CN109867721B - 一种重组刺参胶原多肽、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种重组刺参胶原多肽，编码重组刺参胶原多肽的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，其制备方法主要包括：S1、克隆基因；S2、构建载体质粒：将目的基因序列整合到载体质粒中，并将整合质粒导入至感受态基因工程菌中；S3、发酵及菌体收集：选取步骤S2中获得的阳性基因工程菌克隆，置于LB液体培养基中培养达到目标浓度，然后离心收集菌体；S4、纯化与透析：将步骤S3中收集到的菌体经过去除杂质后进行蛋白纯化，再进行蛋白透析。通过本方案中的制备方法可以高效制备刺参胶原多肽，解决了当前海参胶原多肽应用中遇到的海参培养、抓获及多肽提取成本高、杂质多、纯度低等问题；生产条件和步骤简单，反应条件易于控制、生产成本低以及纯度低的优点。

Description

一种重组刺参胶原多肽、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种重组刺参胶原多肽、制备方法及其应用。

背景技术

胶原蛋白广泛分布于多细胞动物的体内。一直以来，人们以为胶原只是作为一种支持组织蛋白而起作用。近年来，有关胶原的研究日渐增多，因其良好的生物学特性和弱的抗原性，经特殊处理后，可用于烧伤、创伤、美容、矫形、组织修复、创面止血等医药卫生领域，在这方面的研究已取得了可喜的成果。

对海参(S.japonicus)胶原研究发现，刺参体壁含蛋白3.3％(湿重)，其中70％为胶原。氨基酸分析发现，胶原富含丙氨酸、羟脯氨酸，但羟赖氨酸含量较少，结果与先前研究中John A所提取的加州海参相似，类似于脊椎动物Ⅰ型胶原。但是海参是一种海洋生物，一方面培育或抓获海参，然后提取有效蛋白的程序繁琐，成本较大；另一方面抓捕海参容易造成生态环境的破坏，对海洋环境和生物链产生影响。因此需要研究利用基因工程菌来合成重组海参胶原多肽的相关技术，并研发所合成的重组海参胶原多肽的应用。

发明内容：

本发明目的是提供了一种重组刺参胶原多肽、制备方法及其应用，以解决现有技术中刺参培育、抓获及提取过程的低效等技术问题。

为实现以上目的，本发明采用如下技术方案：

一种重组刺参胶原多肽，编码所述重组刺参胶原多肽的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

一种重组刺参胶原多肽的质粒，包含权利要求1中所述的重组刺参胶原多肽的核苷酸序列。

一种表达重组刺参胶原多肽的基因工程菌，包含权利要求2所述的质粒。

一种权利要求1中所述重组刺参胶原多肽的制备方法，包括以下步骤：

S1、克隆基因：获得人工合成的重组刺参胶原多肽的核苷酸序列；

S2、构建载体质粒：用Nde I和Xho I限制性内切酶切割载体质粒，使重组刺参胶原多肽的核苷酸序列和载体质粒pET15b具有相同粘性末端，然后通过DNA连接酶将目的基因序列整合到载体质粒pET15b中，获得整合重组刺参胶原多肽的质粒，并将质粒导入至感受态基因工程菌中；

S3、发酵及菌体收集：选取所述步骤S2中获得的阳性基因工程菌克隆，置于培养基中，然后收集菌体；

S4、纯化与透析：将所述步骤S3中收集到的菌体经过去除杂质后，用FPLC系统进行纯化，然后再进行透析。

优选的，所述步骤S3中进行小体系培养时，具体操作如下：用灭菌牙签挑取阳性克隆，置于含有5mL LB培养基(含100μg/mL Ampicillin)的培养管中，200rpm 37℃培养过夜；

优选的，所述步骤S3中进行大体系培养时，具体操作如下：将5mL小体系过夜培养的菌液转入1L LB(含100μg/mL Ampicillin)的培养基中，130rpm，37℃，培养2-4h；待培养液OD₆₀₀值到达0.8后，加入1M IPTG 133μL，继续培养20h后，8000rpm收集菌体。

优选的，所述步骤S4中的蛋白纯化操作具体包括：将菌体用Resuspension Buffer重悬，离心，弃上清；在菌体沉淀中加入5倍体积Buffer B，反复吹打直至菌体溶液均一，离心，收集上清；用装有Ni-NTA柱的FPLC系统进行纯化，上柱后，用含有咪唑的ElutionBuffer进行洗脱并收集洗脱液。

优选的，所述步骤S4中的蛋白透析操作具体包括：根据所述纯化操作中收集的洗脱液的体积，用蒸馏水稀释至10倍体积；将稀释后的洗脱液转移到500Da的半透膜中，用蒸馏水进行透析，每隔12小时换一次透析液，重复3-5次后获得多肽溶液。

优选的，所述步骤S4之后还包括步骤S5、冷冻干燥：将透析后获得多肽溶液转移至25mL离心管中，放置冰盒上，转移至-80℃冰箱静置30min。

优选的，还包括步骤S5检测：将纯化后的重组刺参胶原多肽制备成溶液，进行质谱检测。

本发明还提供一种根据上述方法制备获得的重组刺参胶原多肽产品及其在护肤品领域的应用。

一种刺参胶原多肽抗皱霜，包括以下重量份的各组分：

A相：60-75份水；

B相：3-6份植物角鲨烷，8-12份霍霍巴油，0.3-0.6份的茉莉精油，0.2-0.6份维生素E；

C相：8-12份的透明质酸，0.8-1.2份的海藻糖，2-3份的烟酰胺，0.2-0.8份的海参胶原多肽；

D相：0.5-1.2份乳化剂；

其中所述胶原多肽为上述方法制备所得的重组刺参胶原多肽。本方案中的抗皱霜中各成分相互配合，功能互补。植物角鲨烷：保湿滋润，使毛孔舒张，有助其他成分吸收。霍霍巴油：具有良好稳定性，极易与皮肤融合，且具有超凡的抗氧化性，有滋养软化皮肤的功效。茉莉精油：改善皮肤干燥、缺水、过油及敏感状况，增加皮肤弹性。维生素E：抗氧化剂，对抗皮肤氧化老化。透明质酸：修复及保水作用。海藻糖：保持细胞活力，滋养皮肤。烟酰胺：抗氧化，抑制黑色素形成。海参胶原多肽：减少皮肤皱纹深度，抑制皮肤衰老过程，增加皮肤弹性。该配方的功效成分在保湿滋润的基础上，通过打开皮肤毛孔，促进抗衰老和抗氧化成分的吸收作用，增加皮肤弹性，延缓皮肤衰老。

一种刺参胶原多肽抗皱霜的制备方法，包括以下步骤：

(1)按照重量份比例称取A相，然后将C相的各组分按重量份比例称量好并依次溶于A相中，得混合液1；

(2)按重量份比例称取B相中各组分，混合后得混合液2；

(3)将所述步骤(2)中制得混合液2缓缓加入所述步骤(1)的混合液1中，轻轻搅拌，加入按重量份比例称量好的D相，然后置于均质乳化机1000rpm反应10min，得到抗皱霜成品。

本发明的技术方案至少具有以下有益效果：

1.通过本方案中的制备方法可以高效制备刺参胶原多肽，解决了当前海参胶原多肽应用中遇到的海参培养、抓获及多肽提取成本高、杂质多、纯度低等问题。

2.本发明提供的基因工程菌生产重组刺参胶原多肽，具有产量高、生产条件和步骤简单，反应条件易于控制、生产成本低以及纯度低的优点，适用于大规模的生产。

3.重组刺参胶原多肽具有很好的医用和美容价值，安全无害，应用领域广。

附图说明

图1为实施例1中构件的重组刺参胶原多肽的载体质粒示意图；

图2为实施例1中质粒pET15b双酶切PCR的电泳照片；

图3为实施例1中扩增PCR的电泳照片；

图4为实施例1中重组刺参胶原多肽的质谱检测峰图；

图5为实施例1中获得的重组刺参胶原多肽的固体粉末照片；

图6为实验例1中重组刺参胶原多肽对成纤维细胞增殖作用的统计柱状图；

图7为实验例2中重组刺参胶原多肽对成纤维细胞凋亡的作用的统计图；

图8为实验例4中裸鼠使用实施例2中的抗皱霜前、后的皮肤褶皱变化对比照片；

具体实施方式

以下提供本发明的优选实施例，以助于进一步理解本发明。本领域技术人员应了解到,本发明实施例的说明仅是示例性的，并不是为了限制本发明的方案。

实施例1重组刺参胶原多肽的合成

本实施例通过检索查询到刺参(拉丁名为Apostichopus japonicas)的胶原多肽的氨基酸序列片段为SEQ ID NO.1所示，具体为：FKALKQP，分子质量：831.03，基因登录号为APA22677。以下具体介绍利用基因工程菌合成重组刺参胶原多肽的操作步骤。

S1、克隆基因：在上述刺参胶原多肽的氨基酸序列的N’端加上Nde I酶切位点，C’端加上Xho I酶切位点，然后根据大肠杆菌(Escherichia coli)偏爱密码子表翻译后获得刺参胶原多肽的核苷酸序列，为SEQ ID NO.2所示：5’—CATATGTTTAAAGCGCTGAAACAGCCGTAACTC—3’。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成上述核苷酸序列。

S2、构建载体质粒，载体质粒的核苷酸示意图参见附图1所示。

(1)用Nde I和Xho I限制性内切酶切割载体质粒pET15b，使目的基因序列和载体质粒具有相同粘性末端。对pET15b质粒进行Nde I和Xho I双酶切反应，反应体系如下；

反应结束后，进行1.5％琼脂糖胶电泳，100V电压，电泳30min，然后取出进行EB染色30min，用凝胶分析系统拍照，电泳结果参见附图2所示的照片。

(3)用质粒回收试剂盒进行载体质粒回收，切胶回收的步骤如下：

①在紫外灯下切除含有目的基因的琼脂糖，用纸巾吸尽凝胶表面的液体，尽量减少不含目的基因的凝胶量，用分析天平称重；

②用小刀尽量切碎凝胶，转入新的离心管中，向离心管中加入凝胶重量2倍体积的NT1溶液(1mg＝1μL)，50℃加热，使凝胶完全融化；

③加入硅胶树脂柱结合，室温放置20min，11000g离心1min，去上清；

④加入700uL清洗液，振荡混匀后，室温静置10min，11000g离心1min，去上清；

⑤重复步骤④，尽量去除上清，完全风干至不残留乙醇味道；

⑥加入NE buffer 30μL，室温1-2min；

⑦11000g离心1min，小心吸取上清到新的离心管中；

⑧按需要重复步骤⑥⑦，收集所有离心后上清到相同离心管中，获得DNA回收液。

(4)扩增质粒载体的构建，连接反应体系如下：

①取0.5μL质粒，加入20μL E.coli DH5α感受态细胞中，轻弹管底混匀,冰上放置30min；

②将离心管移入42℃水浴45s(放置前必须关掉水浴箱以防震动)，然后冰上放置3-5min；

③将管内液体全部涂在LB平板(含100μg/mL Ampicillin)上；

④37℃恒温孵箱培养12-14h,将含有单克隆菌落的平板倒置后放在4℃冰箱保存。

(5)菌落PCR

挑取DH5α单克隆菌落，用LB液体培养基(含100μg/mL Ampicillin)，37℃恒温孵箱,200rpm,培养12-14h后，用质粒回收试剂盒回收连接后的质粒：

①取1.5-5mL菌液室温10000×g离心1min；

②去上清，加250μl溶液Ⅰ(含RNase A)，涡漩振荡器震摇至菌体完全悬浮；

③加入250μl溶液Ⅱ，温和颠倒离心管4-6次，获得澄清的裂解液，室温孵育2min；

④加350μl溶液Ⅲ，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀；

⑤室温13000×g离心10min；

⑥小心吸取上清，移至洁净的装配好容积2mL离心管的吸收柱中，室温10000×g离心1min，至裂解物完全通过吸收柱；

⑦弃滤过液，加500μL Buffer HB，10000×g离心1min，清洗吸收柱；

⑧弃滤过液，用100％乙醇稀释的700μL Wash Buffer清洗吸收柱，10000×g离心1min；

⑨将吸收柱放入干净1.5mL离心管，加30-50μl无菌超纯水在滤膜上，13000×g离心1min，离心管中溶液即为回收的质粒DNA溶液；设计构建表达载体pET15b-重组刺参胶原的引物，其5’和3’的引物序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4：

5’Primer 5’-CAACTTCGTTTCTCTGTGCTCT-3’

3’Primer 5’-TGATGTCGGTTTCGTAGTCC-3’

每个克隆取1μL回收的质粒DNA作为模板，用上述引物进行PCR鉴定，PCR体系如下：

待PCR反应结束后，取PCR反应产物2μL，同时取DNA分子量标识物作为参照，经1％琼脂糖凝胶电泳及EB染色后，紫外灯下观察检验扩增产物，电泳结果参见附图3所示。

(6)扩增质粒载体的构建，DNA连接反应体系如下：

①取0.5μL质粒，加入20μL E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，轻弹管底混匀,冰上放置30min；

②将离心管移入42℃水浴45s(放置前关掉水浴箱以防震动)，冰上放置3-5min；

③将管内液体全部涂在LB平板(含100μg/mL Ampicillin)上；

④37℃恒温孵箱培养12-14h,将含有单克隆菌落的平板倒置后放在4℃冰箱保存。

S3、发酵及菌体收集

(1)小体系E.coli培养：

用灭菌牙签挑取阳性克隆，置于含有5mL LB培养基(含100μg/mL Ampicillin)的培养管中，200rpm 37℃培养过夜；

(2)大体系E.coli培养：

1)将5mL小体系过夜培养的菌液转入1L LB(含100μg/mL Ampicillin)的培养基中，130rpm，37℃，培养2-4h；

2)待培养液OD₆₀₀值到达0.8后，加入1M IPTG 133μL，继续培养20h后，8000rpm收集菌体。

S4、蛋白纯化与透析

(1)蛋白纯化：

1)将5g菌体用25mL Resuspension Buffer重悬，8000g，4℃离心15min后，弃去上清，保留菌体沉淀；

2)加入5倍体积Buffer B，反复吹打直至菌体溶液均一，8000g，4℃离心30min后，收集上清；

3)用装有Ni-NTA柱的FPLC系统进行纯化，在上柱后，用含有咪唑的ElutionBuffer进行洗脱并收集洗脱液。

(2)蛋白透析：

1)根据收集的洗脱液的体积，用蒸馏水以1mL/min稀释至10倍体积，使原为8M尿素的溶液降低到0.8M；

2)将稀释后的蛋白洗脱液转移到500Da的半透膜中，用蒸馏水4℃进行透析，每隔12小时换一次透析液，重复3-5次；

3)透析结束后，将蛋白溶液转移至25mL离心管中，放置冰盒上，转移至-80℃冰箱静置30min；

4)用冷冻干燥机进行冻干，-80℃，30h；获得的重组刺参胶原多肽产品参见附图4所示。

S5、蛋白检测

利用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测：

1)纯化后的刺参胶原寡肽重组蛋白冻干粉，用PBS溶液制备成100μg/mL的蛋白溶液；

2)将步骤1)中制备的蛋白溶液置于Applied Biosystems QSTAR Elite MALDI-TOF-MS仪器上进行检测。检测结果见附图3所示，所测得的海参胶原寡肽实际分子质量为831.21，与理论值830.01相符。

实施例2刺参胶原多肽抗皱霜配方一

本实施例中的刺参胶原多肽抗皱霜，包括以下重量份的各组分：

A相：69份蒸馏水；B相：5份植物角鲨烷，10份霍霍巴油，0.5份的茉莉精油(100％纯度)，0.5份维生素E；C相：10份的小分子量透明质酸(化妆品级)，1份的海藻糖(99.9％纯度)，2.5份的烟酰胺(99.9％纯度)，0.5份的刺参胶原多肽(98％纯度)；D相：1份乳化剂；其中乳化剂配方为：聚丙烯酸钠：三癸醇聚醚-6按照57％：43％的重量份比例配置，胶原多肽为实施例1中制备所得的重组刺参胶原多肽粉末。

本实施例中的刺参胶原多肽抗皱霜的制备方法，包括以下步骤：

(1)按照重量份比例称取A相，然后将C相的各组分按重量份比例称量好并依次溶于A相中，得混合液1；

(2)按重量份比例称取B相中各组分，混合后得混合液2；

(3)将所述步骤(2)中制得混合液2缓缓加入所述步骤(1)的混合液1中，轻轻搅拌，加入按重量份比例称量好的D相，然后置于均质乳化机1000rpm反应10min，得到抗皱霜成品。

实施例3刺参胶原多肽抗皱霜配方二

本实施例中的刺参胶原多肽抗皱霜，包括以下重量份的各组分：

A相：60份蒸馏水；B相：6份植物角鲨烷，12份霍霍巴油，0.6份的茉莉精油(100％纯度)，0.6份维生素E；C相：12份的透明质酸(化妆品级)，1.2份的海藻糖(99.9％纯度)，3份的烟酰胺(99.9％纯度)，0.8份的胶原多肽(98％纯度)；D相：1.2份乳化剂；其中乳化剂配方为：聚丙烯酸钠：三癸醇聚醚-6按照57％：43％的重量份比例配置，胶原多肽为实施例1中制备所得的重组刺参胶原多肽粉末。

本实施例中的抗皱霜的制备方法同实施例2，在此不赘述。

实施例4刺参胶原多肽抗皱霜配方三

A相：60份蒸馏水；B相：3份植物角鲨烷，8份霍霍巴油，0.3份的茉莉精油，0.2份维生素E；C相：8份的透明质酸，0.8份的海藻糖，2份的烟酰胺，0.2份的胶原多肽；D相：0.5份乳化剂；其中乳化剂的配方同实施例2，胶原多肽为实施例1中制备所得的重组刺参胶原多肽粉末。

本实施例中的抗皱霜的制备方法同实施例2，在此不赘述。

实验例1重组刺参胶原多肽对成纤维细胞增殖的作用

(1)收集对数期的人成纤维BJ细胞，调整细胞悬液浓度；每孔加入100uL，铺板使待测细胞调密度5000/孔，5％CO₂，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)；加入浓度梯度的重组刺参胶原多肽，设置50、100/200和400μM共计4个浓度梯度，每孔100uL，设3个复孔。5％CO₂，37℃孵育48小时，倒置显微镜下观察。

(2)然后在每孔加入10ulMTT溶液(5mg/mL，即0.5％MTT)，继续培养4h。终止培养，小心吸去孔内培养液。

(3)在每孔加入100uL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值，实验数据参见附图6所示。

本实验例中对照组的人成纤维BJ细胞不添加重组刺参胶原多肽，其他配方过程完全相同。

从附图6的实验结果可知，不同重组刺参胶原多肽浓度(50、100、200、400μM)处理后测得OD490nm吸光值分别为0.932、1.078、1.213、1.432，而无添加阴性对照组OD490nm吸光值为0.891，吸光值越大说明细胞数量越多，结果说明加入重组刺参胶原多肽对成纤维细胞的增殖具有促进作用，且随浓度的增加促进作用增强。

实验例2重组刺参胶原多肽对成纤维细胞凋亡的作用

(1)取对数皮肤成纤维BJ细胞，用胰蛋白酶消化后以1*10⁵mL^-1接种入6孔板中，每孔1mL。37℃，5％CO₂培养过夜；按照实验例1中不同的刺参胶原多肽浓度进行4个分组实验。

(2)培养24h后取1滴细胞悬液滴至载玻片上，用滤纸吸去多余的培养液，随后滴加AO和EB染液各5μL，立即在荧光显微镜下拍照，观察各组细胞调亡情况，并计算细胞凋亡率，参见附图7的统计图，统计结果显示，不同重组刺参胶原多肽浓度(50、100、200、400μM)处理后通过凋亡试验测得凋亡比率分别为15.4％、13.2％、10.2％、8.4％，而不添加重组刺参胶原多肽的阴性对照组为17.2％，结果说明加入重组刺参胶原多肽对成纤维细胞凋亡具有抑制作用，且随浓度的增加抑制作用增强。

实验例3刺参胶原多肽抗皱霜的过敏性测试实验

使用SPF级裸鼠，用实施例2中所获得的刺参胶原多肽抗皱霜产品进行连续7天、全身50％以上面积的涂抹(每日1次)。7天后，进行过敏性结果统计，结果如下表1所示，在雌性和雄性裸鼠样本中，均未发现过敏性案例出现。

表1采用裸鼠进行刺参胶原多肽抗皱霜的过敏性测试实验

实验组	试验数量(n＝10)	过敏数量	多次皮肤刺激性试验结果
				雌性	10	0	无过敏现象
雄性	10	0	无过敏现象

实验例4刺参胶原多肽抗皱霜的功效测试实验

使用SPF级裸鼠10只，用实施例2中所获得的刺参胶原多肽抗皱霜产品进行连续28天背部皮肤涂抹(每日1次)，实验开始前和实验完成后均对每一只裸鼠进行显微镜拍照，查看皮肤褶皱大小，对比照片请参见附图8所示。其中对照组的抗皱霜配方与实施例2的差别在于：未添加重组刺参胶原多肽，其他成分和比例完全相同。从附图8中可以看出，在连续涂抹刺参胶原多肽抗皱霜28天之后，裸鼠的皮肤变得光滑细致、皮肤褶皱直径从55μm变成10μm左右，减少了约5.5倍，而涂抹对照组抗皱霜的皮肤褶皱直径约为45μm，远不及添加海参肽的抗皱霜效果明显。这说明添加了实施例2中的重组刺参胶原多肽的抗皱霜，其抗皱性能优良，能非常明显的降低皮肤褶皱，舒展皮肤机理。

最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本申请的技术方案而非对其保护范围的限制，尽管参照上述实施例对本申请进行了详细的说明，所述领域的普通技术人员应当理解：本领域技术人员阅读本申请后依然可对申请的具体实施方式进行种种变更、修改或等同替换，但以上变更、修改或等同替换，均在本申请的待授权或待批准之权利要求保护范围之内。

Claims (9)

1.一种重组刺参胶原多肽，其特征在于，编码所述重组刺参胶原多肽的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，编码所述重组刺参胶原多肽的核苷酸序列翻译对应的重组刺参胶原多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示。

2.一种包含编码重组刺参胶原多肽的核苷酸序列的质粒，其特征在于，所述质粒中包含编码权利要求1中所述重组刺参胶原多肽的核苷酸序列。

3.一种表达重组刺参胶原多肽的基因工程菌，其特征在于，包含权利要求2所述的质粒。

4.一种权利要求1中所述重组刺参胶原多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、克隆基因：获得人工合成的编码所述重组刺参胶原多肽的核苷酸序列；

S2、构建载体质粒：用限制性内切酶切割载体质粒，使编码重组刺参胶原多肽的核苷酸序列和载体质粒具有相同粘性末端，然后通过DNA连接酶将目的基因序列整合到载体质粒中，并将整合质粒导入至感受态基因工程菌中；

S3、发酵及菌体收集：选取所述步骤S2中获得的阳性基因工程菌克隆，置于培养基中培养至菌体达目标浓度，然后收集菌体；

S4、纯化与透析：将所述步骤S3中收集到的菌体去除杂质后，进行蛋白纯化操作，再进行蛋白透析操作。

5.根据权利要求4所述的重组刺参胶原多肽的制备方法，其特征在于，还包括步骤S5检测：将纯化与透析后获得的重组刺参胶原多肽溶液进行质谱检测。

6.根据权利要求4至5任意一项中制备获得的重组刺参胶原多肽产品。

7.一种含有权利要求6中的所述重组刺参胶原多肽产品的护肤品。

8.一种刺参胶原多肽抗皱霜，其特征在于，包括以下重量份的各组分：

A相：60-69份水；

B相：3-6份植物角鲨烷，8-12份霍霍巴油，0.3-0.6份的茉莉精油，0.2-0.6份维生素E；

C相：8-12份的透明质酸，0.8-1.2份的海藻糖，2-3份的烟酰胺，0.2-0.8份的胶原多肽；

D相：0.5-1.2份乳化剂；

其中所述胶原多肽为权利要求4至5任意一项中制备所得的重组刺参胶原多肽。

9.一种权利要求8所述刺参胶原多肽抗皱霜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）按照重量份比例称取A相，然后将C相的各组分按重量份比例称量好并依次溶于A相中，得混合液1；

（2）按重量份比例称取B相中各组分，混合后得混合液2；

（3）将所述步骤（2）中制得混合液2缓缓加入所述步骤（1）的混合液1中，轻轻搅拌，加入按重量份比例称量好的D相，然后置于均质乳化机1000rpm反应10min，得到抗皱霜成品，无菌条件下分装保存。

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