CN111253481B

CN111253481B - 一种仿生智能水凝胶的制备及应用

Info

Publication number: CN111253481B
Application number: CN202010059780.2A
Authority: CN
Inventors: 刘伟治; 徐平平; 崔海栋
Original assignee: Qingdao Weiliao Medical Biomaterial Co ltd; Ocean University of China
Current assignee: Qingdao Weiliao Medical Biomaterial Co ltd; Ocean University of China
Priority date: 2020-01-19
Filing date: 2020-01-19
Publication date: 2022-03-29
Anticipated expiration: 2040-01-19
Also published as: CN111253481A

Abstract

本发明提供一种可自发形成水凝胶的蛋白片段，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1。本发明所提供的蛋白用于制备水凝胶。本发明所提供的蛋白制备的水凝胶具有成胶时间和力学性能可控，胶的生物相容性好等优异的性能，因此在生物医用材料,药物缓释等领域具有广阔的应用前景。

Description

一种仿生智能水凝胶的制备及应用

技术领域

本发明属于生物医学材料技术领域，具体涉及一种仿生智能水凝胶的制备及应用。

背景技术

水凝胶是一种具有强吸水能力的三维网状结构的胶状材料。水凝胶材料在生物医学领域具有广阔的应用前景，可以作为药物缓释的载体材料，细胞组织工程支架材料和医用修复材料等。根据组成水凝胶材料的来源不同，可以分成(1).基于化学合成高分子材料的水凝胶，如基于聚乳酸，聚乙二醇等材料的水凝胶；这类水凝胶存在生物相容性差的问题；(2).基于壳聚糖等天然生物多糖分子的水凝胶，这类水凝胶存在天然生物多糖分子分子量均一性差，产品质量难以控制的问题；(3).基于胶原，丝蛋白等来源的天然蛋白来源的水凝胶。这类水凝胶往往存在力学性质差的问题；为了弥补上述水凝胶材料的不足，研究人员往往通过尝试共混的方法来制备复合型水凝胶。另一方面，深入研究发现能够对外界环境刺激产生响应的智能型水凝胶在医用生物材料领域具有更加广阔的应用潜力。如对温度具有响应的温敏型水凝胶，对pH环境具有响应的pH-敏感水凝胶等。因此，迫性需要开发新型的智能型、生物相容性良好的水凝胶。

发明内容

本发明的目的是提供一种仿生智能水凝胶的制备及应用，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种可自发形成水凝胶的蛋白片段，其氨基酸序列如下：

SKPSTFSLVQRIYNVKENVGQVQIEVVRSEGSAGSYVVSWQTSDGSAVQKQDYVGTKGSVNFKSEAKSQKFNIKIVNDKEYEPDESFTVSLVSVSAGGSLGAITLATINIANDDAPCGGSCKANEHCDMHSQECVCNTGYKLYKKACVLPCGGPCKQYERCDEGSNKCVCMTGYSLFKGSCVVPCGGPCGPNAYCDKNKNQCNCNKGYFTYHGVCALPCGGPCKQNANCDKNSNQCVCNKGYKEIGGVCAV(SEQ ID NO：1)；

本发明所提提供的可自发形成水凝胶的蛋白片段，还包含有从扇贝中分离的，与上述的蛋白具有不少于90％同源性，可自发形成水凝胶的蛋白；

所述的同源性，优选为95％以上；更优选为99％以上。

编码上述蛋白的多肽的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2:AGCAAACCGAGTACCTTTAGCCTGGTTCAGCGCATCTACAACGTCAAAGAGAACGTCGGTCAGGTCCAGATTGAAGTCGTTCGTAGCGAAGGTAGCGCAGGTAGTTACGTCGTTAGTTGGCAAACCTCTGACGGTTCTGCGGTTCAGAAACAAGATTACGTTGGCACCAAAGGCAGCGTTAACTTCAAAAGCGAGGCGAAAAGCCAGAAATTCAACATCAAAATCGTCAACGACAAAGAGTACGAACCGGACGAAAGCTTTACCGTCAGTCTGGTTAGCGTTAGCGCAGGCGGTAGTCTGGGCGCAATTACCCTGGCGACCATTAACATTGCAAATGACGACGCACCGTGCGGCGGTAGTTGTAAAGCGAACGAACACTGCGACATGCACTCTCAGGAATGCGTTTGCAACACCGGCTATAAACTGTACAAAAAAGCCTGCGTTCTGCCGTGCGGCGGTCCGTGTAAACAATACGAACGTTGCGACGAAGGCTCCAATAAATGCGTTTGCATGACCGGCTACAGCCTGTTTAAAGGCTCTTGCGTTGTTCCGTGCGGCGGTCCGTGCGGTCCGAACGCATACTGCGACAAAAACAAAAACCAGTGCAACTGCAACAAAGGCTACTTCACCTATCACGGGGTTTGCGCTCTGCCGTGCGGCGGTCCGTGTAAACAGAACGCGAACTGCGATAAAAACTCCAACCAGTGCGTCTGCAACAAAGGCTATAAAGAAATTGGCGGCGTTTGCGCAGTT。

本发明所提供的蛋白用于制备水凝胶；

本发明还提供一种水凝胶，是使用上述的蛋白制备的；

所述的水凝胶，其一种制备方法是使用上述的蛋白溶液制备的，

其一种制备方法，是在所述蛋白的溶液中添加过氧化氢制备的；

所述的蛋白的溶液，其中蛋白的浓度为20-150mg/mL；加入过氧化氢的浓度为1-0.1％。

本发明还提供一种试剂盒，所述的试剂盒包含有上述的蛋白和过氧化氢溶液。

本发明所提供能的水凝胶在制备医学材料中的应用。

本发明所提供的蛋白制备的水凝胶具有成胶时间和力学性能可控，胶的生物相容性好等优异的性能，因此在生物医用材料,药物缓释等领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1：重组蛋白的纯化电泳图；

图2：蛋白形成的水凝胶图；

图3：浓缩后的蛋白溶液静置1min后成胶情况图；

图4：蛋白凝胶压缩性能图；

图5：蛋白加入H₂O₂交联后凝胶疲劳测试图；

图6：L929在蛋白水凝胶表面生长情况图。

具体实施方式

本发明基于对扇贝足丝关键蛋白组分的研究，并通过大肠杆菌重组表达系统获取单一样品为主的重组蛋白。通过浓缩技术，制备了一种具有对氧化还原环境依赖的水凝胶。该水凝胶具有氧化还原环境响应性，成胶速度快(成胶时间<1min)，水凝胶具有一定的力学性能和良好的生物相容性，表明该水凝胶在药物缓释，组织修复和细胞组织工程领域具有广阔的应用前景。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：可自发形成水凝胶的蛋白片段的筛选

栉孔扇贝饲养于实验室环境(约18℃)。每24小时收集足丝根部，加入液氮冷冻，使用研钵研磨。收集研磨后的足丝，加入蛋白抽提液，37℃抽提1h，17,600g离心30min。离心后上清透析至预冷的去离子水中(透析袋截留分子量3.5kDa)，除去盐酸胍与冰乙酸。透析后的样品冻干。Shotgun法质谱鉴定提取的足丝根部蛋白，检索的数据库为栉孔扇贝基因组。

使用以下2个条件进行筛选：(1)特异性表达的基因；(2)蛋白的表达量及在足丝根部含量应当相对较高。通过上述条件，筛选出足丝蛋白Sbp9(GenBank:MK050192)。此外，序列比对发现，来自Sbp9的EGFL(EGFL^Sbp9)与其他EGFL具有较低的序列相似性(<30％)，PCGGPC序列与其他EGFL的N-末端明显不同。因此EGFL^Sbp9可能具有不同的性质。

对足丝蛋白Sbp9的氨基酸序列进行分析后，最终确定的可自发形成水凝胶的蛋白片段，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1：其一种编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

实施例2：蛋白的重组表达及水凝胶的制备

1.样品制备

将编码氨基酸序列为SEQ ID NO：1的蛋白的核苷酸连接到pET32a载体上。连接后的质粒转化至表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)中。选择测序正确的单克隆进行重组表达。

菌种在LB培养基中培养过夜，过夜培养的大肠杆菌按照1:100的比例扩大培养。OD₆₀₀约为0.6-0.8时，0.2mM IPTG诱导，16℃诱导过夜，收集菌体，分离纯化或-80℃保存。

2.重组蛋白分离纯化及复性

PBS重悬菌体，置于冰水混合物中超声破碎，时间30min，功率40％，超声3s，间隔6s。17,600g离心10min，弃上清。沉淀分别使用PBS、1M尿素洗涤。17,600g离心10min，弃上清。洗涤后沉淀使用20mM Tris-HCl pH 8.5/8M尿素溶解，室温震荡30min至沉淀完全溶解。透析至20mM Tris-HCl pH 8.5/1mM DTT中除去尿素复性。

3.水凝胶制备

浓缩透析后的蛋白溶液在20-150mg/mL。15℃静置成胶。加入过氧化氢的蛋白溶液加入1-0.1％形态

水凝胶冻干，手术刀片切开，喷金后扫描电子显微镜(Hitachi S-3400N)观察切面形貌。

5.机械性能测试

万能试验机检测检测蛋白水凝胶的压缩性能(MTS Fundamental Tm)。速度为2mm/min。压缩实验将水凝胶压碎或压缩至90％。循环实验压缩至30％后以同样的速度返回原点，循环4次。

6.细胞相容性测试

24孔板中加入浓缩后的蛋白溶液形成水凝胶，并使用0.3％H₂O₂氧化交联，紫外灭菌。灭菌后的CE4凝胶使用PBS浸洗。L929复苏并传至第三代，细胞消化后每孔接入10,000个细胞，培养24,48,72h后，显微镜观察细胞的形态。

具体的实验结果如下：

1.样品纯化

样品纯化结果如图1所示，可观察到29kDa附近有明显条带，与目标蛋白分子相符。蛋白纯度约70％。

2.水凝胶制备

本发明的蛋白可自发形成水凝胶，形成的水凝胶如图2所示。15℃成胶时间约2h。加入一定浓度的H₂O₂后迅速成胶，最短成胶时间小于1min(图3)。

3.水凝胶的机械性能

蛋白水凝胶在30％左右压碎，经过H₂O₂氧化交联的水凝胶可达到60％。正常形成的水凝胶压缩模量为10.68kPa，交联后模量增加至13.7kPa，H₂O₂交联可增加其机械性能，可能加速了半胱氨酸形成二硫键，共价键增加凝胶的交联度有关(图4)。进一步检测蛋白水凝胶的抗疲劳性，对其进行循环压缩(图5)。结果显示，在经过4次压缩后，最大应力为第一次的80％左右。表明本发明的蛋白水凝胶具有较好抗疲劳性能。

4.细胞相容性测试

细胞形态如图6所示。细胞无明显损伤、坏死及凋亡等现象。对照组细胞增殖正常，加入凝胶的细胞增殖，细胞数目明显增加。表明水凝胶无细胞毒性或具有低细胞毒性。L929细胞在水凝胶表面生长的形态与贴壁生长有明显区别，24h时贴壁生长的细胞未完全伸展，大多数细胞呈球形，生长在水凝胶表面的细胞已经开始伸展，形成一定的细胞形态，表明水凝胶可能促进细胞的贴壁或伸展。48h及72h贴壁生长的细胞呈梭形，在水凝胶表面生长的细胞更加细长，并在长的一端伸展出细丝。表明细胞在水凝胶表面具有不同的状态，可能与分化有关。水凝胶能够促进成纤维细胞的贴壁及粘附，在体内可促进细胞的生长，可能在组织工程、伤口愈合等领域具有应用前景。

本发明还保护从扇贝分离的，与本发明氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白具有同源性(同源性>30％)，可自发形成水凝胶的其它蛋白。

序列表

<110> 中国海洋大学青岛卫辽医用生物材料有限公司

<120> 一种仿生智能水凝胶的制备及应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 251

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Lys Pro Ser Thr Phe Ser Leu Val Gln Arg Ile Tyr Asn Val Lys

1 5 10 15

Glu Asn Val Gly Gln Val Gln Ile Glu Val Val Arg Ser Glu Gly Ser

20 25 30

Ala Gly Ser Tyr Val Val Ser Trp Gln Thr Ser Asp Gly Ser Ala Val

35 40 45

Gln Lys Gln Asp Tyr Val Gly Thr Lys Gly Ser Val Asn Phe Lys Ser

50 55 60

Glu Ala Lys Ser Gln Lys Phe Asn Ile Lys Ile Val Asn Asp Lys Glu

65 70 75 80

Tyr Glu Pro Asp Glu Ser Phe Thr Val Ser Leu Val Ser Val Ser Ala

85 90 95

Gly Gly Ser Leu Gly Ala Ile Thr Leu Ala Thr Ile Asn Ile Ala Asn

100 105 110

Asp Asp Ala Pro Cys Gly Gly Ser Cys Lys Ala Asn Glu His Cys Asp

115 120 125

Met His Ser Gln Glu Cys Val Cys Asn Thr Gly Tyr Lys Leu Tyr Lys

130 135 140

Lys Ala Cys Val Leu Pro Cys Gly Gly Pro Cys Lys Gln Tyr Glu Arg

145 150 155 160

Cys Asp Glu Gly Ser Asn Lys Cys Val Cys Met Thr Gly Tyr Ser Leu

165 170 175

Phe Lys Gly Ser Cys Val Val Pro Cys Gly Gly Pro Cys Gly Pro Asn

180 185 190

Ala Tyr Cys Asp Lys Asn Lys Asn Gln Cys Asn Cys Asn Lys Gly Tyr

195 200 205

Phe Thr Tyr His Gly Val Cys Ala Leu Pro Cys Gly Gly Pro Cys Lys

210 215 220

Gln Asn Ala Asn Cys Asp Lys Asn Ser Asn Gln Cys Val Cys Asn Lys

225 230 235 240

Gly Tyr Lys Glu Ile Gly Gly Val Cys Ala Val

245 250

<210> 2

<211> 753

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agcaaaccga gtacctttag cctggttcag cgcatctaca acgtcaaaga gaacgtcggt 60

caggtccaga ttgaagtcgt tcgtagcgaa ggtagcgcag gtagttacgt cgttagttgg 120

caaacctctg acggttctgc ggttcagaaa caagattacg ttggcaccaa aggcagcgtt 180

aacttcaaaa gcgaggcgaa aagccagaaa ttcaacatca aaatcgtcaa cgacaaagag 240

tacgaaccgg acgaaagctt taccgtcagt ctggttagcg ttagcgcagg cggtagtctg 300

ggcgcaatta ccctggcgac cattaacatt gcaaatgacg acgcaccgtg cggcggtagt 360

tgtaaagcga acgaacactg cgacatgcac tctcaggaat gcgtttgcaa caccggctat 420

aaactgtaca aaaaagcctg cgttctgccg tgcggcggtc cgtgtaaaca atacgaacgt 480

tgcgacgaag gctccaataa atgcgtttgc atgaccggct acagcctgtt taaaggctct 540

tgcgttgttc cgtgcggcgg tccgtgcggt ccgaacgcat actgcgacaa aaacaaaaac 600

cagtgcaact gcaacaaagg ctacttcacc tatcacgggg tttgcgctct gccgtgcggc 660

ggtccgtgta aacagaacgc gaactgcgat aaaaactcca accagtgcgt ctgcaacaaa 720

ggctataaag aaattggcgg cgtttgcgca gtt 753

Claims

1.氨基酸序列为SEQ ID NO：1的蛋白在制备水凝胶中的应用。

2.一种水凝胶，其特征在于，所述的水凝胶是使用氨基酸序列为SEQ ID NO：1的蛋白的溶液制备的。

3.如权利要求2所述的水凝胶，其特征在于，所述的蛋白的溶液中添加有过氧化氢。

4.如权利要求2或3所述的水凝胶，其特征在于，所述的蛋白的溶液中蛋白的浓度为20-150 mg/mL。

5.如权利要求3所述的水凝胶，其特征在于，所述的过氧化氢的浓度为1-0.1%。

6.一种用于制备水凝胶的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有氨基酸序列为SEQID NO：1的蛋白和过氧化氢溶液。

7.权利要求2或3所述的水凝胶在制备医学材料中的应用。