CN110117323B

CN110117323B - 一种可溶性人源角蛋白及其应用

Info

Publication number: CN110117323B
Application number: CN201810123711.6A
Authority: CN
Inventors: 王伯初; 郝石磊; 管璐晗
Original assignee: Haimosi Chongqing Medical Biotechnology Co ltd
Current assignee: Haimosi Chongqing Medical Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-02-07
Filing date: 2018-02-07
Publication date: 2023-01-10
Anticipated expiration: 2038-02-07
Also published as: CN110117323A

Abstract

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种可溶性人源角蛋白及其应用。所述可溶性角蛋白通过以下过程获得：克隆人源K37基因的中间序列，构建重组载体，转化细菌，诱导重组蛋白表达并纯化重组蛋白，即得可溶性角蛋白。本发明的可溶性角蛋白具有快速溶胀的特性，并能够促进表皮细胞的有丝分裂和迁移，因此可用于促进细胞的增殖或迁移的生物材料或药物的制备，在止血及伤口愈合中发挥作用。并且本发明的可溶性角蛋白用于人体时无排斥现象，使用安全，因此在生物医学领域具有广泛的应用前景。

Description

一种可溶性人源角蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种可溶性人源角蛋白的制备方法及其在生物医学领域的应用。

背景技术

角蛋白是一类具有结缔和保护功能的纤维状动物蛋白质，是外胚层细胞的结构蛋白，广泛存在于动物的毛发、羽毛和蹄中。所有角蛋白均具有高半胱氨酸这一特征，从而形成角蛋白之间的二硫键，这为角蛋白提供所需的机械性能，同时也造成了角蛋白的不溶性，为角蛋白的利用带来障碍。角蛋白具有良好的生物活性高和组织相容性，能够起到消炎、止血、神经修复、减少创面渗出和促进创伤组织再生、修复、愈合的作用，可在体内生物降解，因此可以作为良好的生物医学材料。

目前国内外可溶性角蛋白的获得主要采用化学提取的方式使角蛋白中二硫键断裂衍生成磺酸基，使其成为可溶性角蛋白片段混合物。此类工艺均以动物毛发或人头发为原材料，采用酸、碱、氧化、还原等复杂的化学提取工艺，不可避免对角蛋白的天然结构造成破坏，从而带来产品的质量及安全性风险，同时带来环境安全风险。

专利CN 105646696A公开了一种载药角蛋白膜及其制备方法，包括如下步骤：(1)羊毛用4∶1三氯甲烷和甲醇混合液进行脱脂；(2)将脱脂后的羊毛溶解在0.4-0.6mol/L亚硫酸氢钠、7-9mol/L尿素和0.05-0.15mol/L十二烷基硫酸钠混合液中，溶解温度为50-70℃，溶解时间为4-7小时，pH值保持在6-7之间，所得溶液在蒸馏水中透析3天，制得角蛋白的水溶液，浓缩浓度(w/v)至4-10％；(3)溶解成角蛋白溶液后，采用谷氨酰胺转氨酶进行交联，得到一种性能优良的载药角蛋白膜。该发明的角蛋白溶液以羊毛为原料，经亚硫酸氢钠、尿素和十二烷基硫酸钠混合液处理，得角蛋白溶液。经过酸碱和氧化还原处理的角蛋白天然结构被破坏，影响其稳定性和安全性。并且由于角蛋白来源为羊毛，当作为医学用途用于人体时可能会引起排斥反应，其使用有一定限制。

因此开发一种绿色温和、避免破坏蛋白结构的可溶性人源角蛋白制备方法，从而获得稳定安全的、具有生物医学用途的可溶性人源角蛋白。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种可溶性人源角蛋白，其在不经过氧化还原或酸碱处理的条件下在水中可溶。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

上述可溶性重组人源角蛋白的氨基酸序列为：SEQ ID NO:3所示。

上述可溶性人源角蛋白具有快速溶胀的特性，完全溶胀时间约为2h；可溶性人源角蛋白溶胀后得到粘稠澄明的液体，2％浓度时粘度约为5000mPa.s。

本发明的目的之二在于提供目的一的可溶性人源角蛋白在促进人角质形成细胞迁移的用途。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

角质形成细胞又称上皮细胞，是表皮的主体，约占表皮细胞的95％以上。在其连续不断的细胞分化与更新过程中，细胞的形态、大小及排列有规律地发生变化，最终形成富含角蛋白的角质层细胞，此即角质形成细胞的角化过程。根据角质形成细胞各分化阶段的细胞特征，将表皮分为5层，即基底层、棘层、颗粒层、透明层、角质层。

角质形成细胞的增殖及迁移对于皮肤的再生、修复、愈合有重要作用。

将目的一的可溶性人源角蛋白加入人角质形成细胞(Hacat)培养液中，当培养液中可溶性人源角蛋白浓度为100μg/ml时，有显著的促细胞迁移作用，培养12小时迁移促进率为185.0％，培养36小时迁移促进率为140.4％。

由此，本发明的可溶性人源角蛋白有促进细胞迁移的作用，可用于制备促进细胞迁移的生物材料。

本发明的目的之三在于提供目的一的可溶性人源角蛋白在促进人角质形成细胞增殖的用途。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

可溶性人源角蛋白添加浓度在0.313mg/ml时具有显著促细胞增值效果(110.5％)，添加浓度为5mg/ml时具有非常显著的促细胞增殖效果(135.5％)，添加浓度在0.313～5mg/ml之间时与促进细胞增殖率呈正相关的量效关系。

由此，本发明的可溶性人源角蛋白有促进细胞增殖的作用，可用于制备促进细胞增殖的生物材料。

本发明的目的之四在于提供一种目的一的可溶性人源角蛋白在用于制备止血药物的用途。

本发明的目的之五在于提供一种目的一的可溶性人源角蛋白在用于制备促进伤口愈合的药物的用途。

本发明的目的之六在于提供一种促进表皮细胞增殖的医用生物材料，其使用安全，并能有效促进表皮细胞再生、修复。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

上述促进表皮细胞增殖的医用生物材料的有效成分为目的一的可溶性人源角蛋白，以及赋予它的材料学的载体。

本发明的目的之七在于提供一种编码目的一的蛋白的多核苷酸序列。

本发明的目的之八在于提供一种包含目的七的多核苷酸序列的重组质粒的制备方法，包括以下步骤：

1)合成包含目的七的多核苷酸序列的DNA片段；

2)构建重组质粒：目的基因的引物序列为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，以上述DNA片段为模板进行PCR扩增，得到目的基因片段；

设计线性化pET28a-His-TEV载体基因的引物，引物序列为SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:7所示，以所述载体为模板进行PCR扩增，得到pET28a-His-TEV线性化载体基因片段；

将获得的目的基因片段与pET28a-His-TEV线性化载体基因片段使用CloneEZ PCR克隆试剂盒进行连接，转化大肠杆菌并筛选阳性克隆后，提取质粒，获得重组质粒。

作为优选的方案，步骤1)的DNA片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。

作为优选的方案，上述大肠杆菌为DH5α或者Top10的感受态细胞。

上述筛选阳性克隆的过程为：

①将菌体均匀地涂布在含Kan抗生素平板上，37℃过夜培养。

②分别挑取3个阳性克隆接于含50μg/ml Kan抗生素的5ml LB培养基中37℃,220rpm/min过夜培养。

③分别对每一个样品的菌液取3ml提取质粒，跑胶检测后送去测序，测序正确的方为重组人源角蛋白的重组质粒。

本发明的目的之九在于提供一种目的八的重组质粒转化感受态细胞获得的基因工程菌。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

目的八的重组质粒转化感受态细胞获得基因工程菌包括以下步骤：

1)取感受态细胞于冰中溶解。

2)取1ul重组质粒加入感受态细胞轻轻混匀。

3)在冰中静置30min后，于42℃热激60s迅速放回冰中。

4)然后向感受态细胞中加入450ul室温LB培养基并于摇床37℃，220rpm摇1小时。

5)再从管中取100ul菌液涂于含Kan抗性的LB平板，37℃过夜培养。

6)从平板上挑2个阳性克隆接于含50μg/ml Kan抗生素的5ml LB培养基中，37℃，220rpm摇菌培养3h左右，OD600＝0.6，取菌液保种，即获得含有重组质粒的大肠杆菌基因工程菌。

作为优选的方案，上述感受态细胞为大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。

本发明的目的之十在于提供一种目的九的基因工程菌在用于制备可溶性人源角蛋白的方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

目的九的基因工程菌在用于制备重组人源角蛋白的方法，包括以下步骤：

1)IPTG诱导重组蛋白的表达；

2)HisFF亲和层析纯化重组蛋白；

3)加入TEV酶除去重组蛋白N-末端的融合HIS标签后，经HisFF亲和层析纯化即获得氨基酸序列为SEQ ID NO:3所示的目的蛋白。

作为优选的方案，步骤1)的IPTG诱导具体为：当测OD600＝0.6左右，向培养基中加入0.5mM的IPTG诱导剂，16℃诱导培养16h，测OD600＝2.0-2.5，停止诱导。

本发明的有益效果在于：本发明提供的可溶性人源角蛋白：

1)通过基因工程的方法制备得到，制备方法绿色温和，不破坏蛋白结构，获得的可溶性人源角蛋白稳定、安全，且用于生物医学用途时避免排斥反应；

2)获得的可溶性人源角蛋白具有快速溶胀的性质，完全溶胀时间仅2h；

3)本发明的可溶性人源角蛋白对角质形成细胞增殖和迁移均有一定的促进作用，可用于制备止血和伤口愈合的药物，以及促进表皮细胞增殖或迁移的生物医学材料。

附图说明

图1为PCR扩增的目的片段及重组质粒的琼脂糖凝胶电泳检测，其中A为DL5000DNA Marker；B为电泳检测结果，1：目的片段，2：DL5000 DNA Marker，3：重组质粒。

图2为目的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，其中A为蛋白Marker；B为电泳检测结果，1：蛋白Marker，2：目的蛋白。

图3为人角质形成细胞的相对增值率。

图4为人角质形成细胞的划痕实验。

具体实施方式

以下将(参照附图)对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1可溶角蛋白的制备

1.扩增目的片段

1)目的基因的合成

根据所示的目的基因的核苷酸序列，于生工生物工程(上海)有限公司进行全基因合成并测序验证，得到模板基因，如SEQ ID NO:1所示。

2)根据目的基因的核苷酸序列，分别设计引物，如SEQ ID NO:4-7所示。以合成的模板基因为模板，以PRO-1-F和PRO-1-R为引物进行PCR扩增。

PCR反应体系：10μmol/L的引物1μL，1μL目的基因或线性化pET28a-His-TEV载体基因,dNTP(各2.5mM)4μL，10×Buffer(含Mg²⁺)5μl，1μL Pfu DNA Polymerase，加水补至总体积为50μL。

PCR反应条件：95℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸5min。

3)将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，见图1。扩增得到的目的片段(1.0kb左右)与预期片段大小相同，即获得目的基因片段及pET28a-His-TEV载体基因片断。

2.构建重组质粒

1)将纯化的目的基因片段4μl及pET28a-His-TEV线性化载体载体6μl，10XCloneEZ Buffer 2μl，CloneEZ Enzyme 2μl，去离子水补足20μl，混合，22℃保持30分钟，之后在冰上保持5分钟。

2)取100μl的DH5α或者Top10大肠杆菌感受态细胞，加入上述混合液，轻弹数下，置冰上孵育30分钟；42℃水浴中热激90秒，冰上孵育5分钟；向细胞中加入1ml SOC培养基，37℃轻摇1小时，转速为200rpm；5000rpm离心5分钟收集菌体，用100μl SOC液体培养基重悬菌体。

3)将菌体均匀地涂布在含抗生素平板上，37℃过夜培养。分别挑取3个阳性克隆接于含50μg/ml Kan抗生素的5ml LB培养基中37℃,220rpm/min过夜培养。

4)分别对每一个样品的菌液取3ml提取质粒(天根质粒提取试剂盒)，跑胶检测，见图1，送南京金斯瑞进行测序，测序正确的命名为pET28a-His-TEV-PRO-1质粒。

3.构建大肠杆菌基因工程菌

1)取BL21(DE3)感受态细胞于冰中溶解，取1ul重组质粒加入BL21(DE3)感受态细胞轻轻混匀。在冰中静置30min后，于42℃热激60s迅速放回冰中。然后向感受态细胞中加入450ul室温LB培养基并于摇床37℃，220rpm摇1小时。

2)再从管中取100ul菌液涂于含Kan抗生性的LB平板，37℃过夜培养。从平板上挑2个阳性克隆接于含50μg/ml Kan抗生素的5ml LB培养基中，37℃，220rpm摇菌培养3h左右，OD600＝0.6，取菌液保种。即获得大肠杆菌基因工程菌。

4.诱导重组蛋白表达

1)取20ul上述保种的大肠杆菌基因工程菌于含Kan(卡那霉素)抗性的200ml的LB液体培养基中，37℃，140rpm过夜培养。

2)再将上述培养过夜的细菌培养液，按2％的接种量转接到含有Kan的LB液体培养基中，37℃110rpm培养3h左右，测OD600＝0.6左右，分别向培养基中加入0.5mM的IPTG诱导剂，16℃诱导培养16h，测OD600＝2.0-2.5，停止诱导。将菌液于3800rpm，4℃离心10min，收沉淀菌体。

5.HisFF亲和层析纯化蛋白

1)取上述收集的沉淀菌体细胞20g，用100mlTris缓冲液重悬，缓冲液中50mM Tris(pH 8.0),500mM NaCl,5％wt Glycerol。均质机破碎2次，混匀，4000rpm 4℃离心0.5h，由于目的蛋白存在于包涵体中，所以收集沉淀备用。

2)将收集的沉淀用40ml变性buffer(50mM Tris(pH 8.0),500mM NaCl,5％甘油，20mMβ-巯基乙醇，8M尿素，余量为去离子水)重悬溶解。充分溶解后，20000rpm离心1h取上清液，再将上清液转入5ml HisFF亲和柱中(经变性Buffer平衡)。

3)用10倍变性buffer冲洗层析柱。然后依次用含有10mM、20mM、50mM、100mM、200mM、300mM和500mM咪唑的变性buffer进行阶段洗脱，收集洗脱蛋白液，以透析液(25mMTris pH＝8.0，10mM咪唑,20mMβ-巯基乙醇，20mM半胱氨酸，余量为去离子水)脱盐换缓冲。

4)向步骤3)获得的蛋白液中加入TEV酶，在25℃条件下酶解2小时，除去蛋白N-末端的融合HIS标签，离心收集上清液。转入5mlHisFF亲和柱中(经透析液平衡)，用3倍透析液冲洗，收集流穿液。

5)以透析液(20mMβ-巯基乙醇，20mM半胱氨酸，余量为去离子水)透析脱盐，透析时间为12h，冻干，即得目标蛋白。

6)将洗脱的目的蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳验证，如图2所示，由于在重组肠激酶的酶解作用下融合蛋白是去除位于目的蛋白N-末端的融合his标签，所以酶解前后蛋白大小相差不大，由图2可以看出，目的蛋白分子量(36kDa左右)与预期大小相符，可见，获得了具有杂质较少的目的蛋白。

实施例2目的蛋白的特性

1.溶胀实验

本发明的可溶性人源角蛋白均具有快速溶胀的特性，本发明的可溶性人源角蛋白完全溶胀时间约为2h。本发明的蛋白溶胀后得到粘稠澄明的液体，2％浓度时粘度约为5000mPa.s。

溶胀实验表明本发明获得的角蛋白具有可溶性，不需化学处理的方式即获得安全的可溶性角蛋白。

2.对细胞增殖的影响

1)将本发明的可溶性人源角蛋白用去离子水配制成浓度5mg/ml(溶液A)，振摇充分溶胀24小时，取溶液A用去离子水分别稀释成2.5mg/ml(溶液B)、1.25mg/ml(溶液C)、0.625mg/ml(溶液D)、0.313mg/ml(溶液E)、0.156mg/ml(溶液F)。

2)将分别取溶液A～F及去离子水、DMSO各20μl加入到96孔板中，再加入80μl培养基平衡24小时，再接种HaCat细胞(接种量8000-10000cells/cm²)，培养24小时。

3)小心移除培养液，每一孔加入20μl MTT液，继续培养3小时，吸去液体，加入二甲基亚砜DMSO 150μl/孔，避光振荡10min，在酶标仪上以570nm波长测其OD570值。计算相对细胞增殖率，结果见图3。

本发明的可溶性角蛋白添加浓度在0.313mg/ml时具有显著促细胞增值效果(110.5％)，添加浓度为5mg/ml时具有非常显著的促细胞增殖效果(135.5％)，添加浓度在0.313～5mg/ml之间时与促进细胞增殖率呈正相关的量效关系。

由此，本发明的可溶性人源角蛋白有促进细胞增殖的作用，可用于制备促进细胞增殖的生物材料或药物。

3.对细胞迁移的影响

1)将本发明的可溶性人源角蛋白溶胀液(0.5mg/ml)与培养液按1：4的比例混合平衡24小时得到可溶性角蛋白培养液，将去离子水与培养液按1：4的比例混合平衡24小时得到对照培养液；

2)将HaCat细胞接种在6孔板上，待细胞基本铺满，用自制针刀划痕，形成宽约3mm均匀一致的十字交叉划痕。造成培养细胞伤口模型并马上换液，分别加入含可溶性角蛋白培养液及对照培养液。倒置显微镜下测微器测定宽度，此时作为划痕后零时。位于划痕缘每间隔2mm标定三个测量点，测量每一个点垂直于划痕方向的宽度,计算初始划痕面积(C₀和S₀)。以后每隔12小时或24小时测定一次划痕面积(C_T和S_T)，至划痕基本愈合。划痕实结果见图4。

本发明的可溶性人源角蛋白具有显著的促细胞迁移作用，根据划痕面积的计算结果，培养12小时迁移促进率为185.0％，培养36小时迁移促进率为140.4％。

由此，本发明的可溶性人源角蛋白有促进细胞迁移的作用，可用于制备促进细胞迁移的生物材料或药物。

本发明的可溶性人源角蛋白对人角质形成细胞的增殖和迁移的促进作用，可以用为促进止血和伤口愈合的药物的有效成分。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

<110>海默斯（重庆）医学生物技术有限公司

<120>一种可溶性人源角蛋白及其应用

<160> 7

<170> PatentIn Version 2.1

<210> 1

<211> 1347

<212> DNA

<213> 人源K37蛋白的基因序列

<400> 1

atgaccagct tttatagcac cagcagctgc ccgctgggct gcaccatggc gccgggcgcg 60

cgcaacgtgt ttgtgagccc gattgatgtg ggctgccagc cggtggcgga agcgaacgcg 120

gcgagcatgt gcctgctggc gaacgtggcg catgcgaacc gcgtgcgcgt gggcagcacc 180

ccgctgggcc gcccgagcct gtgcctgccg ccgaccagcc ataccgcgtg cccgctgccg 240

ggcacctgcc atattccggg caacattggc atttgcggcg cgtatggcaa aaacaccctg 300

aacggccatg aaaaagaaac catgaaattt ctgaacgatc gcctggcgaa ctatctggaa 360

aaagtgcgcc agctggaaca ggaaaacgcg gaactggaaa ccaccctgct ggaacgcagc 420

aaatgccatg aaagcaccgt gtgcccggat tatcagagct attttcgcac cattgaagaa 480

ctgcagcaga aaattctgtg cagcaaagcg gaaaacgcgc gcctgattgt gcagattgat 540

aacgcgaaac tggcggcgga tgattttcgc attaaactgg aaagcgaacg cagcctgcat 600

cagctggtgg aagcggataa atgcggcacc cagaaactgc tggatgatgc gaccctggcg 660

aaagcggatc tggaagcgca gcaggaaagc ctgaaagaag aacagctgag cctgaaaagc 720

aaccatgaac aggaagtgaa aattctgcgc agccagctgg gcgaaaaatt tcgcattgaa 780

ctggatattg aaccgaccat tgatctgaac cgcgtgctgg gcgaaatgcg cgcgcagtat 840

gaagcgatgg tggaaaccaa ccatcaggat gtggaacagt ggtttcaggc gcagagcgaa 900

ggcattagcc tgcaggcgat gagctgcagc gaagaactgc agtgctgcca gagcgaaatt 960

ctggaactgc gctgcaccgt gaacgcgctg gaagtggaac gccaggcgca gcataccctg 1020

aaagattgcc tgcagaacag cctgtgcgaa gcggaagatc gctatggcac cgaactggcg 1080

cagatgcaga gcctgattag caacctggaa gaacagctga gcgaaattcg cgcggatctg 1140

gaacgccaga accaggaata tcaggtgctg ctggatgtga aagcgcgcct ggaaaacgaa 1200

attgcgacct atcgcaacct gctggaaagc gaagattgca aactgccgtg caacccgtgc 1260

agcaccccgg cgagctgcac cagctgcccg agctgcggcc cggtgaccgg cggcagcccg 1320

agcggccatg gcgcgagcat gggccgc 1347

<210> 2

<211> 933

<212> DNA

<213>人源K37蛋白的基因中间序列

<400> 2

gaaaaagaaa ccatgaaatt tctgaacgat cgcctggcga actatctgga aaaagtgcgc 60

cagctggaac aggaaaacgc ggaactggaa accaccctgc tggaacgcag caaatgccat 120

gaaagcaccg tgtgcccgga ttatcagagc tattttcgca ccattgaaga actgcagcag 180

aaaattctgt gcagcaaagc ggaaaacgcg cgcctgattg tgcagattga taacgcgaaa 240

ctggcggcgg atgattttcg cattaaactg gaaagcgaac gcagcctgca tcagctggtg 300

gaagcggata aatgcggcac ccagaaactg ctggatgatg cgaccctggc gaaagcggat 360

ctggaagcgc agcaggaaag cctgaaagaa gaacagctga gcctgaaaag caaccatgaa 420

caggaagtga aaattctgcg cagccagctg ggcgaaaaat ttcgcattga actggatatt 480

gaaccgacca ttgatctgaa ccgcgtgctg ggcgaaatgc gcgcgcagta tgaagcgatg 540

gtggaaacca accatcagga tgtggaacag tggtttcagg cgcagagcga aggcattagc 600

ctgcaggcga tgagctgcag cgaagaactg cagtgctgcc agagcgaaat tctggaactg 660

cgctgcaccg tgaacgcgct ggaagtggaa cgccaggcgc agcataccct gaaagattgc 720

ctgcagaaca gcctgtgcga agcggaagat cgctatggca ccgaactggc gcagatgcag 780

agcctgatta gcaacctgga agaacagctg agcgaaattc gcgcggatct ggaacgccag 840

aaccaggaat atcaggtgct gctggatgtg aaagcgcgcc tggaaaacga aattgcgacc 900

tatcgcaacc tgctggaaag cgaagattgc aaa 933

<210> 3

<211> 311

<212> PRT

<213> 人源K37蛋白的中间片段氨基酸序列

<400> 3

Glu Lys Glu Thr Met Lys Phe Leu Asn Asp Arg Leu Ala Asn

1 5 10

Tyr Leu Glu Lys Val Arg Gln Leu Glu Gln Glu Asn Ala Glu

15 20 25

Leu Glu Thr Thr Leu Leu Glu Arg Ser Lys Cys His Glu Ser

30 35 40

Thr Val Cys Pro Asp Tyr Gln Ser Tyr Phe Arg Thr Ile Glu

45 50 55

Glu Leu Gln Gln Lys Ile Leu Cys Ser Lys Ala Glu Asn Ala

60 65 70

Arg Leu Ile Val Gln Ile Asp Asn Ala Lys Leu Ala Ala Asp

75 80

Asp Phe Arg Ile Lys Leu Glu Ser Glu Arg Ser Leu His Gln

85 90 95

Leu Val Glu Ala Asp Lys Cys Gly Thr Gln Lys Leu Leu Asp

100 105 110

Asp Ala Thr Leu Ala Lys Ala Asp Leu Glu Ala Gln Gln Glu

115 120 125

Ser Leu Lys Glu Glu Gln Leu Ser Leu Lys Ser Asn His Glu

130 135 140

Gln Glu Val Lys Ile Leu Arg Ser Gln Leu Gly Glu Lys Phe

145 150

Arg Ile Glu Leu Asp Ile Glu Pro Thr Ile Asp Leu Asn Arg

155 160 165

Val Leu Gly Glu Met Arg Ala Gln Tyr Glu Ala Met Val Glu

170 175 180

Thr Asn His Gln Asp Val Glu Gln Trp Phe Gln Ala Gln Ser

185 190 195

Glu Gly Ile Ser Leu Gln Ala Met Ser Cys Ser Glu Glu Leu

200 205 210

Gln Cys Cys Gln Ser Glu Ile Leu Glu Leu Arg Cys Thr Val

215 220

Asn Ala Leu Glu Val Glu Arg Gln Ala Gln His Thr Leu Lys

225 230 235

Asp Cys Leu Gln Asn Ser Leu Cys Glu Ala Glu Asp Arg Tyr

240 245 250

Gly Thr Glu Leu Ala Gln Met Gln Ser Leu Ile Ser Asn Leu

255 260 265

Glu Glu Gln Leu Ser Glu Ile Arg Ala Asp Leu Glu Arg Gln

270 275 280

Asn Gln Glu Tyr Gln Val Leu Leu Asp Val Lys Ala Arg Leu

285 290

Glu Asn Glu Ile Ala Thr Tyr Arg Asn Leu Leu Glu Ser Glu

295 300 305

Asp Cys Lys

310

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工设计引物

<400> 4

GAAAACCTGTATTTTCAGGGCAGCGAAAAAGAAACCATGCAG 42

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工设计引物

<400> 5

TTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGTTGCAATCTTCGCTTTCCAG 42

<210> 6

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工设计引物

<400> 6

GCCCTGAAAATACAGGTTTTCGTGATGATGATGATGATGGCTGCTGCCCAT 51

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工设计引物

<400> 7

TGAGATCCGGCTGCTAACAAAGC 23

Claims

1.可溶性人源角蛋白在制备用于止血的药物中的应用，其特征在于，所述可溶性角蛋白为人K37蛋白的中间片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.权利要求1中所述的可溶性人源角蛋白在制备促进人角质形成细胞迁移的药物中的用途。

3.权利要求1中所述的可溶性人源角蛋白在制备促进人角质形成细胞增殖的药物中的用途。

4.权利要求1中所述的可溶性人源角蛋白在用于制备促进伤口愈合的药物的用途。

5.一种促进表皮细胞增殖的医用生物材料，其特征在于，所述医用生物材料的有效成分为权利要求1中所述的可溶性人源角蛋白以及赋予它的材料学的载体。

6.多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1中所述的可溶性人源角蛋白。

7.包含权利要求6所述的多核苷酸的重组质粒。

8.权利要求7所述重组质粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）合成包含权利要求6所述多核苷酸的DNA片段；

2）构建重组质粒：目的基因的引物序列为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，以步骤1）所述DNA片段为模板进行PCR扩增，得到目的基因片段；

设计线性化pET28a-His-TEV载体基因的引物，引物序列为SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示，以所述载体为模板进行PCR扩增，得到pET28a-His-TEV线性化载体基因片段；

将获得的目的基因片段与pET28a-His-TEV线性化载体基因片段使用CloneEZ PCR克隆试剂盒进行连接，转化大肠杆菌并筛选阳性克隆后，提取质粒，获得权利要求7所述多核苷酸的重组质粒。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤1）所述DNA片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。

10.权利要求8所述的方法制备得到的重组质粒转染获得的基因工程菌。

11.权利要求10所述的基因工程菌用于制备权利要求1中所述的可溶性人源角蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）IPTG诱导重组蛋白的表达；

2）亲和层析纯化重组蛋白；

3）加入TEV酶除去重组蛋白N-末端的融合HIS标签后，经亲和层析纯化即获得权利要求1所述可溶性人源角蛋白。