时间,待外敷样品能较好黏附在切口后,不再按压,以不再出血渗血为止血标准,计录止血时间,计算术中总的出血量。出血量计算方式如下:
L出血量=(L3+L4)-(L1+L2)
该公式中,L1:止血前样品的重量;L2:干纱布的重量;L3:止血后样品的重量;L4:擦拭血液干纱布的重量。
经测试,止血时间和出血量如表4所示。从表中可知,本发明制得的胶原蛋白海绵止血时间短,失血量少。
表4 各组大鼠肝脏止血时间和失血量的对比
组别 | 止血时间(s) | 失血量(g) |
试验组 | 75.4±22.1 | 1.08±0.58 |
对照组1 | 92.8±19.4 | 1.32±0.62 |
对照组2 | 141.2±25.2 | 1.71±0.41 |
实施例5:
本实施例为对上述一优选方案制备的海洋源胶原蛋白进行理化表征。
色氨酸检测方法参考YY/T 0954中的附录E进行检测;胶原蛋白纯度检测方法参考YY/T 1453的附录A进行检测;灰分检测方法参考《中华人民共和国药典》(2020年版)中0841炽灼残渣检查法进行检测;重金属检测方法参考《中华人民共和国药典》(2020年版)0821重金属检查法进行检测。最终检测结果如下:
表5 海洋源胶原蛋白表征结果
检测项目 | 要求 | 检测结果 |
杂蛋白 | ≤1% | 合格 |
色氨酸 | 不含色氨酸 | 合格 |
胶原蛋白含量 | ≥90% | 98.2±1.1% |
灰分 | ≤1% | 0.18±0.05% |
重金属含量 | ≤10μg/g | 合格 |
实施例6:
本实施例考察在本发明所述的方法下,离子处理工艺对胶原蛋白膜力学性能的影响。
取罗非鱼鱼皮胶原溶于0.1%的盐酸溶液,配置胶原浓度为1.3%的A液。另取该胶原溶于水中,配置胶原浓度为0.8%的B液。在4℃环境下,向A液加入盐离子,盐离子类型和浓度如表6所示。加盐后将A液搅拌均匀并置于4℃下静置30 h。用均质机混匀B液,以2500 U/mg的酶与底物比向其加入木瓜蛋白酶,调节B液pH至7.0,置于55℃水浴下酶解4 h。将酶解液煮沸5 min后过滤,随后用3000 Da超滤膜包进行超滤,收集滤出液在15℃恒温60 min。将A液与滤出液以10:1的体积比混合,并用NaOH调节混合液的pH至6.0。把混合液倒入平板盒中自然风干。风干的膜片随后在4℃下用交联剂浸泡24 h,交联剂浓度为0.1%,其溶质为戊二醛,溶剂为3% 的(NH4)2SO4。交联后的膜片用纯化水洗净,并经冻干、辐照后得到鱼源胶原蛋白膜。采用万能力学实验机对胶原蛋白膜的力学性能进行检测,结果如表6所示。
表6 离子处理工艺对鱼源胶原蛋白膜抗拉强度的影响
根据本发明包括离子处理的方法获得令人满意的胶原蛋白膜的力学性能如抗拉强度。
Claims (10)
1.一种胶原蛋白-基材料,其具有吸水率为自身质量的至少60倍。
2.根据权利要求1所述的胶原蛋白-基材料,其具有下述特性的一种或多种:
- 平均孔径大小为50~250 μm,优选60~200 μm,更优选80~120 μm;
- 吸水率为自身质量的至少65倍,优选至少70倍,更优选至少80倍;
- 孔隙率为85~99%,优选90~98%,更优选92~96%;
- 任选地具有至少二种类型表面,其中一种表面为粗糙表面,其中一种表面为光滑表面;
- 具有5.0至30.0 MPa的断裂强力,优选10.0至25.0 MPa ,更优选15.0至20 MPa。
3.根据前述权利要求任一项所述的胶原蛋白-基材料,其特征在于:
- 抗炎活性,炎症因子TNF-α的抑制率为15~80%,优选20~60%,更优选23~40%;
- 在大鼠肝脏创面的止血时间为35~120s,优选40~100 s,更优选53.3~97.5 s;
- 出血量为0.20~3g,优选0.3~2g,更优选0.50~1.66 g。
4.根据前述权利要求任一项所述的胶原蛋白-基材料,其特征在于,所述胶原蛋白-基材料为胶原蛋白海绵或膜。
5.一种制备胶原蛋白-基材料的方法,特别地制备根据前述权利要求任一项所述的胶原蛋白-基材料,包括以下步骤:
(a)提供第一胶原液的步骤,其中将原料胶原形成胶原液并然后经由离子处理形成第一胶原液;
(b)提供第二胶原液的步骤,其中将原料胶原液加入一种或多种蛋白酶处理形成第二胶原液;
(c)提供第三胶原液的步骤,其中将第一胶原液与第二胶原液混合;
(d)交联步骤,其中将第一胶原液与第二胶原液混合后的第三胶原液进行交联,
(e)任选地后处理步骤。
6.根据权利要求5所述的方法,其中步骤(a)包括:将原料胶原的一部分溶于酸溶液形成A液,向该A液中加入盐离子物质,任选地搅拌均匀并静置,形成第一胶原液。
7.根据权利要求5或6所述的方法,其中步骤(a)中,离子处理包括:所述盐离子物质在低温情况下被加入所述A液中。
8.根据权利要求5-7任一项所述的方法,其中步骤(a)中,离子处理的温度为1-10℃,优选2~8℃,更优选3-6℃。
9.产品,其包含根据前述权利要求1-4任一项所述的胶原蛋白-基材料和由根据前述权利要求5-28任一项所述的方法获得的胶原蛋白-基材料。
10.根据前述权利要求1-4任一项所述的胶原蛋白-基材料或由根据前述权利要求5-8任一项所述的方法获得的胶原蛋白-基材料或前述权利要求9的产品在制备用于皮肤屏障修复、伤口护理的产品中的应用,例如但不限于伤口处理如止血、注射填充和激光治疗的术后护理、烫伤伤口护理中的应用。
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