CN105859892A - 一种类胶原蛋白-人碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白及其制备方法 - Google Patents

一种类胶原蛋白-人碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种类胶原蛋白‑人碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白，该融合蛋白全长488个氨基酸，氮端为经修饰的化脓链球菌来源的类胶原蛋白Scl2‑M，Scl2‑M蛋白长度为327个氨基酸，碳端为人碱性成纤维细胞生长因子hbFGF，hbFGF蛋白长度为155个氨基酸。两个肽段之间含有肠激酶酶切位点。制备方法包括类胶原蛋白‑人碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白表达载体的构建、融合蛋白的发酵、重组人碱性成纤维细胞生长因子和类胶原蛋白的纯化以及生物活性的测定。本发明能够同时高效生产人碱性成纤维细胞生长因子和类胶原蛋白，从而为人碱性成纤维细胞生长因子的规模化制备以及类胶原蛋白的应用奠定基础。

Description

一种类胶原蛋白-人碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白及其 制备方法
技术领域
本发明涉及一种类胶原蛋白-人碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白及其表达和纯化，尤其涉及一种利用类胶原蛋白融合标签同时高效生产重组人碱性成纤维细胞生长因子和类胶原蛋白的方法，属于生物技术领域。
背景技术
化脓链球菌的类胶原蛋白Scl2无需羟基化修饰就可形成稳定的三螺旋结构并且Tm为35-39℃（Chunying Xu, Zhuoxin Yu, et al. Biomacromolecules, 2010, 11: 348-356）。来源于化脓链球菌的类胶原蛋白Scl2研究较多，该重组Scl2蛋白由N-端球状结构域（V）和胶原区域（CL）组成，重组CL蛋白可促进细胞的粘附且对细胞无毒性并可通过戊二醛交联和冷冻干燥形成生物材料，为该类胶原蛋白在生物医学材料和组织工程中的应用提供依据（Yong Y. Peng, AyumiYoshizumi, et al. Biomaterials, 2010, 31: 2755-2761）。通过高密度发酵，该重组蛋白Scl2在大肠杆菌中的表达量最高可达19 g/L（Y. Y. Peng, LHowell, et al. Microb Cell Fact, 2012, 11: 96-103）。
CL本身不具有生物功能，但将一些具有特殊功能的氨基酸序列整合到该蛋白中后，可赋予该重组蛋白新的功能，如整合素结合位点（GERGFPGERGVE）可使得该蛋白对细胞具有更好的粘附作用和促进伤口愈合等作用（Stacy Cereceres, Tyler Touchet, et al.Adv Wound Care (New Rochelle), 2015, 4: 444-456；Y. Peng Yong, VioletStoichevska, et al. J Biomed Mater Res A, 2014, 102: 2189-2196；Dany J. Munoz-Pinto, Viviana R. Guiza-Arguello, et al. J Mater Chem B, 2015, 3: 7912-7919）、肝素结合位点（GRPGKPGKQGQK）可使得该蛋白具有结合肝素的能力（Y. Peng Yong, VioletStoichevska, et al. J Biomed Mater Res A, 2014, 102: 2189-2196）、RGD能介导细胞与细胞间的粘附作用（Susan L. Bellis. Biomaterials, 2011, 32: 4205-4210）并且含有RGD的多肽可阻止肿瘤细胞的转移及诱导肿瘤细胞死亡（Sabine Zitzmann, VolkerEhemann, et al. Cancer Res, 2002, 62: 5139-5143）等功能，从而使得该蛋白在生物医学材料和组织工程方面的应用具有无限的潜力。
人碱性成纤维细胞生长因子（human basic fibroblast growth factor，hbFGF）由155个氨基酸组成，分子量约为17.18 kDa。hbFGF是细胞生长和分化的重要调节因子，具有促血管生成、细胞增殖、细胞趋化和细胞迁移等活性，在细胞分化和机体发育过程中发挥重要作用（CN102675473A）。
hbFGF分子量小且不需要进行糖基化修饰，因此可在原核表达系统中进行表达。但hbFGF在大肠杆菌中的可溶性表达不高，这是由于hbFGF容易降解且大多数还以包涵体的形式存在，使得hbFGF的大规模制备变得繁琐、昂贵，从一定程度上限制了该蛋白的广泛应用（J. A. Andrades, J. A. Santamaría, et al. Protoplasma, 2001, 218: 95-103）。将hbFGF与融合蛋白进行融合表达有助于提高该蛋白的可溶性表达，如GST、TrxA标签等（ZhiSheng, Shin Bey Chang, et al. Protein ExpresPurif, 2003, 27: 267-271；S.Imsoonthornruksa, K. Pruksananonda, et al. JMolMicrob Biotech, 2015, 25: 372-380）。通过载体中的凝血酶、肠激酶等特异性酶切位点将亲和标签和融合蛋白进行切除，可获得成熟的hbFGF。但此类融合蛋白标签随后却被丢弃，从而造成了一定的浪费。
发明内容
本发明首先要解决的技术问题是，针对背景技术中的问题，提供一种类胶原蛋白-人碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白。
为此，本发明采用以下技术方案：该融合蛋白全长488个氨基酸，其氨基酸序列为序列表中的SEQ NO.1，氮端为经修饰的化脓链球菌来源的类胶原蛋白Scl2-M，Scl2-M蛋白长度为327个氨基酸，其氨基酸序列为序列表中的SEQ NO.7，其基因序列为序列表中的SEQNO.8，碳端为人碱性成纤维细胞生长因子hbFGF，hbFGF蛋白长度为155个氨基酸，其氨基酸序列为序列表中的SEQ NO.2，其基因序列为序列表中的SEQ NO.3，类胶原蛋白Scl2-M和生长因子hbFGF这两个肽段之间含有肠激酶酶切位点。
进一步地，所述的肠激酶酶切位点的氨基酸序列为Asp-Asp-Asp-Asp-Lys（序列表中SEQ NO.16。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供上述融合蛋白的制备方法，将含有功能位点的类胶原蛋白Scl2-M作为融合蛋白标签与hbFGF进行融合表达，通过亲和纯化、肠激酶酶切和离子交换纯化等步骤，分别获得并对该两者的生物活性进行测定，为重组hbFGF和重组类胶原蛋白Scl2-M的高效制备奠定基础。
为此，本发明采用以下技术方案：该制备方法包括以下步骤：
（1）人碱性成纤维细胞生长因子hbFGF和类胶原蛋白Scl2基因的全合成：
根据人碱性成纤维细胞生长因子hbFGF和化脓链球菌来源的类胶原蛋白Scl2的原始基因序列，按照大肠杆菌密码子分析用表分别对原始基因序列进行密码子优化，并委托上海捷瑞生物科技有限公司，获得pUC19-hbFGF和pET28a-Scl2质粒。优化后的hbFGF基因序列如SEQ NO.2所示，氨基酸序列如SEQ NO.3所示；优化后的Scl2基因序列如SEQ NO.4所示，氨基酸序列如SEQ NO.5所示。
（2）类胶原蛋白Scl2-M的获取：通过PCR技术将整合素结合位点（GERGFPGERGVE）、肝素结合位点（GRPGKPGKQGQK）和RGD等位点整合到Scl2原始基因序列中，获得基因Scl2-M并将该基因连接到载体pET28a上，获得pET28a-Scl2-M质粒。Scl2-M基因序列如SEQ NO.6所示，氨基酸序列如SEQ NO.7所示。
（3）融合蛋白表达载体的构建：通过PCR扩增和利用ClonExpress一步法定向克隆无缝克隆试剂盒，将hbFGF基因和Scl2-M基因进行融合，获得表达载体pET28a-Scl2-M-hbFGF，最后，将重组质粒送去测序以最终确定基因序列的正确性。
（4）融合蛋白的表达：将重组质粒pET28a-Scl2-M-hbFGF转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。挑取重组大肠杆菌单菌落接种至5 mL含有50 µg/mL卡那霉素的LB培养基，37℃过夜培养。然后以1%接种量接种到装有50 mL LB培养基的250 mL摇瓶中（含50 µg/mL卡那霉素），37℃，200 rpm培养至OD600到0.8左右。加入终浓度为0.1 mM IPTG，25℃下诱导8-10 h。
（5）融合蛋白在10 L发酵罐上放大培养：从新鲜LB平板上挑取重组菌BL21 (DE3)/pET28a-Scl2-M-hbFGF于装有50 mL LB培养基的250 mL摇瓶中（含50 μg/mL卡那霉素），37℃，200 rpm培养过夜。次日，于1%接种量接种于含有350 mL LB培养基的2.5 L摇瓶中（含50μg/mL卡那霉素），37℃，200 rpm培养至OD600为1.0-1.5左右。以火焰接种法将二级种子液接种至含有7 L甘油培养基的10 L发酵罐中（含50 μg/mL卡那霉素），培养温度为37℃，通气量30 L/min，最初搅拌转速为200 rpm。当OD600达到25左右时，加入终浓度0.1 mM IPTG并将培养温度由37℃降至25℃进行诱导表达。每隔两小时取样进行OD600、甘油浓度和目标蛋白表达情况的分析。
（6）融合蛋白的亲和纯化：将发酵结束的培养液以5,000 rpm离心10 min，弃上清获得重组菌体，用无菌水洗涤菌体三次，用2倍体积浓缩并悬浮于预冷的平衡缓冲液bufferA（20 mM咪唑，20 mMTris-HCl，0.5 M NaCl，pH8.0）中，然后用超声波破碎细胞。将所有破碎样品12,000 rpm离心10 min以分离可溶和不可溶组分，上清即为待纯化样品。将待纯化样品上样至预先平衡好的Ni2+填料上，上样完毕后用平衡缓冲液buffer A冲洗Ni2+填料至平衡；冲洗过后，采用洗脱缓冲液buffer B（70 mM咪唑，20 mMTris-HCl，0.5 M NaCl，pH8.0）洗脱杂蛋白至平衡；然后采用洗脱缓冲液buffer C（250mM咪唑，20 mMTris-HCl，0.5 MNaCl，pH8.0）洗脱目标蛋白。
（7）肠激酶酶切：使用密理博小型切向流超滤装置去除亲和层析获得的融合蛋白Scl2-M-hbFGF洗脱液中的小分子杂质，用肠激酶酶切反应液（2mMTris-HCl，0.2 mM CaC12，5mMNaCl，pH7.5）进行融合蛋白缓冲液的置换。随后在融合蛋白中加入一定量的肠激酶，30℃过夜酶切。
（8）重组hbFGF的纯化：用缓冲液D（20 mMTris-HCl，pH8.5）冲洗装有CM SeparoseFF填料的层析柱至A280不再变化，流速为3 mL/min；脱盐后的样品以3 mL/min上样；用缓冲液D冲洗柱子至A280不再变化；控制缓冲液D和E（20 mMTris-HCl，1 M NaCl，pH8.5）比例，使NaCl浓度分别为0.25、0.5、0.75和1 M进行梯度洗脱，流速3 mL/min，出峰时用离心管进行收集；最后，用缓冲液D冲洗柱子至A280不再变化。将各梯度收集的样品进行蛋白电泳分析，确定目标蛋白的最佳洗脱浓度。
（9）hbFGF的生物活性测定：采用MTT法对纯化后获得的重组hbFGF的生物活性进行测定。
附图说明
图1a是本发明构建的重组融合蛋白的表达质粒pET28-Scl2-M的过程示意图。
图1b是本发明构建的重组融合蛋白的表达质粒pET28-Scl2-M-hbFGF的过程示意图。
图2是大肠杆菌BL21(DE3)/pET28-Scl2-M和BL21(DE3)/pET28-Scl2-M-hbFGF诱导表达后目标蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中，M为蛋白标准品；泳道1为大肠杆菌BL21(DE3)对照菌；泳道2为诱导后的重组大肠杆BL21(DE3)/pET28-Scl2-M的上清液；泳道3为诱导后的重组大肠杆BL21(DE3)/pET28-Scl2-M的上清液。
图3是重组Scl2-M-hbFGF在10 L发酵罐上的表达。
图4是融合蛋白Scl2-M-hbFGF的亲和纯化，其中，M为蛋白标准品；泳道1为重组融合蛋白粗蛋白；泳道2-3为纯化后的重组融合蛋白。
图5是重组Scl2-M和hbFGF的离子交换纯化，其中，M为蛋白标准品；泳道1为肠激酶酶切后的重组融合蛋白；泳道2为纯化后的重组Scl2-M；泳道4-7为纯化后的重组hbFGF。
图6是重组hbFGF的生物活性测定。
具体实施方式
以下通过步骤进一步对本发明进行描述：
步骤1、人碱性成纤维细胞生长因子hbFGF和类胶原蛋白Scl2基因的全合成：根据人碱性成纤维细胞生长因子hbFGF和化脓链球菌来源的类胶原蛋白Scl2的原始基因序列，按照大肠杆菌密码子分析用表分别对原始基因序列进行密码子优化，并委托上海捷瑞生物科技有限公司，获得pUC19-hbFGF和pET28a-Scl2质粒。优化后的hbFGF基因序列如SEQ NO.2所示，氨基酸序列如SEQ NO.3所示；优化后的Scl2基因序列如SEQ NO.4所示，氨基酸序列如SEQ NO.5所示。
步骤2、类胶原蛋白Scl2-M的获取：根据整合素结合位点（GERGFPGERGVE）、肝素结合位点（GRPGKPGKQGQK）和RGD位点以及Scl2基因序列，设计3对引物：
F Scl2：TTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGGCCATCACCATCACCATCACGC；（序列8）
R Scl2：CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTCACTCGAGATATTTACCCGGTTTACCTGG；（序列9）
F heparin：TAAACGTGGTGATGCTGGTGCTCAAGGCAGGCCGGGTAAGCGGGGTAAACAGGGCCAGAAGGGTGAAAAAGGAGAACGTGGCGATCA；（序列10）
R heparin：TTGAGCACCAGCATCACCACGTTTACCTGGAAGACCTTGCG；（序列11）
F integrin：GGCCAAAACGGCCAAGATGGTCTTCCAGGTAAAGAC；（序列12）
R integrin：GGAAGACCATCTTGGCCGTTTTGGCCCTCGACGCCCCTCTCACCCGGGAAACCACGTTCACCATCTTTTCCAGCGGGACCGGCATCGCCTCGCTC（序列13）。
下划线为编码功能位点的碱基序列，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。修饰后的Scl2-M基因序列如SEQ NO.6所示，氨基酸序列如SEQ NO.7所示。
以载体pET28a-Scl2为模板，分别用引物F Scl2和R heparin、F heparin和R integrin、Fintegrin和R Scl2扩增获得三个目的基因片段。
PCR扩增完成后，对PCR产物进行凝胶电泳并进行割胶回收。用NcoI和XhoI对质粒pET28a进行酶切并回收大片段，随后用ClonExpressTM II One Step Cloning Kit进行目的载体的构建。反应体系为：5×CE II Buffer 5.0 µL，ExnaseTM II 2.0 µL，线性化克隆载体6.0 µL，目的基因片段各4.0 µL，总体积为25 µL。
将各溶液进行充分混匀，37℃下反应3-5 h后，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态中，复苏培养后并涂布50 µg/mL卡那霉素抗性平板上，37℃培养过夜。次日，挑取单菌落到含有50 µg/mL卡那霉素抗性的5 mL LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养，收集菌体，提取质粒，并对质粒进行PCR鉴定和测序鉴定，获得重组质粒pET28a-Scl2-M。
步骤3、融合蛋白质粒pET28-Scl2-M-hbFGF的构建：以载体pUC19-hbFGF为模板，利用引物F hbFGF：GGTAAACCGGGTAAATATCTCGAGGATGACGATGACAAGATGGCAGCCGGTAGCATTACCACGCTG（序列14）和R hbFGF：CTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAGCTCTTAGCAGACATTGGAAG（序列15）扩增获得hbFGF基因。
PCR扩增完成后，对PCR产物进行凝胶电泳并进行割胶回收。用XhoI对质粒pET28a-Scl2-M进行酶切并回收大片段，随后用ClonExpressTMII One Step Cloning Kit进行目的载体的构建。反应体系为：5×CE II Buffer 4.0 µL，ExnaseTM II 2.0 µL，线性化克隆载体4.0 µL，目的基因4.0 µL，ddH2O 6.0 µL，总体积为20 µL。
将各溶液进行充分混匀，37℃下反应1 h后，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态中，复苏培养后并涂布50 µg/mL卡那霉素抗性平板上，37℃培养过夜。次日，挑取单菌落到含有50 µg/mL卡那霉素抗性的5 mL LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养，收集菌体，提取质粒，并对质粒进行PCR鉴定和测序鉴定，获得重组质粒pET28a-Scl2-M-hbFGF。
步骤4、融合蛋白Scl2-M-hbFGF的表达：将重组质粒pET28a-Scl2-M和pET28a-Scl2-M-hbFGF分别转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中。分别挑取重组大肠杆菌单菌落接种至5mL含有50 µg/mL卡那霉素的LB培养基，37℃过夜培养。然后以1%接种量接种到装有50 mLLB培养基的250 mL摇瓶中（含50 µg/mL卡那霉素），37℃，200 rpm培养至OD600到0.8左右。加入终浓度为0.1 mM IPTG，25℃下诱导8-10 h。从附图2中可见重组融合蛋白Scl2-M-hbFGF获得成功表达，在以LB为培养基时表达量可达0.15 g/L且全部可溶。
步骤5、融合蛋白Scl2-M-hbFGF在10 L发酵罐中的放大培养：在10 L发酵罐中对重组菌BL21 (DE3)/pET28a-Scl2-M-hbFGF进行间歇发酵。菌体生长曲线、甘油消耗曲线及重组融合蛋白Scl2-M-hbFGF的表达量曲线见附图3。
由图3可知，重组菌体的OD600最后可达102.8，重组Scl2-M-hbFGF的最高表达量可达11.32 g/L。重组Scl2-M的理论计算分子量为33.57 kDa，hbFGF的理论计算分子量为17.18 kDa，因而可知hbFGF的理论表达量可达3.83 g/L。
步骤6、融合蛋白的亲和纯化：收集发酵罐培养所获得的菌体，细胞破碎并离心获得上清液。利用Ni2+亲和层析对融合蛋白Scl2-M-hbFGF进行分离纯化。待样品上完后，先用Buffer A平衡柱子，再用含不同浓度咪唑的缓冲液Buffer B和Buffer C进行洗脱，用SDS-PAGE进行分析。
结果表明，经Ni2+亲和层析，可获得融合蛋白Scl2-M-hbFGF，纯度为83.2%（附图4），回收率为70.1%。
步骤7、离子交换纯化：用缓冲液D冲洗装有CM Separose FF填料的层析柱至A280不再变化，流速为3 mL/min；脱盐后的样品以3 mL/min上样；用缓冲液D冲洗柱子至A280不再变化；控制缓冲液D和E的比例，使NaCl浓度分别为0.25、0.5、0.75和1 M进行梯度洗脱，流速3 mL/min，出峰时用离心管进行收集；最后，用缓冲液D冲洗柱子至A280不再变化。
将各梯度收集的样品进行蛋白电泳分析，确定目标蛋白的最佳洗脱浓度，
由附图5可知经离子交换法分离后可获得纯的重组蛋白hbFGF以及融合标签Scl2-M，该步回收率分别为65%和90%左右。
经亲和层析、脱盐、离子交换层析等步骤后，重组蛋白hbFGF的总回收率为38.3%，融合标签Scl2-M的总回收率为53.4%。
步骤8、重组hbFGF生物活性测定：将成熟的hbFGF以0、2、5、10、20、40、60、100和200ng/mL的浓度加入到细胞维持液中，加入72 h之后经MTT法测定发现2 ng/mL的hbFGF就可显著促进成纤维细胞株NIH3T3的增殖，当hbFGF的加入量为20 ng/mL时，活细胞数比不加入hbFGF的阴性对照组的活细胞总数提升41.5%，但低于加入10%新生胎牛血清的阳性对照组，结果见附图6。
步骤9、重组Scl2-M生物活性测定：将2 μg的纯的重组蛋白Scl2和Scl2-M分别加入到含有细胞THP-1的培养液中，培养1.5 h后于显微镜下观测细胞的生长状态。结果发现不含有整合素结合位点和RGD位点的Scl2蛋白对细胞THP-1的粘附作用不明显，而含有整合素结合位点和RGD位点的蛋白Scl2-M对细胞THP-1具有一定的粘附作用。
通过本发明的制备方法所获得的类胶原蛋白-人碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白，全长488个氨基酸，如序列NO.1所示，其氮端为经修饰的化脓链球菌来源的类胶原蛋白Scl2-M，Scl2-M蛋白长度为327个氨基酸，如序列NO.7所示，碳端为人碱性成纤维细胞生长因子hbFGF，hbFGF蛋白长度为155个氨基酸，如序列NO.2所示，两个肽段之间含有肠激酶酶切位点，肠激酶酶切位点序列为Asp-Asp-Asp-Asp-Lys。
<110> 浙江大学
<120> 一种类胶原蛋白-人碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白及其制备方法
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 488
<212> Protein1
<213> 人工序列
<400> 1
MGHHHHHHAD EQEEKAKVRT ELIQELAQGL GGIEKKNFPT LGDEDLDHTY MTKLLTYLQE 60
REQAENSWRK RLLKGIQDHA LDLVPRGSPG LPGPRGEQGP TGPTGPAGPR GLQGLQGLQG 120
ERGEQGPTGP AGPRGLQGER GEQGPTGLAG KAGEAGAKGE TGPAGPQGPR GEQGPQGLPG 180
KRGDAGAQGR PGKRGKQGQK GEKGERGDQG AKGDRGETGP VGPRGERGDA GPAGKDGERG 240
FPGERGVEGQ NGQDGLPGKD GKDGQNGKDG LPGKDGKDGQ NGKDGLPGKD GKDGQDGKDG 300
LPGKDGKDGL PGKDGKDGQP GKPGKYLEDD DDKMAAGSIT TLPALPEDGG SGAFPPGHFK 360
DPKRLYCKNG GFFLRIHPDG RVDGVREKSD PHIKLQLQAE ESGVVSIKGV CANRYLAMKE 420
DGRLLASKCV TDECFFFERL ESNNYNTYRS RKYTSWYVAL KRTGQYKLGS KTGPGQKAIL 480
FLPMSAKS 488
<210> 2
<211> 468
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atggcagccg gtagcattac cacgctgccg gctctgccgg aagatggtgg tagcggtgca 60
ttcccgccgg gccacttcaa ggacccaaag cgtctgtact gcaaaaacgg tggcttcttc 120
ctgcgcatcc acccggacgg ccgtgttgac ggtgtccgcg agaagagcga cccacacatc 180
aaactgcaac tgcaagcaga agagagtggt gttgtgtcta tcaaaggagt gtgtgcaaac 240
cgttacctgg ctatgaaaga agatggacgt ttactggctt ctaaatgtgt tacggatgag 300
tgtttctttt ttgaacgttt agaatctaat aactacaata cttaccgctc tcgtaaatac 360
accagttggt atgtggcact gaaacgtact ggtcagtata aacttggttc caaaacagga 420
ccaggtcaga aagctattct gtttcttcca atgtctgcta agagctga 468
<210> 3
<211> 155
<212> Protein1
<213> 人工序列
<400> 3
MAAGSITTLP ALPEDGGSGA FPPGHFKDPK RLYCKNGGFF LRIHPDGRVD GVREKSDPHI 60
KLQLQAEESG VVSIKGVCAN RYLAMKEDGR LLASKCVTDE CFFFERLESN NYNTYRSRKY 120
TSWYVALKRT GQYKLGSKTG PGQKAILFLP MSAKS 155
<210> 4
<211> 978
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgggccatc accatcacca tcacgctgat gaacaagaag agaaagctaa agttcgtact 60
gaattaattc aagagttagc tcagggatta gggggtattg agaagaaaaa ttttccaact 120
ttaggtgatg aagatttaga tcatacttat atgacaaagc tgttaacata cctgcaggaa 180
cgcgaacaag ctgagaatag ttggcgtaaa cgtctgttaa agggtataca agatcatgcc 240
cttgatctgg tgccacgcgg tagtcccggg ctgccagggc cacgtggtga acaaggacca 300
acaggtccaa ccggacctgc tggtccacga ggtctgcaag gtctgcaagg tctgcaaggt 360
gaacgtgggg aacaaggacc aacaggtccc gctggtccac gaggtctgca aggtgaacgt 420
ggggaacaag gaccaacagg tctcgctggt aaagccggtg aagctggagc caaaggcgaa 480
accggccccg ctggtccaca gggtccacgt ggtgaacaag gcccgcaagg tcttccaggt 540
aaagatggtg aagctggtgc tcaaggccca gcaggtccaa tgggtcctgc tggtgagcgc 600
ggtgaaaaag gagaacctgg cacccaaggc gctaaaggtg atcgcggtga aaccggtcca 660
gtaggtccac gtggtgagcg aggcgaagcc ggtcccgctg gaaaagatgg tgaacgtggt 720
ccagtaggtc cagctggtaa ggacggccaa aacggccaag atggtcttcc aggtaaagac 780
ggtaaggacg gccaaaacgg taaagatggt cttccaggta aagacggtaa ggacggccaa 840
aacggtaaag atggtcttcc aggtaaagac ggtaaggacg gtcaagatgg taaagacggc 900
ctcccaggta aagacggtaa agatggcctc ccaggtaagg acggtaagga cggtcaacca 960
ggtaaaccgg gtaaatat 978
<210> 5
<211> 326
<212> Protein1
<213> 人工序列
<400> 5
MGHHHHHHAD EQEEKAKVRT ELIQELAQGL GGIEKKNFPT LGDEDLDHTY MTKLLTYLQE 60
REQAENSWRK RLLKGIQDHA LDLVPRGSPG LPGPRGEQGP TGPTGPAGPR GLQGLQGLQG 120
ERGEQGPTGP AGPRGLQGER GEQGPTGLAG KAGEAGAKGE TGPAGPQGPR GEQGPQGLPG 180
KDGEAGAQGP AGPMGPAGER GEKGEPGTQG AKGDRGETGP VGPRGERGEA GPAGKDGERG 240
PVGPAGKDGQ NGQDGLPGKD GKDGQNGKDG LPGKDGKDGQ NGKDGLPGKD GKDGQDGKDG 300
LPGKDGKDGL PGKDGKDGQP GKPGKY 326
<210> 6
<211> 978
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atgggccatc accatcacca tcacgctgat gaacaagaag agaaagctaa agttcgtact 60
gaattaattc aagagttagc tcagggatta gggggtattg agaagaaaaa ttttccaact 120
ttaggtgatg aagatttaga tcatacttat atgacaaagc tgttaacata cctgcaggaa 180
cgcgaacaag ctgagaatag ttggcgtaaa cgtctgttaa agggtataca agatcatgcc 240
cttgatctgg tgccacgcgg tagtcccggg ctgccagggc cacgtggtga acaaggacca 300
acaggtccaa ccggacctgc tggtccacga ggtctgcaag gtctgcaagg tctgcaaggt 360
gaacgtgggg aacaaggacc aacaggtccc gctggtccac gaggtctgca aggtgaacgt 420
ggggaacaag gaccaacagg tctcgctggt aaagccggtg aagctggagc caaaggcgaa 480
accggccccg ctggtccaca gggtccacgt ggtgaacaag gcccgcaagg tcttccaggt 540
aaacgtggtg atgctggtgc tcaaggcagg ccgggtaagc ggggtaaaca gggccagaag 600
ggtgaaaaag gagaacgtgg cgatcaaggc gctaaaggtg atcgcggtga aaccggtcca 660
gtaggtccac gtggtgagcg aggcgatgcc ggtcccgctg gaaaagatgg tgaacgtggt 720
ttcccgggtg agaggggcgt cgagggccaa aacggccaag atggtcttcc aggtaaagac 780
ggtaaggacg gccaaaacgg taaagatggt cttccaggta aagacggtaa ggacggccaa 840
aacggtaaag atggtcttcc aggtaaagac ggtaaggacg gtcaagatgg taaagacggc 900
ctcccaggta aagacggtaa agatggcctc ccaggtaagg acggtaagga cggtcaacca 960
ggtaaaccgg gtaaatat 978
<210> 7
<211> 326
<212> Protein1
<213> 人工序列
<400> 7
MGHHHHHHAD EQEEKAKVRT ELIQELAQGL GGIEKKNFPT LGDEDLDHTY MTKLLTYLQE 60
REQAENSWRK RLLKGIQDHA LDLVPRGSPG LPGPRGEQGP TGPTGPAGPR GLQGLQGLQG 120
ERGEQGPTGP AGPRGLQGER GEQGPTGLAG KAGEAGAKGE TGPAGPQGPR GEQGPQGLPG 180
KRGDAGAQGR PGKRGKQGQK GEKGERGDQG AKGDRGETGP VGPRGERGDA GPAGKDGERG 240
FPGERGVEGQ NGQDGLPGKD GKDGQNGKDG LPGKDGKDGQ NGKDGLPGKD GKDGQDGKDG 300
LPGKDGKDGL PGKDGKDGQP GKPGKY 326
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ttaactttaa gaaggagata taccatgggc catcaccatc accatcacgc 50
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cagtggtggt ggtggtggtg tcactcgaga tatttacccg gtttacctgg 50
<210> 10
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
taaacgtggt gatgctggtg ctcaaggcag gccgggtaag cggggtaaac agggccagaa 60
gggtgaaaaa ggagaacgtg gcgatca 87
<210> 11
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ttgagcacca gcatcaccac gtttacctgg aagaccttgc g 41
<210> 12
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ggccaaaacg gccaagatgg tcttccaggt aaagac 36
<210> 13
<211> 95
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ggaagaccat cttggccgtt ttggccctcg acgcccctct cacccgggaa accacgttca 60
ccatcttttc cagcgggacc ggcatcgcct cgctc 95
<210> 14
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ggtaaaccgg gtaaatatct cgaggatgac gatgacaaga tggcagccgg tagcattacc 60
acgctg 66
<210> 15
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tggtggtggt gctcgagtca gctcttagca gacattggaa g 41
<210> 16
<211> 15
<212> Protein1
<213> 人工序列
<400> 16
ASPASPASPA SPLYS 15

Claims (5)

1.一种类胶原蛋白-人碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白，其特征在于：该融合蛋白全长488个氨基酸，其氨基酸序列为序列表中SEQ NO.1，氮端为经修饰的化脓链球菌来源的类胶原蛋白Scl2-M，Scl2-M蛋白长度为327个氨基酸，其氨基酸序列为序列表中的SEQ NO.7，碳端为人碱性成纤维细胞生长因子hbFGF，hbFGF蛋白长度为155个氨基酸，其氨基酸序列为序列表中的SEQ NO.2，Scl2-M蛋白和hbFGF蛋白这两个肽段之间含有肠激酶酶切位点。
2.根据权利要求1所述的类胶原蛋白-人碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白，其特征在于：所述的肠激酶酶切位点序列为Asp-Asp-Asp-Asp-Lys。
3.一种类胶原蛋白-人碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的制备方法，其特征在于它包括下述步骤：
（1）类胶原蛋白-人碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白表达载体的构建：
1.1人碱性成纤维细胞生长因子和类胶原蛋白Scl2基因的全合成：
根据大肠杆菌密码子偏爱性用表，对人碱性成纤维细胞生长因子和类胶原蛋白Scl2的基因序列进行密码子优化；分别获得pUC19-hbFGF和pET28a-Scl2质粒；
1.2类胶原蛋白Scl2-M的获取：
通过PCR技术将整合素结合位点（GERGFPGERGVE）、肝素结合位点（GRPGKPGKQGQK）和RGD等位点整合到Scl2原始基因序列中，获得基因Scl2-M并将该基因连接到载体pET28a上，获得pET28a-Scl2-M质粒；
1.3融合蛋白表达载体的构建：
通过PCR扩增和利用一步法定向克隆技术，将hbFGF基因和Scl2-M基因进行融合，获得融合蛋白表达载体pET28a-Scl2-M-hbFGF；
（2）融合蛋白的表达：
将表达载体pET28a-Scl2-M-hbFGF转化至大肠杆菌BL21 (DE3)并挑取重组子进行诱导表达；
（3）融合蛋白的发酵培养：
对重组菌BL21 (DE3)/pET28a-Scl2-M-hbFGF进行间歇发酵并测定细胞生物量和目标蛋白含量；
（4）融合蛋白的亲和纯化：
采用Ni2+亲和层析对重组融合蛋白Scl2-M-hbFGF进行分离纯化；
（5）离子交换层析：
对纯的融合蛋白Scl2-M-hbFGF进行脱盐并置换成肠激酶缓冲液，肠激酶过夜酶切后采用离子交换法分别对重组蛋白Scl2-M和hbFGF进行分离纯化；
（6）生物活性测定：分别对重组蛋白Scl2-M和hbFGF进行生物活性的测定。
4.根据权利要求3所述的重组蛋白hbFGF的活性测定采用MTT测定法，所用细胞为成纤维细胞株NIH3T3。
5.根据权利要求3所述的重组蛋白Scl2-M的活性测定所用细胞为人急性单核细胞白血病细胞系THP-1。
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