CN105169461A - 一种具有生物活性的高纯度胶原蛋白海绵及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种具有生物活性的高纯度胶原蛋白海绵及其制备方法，通过将动物跟腱采用特殊的酶解、自组装、凝胶层析、透析等纯化过程制得纯度大于99%的高纯度胶原蛋白，再通过特殊的冷冻干燥程序制备出的胶原蛋白海绵。本发明提供的一种具有生物活性的高纯度胶原蛋白海绵及其制备方法，制备的胶原蛋白海绵具有完整的二次自组装三螺旋结构，表面平整细腻，质地柔软，可用于自然腔道填充，可用于创面快速止血，可有效快速止血，防止创面血液渗出，低免疫原性，使胶原蛋白海绵的安全性得到更好的保障。
Description
技术领域
本发明属于医学生物材料技术领域，涉及一种具有生物活性的高纯度胶原蛋白海绵及其制备方法，具体涉及一种在动物跟腱中具有生物活性的高纯度胶原蛋白海绵及其制备方法。
背景技术
胶原蛋白是一种细胞外蛋白质，它是由3条肽链拧成螺旋形的纤维状蛋白质，胶原蛋白是人体内含量最丰富的蛋白质，占全身总蛋白质的30％以上。存在于几乎所有组织中，是一种细胞外基质蛋白，以不溶纤维形式存在，具高度抗张能力，对动物和人体皮肤、血管、骨、软骨的形成十分重要，是结缔组织的重要物质，是决定结缔组织韧性的主要因素，胶原蛋白也是细胞外基质中最重要的组成部分。
胶原蛋白和其他蛋白一样也是由氨基酸组成的，但在其组成中甘氨酸几乎占到了1/3，并且脯氨酸和羟脯氨酸是各类蛋白质中最高的，正因为氨基酸的组成特点，胶原蛋白在空间中以稳定的三螺旋结构存在。胶原蛋白具有诸多优异的生物学性质，如低免疫性：胶原分子结构中的重复性单元大，免疫原性非常低，对机体无排异反应，亲和性好，一般生物机体不会对其产生慢性的排斥现象。
其中，胶原蛋白海绵为白色海绵状固体，是胶原蛋白的一种。作为常用的医疗耗材，具有充当填充物，快速止血，防止粘连，加速伤口愈合等功效，减少术后并发症，在医疗上用途广泛。其主要利用了胶原特殊的四级结构，从而使血小板活化、释放出颗粒成分，迅速凝血，在正常血液循环中，血小板并不与内皮细胞表面或其他细胞发生作用，而是沿着毛细血管内壁排列，维持其完整性，血管局部受损时，血小板的止血兼有机械性堵塞伤口和化学性粘附聚集作用。首先，血小板迅速粘附于暴露的胶原纤维(血小板膜上的糖蛋白GPⅡb-Ⅲa，由vWF介导与胶原结合)，此时血小板被激活，血小板形态发生改变，由正常的圆盘状态变为圆球形，伪足突起，血小板发生聚集(血小板膜上的糖蛋白GPⅡb-Ⅲa由胶原介导发生相互粘附聚集)，此为血小板第一相聚集，促进血小板聚集的主要物质是胶原、损伤内皮细胞的二磷酸腺苷和已形成的微量凝血酶；血小板的二磷酸腺苷可加速血小板的聚集、变性，成为不可逆的第二相聚集，形成白色血栓，构成初步的止血屏障。
同时，胶原激活人体内源性凝血途径：当血管发生损伤，皮下组织暴露，Ⅻ因子与带负电荷的皮下胶原接触就被激活为Ⅻa，少量Ⅻa与HMWK可使PK转变为激肽释放酶，后者又可与HMWK一起迅速激活大量Ⅻa，Ⅻa又同时激活因子Ⅵ，因子Ⅵ与Ca2+、因子Ⅷ共同形成复合体，从而激活因子Ⅹ为Ⅹa，继而在Ca2+参与下激活凝血酶原为凝血酶，凝血酶激活纤维蛋白原为纤维蛋白，然后凝固形成血栓，达到止血效果。
但是，由于从不同组织中分离纯化得到的胶原蛋白在纯度、理化性质和胶原蛋白构型方面有显著的差异，其吸水速率慢，吸水倍率低，力学强度低，生物活性差。因此本发明选择生物体内含量最为丰富的动物跟腱作为原材料，同时，针对原料中的可能存在的危险因素在生产过程进行控制，以便获得具有生物活性的高纯度胶原蛋白海绵。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种具有生物活性的胶原蛋白海绵及其制备方法，用于解决现有技术中缺乏高纯度、生物活性结构、生物相容性良好、表面平整细腻、质地柔软、富有弹性等特点的胶原蛋白海绵的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种具有生物活性的胶原蛋白海绵的制备方法，包括以下步骤：
1)取动物跟腱，清洗、冰冻切片后除脂、清洗，备用；
优选地，所述动物跟腱为牛、马、羊、猪等动物的跟腱。更优选地，所述动物跟腱为牛或马的跟腱。
优选地，所述动物跟腱要剔除筋膜。所述剔除筋膜目的在于初步除去脂肪和其他杂蛋白。
优选地，所述冰冻为成束整装冰冻。
所述成束整装是将剔除筋膜并用水清洗后的动物跟腱按顺序并排在一起，捆成束处理。
更优选地，所述冰冻在低温冰箱中进行。所述低温冰箱为医学生物领域中常规使用的低温冰箱。
更优选地，所述冰冻的条件为：冰冻温度：-20至-40℃；冰冻时间≥12h；所述动物跟腱避免反复冻融。
优选地，所述切片采用切片机将冻好的跟腱束切成薄片。所述切片机为医学生物领域中常规使用的切片机。
更优选地，所述薄片的厚度为0.5-5mm。所述薄片切片时只管厚度，体积由牛筋本身形状决定。
优选地，所述除脂是将跟腱片用除脂液浸泡后再用水清洗。
更优选地，所述除脂液为碳酸氢钠与乙醇水溶液的混合液。所述除脂液能够去除跟腱片上的脂肪。
最优选地，所述除脂液中所含碳酸氢钠的终浓度为0.5-5％(m/V)，所含乙醇的终浓度为70-90％(V/V)。所述终浓度是指溶液中溶质的最后浓度。
更优选地，所述除脂液浸泡条件为：浸泡次数：2-5次；浸泡时间：15-30min。
更优选地，所述跟腱片与除脂液加入的质液比为1：10-25(g/mL)。
2)取步骤1)的跟腱片，分散于水中，再加入胰蛋白酶处理并清洗；
优选地，所述含跟腱片的水的pH值调整为8.0-8.5。所述pH值调整采用碱液调整。所述碱液为氨水或氢氧化钠水溶液。
优选地，所述跟腱片与水溶液的质液比为1：10-100(g/mL)。
优选地，所述胰蛋白酶与水加入的质液比为25-250：100000(g/mL)。即所述胰蛋白酶加入到水中，形成胰蛋白酶水溶液的浓度为0.025-0.25％(m/v)。
优选地，所述胰蛋白酶处理条件为：反应温度：35-40℃，优选为37℃；反应时间：0.5-2h。所述跟腱片与胰蛋白酶反应，能够去除跟腱片中的部分杂蛋白。
优选地，上述步骤1)或2)中，所述清洗均为用水清洗。所述用水清洗时，使跟腱片的pH值与纯化水的pH值接近，调整pH值至7，为中性。
更优选地，所述用水清洗条件为：清洗时间：3-10min，次数：2-5次。
3)取步骤2)的跟腱片加酸浸泡后分散，再在分散液中加入胃蛋白酶，反应后收集酶解液；
优选地，所述跟腱片与酸加入的质液比为1：50-150(g/mL)。
优选地，所述酸选自乙酸、盐酸中的任意一种。所述酸为pH＝2-4的稀酸水溶液。
更优选地，所述乙酸(醋酸)水溶液的摩尔浓度为0.1-1M；所述盐酸水溶液的摩尔浓度为0.01-0.1M。
优选地，所述酸浸泡时间为0.5-4h。所述酸浸泡能够使跟腱片充分溶胀。
优选地，所述分散是将跟腱片与酸充分混合均匀。从而使成团的跟腱片均匀的分散在稀酸溶液中，便于在提取时更充分更均匀的反应。
优选地，所述分散采用组织捣碎机进行。所述组织捣碎机为医学生物领域中常规使用的组织捣碎机。
优选地，所述跟腱片与胃蛋白酶加入的质量之比为20-200：1。更优选的，所述跟腱片与胃蛋白酶加入的质量之比为50-150：1。
优选地，所述酶溶解的条件为：反应温度：0-20℃；反应时间：24-96h；搅拌周期：每隔1h搅拌5-15min；搅拌速率：50～100rpm/min。
更优选地，所述搅拌周期为每隔1h搅拌10min。
优选地，所述收集酶解液采用离心收集上清液或压滤收集滤液的方式收集。
更优选地，所述离心收集上清液的条件：离心力：5000-10000g；离心时间：10-60min；离心温度：2-8℃。
更优选地，所述压滤收集滤液的条件：压力：0.1-0.5MPa；滤网目数：40-200目。所述压滤收集滤液采用压滤器进行。
4)在步骤3)中获得的酶解液中加入硫酸钠水溶液，搅拌后静置，取沉淀产物离心后收集沉淀物A；
优选地，所述硫酸钠水溶液的浓度为15％-20％(m/V)。更优选地，所述硫酸钠水溶液的浓度为20％(m/V)。
优选地，所述硫酸钠水溶液与酶解液加入的体积之比为1：1-4。
优选地，所述搅拌条件为：搅拌时间为1-10min；搅拌器转速：1～10rpm/min。所述搅拌为轻微搅拌。
优选地，所述静置时间为12-24h。所述静置能够使反应液充分完成自组装。
优选地，所述离心的条件为：离心力：1000-5000g；离心时间：5-30min；离心温度：2-8℃。
5)取步骤4)中获得的沉淀物A，加水重溶并调节pH，静置，将再次沉淀产物重复进行离心清洗后收集沉淀物B；
优选地，所述加水重溶是指加入水使沉淀物A重新溶解。
更优选地，所述沉淀物A与水加入的质量之比为：1：1-5。
优选地，所述调节pH是通过滴加碱液进行。所述碱液优选为氨水或氢氧化钠水溶液。所述加水重溶并调节pH，能够使沉淀物二次自组装。
优选地，所述pH值控制在6-7之间。
优选地，所述静置时间为12-24h。
优选地，所述再次沉淀产物的离心清洗，包括以下步骤：
A)将再次沉淀产物进行离心后收集沉淀，用水清洗后，静置，再离心后收集沉淀；
更优选地，所述离心的条件为：离心力：1000-5000g；离心时间：5-30min；离心温度：2-8℃。
更优选地，所述水洗条件为：用量：跟腱与水的质量之比为1：10-50；清洗时间：10-20min。
更优选地，所述静置时间为5-15min。
B)重复进行步骤A)后，收集获得沉淀物B。
更优选地，所述重复次数为2-5次。所述中和产物的离心清洗能够洗去反应沉淀物上的多余盐分。
6)将步骤5)中获得的沉淀物B，加酸溶解后纯化，纯化完成后收集液体；
优选地，所述酸为弱酸稀溶液。
更优选地，所述弱酸稀溶液为乙酸(醋酸)水溶液，其摩尔浓度为0.01-0.3M。
优选地，所述沉淀物B加酸溶解后溶液的浓度为1-10mg/mL。
优选地，所述纯化采用Akata蛋白纯化系统，在Superdex-200凝胶柱中纯化。所述Akata蛋白纯化系统及Superdex-200凝胶柱均为GE公司生产的商业化设备。
优选地，所述纯化时，收集管数为29-39的纯化胶原蛋白液。
7)将6)中收集到的纯化后胶原蛋白液体进行透析，透析后脱水浓缩，获得胶原原液，再将胶原原液进行冷冻干燥，即得胶原蛋白海绵。
优选地，所述透析在透析袋中进行。
优选地，所述透析依次分别采用透析外液、纯化水进行透析。
更优选地，所述透析外液为磷酸氢二钠水溶液。
最优选地，所述磷酸氢二钠水溶液的浓度为0.001-0.01M。
更优选地，所述透析条件为：透析温度：2-8℃；透析外液的透析次数：1次；透析外液的一次透析时间：12-24h；纯化水的透析次数：2-5次；纯化水的一次透析时间：3-9h。
所述透析过后溶液的pH值与纯化水的pH值接近，为中性。
优选地，所述脱水浓缩的条件为：透析外液：分子量十万以上的聚乙二醇水溶液；透析外液浓度：0.1-10％(m/V)；脱水浓缩时间：12-20h；浓缩后胶原蛋白液体的浓度：5-20mg/mL。
更优选地，所述脱水浓缩的条件为：透析外液：分子量十万以上的聚乙二醇水溶液；透析外液浓度：1-5％(m/V)；脱水浓缩时间：12-20h；浓缩后胶原蛋白液体的浓度：8-16mg/mL。
所述脱水浓缩采用透析方式，由于聚乙二醇水溶液对水具有吸附作用，通过采用分子量十万以上的聚乙二醇溶液为透析外液，对透析后的胶原蛋白液体进一步透析，脱水浓缩，当脱水使透析袋中胶原蛋白液体浓缩达到一定浓度时，停止透析，即得胶原原液。
浓缩后所述胶原蛋白液体的浓度采用药典2010年版二部附录ⅦM中《蛋白质含量测定法第三法：双缩脲法测定蛋白浓度》进行测定。
优选地，所述胶原原液要倒入不锈钢盘中，进行冷冻干燥。
优选地，所述冷冻干燥采用冻干机冻干方式进行。所述冻干机为医学生物领域中常规使用的冻干机。
更优选地，所述冻干机冻干方式的条件为：预冻温度：-45±5℃；预冻时间：4-12h；冷冻干燥时间：24-72h。最优选地，所述预冻温度为-45℃。
优选地，上述用水均为纯化水。所述纯化水为药典中记载的饮用水经蒸馏法、离子交换法、反渗透法或其他适宜的方法制得的供药用的水，不含任何添加剂。
优选地，所述胶原蛋白海绵制得后，还要进行包装、灭菌。
更优选地，所述灭菌采用Co60辐射灭菌。
本发明第二方面提供一种采用上述方法制备的具有生物活性的高纯度胶原蛋白海绵。
优选地，所述胶原蛋白海绵的厚度为1-10mm。所述胶原蛋白海绵的厚度有助于海绵外观形态的美化。
更优选地，所述胶原蛋白海绵的厚度为2-5mm。
优选地，所述胶原蛋白海绵具有生物活性和三螺旋结构，其纯度＞99％，孔径为50-350μm，孔隙率＞90％。
本发明第三方面提供一种具有生物活性的胶原蛋白海绵的制备方法在制备从动物跟腱中获得具有生物活性的高纯度胶原蛋白海绵的用途。
如上所述，本发明的一种具有生物活性的胶原蛋白海绵及其制备方法，通过将动物跟腱采用特殊的酶解、自组装、凝胶层析、透析等纯化过程制得纯度大于99％的高纯度胶原蛋白，再通过特殊的冷冻干燥程序制备出的胶原蛋白海绵，具有以下优益效果：
(1)本发明中制备的胶原蛋白海绵，纯度高，通过二次自组装三螺旋结构保持完整，分子完整性好。
(2)本发明中制备的胶原蛋白海绵，表面平整细腻，孔径大小均匀，质地柔软，富有弹性，可弯折，空隙率高，更有利于液体吸收，吸水倍率高，可用于自然腔道填充。
(3)本发明中制备的胶原蛋白海绵，可生物降解、具有良好的细胞适应性，促进细胞增殖和促进血凝等特点，可用于创面快速止血，可有效快速止血，防止创面血液渗出。同时，该胶原蛋白海绵具有促进成纤维细胞活性和各种生长因子活性的特点，良好的降解性能可作为创面细胞和组织的生长支架，使止血后的创面更好的修复。
(4)本发明中制备的胶原蛋白海绵，具有低免疫原性、具有良好生物活性及相容性，通过制造过程中的特殊工序，降低免疫原性，使胶原蛋白海绵的安全性得到更好的保障。
附图说明
图1显示为本发明中胶原蛋白凝胶层析图。
图2显示为本发明中胶原蛋白提取过程中产物的SDS-PAGE电泳图。
图3显示为本发明实施例中胶原蛋白的SDS-PAGE电泳图。
图4显示为本发明中胶原蛋白海绵的表面外观示意图。
图5显示为本发明中胶原蛋白海绵的扫描电镜图(200倍)。
图6显示为本发明中胶原蛋白海绵的透射电镜图。
图7显示为本发明中胶原蛋白海绵的细胞毒性试验结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987andperiodicupdates；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，SanDiego，1999；和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。
本发明中使用的仪器装置及其试剂均为常规使用的仪器装置及试剂，均可从市场上购买获得。
实施例1
取18～24月龄新鲜牛跟腱，剔除筋膜，用纯化水冲洗3次，每次4min，然后成束整装冰冻，冰冻在低温冰箱中进行，冰冻温度为-20至-40℃，冰冻时间≥12h，并避免反复冻融。用切片机将冻好的跟腱束切成0.5mm的薄片。称取牛跟腱薄片40g，用1％(m/V)碳酸氢钠的75％(V/V)乙醇水溶液作为除脂液浸泡3次，浸泡时间为20min后除去脂肪，纯化水冲洗3次，时间4min至pH与纯化水接近为中性。
取上述经处理的跟腱片分散于2L纯化水中，调整pH为8.0，加入终浓度为0.1％的胰蛋白酶，在37℃的反应温度中反应2h，纯化水冲洗3次，时间4min至pH与纯化水接近为中性。
然后加入0.5M醋酸溶液2000mL浸泡，溶胀30min后，采用组织捣碎机分散，加入胃蛋白酶2g，在16℃条件下酶解72h，期间每隔1h搅拌器搅拌10min。反应完成后采用压滤器压滤，条件为：压力0.2MPa，筛网为120目，收集滤液。
配制20％硫酸钠500mL，加入上述滤液，缓慢搅拌5min，静置16h后收集沉淀，并将沉淀物在4℃离心力为5000g下离心10min，收集沉淀物A。
再加水重溶沉淀物A，沉淀物A与水加入的质量之比为1：5，完全溶解后缓慢滴加氨水溶液，调节pH至6.5，静置16h后，将自组装后的产物4℃下离心10min，离心力为5000g，收集沉淀加纯化水清洗10-20min后，静置10min，在离心力为5000g、4℃条件下离心收集沉淀物B，重复3次。
将清洗后的沉淀物B中加入0.05M醋酸水溶液，配制成2mg/mL的溶液，在Akata蛋白纯化系统，Superdex-200凝胶柱中纯化，纯化完成后收集液体。
将收集的纯化产物装入透析袋中，放入0.01M磷酸氢二钠溶液透析16h后，更换透析外液为纯化水，每隔4h换水一次，直至透析袋中原液pH与纯化水pH接近为中性。透析完成后，将透析外液换为2％聚乙二醇水溶液(分子量为十万)，透析12h脱水浓缩，测定透析袋中胶原蛋白浓度，调节胶原原液浓度为10mg/mL。
将原液倒入316L不锈钢盘中铺平，开启冻干机预冻将冻干盘转移至冻干机中，并开始冻干程序进行冻干，其中，预冻温度为-45℃，预冻时间为8h；冷冻干燥时间为48h。得到胶原蛋白海绵样品1#，其厚度为2-5mm。
制备过程中的相关数据图表如下：胶原蛋白溶液进行层析纯化，见图1，由图1显示收集峰值蛋白获得纯化胶原蛋白的过程。将胶原蛋白提取步骤中的样品进行SDS-PAGE电泳检测，具体结果见图2，由图2可知胶原蛋白在提取过程纯度不断提高。将胶原蛋白进行凝胶电泳检测，具体结果见图3，由图3可知本发明提取的胶原蛋白纯度非常高，其纯度＞99％。由图4可知，胶原蛋白海绵表面平整细腻，孔径大小均匀，质地柔软，富有弹性，可弯折180°。将胶原蛋白海绵样品1#进行扫描电镜测试，具体结果见图5，由图5可知胶原蛋白海绵孔径大小较为均匀，孔径为50-350μm，孔隙率高。胶原蛋白海绵样品1#进行透射电镜测试，具体结果见图6，由图6可知胶原蛋白具有周期性横纹结构，具有生物活性。将胶原蛋白海绵样品1#进行细胞毒性试验，具体结果见图7，由图7可知胶原蛋白海绵无细胞毒性。由上述图表数据可知，本发明中制备方法制备的胶原蛋白海绵具有优异的性能。
实施例2
取18～24月龄新鲜牛跟腱，剔除筋膜，纯化水冲洗5次，时间5min，然后成束整装冰冻，冰冻在低温冰箱中进行，冰冻温度为-20至-40℃，冰冻时间为12h，并避免反复冻融。用切片机将冻好的跟腱束切成0.5mm的薄片，称取牛跟腱40g，用1％(m/V)碳酸氢钠的75％(V/V)乙醇水溶液作为除脂液浸泡5次，浸泡时间为30min后除去脂肪，纯化水冲洗5次，每次5min至pH与纯化水接近为中性。
取上述经处理的跟腱片分散于1L纯化水中，调整pH至8.2，加入终浓度为0.1％的胰蛋白酶，在40℃的反应温度中反应2h，纯化水冲洗5次，每次5min至pH与纯化水接近为中性。
然后加入0.01M盐酸溶液2000mL浸泡，溶胀30min后，采用组织捣碎机分散，加入胃蛋白酶2g，在16℃条件下酶解72h，期间每隔1h搅拌器搅拌10min。反应完成后采用离心机在4℃离心力为5000g下10min，收集滤液。
配制20％硫酸钠500mL，加入上述滤液，缓慢搅拌5min，静置16h后收集沉淀，并将沉淀物在4℃下10min，离心力为5000g，收集沉淀物A。
加水重溶沉淀，沉淀物A与水加入的质量之比为1：1，完全溶解后缓慢滴加氢氧化钠水溶液，调节pH至6.5，静置16h后，将自助装后的产物4℃离心力为5000g下离心10min，收集沉淀加纯化水清洗10-20min后，静置10min，在离心力为5000g、4℃条件下离心收集沉淀物B，重复3次。
将清洗后的沉淀物B中加入0.05M醋酸水溶液进行溶解，配制成2mg/mL的溶液，在Akata蛋白纯化系统，Superdex-200凝胶柱中纯化，纯化完成后收集液体。
将收集的纯化产物装入透析袋中，放入0.01M磷酸氢二钠溶液透析16h后，更换透析外液为纯化水，每隔4h换水一次，直至透析袋中原液pH与纯化水pH接近为中性。透析完成后，将透析外液换为2％聚乙二醇水溶液(分子量为十万)，透析12h脱水浓缩，测定透析袋中胶原蛋白浓度，调节胶原原液浓度为10mg/mL。
将原液倒入316L不锈钢盘中铺平，开启冻干机将冻干盘转移至冻干机中，并开始冻干程序进行冻干，其中，预冻温度为-45℃，预冻时间为10h；冷冻干燥时间为72h。得到胶原蛋白海绵样品2#，其厚度为2-5mm。
获得的胶原蛋白海绵样品2#具有生物活性、无细胞毒性、纯度高、表面平整细腻，孔径大小均匀，质地柔软，富有弹性等优异性能。
实施例3
取18～24月龄新鲜牛跟腱，剔除筋膜，纯化水冲洗4次，时间3min，然后成束整装冰冻，冰冻在低温冰箱中进行，冰冻温度为-20至-40℃，冰冻时间为15h，并避免反复冻融。用切片机将冻好的跟腱束切成5mm的薄片，称取牛跟腱40g，用5％(m/V)碳酸氢钠的90％(V/V)乙醇水溶液作为除脂液浸泡2次，浸泡时间为15min后除去脂肪，纯化水冲洗4次，每次10min至pH与纯化水接近为中性。
取上述经处理的跟腱片分散于400mL纯化水中，调整pH为8.5，加入终浓度为0.025％的胰蛋白酶，在40℃的反应温度中反应2h，纯化水冲洗4次，每次10min至pH与纯化水接近为中性。
然后加入0.01M盐酸溶液6000mL浸泡，溶胀4h后，采用组织捣碎机分散，加入胃蛋白酶0.2g，在20℃条件下酶解96h，期间每隔1h搅拌器搅拌15min。反应完成后采用离心机在2℃离心力为10000g下60min，收集滤液。
配制15％硫酸钠500mL，加入上述滤液，缓慢搅拌10min，静置24h后收集沉淀，并将沉淀物在8℃离心力为1000g下30min，收集沉淀物A。
加水重溶沉淀，沉淀物A与水加入的质量之比为1：3，完全溶解后缓慢滴加氢氧化钠水溶液，调节pH至6.5，静置24h后，将自助装后的产物6℃离心力为3000g下离心20min，收集沉淀加纯化水清洗10-20min后，静置15min，在离心力为3000g、6℃条件下离心收集沉淀物B，重复3次。
将清洗后的沉淀物B中加入0.3M醋酸水溶液进行溶解，配制成5mg/mL的溶液，在Akata蛋白纯化系统，Superdex-200凝胶柱中纯化，纯化完成后收集液体。
将收集的纯化产物装入透析袋中，放入0.001M磷酸氢二钠溶液透析24h后，更换透析外液为纯化水，每隔6h换水一次，直至透析袋中原液pH与纯化水pH接近为中性。透析完成后，将透析外液换为1％聚乙二醇水溶液(分子量为十万)，透析20h脱水浓缩，测定透析袋中胶原蛋白浓度，调节胶原原液浓度为15mg/mL。
将原液倒入316L不锈钢盘中铺平，开启冻干机将冻干盘转移至冻干机中，并开始冻干程序进行冻干，其中，预冻温度为-50℃，预冻时间为12h；冷冻干燥时间为48h。得到胶原蛋白海绵样品3#，其厚度为1-10mm。
获得的胶原蛋白海绵样品3#具有生物活性、无细胞毒性、纯度高、表面平整细腻，孔径大小均匀，质地柔软，富有弹性等优异性能。
对比例1
按照现有常规方法制备胶原蛋白海绵样品1*，具体步骤如下：将新鲜牛跟腱去脂肪、筋膜，切成片，生理盐水反复浸泡清洗，去除血清和脂肪，再用纯化水漂洗3次
将40g跟腱加入2000mL0.5M的醋酸水溶液中，加入胃蛋白酶1g，在室温条件下酶解72h，期间每天用搅拌器搅拌一次，每次30min。反应完成后采用离心机在4℃下4000g离心10min，收集滤液。
将收集的滤液倒入500mL饱和氯化钠溶液中，搅动10min，静置16h，并将沉淀物在4℃离心力为5000g下离心10min，收集沉淀。
将沉淀装入透析袋中，置于0.05M醋酸溶液中透析48h，透析袋中为凝胶状时换0.01M醋酸溶液中透析48h，然后换纯化水透析108h，至pH与水接近为中性。
将原液倒入316L不锈钢盘中铺平，放入冻干机进行冻干，其中，预冻温度为-30℃，预冻时间为8h；冷冻干燥时间为48h。得到胶原蛋白海绵样品1*。
实施例4
将实施例1-2与对比例1中提取获得的胶原蛋白海绵样品进行相关性能测试，具体数据见表1。
表1胶原蛋白海绵的性能比较
| 性能指标 | 标准值 | 样品1# | 样品2# | 样品1* |
| 纯度 | 90.0％ | 99.6％ | 99.6％ | 95.1％ |
| 吸水力 | ≥20倍 | 60倍 | 62倍 | 45倍 |
| pH | 4.0-7.0 | 5.95 | 5.89 | 5.05 |
| 脂质体 | ≤1％ | 0.2％ | 0.2％ | 1.2％ |
| 孔隙率 | ＞90％ | 97.9％ | 98.4％ | 92.1％ |
| 拉伸性能 | ＞0.5N | 0.8565N | 0.8847N | 0.5233N |
由表1中数据可知，本发明中制备方法制备的胶原蛋白海绵样品，其性能指标不仅优于标准值，也优于对比例中的样品，纯度可以达到99％以上，吸水力强，孔隙率高，拉伸强度高，具有非常好的实用性能。
上述表1中的各项性能指标的具体意义如下：
纯度：按照中国药典2010年版二部附录ⅤF进行测定：经凝胶成像系统(bio-rad)扫描，测定计算胶原蛋白纯度。
吸水力：按照中国药典2010年版二部吸收性明胶海绵中检查吸水力方法进行测试。
pH：按照中国药典2010年版二部附录ⅥHpH值测定法进行测定：取样品0.1g放入烧杯中，加入20mL蒸馏水，于37℃下浸泡24h±1h。
脂质体：取2.0g样品干燥失水后的样品，按照GB/T5009.6规定的方法进行测定，酸水解法测定脂质体含量。
孔隙率：取产品1块，剪成合适大小，精密称重，记为m1，取带有刻度的容器，清洗并干燥后向里加入指定刻度(记为V)的纯化水，称重，记为m2，将称量好的样品放入装有水的容器内，用玻璃棒小心的赶去试样中的气泡，使其吸饱水，注意不使试样破裂，待试样吸饱水后，向容器中加水到指定刻度(V),将容器外周水擦干后称重，记为m3，用镊子夹住试样一角把试样从容器中取出，在容器上方静置1min后，称量容器和剩余水的质量，记为m4。按下式计算。共随机抽取试样5份，以平均值报告孔隙率：
θ＝(m3-m4-m1)/(m2-m4)
式中：θ——试样的孔隙率；m1——试样质量，g；m2——加入指定刻度水后容器和水的质量，g；m3——加水到指定刻度容器、水和试样的质量，g。
拉伸性能：取样品1片，剪成1cm×2cm长的胶原条，用扁平夹子夹住两端，拉力机测定其抗拉性能。
实施例5
将实施例1中的提取获得的胶原蛋白海绵样品1#进行细胞毒性测试，具体数据见表2。
表2：1#样品细胞毒性实验结果
| 样品及稀释比例 | 增值率(％) | 毒性等级 |
| 100％ | 110.3 | 0 |
| 50％ | 105.3 | 0 |
| 25％ | 102.8 | 0 |
| 12.5％ | 103.2 | 0 |
| 阴性 | 99.3 | 1 |
| 阳性 | 20.6 | 4 |
由表2中数据并结合图7可知，本发明中方法制备的胶原蛋白海绵无细胞毒性，安全性得到更好的保障。
所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取动物跟腱，清洗、冰冻切片后除脂、清洗，备用；
2)取步骤1)的跟腱片，分散于水中，再加入胰蛋白酶处理并清洗；
3)取步骤2)的跟腱片加酸浸泡后分散，再在分散液中加入胃蛋白酶，反应后收集酶解液；
4)在步骤3)中获得的酶解液中加入硫酸钠水溶液，搅拌后静置，取沉淀产物离心后收集沉淀物A；
5)取步骤4)中获得的沉淀物A，加水重溶并调节pH，静置，将再次沉淀产物重复进行离心清洗后收集沉淀物B；
6)将步骤5)中获得的沉淀物B，加酸溶解后纯化，纯化完成后收集液体；
7)将6)中收集到的纯化后胶原蛋白液体进行透析，透析后脱水浓缩，获得胶原原液，再将胶原原液进行冷冻干燥，即得胶原蛋白海绵。
2.根据权利要求1所述的胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述冰冻的条件为：冰冻温度：-20至-40℃，冰冻时间≥12h，所述动物跟腱避免反复冻融；所述除脂是将跟腱片用除脂液浸泡后再用水清洗；所述跟腱片与除脂液加入的质液比为1：10-25。
3.根据权利要求1所述的胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述跟腱片与水溶液的质液比为1：10-100；所述胰蛋白酶与水加入的质液比为25-250：100000；所述胰蛋白酶处理条件为：反应温度：35-40℃，反应时间：0.5-2h。
4.根据权利要求1所述的胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述跟腱片与酸加入的质液比为1：50-150；所述酸选自乙酸、盐酸中的任意一种；所述酸浸泡时间为0.5-4h。
5.根据权利要求1所述的胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述跟腱片与胃蛋白酶加入的质量之比为20-200：1；所述酶溶解的条件为：反应温度：0-20℃，反应时间：24-96h，搅拌周期：每隔1h搅拌5-15min，搅拌速率：50～100rpm/min。
6.根据权利要求1所述的胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于，步骤4)中，所述硫酸钠水溶液与酶解液加入的体积之比为1：1-4；所述搅拌条件为：搅拌时间为1-10min，搅拌器转速：1～10rpm/min；所述静置时间为12-24h。
7.根据权利要求1所述的胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于，步骤6)中，所述酸为弱酸稀溶液；所述纯化采用Akata蛋白纯化系统，在Superdex-200凝胶柱中纯化。
8.根据权利要求1所述的胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于，步骤7)中，所述透析依次分别采用透析外液、纯化水进行透析；所述透析外液为磷酸氢二钠水溶液；所述透析条件为：透析温度：2-8℃，透析外液的透析次数：1次，透析外液的一次透析时间：12-24h，纯化水的透析次数：2-5次，纯化水的一次透析时间：3-9h。
9.根据权利要求1所述的胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于，步骤7)中，所述脱水浓缩的条件为：透析外液：分子量十万以上的聚乙二醇水溶液，透析外液浓度：0.1-10％，脱水浓缩时间：12-20h，浓缩后胶原蛋白液体的浓度：5-20mg/mL；所述冷冻干燥采用冻干机冻干方式进行。
10.一种胶原蛋白海绵，由权利要求1-9任一所述的胶原蛋白海绵的制备方法制得。
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