CN115991763B - 一种重组人iii型胶原蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种重组人III型胶原蛋白及其制备方法和应用。所述重组人III型胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过在宿主细胞中表达，得到所述重组人Ш型胶原蛋白，该蛋白具有良好的稳定性和功能性，用其包被的细胞具有优异的细胞粘附性，在此粘附机制上，可以为免疫应答、炎症反应、凝血、肿瘤转移以及创伤愈合等一系列重要生理和病理过程的重要分子基础。

Description

一种重组人III型胶原蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种重组人III型胶原蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

胶原蛋白是哺乳动物中最重要和最丰富的蛋白质之一，在人体的皮肤、结缔组织和骨骼以及其它组织中发现的结构蛋白。在人体内胶原蛋白的含量约为总蛋白质的30％。胶原蛋白是一种结构蛋白，细胞外基质的主要成分。Ш型胶原蛋白由三条肽链向右卷曲扭成三股螺旋状。一级结构分析表明，其多肽链很长的区段序列是由Gly-X-Y氨基酸序列重复而成。其中，x通常为脯氨酸，y通常为羟脯氨酸和羟赖氨酸，后两种氨基酸在其他蛋白质中很少见。

胶原蛋白的免疫原性低，具有促进组织修复、止血等功能，现已被广泛应用于食品、化妆品、生物医学材料、药品等领域。现阶段，胶原蛋白主要从动物组织中提取得到，然而来源于动物组织的材料都存在病毒感染的风险，如疯牛病等；同时，由于动物个体的差别导致胶原蛋白的批间稳定性很差，而且天然胶原蛋白对细胞的促粘作用还有待于进一步提高。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种具有细胞粘附的重组胶原蛋白，所述的细胞粘附性重组胶原蛋白能有效支持细胞粘附，为免疫应答、炎症反应、凝血、肿瘤转移以及创伤愈合等一系列重要生理和病理过程的重要分子基础。可广泛应用于食品、保健品、生物医药等领域。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明第一方面提供一种重组人III型胶原蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明第二方面提供编码所述的重组人III型胶原蛋白的基因，核苷酸序列如SEQID NO.2第28-3231位所示。

本发明第三方面提供含有所述的基因的表达载体。

本发明第四方面提供含有所述表达载体的宿主细胞。

进一步的，所述宿主细胞选自毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的任意一种。

本发明第五方面提供所述重组人III型胶原蛋白的制备方法，在培养基中培养所述的宿主细胞，诱导表达后进行蛋白纯化，获得重组人III型胶原蛋白。

进一步的，纯化方法选自盐析法、超滤法、亲和层析法和凝胶过滤层析法中的任意一种。

本发明第六方面提供所述重组人III型胶原蛋白在制备细胞粘附促进剂中的应用。

本发明第七方面提供所述重组人III型胶原蛋白在制备组织修复材料中的应用。

本发明第八方面提供所述重组人III型胶原蛋白在制备止血材料中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)本发明的重组人III型胶原蛋白与天然人胶原蛋白基因长度相当，保留了原有全长胶原蛋白的特性，且其翻译的蛋白分子量适中，容易制备。

2)本发明的重组人III型胶原蛋白去除了胶原编码区C-端、N-端的全长链序列，有效地避免了一系列抗原免疫反应。

3)本发明制备的重组人III型胶原蛋白由毕赤酵母工程菌表达而得，该蛋白无内毒素隐患，且该蛋白不携带组氨酸标记，可通过分子筛进行纯化，最终直接可得目的蛋白，不需要额外切除组氨酸标记序列。

4)本发明的方法所制备的重组人III型胶原蛋白，可以有效地进行免疫应答、炎症反应、凝血、肿瘤转移以及创伤愈合。

5)本发明的重组人III型胶原蛋白制备方法适于工业化大规模生产，并且制备出的产品没有动物来源的感染源，因此生物安全性更高。

附图说明

图1为实施例3的阴性对照的细胞粘附图。

图2为实施例3的实验组的细胞粘附图。

图3为实施例3的阳性对照的细胞粘附图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明采取全长天然III型胶原蛋白序列作为改性基底，这是由于胶原蛋白的完整结构序列在细胞粘附中起着重要作用，为其他细胞表面受体提供了许多结合结构域，其中一些支持与整合素介导的效应的协同和协同相互作用，更有利于细胞与胶原蛋白的粘附。

本发明提供一种具有细胞粘附的重组人III型胶原蛋白，氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。针对宿主细胞表达进行密码子优选，在设计过程中两端分别添加信号肽切割位点以及EcoR I及Not I酶切位点以有利于后期基因操作。经过上述优化获得编码所述重组人III型胶原蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2第28-3231位所示，第1-6位为EcoRI酶切位点，第7-27位为信号肽切割位点，第3232-3234为终止子，第3235-3242为Not I酶切位点。

本发明还提供了含有所述基因的表达载体，所述载体可以含有调节序列(如转录和翻译起始和终止密码子)，其对待引入载体的宿主的类型(例如，细菌、真菌、植物或动物)具有特异性，酌情并考虑载体是基于DNA还是基于RNA。

在一个具体的实施方式中，所述表达载体为pPIC9k，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了一种包含所述表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括转化体和转化细胞，其包括原代转化细胞和源自其的后代，不考虑传代次数。后代在核酸含量上可能与亲代细胞不完全相同，但可能含有突变。所述宿主细胞选自毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌中的任意一种。

在一个具体的实施方式中，所述宿主细胞为毕赤酵母GS115。

本申请提供一种制备所述重组人III型胶原蛋白的方法，其包括如下步骤：利用上述的宿主细胞进行表达，然后进行分离纯化得到。所述将宿主细胞进行表达指的将宿主细胞进行培养，培养基和培养条件对于本领域技术人员来说是公知的。

在一个具体的实施方式中，所述宿主细胞为毕赤酵母，得到毕赤酵母基因工程菌后，具体的培养条件如下：将毕赤酵母基因工程菌接种于YPD培养基中，于30℃，220rpm条件下培养22～24h，至OD₆₀₀＝18～20作为上罐种子液，将种子液扩培后按10％接种量接入初始体积为5L的NBS 415发酵罐中，培养温度为28～30℃，pH＝5.0～6.0，溶氧控制在20％～30％，待甘油耗尽，开始进入甘油补料培养，至菌体湿重达到180g/L以上时，开始进行诱导培养。

对于表达方式，本发明不作任何限制，其可以根据需要进行确认，例如表达为诱导表达，对于诱导表达，其诱导剂甲醇。

在一个具体的实施方式中，流加甲醇进行诱导培养，诱导阶段温度为28℃，pH为5.0，诱导48h放罐。

对于分离纯化的方法，本申请不作任何限制，其可以根据进行确定，例如可以使用盐析法、超滤法、亲和层析法和凝胶过滤层析法。

实施例1：重组人III型胶原蛋白的表达

化学合成本发明的重组人III型胶原蛋白基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.2第28-3231位所示)。合成时在5'端和3'分别加入了EcoR I和Not I识别位点和信号肽识别位点，经限制性内切酶Sac I线性化后克隆至表达载体pPIC9K中，以毕赤酵母GS115为表达宿主菌，通过电转化将获得的p PIC9K-col A克隆质粒线性化后转化到GS115中。以G418梯度法挑选高拷贝阳性克隆，30℃培养72h得到毕赤酵母基因工程菌。

将上述得到的毕赤酵母基因工程菌接种于YPD培养基，培养至OD₆₀₀＝19.88时按10％接种量接入初始体积为5L的NBS 415发酵罐中，培养温度为30℃，p H＝5.5，溶氧控制在20％～30％，待甘油耗尽，开始进入甘油补料培养，至菌体湿重达到190g/L以上时，开始流加甲醇进行诱导培养，诱导阶段温度为28℃，pH为5.0，诱导48h放罐，离心收集上清液。

实施例2：重组人III型胶原蛋白的纯化

(1)将实施例1离心收集的上清液超滤至初始体积的50％时，加入3～5倍体积的纯水，再经超滤浓缩至初始体积的5％；

(2)将浓缩后的上清液加入60％饱和硫酸铵，常温下搅拌30min，9000rpm离心10min后收集沉淀，将得到的沉淀溶解于500mL0.05M，p H为7.0的PBS后经0.22μm滤膜过滤；

(3)依据该蛋白的等电点配制平衡缓冲液：20mmol/L磷酸钠缓冲液(A液，pH 6.0)，以20mmol/L磷酸钠缓冲液+1.0mol/L NaCl(B液，pH 6.0)为洗脱液。用A液溶解上一步的蛋白沉淀配制成上样液，经过滤后上样于25mL CM-Sepharose阳离子交换层析柱，上样前用平衡缓冲液平衡柱子。上样结束后先用A液冲洗1-2个柱体积，再用30％B液、B液进行梯度洗脱，流速2mL/min。收集各洗脱组分并用SDS-PAGE进行检测。

(4)根据离子交换层析后所得的蛋白分子量的分布范围，选择Sephadex200凝胶柱进一步纯化目的蛋白。AKTA操作过程：先用平衡缓冲液(0.01mol/L PBS，0.05mol/L NaCl)冲洗至基线稳定，再将上一步得到的离子交换柱洗脱的蛋白组分上样于装填有Superdex200的凝胶过滤层析柱，洗脱液洗脱，流速设定为10mL/min，紫外检测波长为215nm。最后以SDS-PAGE电泳检测后收集流出目标蛋白组分。

(5)超滤脱盐；G25脱盐柱脱盐，即采用25mL G25填料，操作过程与凝胶过滤层析步骤类似，每次上样6.5mL，收集8mL左右，上样10min后即可完成脱盐。

(6)经超滤浓缩至初始体积的20-30％，然后置于-20℃冰箱预冻4h，然后转入真空冷冻干燥机中进行冻干，48h后收集冻干后蛋白，将冻干后的蛋白样品保存至-80℃冰箱，以便后期使用。

实施例3：重组人III型胶原蛋白在制备细胞粘附促进剂中的应用

将L929细胞接种到包被有胶原蛋白的48孔板中，观察细胞的粘附情况。设置对照组，简述如下：孔板内分别加入浓度为0.2mg/ml的重组人III型重组胶原蛋白(实验组)、天然III型胶原蛋白(阳性对照，NCBI ID:NM_000090.4)及BSA(阴性对照)，4℃过夜。用1％热变性的BSA室温封闭1h，PBS洗2次。对数生长期细胞消化离心，PBS洗2次，无血清培养基重悬计数，终浓度为2×10⁵个/mL。细胞悬液每孔300μL，5％CO₂培养箱中37℃孵育4h。PBS洗去未粘附细胞,粘附细胞用0.2％结晶紫-甲醇溶液固定染色20min，超纯水洗涤2次后加1％SDS溶液，于590nm波长下分别测定OD值。根据吸光度值计算细胞的相对粘附率结果，设定天然III型胶原蛋白(阳性对照)为100％，细胞的相对粘附率结果见表1，细胞粘附图见图1-3。

表1细胞的相对粘附率

	阳性对照	实验组	阴性对照
				粘附率(％)	100	107	75.31

结果表明，本发明的重组人III型重组胶原蛋白可以明显促进L929细胞粘附贴壁，促粘附作用与天然胶原相近，且均明显高于BSA,具有良好的细胞相容性，并表现出较好的促进作用，这与光镜观察结果相一致。

实施例4：重组人III型胶原蛋白在止血方面的应用

1实验方法

(1)取SD大鼠36只，雄性，随机分为3组，每组12只，分别受试药组(重组人III型胶原蛋白)、模型组和阳性对照组(天然III型胶原蛋白)。

(2)大鼠禁食12h后，以3％水合氯醛腹腔注射麻醉(1mL/100g)，腹部备皮，5％碘酒消毒手术区域。

(3)用手术刀在大鼠腹部中正作一2.5cm纵行切口，逐层分离，充分暴露肝脏右叶，在肝右叶下缘切取一1cm×0.2cm×0.3cm肝组织。

(4)提前备好无菌纱布，并使用电子天平测量纱布初始重量。

(5)切除肝脏组织后，模型组立即使用无菌纱布吸取流出的血液，打开计时器计时。

(6)受试药组在创面迅速敷用重组人III型胶原蛋白固体(0.1g每只)后，使用无菌纱布吸取流出的血液，并打开计时器计时。

(7)阳性对照组在创面迅速均匀敷用天然III型胶原蛋白固体(0.1g每只)后，使用无菌纱布吸取流出的血液，并打开计时器计时。

(8)各组待出血完全停止时，终止计时器，此时的时间即为各组的出血时间。

(9)测量各组无菌纱布的最终重量，减去各自的初始重量，即为各组的出血量。

(10)术后将肝脏回纳至腹中，用缝线逐层关闭腹腔，5％碘酒消毒创面。

(11)每只大鼠单笼饲养，术后3d，每日腹腔注射每只10万单位青霉素钠，观察大鼠有无感染征兆。

2结果

一周后大鼠均存活，未出现明显感染情况，表2为各实验组对大鼠肝脏出血时间和出血重量的影响，结果表明与模型组相比，重组人III型胶原蛋白和天然III型胶原蛋白均能显著减少大鼠肝脏出血时间和出血重量，说明重组人III型胶原蛋白和天然III型胶原蛋白均具有较好的抗凝血作用，且重组人III型胶原蛋白的效果优于天然III型胶原蛋白。

表2各组大鼠肝脏出血时间和出血重量统计

组别	出血时间(s)	出血重量(g)
			模型组	220±56	0.56±0.25
阳性对照组	140.2±48*	0.18±0.04**
			受药组	135±66**	0.16±0.26**

注：*P<0.05,**P<0.01，与模型组比较。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种重组人III型胶原蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码如权利要求1所述的重组人III型胶原蛋白的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.2第28-3231位所示。

3.含有权利要求2所述的基因的表达载体。

4.含有权利要求3所述表达载体的宿主细胞。

5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的任意一种。

6.权利要求1所述重组人III型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，在培养基中培养权利要求5所述的宿主细胞，诱导表达后进行蛋白纯化，获得重组人III型胶原蛋白。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，纯化方法选自盐析法、超滤法、亲和层析法和凝胶过滤层析法中的任意一种。

8.权利要求1所述重组人III型胶原蛋白在制备细胞粘附促进剂中的应用。

9.权利要求1所述重组人III型胶原蛋白在制备组织修复材料中的应用。

10.权利要求1所述重组人III型胶原蛋白在制备止血材料中的应用。

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