CN116102637B - 一种稳定的i型重组胶原蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种稳定的I型重组胶原蛋白及其应用。所述I型重组胶原蛋白由来自天然人I型胶原蛋白的短氨基酸序列作为重复单元进行多次重复而构成，其中，所述短氨基酸序列为GFPGER，重复次数为20～120次。所述I型重组胶原蛋白具有极其良好的亲水性及稳定性，其结构与天然胶原蛋白基因序列相应部分100％相同，应用于人体当中不会造成免疫排斥，可以应用于制备皮下填充剂、人工骨、人工皮肤、口腔可吸收生物膜、骨植入剂、骨修复支架等组织工程材料中。

Description

一种稳定的I型重组胶原蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种稳定的I型重组胶原蛋白及其应用。
背景技术
胶原蛋白是哺乳动物中最重要和最丰富的蛋白质之一，在人体的皮肤、结缔组织和骨骼以及其它组织中发现的结构蛋白。在人体内胶原蛋白的含量约为总蛋白质的30％。由于I型胶原在肌腱、软骨和骨等组织中的的广泛存在，又是细胞外基质的骨架，并且可促进骨髓间充质干细胞黏附和成骨分化，因此是当下研究的热点之一。由于I型胶原缺少特殊的专一的整合素受体，因此限制了其介导的细胞应答反应。并且由于存在多余的天然基质蛋白，往往会干扰想要的细胞应答，也有可能会产生对抗的级联反应信号，带来的不利的结果。
而与I型胶原的全长基质分子相比，GFPGER是其与细胞整合素受体α2β1特异性结合的三螺旋序列，也有促进细胞黏附、增殖和成骨的功效，还可以减少许多不必要的反应。
现阶段，胶原蛋白主要从动物组织中提取得到，然而来源于动物组织的材料都存在病毒感染的风险，如疯牛病等；同时，由于动物个体的差别导致胶原蛋白的批间稳定性很差。随着基因工程技术的发展，已经有研究采用基因工程手段来表达重组人I型胶原蛋白。
已知人胶原蛋白发生降解的原因是其氨基酸序列中含有较多的易发生水解的位点。因此，技术人员通过选择来自天然人胶原蛋白的短氨基酸序列进行重复来构建重组胶原蛋白，以期回避易发生水解的位点，从而提高胶原蛋白的稳定性，同时还能保持天然人胶原蛋白的优良性能。
但是，通过来自天然人胶原蛋白的短氨基酸序列重复构建的重组胶原蛋白，其氨基酸组成及分布都相对单调，理论上讲，这会造成其表面的电荷负载大，整体不容易达到稳定的平衡状态，因而在水溶液中容易水解、变性，且存在短氨基酸序列重复单元越短、重复次数越多，重组胶原蛋白分子在水溶液中越不稳定的倾向，因此，如何获得适合替代天然人胶原蛋白用作组织工程材料的胶原蛋白成为本技术领域的限制性问题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种稳定的I型重组胶原蛋白及其应用。
第一方面，本发明提供一种稳定的I型重组胶原蛋白，由来自天然人I型胶原蛋白的短氨基酸序列作为重复单元进行多次重复而构成，其中，所述短氨基酸序列为GFPGER，重复次数为20～120次。
第二方面，本发明提供编码所述I型重组胶原蛋白的基因。
第三方面，本发明提供含有所述基因的重组工程菌。
第四方面，本发明提供所述重组工程菌的表达产物，所述表达产物为所述I型重组胶原蛋白。
第五方面，本发明提供所述I型重组胶原蛋白或所述表达产物在制备组织工程材料中的应用，所述组织工程材料包括皮下填充剂、人工骨、人工皮肤、口腔可吸收生物膜、骨植入剂、骨修复支架。
第六方面，本发明提供一种骨修复支架的制备方法，包括以下步骤：
S1、将成骨因子BMP-2加入到浓度为0.2mol/L的PBS溶液，然后将该溶液以20-22μL：1mg的质量体积比滴在丝素蛋白微球粉末上，37℃下在摇床上混合3-4小时，制得负载BMP-2的微球溶液；PBS溶液中BMP-2的浓度为0.1mol/L；
S2、按丝素蛋白微球粉末：纳米羟基磷灰石＝2：3的质量比，将纳米羟基磷灰石加入到所述负载BMP-2的微球溶液中，然后冷冻干燥，首次冷冻干燥后用甲醇浸泡处理24-25h，取出后再次冷冻干燥获得不溶于水的支架，将支架切片，制成与骨缺损形状相适配的形状，记作SF/nHAP支架切片；
S3、通过交联剂Sulfo-Lc-SPDP与SF/nHAP支架切片上的氨基发生反应，生成酰胺键，将交联剂固定到SF/nHAP支架切片上，再通过交联剂与I型重组胶原蛋白序列中的GFPGER上的巯基反应生成双硫键，从而将I型重组胶原蛋白固定到SF/nHAP支架切片，得所述骨修复支架。
进一步的，S2中，首次冷冻干燥和再次冷冻干燥的条件均为-50℃，3-4d。
第七方面，本发明提供所述方法制备得到的骨修复支架。
本发明具有如下有益效果：
发明人对通过来自天然人胶原蛋白的短氨基酸序列重复构建的重组胶原蛋白进行了技术文献调研，选取了现有技术中的来自天然人I型胶原蛋白的短氨基酸序列，然后将这些短氨基酸序列作为重复单元，构建不同重复次数的重组胶原蛋白，考察这些重组胶原蛋白在水溶液中长期保存的稳定性，以期获得能够在水溶液中长期稳定保存，且能够满足作为骨修复支架中的重要外源材料的重组胶原蛋白。发明人意外发现，通过将来自天然的人I型胶原蛋白的一段六肽(GFPGER)进行20～120次重复而得到的重组I型胶原蛋白具有异常优异的稳定性。具体体现在：
(1)尽管其重复单元的长度是发明人测试的所有重组胶原蛋白中最短的，但其在水溶液中的稳定性是最好的；而通常认为，重复单元越短，氨基酸组成及分布就越单调，由此构建的重组胶原蛋白的表面电荷负载越大，越不容易达到稳定的平衡状态，因而更易水解。
(2)其甚至比将该六肽进行60次或100次重复而得到的重组I型胶原蛋白更加稳定，而通常认为，重复次数越多，分子量越大，重组胶原蛋白的表面电荷负载越大，越不容易达到稳定的平衡状态，因而更易水解。
关于本发明的I型重组胶原蛋白具有异常优异的稳定性的原因，发明人正在进行更为深入的研究。初步的研究结果表明，这可能是因为：
以某一氨基酸序列作为重复片段进行重复的重组胶原，其稳定性与表面电荷密切相关，而表面电荷与氨基酸组成及蛋白的空间结构相关联，达到某一特定的重复次数后刚好形成了某一空间结构，使得表面荷载处于平衡或近平衡的状态，因此会表现出异常稳定的状态。发明人刚好找到了该6个氨基酸重复序列胶原蛋白处于荷载平衡的范围，因而本发明的I型重组胶原蛋白具有异常优异的稳定性。
附图说明
图1为No.2的I型重组胶原蛋白的SDS-PAGE电泳图。
图2为No.2的I型重组胶原蛋白的二级结构分析图。
图3为No.2的I型重组胶原蛋白的疏水性分析图。
图4为不同处理组模型的Micro-CT扫描重建和新生骨含量分析结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：利用酵母表达系统制备不同重复次数的I型重组胶原蛋白
1.表达工程菌毕赤酵母GS115的构建
构建了分别表达表1所示的No.1～3的I型重组胶原蛋白的酵母表达菌株。具体操作是：根据毕赤酵母密码子偏好优化后，通过全基因合成的方式合成对应的目标基因，并在基因的两端分别添加EcoR I和Not I识别位点和信号肽识别位点，序列依次如SEQ IDNO.1-3所示(EcoR I:GAATTC；信号肽切割位点：GAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT；终止子：TAA；NotI:GCGGCCGC)。经限制性内切酶Sac I线性化后克隆至表达载体pPIC9K中，以毕赤酵母GS115为表达宿主菌，通过电转化将获得克隆质粒线性化后转化到GS115中。以G418梯度法挑选高拷贝阳性克隆，30℃培养72h得到毕赤酵母基因工程菌。
表1各酵母表达菌株表达的I型重组胶原蛋白
2.目标蛋白的诱导表达
(1)挑取酵母表达菌株的单菌落加入到5ml YPD液体培养基中(1％酵母提取物，2％蛋白胨和2％葡萄糖)，30℃，200rpm培养过夜进行活化；
(2)以1％的接种量接种于10ml的BMGY液体培养基，28℃,220rpm培养至OD600＝15.0～20.0；
(3)在8000rpm离心力作用下，25℃离心3min收集菌体，并将其悬浮于20ml BMMY液体培养基中，使其起始浓度为OD600＝1.0，在28℃，220rpm条件下培养；
(4)每隔24h加甲醇，终浓度为0.5～1.0％，进行诱导表达；
(5)诱导72h，取培养液在12000rpm条件下离心2min，取上清液。
实施例2：重组胶原蛋白的纯化
(1)将实施例1离心收集的上清液超滤至初始体积的50％时，加入3～5倍体积的纯水，再经超滤浓缩至初始体积的5％；
(2)将浓缩后的上清液加入60％饱和硫酸铵，常温下搅拌30min，9000rpm离心10min后收集沉淀，将得到的沉淀溶解于500mL0.05M，p H为7.0的PBS后经0.22μm滤膜过滤；
(3)依据该蛋白的等电点配制平衡缓冲液：20mmol/L磷酸钠缓冲液(A液，pH 6.0)，以20mmol/L磷酸钠缓冲液+1.0mol/L NaCl(B液，pH 6.0)为洗脱液。用A液溶解上一步的蛋白沉淀配制成上样液，经过滤后上样于25mL CM-Sepharose阳离子交换层析柱，上样前用平衡缓冲液平衡柱子。上样结束后先用A液冲洗1-2个柱体积，再用30％B液、B液进行梯度洗脱，流速2mL/min。收集各洗脱组分并用SDS-PAGE进行检测。
(4)超滤脱盐；G25脱盐柱脱盐，即采用25mL G25填料，操作过程与凝胶过滤层析步骤类似，每次上样6.5mL，收集8mL左右，上样10min后即可完成脱盐。
(5)经超滤浓缩至初始体积的20-30％，然后置于-20℃冰箱预冻4h，然后转入真空冷冻干燥机中进行冻干，48h后收集冻干后蛋白，将冻干后的蛋白样品保存至-80℃冰箱，以便后期使用。
实施例3：各种I型重组胶原蛋白在水溶液中的稳定性实验
实验材料：实施例2中制备的冻干后的蛋白样品。
实验方法：将实验材料用dd H2O配置成蛋白浓度为1mg/m L的蛋白溶液，在超净工作台中用0.22μm的无菌滤器过滤后分装到无菌离心管中密封，置于25℃±2℃的条件下，分别于0个月、6个月、12个月取样，每次取样3管，检测蛋白纯度(高效液相色谱法测定蛋白纯度)，根据纯度变化判定蛋白的稳定性。
测试结果如下表2所示，重复单元GFPGER重复40次后稳定性最强
表2重组胶原蛋白溶液12个月稳定性测试结果(纯度，％)
通过上述表述，我们对No.2的重组胶原蛋白进行SDS-PAGE的条带验证及二级结构检测(图1及图2)，发现其在实际分子量为理论分子量的3倍，发明人认为该蛋白自发形成了蛋白三聚体，提高了该重复次数下蛋白的稳定性。同时，对该重组人源Ⅰ型胶原蛋白的氨基酸进行疏水性分析，结果如图3所示，该蛋白中所有氨基酸疏水性评价几乎低于零，表明该蛋白的亲水性很好。
实施例4：No.1～3的I型重组胶原蛋白接枝于骨修复支架SF/nHAP后的骨修复作用
1实验方法
(1)构建SF/nHAP支架切片
将成骨因子BMP-2加入到浓度为0.2mol/L的PBS溶液，使BMP-2的浓度为0.1mol/L，取100μL上述加BMP-2的PBS溶液以及不加BMP-2的PBS溶液，分别滴在5mg的丝素蛋白(SF)微球粉末(湖州新天丝生物技术有限公司)上，37℃下在摇床上混合4小时，制得负载BMP-2的微球溶液和不负载BMP-2的微球溶液；
按SF微球粉末：纳米羟基磷灰石(nHAP)＝2：3的质量比，将nHAP分别加入到负载BMP-2的微球溶液和不负载BMP-2的微球溶液中。然后冷冻干燥，首次冷冻干燥(冷冻温度：-50℃，冷冻时间：3d)后用甲醇浸泡处理24h，形成β-折叠，取出再次冷冻干燥(冷冻温度：-50℃，冷冻时间：3d)获得不溶于水的支架。将支架切片，制成直径5mm高度1mm的圆柱体材料，即SF/nHAP支架切片。
(2)将包含BMP-2的SF/nHAP支架切片记为BMP-2组；将不包含BMP-2的SF/nHAP支架切片作为本实验的对照组，记为Control组；
(3)通过异-双功能团交联剂Sulfo-Lc-SPDP进行化学反应
通过Sulfo-Lc-SPDP与BMP-2组的SF/nHAP支架切片上的氨基(-NH2)发生反应，生成酰胺键(-CONH-)，将交联剂固定到SF/nHAP支架切片上，再通过交联剂与I型重组胶原蛋白序列中的GFPGER上的巯基(-SH)反应生成双硫键(-S-S-)，从而将I型重组胶原蛋白(No.1～3)固定到SF/nHAP支架切片上，依次记作G+B(1)、G+B(2)和G+B(3)，具体步骤包括：
取上步骤得到的SF/nHAP支架切片(0.2mg)，分别放入塑封袋中，配置10mg/mL的Sulfo-Lc-SPDP的PBS溶液1mL，调节PH至8.0，将溶液加入到塑封袋中后电灼塑封，放置于28℃摇床反应24h，确保反应在小体积空间下可充分进行。将固定了交联剂的SF/nHAP支架切片进行水洗，再放入塑封袋中，配置0.5mg/mL I型重组胶原蛋白的PBS溶液1mL，调节PH至8.0后加入塑封袋中，再次塑封并置于28℃摇床反应24h，反应结束后水洗并冻干，得到接枝了I型重组胶原蛋白的支架，记作G+B(1)、G+B(2)和G+B(3)。
(4)动物实验使用了大鼠颅骨双侧临界缺损模型，手术用SD大鼠为3月龄，平均体重250g。将Control、BMP-2(阳性对照)、G+B(1)、G+B(2)和G+B(3)五组支架紫外及酒精消毒后备用。
(5)将SD大鼠随机分为5组，备皮消毒后按分组进行手术。在颅骨处沿矢状缝切开并暴露骨组织，刮去缺损处的骨膜，使用牙科钻制作双侧对称的、直径为5mm的骨缺损，分别将对应组别支架植入双侧缺损处，用0.9％的生理盐水冲洗后，使用4-0的线进行缝合，并在手术当天及术后三天连续注射青霉素，防止感染；
(6)术后8周和12周，每组分别取6只SD大鼠(平均体重420g)，二氧化碳窒息后取出颅骨标本，并用10％福尔马林固定。使用了Micro-CT并三维重建颅骨模型，获得新生骨体积和缺损处总体积比值(BV/TV)，对骨缺损及骨再生进行分析。
2结果
将模型进行Micro-CT扫描重建和新生骨含量(新生骨和模型缺损的体积比，BV/TV)分析，其结果如下所示。从图中可看出，8周时，Control组骨缺损处仅边缘有约10％的新骨形成，12周时骨生成量稍有增多，平均不超过15％，几乎没有完全修复的可能，证明临界缺损模型的建立有效。
BMP-2组和G+B(1)、G+B(3)在8周时，缺损表面处不但边缘有新骨形成，中间也有一定成骨，12周时，两组缺损表面已有逐渐桥接趋势，骨含量分别达到30％和25％以上，并且有继续增长的可能。
实验组G+B(2)效果最佳，8周时有近40％的新生骨形成，缺损表面基本形成新的桥接，12周时缺损处表面已有完整的新生骨覆盖，骨含量也超过了50％。除了Control组之外，加了成骨因子BMP-2的四组均有不同的程度的新骨生成，其中双因子组G+B(2)的体内成骨能力最强。
即重复40次形成了三聚体的I型重组胶原蛋白对骨修复具有较好的促进作用，主要原理是GFPGER可使骨细胞的整合素活化，增加促血管生成信号，同时GFPGER可促进成骨因子BMP-2进行缓释，与成骨因子BMP-2发挥协同作用，进而进行骨修复。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (2)

1.一种稳定的I型重组胶原蛋白联合成骨因子BMP-2在制备骨修复支架中的应用，其特征在于，所述I型重组胶原蛋白由来自天然人I型胶原蛋白的短氨基酸序列作为重复单元进行多次重复而构成，其中，所述短氨基酸序列为GFPGER，重复次数为40次；
所述骨修复支架的制备方法，包括以下步骤：
S1、将成骨因子BMP-2加入到浓度为0.2mol/L的PBS溶液，然后将该溶液以20-22μL：1mg的质量体积比滴在丝素蛋白微球粉末上，37℃下在摇床上混合3-4小时，制得负载BMP-2的微球溶液；PBS溶液中BMP-2的浓度为0.1mol/L；
S2、按丝素蛋白微球粉末：纳米羟基磷灰石＝2：3的质量比，将纳米羟基磷灰石加入到所述负载BMP-2的微球溶液中，然后冷冻干燥，首次冷冻干燥后用甲醇浸泡处理24-25h，取出后再次冷冻干燥获得不溶于水的支架，将支架切片，制成与骨缺损形状相适配的形状，记作SF/nHAP支架切片；
S3、通过交联剂Sulfo-Lc-SPDP与SF/nHAP支架切片上的氨基发生反应，生成酰胺键，将交联剂固定到SF/nHAP支架切片上，再通过交联剂与所述I型重组胶原蛋白序列中的GFPGER上的巯基反应生成双硫键，从而将I型重组胶原蛋白固定到SF/nHAP支架切片，得所述骨修复支架。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，S2中，首次冷冻干燥和再次冷冻干燥的条件均为-50℃，3-4d。
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