CN107630059B - 新型自组装胶原蛋白及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了自组装胶原蛋白及其制备方法和用途，其中，自组装胶原蛋白制备方法包括以下步骤：利用胰蛋白酶和碱性蛋白酶对动物源胶原蛋白进行酶解处理，以便获得含有小分子肽的酶解产物；对所述酶解产物进行超滤处理，以便获得胶原蛋白多肽溶液；将所述胶原蛋白多肽溶液与醋酸混合后进行透析处理以便获得所述自组装胶原蛋白，其中，所述透析处理采用磷酸盐缓冲液作为透析外液。该方法采用特定蛋白酶水解胶原蛋白，不仅得到低分子量的胶原多肽溶液，并且可以在肽的末端产生特定的“粘性末端”，通过自组装形成可以在体内起到更好地支撑器官、保护机体作用的胶原纤维。

Description

新型自组装胶原蛋白及制备方法

技术领域

本发明涉及蛋白质工程领域，具体的，本发明涉多肽分子自组装领域，更具体的，本发明涉及自组装胶原蛋白及其制备方法和用途。

背景技术

胶原蛋白是一种动物体内由纤维原细胞合成产生的天然蛋白，是细胞外基质的结构蛋白，又称胶原，广泛存在于动物的骨豁、皮肤、肌腱等结缔组织中，使组织和器官具有良好的机械力学结构，从而起到支撑器官、保护机体的作用。(Gly-X-Y)n重复氨基酸序列单元是构成胶原三螺旋结构的分子基础，其中甘氨酸(Gly)占据三螺旋的轴心位置、脯氨酸和羟脯氨酸分别在X和Y位置上高频出现并对三螺旋的稳定性发挥重要作用。胶原蛋白及其降解产物富含甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、天冬氨酸等天然保湿因子和大量的亲水基团，因而它具有保湿功能。另外，胶原蛋白具有良好的渗透性，能填充在皮肤基质之间且被皮肤吸收，具有修复皮肤和美白的作用，因此胶原及其降解产物胶原肽在美容保健和化妆品中的应用越来越广泛。

由于从组织提取的胶原蛋白分子量比较大，一般为200kDa左右，而分子量大于4kDa的物质很难进入人皮肤的真皮层，导致人体对胶原蛋白的吸收效率低。因此，通过体外蛋白酶的水解作用，生成分子量为1kDa左右的胶原蛋白寡肽，这些小肽能够被皮肤吸收，能促进氨基酸吸收和机体蛋白质的合成。采用特异性酶水解胶原蛋白得到胶原蛋白寡肽，胶原蛋白在水解为多肽时其三螺旋结构遭到破坏，起不到支撑器官、保护机体的作用。

多肽自组装技术是指利用多肽分子在热力学平衡条件下通过非共价键间的相互作用自发形成稳定的聚集态结构。自组装机理是利用多肽分子的非共价键，如分子间的氢键、离子键、盐键等自发形成多肽聚集体。胶原蛋白的自组装过程十分复杂，目前的研究大多数集中在考察胶原蛋白的浓度、自组装时间、溶液pH、电解质、基底等因素对胶原蛋白自组装过程的影响。

因而，对自组装前胶原蛋白样本的制备方法仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够制备具有良好的支撑器官、保护机体等生物功能的自组装胶原蛋白的方法。

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：由于胶原蛋白富含谷氨酸、赖氨酸和天冬氨酸等带电氨基酸，可以通过蛋白酶水解得到末端为特定氨基酸的肽段，比如末端为带正电的谷氨酸和负电的赖氨酸，从而形成“粘性末端”，能够促使胶原蛋白多肽自组装形成胶原纤维。

因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种制备自组装胶原蛋白的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：利用胰蛋白酶和碱性蛋白酶对动物源胶原蛋白进行酶解处理，以便获得含有小分子肽的酶解产物；对所述酶解产物进行超滤处理，以便获得胶原蛋白多肽溶液；将所述胶原蛋白多肽溶液与醋酸混合后进行透析处理以便获得所述自组装胶原蛋白，其中，所述透析处理采用磷酸盐缓冲液作为透析外液。

发明人惊奇的发现，利用本发明的制备自组装胶原蛋白的方法，采用特定蛋白酶水解胶原蛋白，不仅得到低分子量的胶原多肽溶液，并且可以在肽的末端产生特定的“粘性末端”，通过自组装形成胶原纤维。单纯用蛋白酶水解胶原蛋白成为小肽段，能够被人体有效吸收，但是并不能在体内自组装成胶原蛋白，不能更好地起到支撑器官、保护机体的作用。因此，将胶原蛋白用特异性蛋白酶水解使其产生“粘性末端”，并通过自组装形成胶原纤维，从而可以更好地发挥其生物功能。

其中，动物源胶原蛋白可以选自畜类胶原蛋白，例如牛胶原蛋白、猪胶原蛋白或者马胶原蛋白等，还可以选自鱼胶原蛋白。胶原蛋白种类较多，常见类型为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅺ型。Ⅰ型胶原蛋白因其在自然界含量最为丰富被广泛研究，由它制成的生物材料具有生物相容性好，易降解，低毒性以及高结构强度等优点。在本发明的实施例中，主要以I型胶原蛋白为例来描述本发明的方法，但本发明所述方法不限于I型胶原蛋白寡肽的自组装。

另外，根据本发明实施例的制备自组装胶原蛋白的方法还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，所述酶解处理进一步包括：

利用胰蛋白酶进行第一水解处理2～6小时；

利用碱性蛋白酶对所述第一水解处理的产物进行第二水解处理2～6小时；以及

对所述第二水解处理的产物进行离心，并收集上清液，所述上清液构成所述酶解处理产物。由此，水解效率高，特异性好。

根据本发明的实施例，在所述第一水解处理和所述第二水解处理后均包括沸水浴灭酶活的步骤。

根据本发明的一些具体示例，所述动物源胶原蛋白首先用胰蛋白酶水解2～6小时之后，沸水浴将酶灭活，再加碱性蛋白酶继续水解2～6小时，沸水浴灭活，离心，弃沉淀，收集上清液。用胰蛋白酶和碱性蛋白酶对胶原蛋白依次进行水解，水解效率高，特异性好，生产成本低。所述沸水浴灭活指的是将酶解反应管置于沸水浴中20分钟，使碱性蛋白酶和胰蛋白灭活。

根据本发明的实施例，所述酶解产物用截留分子量为1～5kDa的超滤膜进行超滤，优选为，用截留分子量为1kDa的超滤膜进行超滤，适合小分子肽的筛选。

根据本发明的实施例，在步骤(2)中，将所述胶原多肽溶液与0.05～1.0mol/L的醋酸混合，其中，所述胶原多肽的终浓度为0.5～5mg/mL。也即，将所述胶原蛋白多肽溶液用浓度为0.05～1.0mol/L的醋酸充分溶解，配制成胶原多肽终浓度为0.5～5mg/mL的酸溶液，优选为所述胶原蛋白多肽溶液用浓度为0.5mol/L的醋酸充分溶解，配制成胶原多肽终浓度为3mg/mL的酸溶液。

根据本分明的实施例，所述磷酸盐缓冲溶液浓度为50mM、pH为6.5～8.5，优先为pH值为7.0。

依据本发明的另一方面，提供一种自组装胶原蛋白，其利用上述本发明一方面或者任一实施例中的方法制备获得。前述对本发明一方面或者任一实施例的自组装胶原蛋白的制备方法的技术特征和优点的描述，同样适用本发明这一方面的自组装胶原蛋白，在此不再赘述。

本发明的这一方面提供自组装胶原蛋白胶，通过发明人多次调整试验验证确定的方法，包括利用特定的酶水解胶原蛋白，获得特定浓度的胶原蛋白酸溶液，酶解产物经超滤后，用醋酸充分溶解配制成酸溶液，置于透析袋中透析，使能够简单方便的获得该自组装胶原蛋白。

需要说明的是，据发明人所知，利用特定酶水解胶原蛋白后再进行胶原蛋白多肽自组装目前尚未见有相关报道。发明人提供的制备方法通过简单的胶原蛋白酶解后，多肽分子自组装，获得可以在体内起到更好地支撑器官、保护机体作用的自组装胶原蛋白。

依据本发明的又一方面，提供上述本发明一方面的自组装胶原蛋白在制备食品、保健品、美容护肤品以及药品中的用途。自组装胶原蛋白因其具有胶原蛋白的韧度、强度以及热稳定性，同时具有胶原蛋白不具备的易吸收性，以及具有胶原蛋白寡肽不具备的支撑器官和保护机体的特性。其在食品工业、生物医疗以及美容护肤品等领域具有巨大的应用空间。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施方式的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1a显示本发明的一个实施例中的胶原蛋白自组装前SDS-PAGE电泳图；

图1b显示本发明的一个实施例中的胶原蛋白自组装后SDS-PAGE电泳图；

图2a显示本发明的一个实施例中的自组装前胶原蛋白膜的扫描电镜图(SEM)；

图2b显示本发明的一个实施例中的自组装后前胶原蛋白膜的扫描电镜图(SEM)。

具体实施方式

下面具体实施方式是对本发明进行详细说明，下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

以下除另有交待，以下实施例中涉及的未特别交待的试剂及仪器，都可来自常规市售产品。

实施例1

制备自组装胶原蛋白，以制备自组装牛I型胶原蛋白为例。

以5mg/ml牛I型胶原蛋白水溶液为原料，制备自组装胶原蛋白。

(1)胶原蛋白浓度分别按E/S为8000U/g先加入胰蛋白酶(Trypsin)于37℃水解3h后，水解期间用0.1mol/L NaOH调节pH，使反应体系pH维持在恒定值8.0，沸水浴灭酶20min；再加入碱性蛋白酶(Alcalase)继续水解，于55℃水解3h,水解期间用0.1mol/L NaOH调节pH，使反应体系pH维持在恒定值8.5；沸水浴灭酶20min，冷却。最后，5000g/min离心10min，弃沉淀，收集上清。

(2)将步骤(1)所得水解产物用1kDa的超滤膜进行超滤，得到胶原蛋白多肽溶液，置于4℃冰箱备用。

(3)将步骤(2)所得胶原蛋白多肽溶液用0.1mol/L的醋酸充分溶解，配制成2mg/mL的酸溶液，4℃条件透析袋透析12小时，浓度为50mM、pH值为7.0的磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution，PBS)为透析外液，得到自组装牛I型胶原蛋白。

(4)将自组装前胶原多肽溶液与步骤(3)所得自主装后的胶原多肽溶液分别溶于0.5mol/L的醋酸溶液，充分搅拌溶解12h，配制成5mg/mL的膜液。以直径为3.5cm/孔的培养板为模具，加入2ml样品。-20℃冰箱冷冻过夜，在-40℃、1Pa条件下，冻干机真空冷冻干燥24h。干燥后膜样用扫描式电子显微镜(SEM)观察其表面形态结构。

自组装后胶原成膜性较自组装前更好。自组装前胶原膜疏松，孔径较大，而自组装后胶原膜排列更加紧密，孔径变小，更有韧性。

实施例2

制备自组装胶原蛋白，以制备自组装鱼皮I型胶原蛋白为例。

以5mg/ml鱼皮I型胶原蛋白水溶液为原料，制备自组装胶原蛋白。

(1)胶原蛋白浓度分别按E/S为8000U/g先加入胰蛋白酶(Trypsin)于37℃水解6h后，水解期间用0.1mol/L NaOH调节pH，使反应体系pH维持在恒定值8.0，沸水浴灭酶20min；再加入碱性蛋白酶(Alcalase)继续水解，于55℃水解6h,水解期间用0.1mol/L NaOH调节pH，使反应体系pH维持在恒定值8.5；沸水浴灭酶20min，冷却。最后，5000g/min离心10min，弃沉淀，收集上清。

(2)将步骤(1)所得水解产物用3kDa的超滤膜进行超滤，得到胶原蛋白多肽溶液，置于4℃冰箱备用。

(3)将步骤(2)所得胶原蛋白多肽溶液用0.5mol/L的醋酸充分溶解，配制成5mg/mL的酸溶液，4℃条件透析袋透析12小时，浓度为50mM、pH值为7.0的磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution，PBS)为透析外液，得到自组装鱼I型胶原蛋白。

实施例1-2所述方法同样适用于猪胶原蛋白、马胶原蛋白、鱼胶原蛋白等Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅺ型胶原蛋白寡肽自组装，此处不一一赘述。

实施例3对获得的胶原多肽与自组装后的胶原多肽进行电泳分析

选择实施例1获得的胶原多肽溶液与自主装后的胶原多肽溶液进行电泳分析，具体如下：

SDS-PAGE凝胶电泳分析

采用5％的浓缩胶浓度，20％和12％的分离胶浓度的SDS-PAGE凝胶电泳鉴定实施例1获得的自组装前后牛I型胶原多肽。

结果如图1a所示，将胶原蛋白与标样蛋白Maker比较，可以看出水解后的牛胶原多肽分子量变小，大部分集中在6.8kDa左右，图中S表示实施例1中经蛋白酶水解后的牛I型胶原多肽。

结果如图1b所示，胶原多肽自组装后，分子量明显变大，主要集中65—70kDa左右，图中S表示实施例1中自组装牛I型胶原多肽。说明胶原多肽在进行了一定程度的自主装后，重新形成了胶原蛋白的三股螺旋结构，图中M表示Maker，S表示样品。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (12)

1.一种制备自组装胶原蛋白的方法，其特征在于，包括：

（1）利用胰蛋白酶和碱性蛋白酶对动物源胶原蛋白进行酶解处理，以便获得含有小分子肽的酶解产物；

（2）对所述酶解产物进行超滤处理，以便获得胶原蛋白多肽溶液；

（3）将所述胶原蛋白多肽溶液与醋酸混合后进行透析处理以便获得所述自组装胶原蛋白，其中，所述透析处理采用磷酸盐缓冲液作为透析外液；

其中，所述酶解处理包括：

利用胰蛋白酶进行第一水解处理2~6小时；

利用碱性蛋白酶对所述第一水解处理的产物进行第二水解处理2~6小时；以及

对所述第二水解处理的产物进行离心，并收集上清液，所述上清液构成所述酶解处理产物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述动物源胶原蛋白为畜类胶原蛋白或鱼胶原蛋白。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述动物源胶原蛋白为牛胶原蛋白、猪胶原蛋白或马胶原蛋白。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在所述第一水解处理和所述第二水解处理后均包括沸水浴灭酶活的步骤。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解产物用截留分子量为1 ~5 kDa的超滤膜进行超滤。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酶解产物用截留分子量为1kDa的超滤膜进行超滤。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（-3 ）中，将所述胶原多肽溶液与0.05~1.0mol/L的醋酸混合，其中，所述胶原多肽的终浓度为0.5~5 mg/mL。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将所述胶原蛋白多肽溶液与0.5 mol/L的醋酸混合，其中，所述胶原多肽的终浓度为3mg/mL。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为50 mM，pH为6.5~8.5。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为7.0。

11.一种自组装胶原蛋白，所述自组装胶原蛋白是通过权利要求1-10任意一项所述方法制备的。

12.权利要求11所述的自组装胶原蛋白在制备食品、保健品、美容护肤品或者药物中的用途。

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