CN114195876B

CN114195876B - 一种神经连接蛋白1的截短蛋白及其应用

Info

Publication number: CN114195876B
Application number: CN202111259540.8A
Authority: CN
Inventors: 吴丹; 郭艳芹; 袁晓环; 武艳; 史嘉翊; 张本卓; 黄青; 苏晓男
Original assignee: Mudanjiang Medical University
Current assignee: Mudanjiang Medical University
Priority date: 2021-10-28
Filing date: 2021-10-28
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2041-10-28
Also published as: CN114195876A

Abstract

本发明涉及生物领域，具体讲，涉及神经连接蛋白1的截短蛋白及其应用。神经连接蛋白1的截短蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明经实验发现，通过筛选获得的截短蛋白能缓解Aβ1‑42对SH‑SY5Y细胞的增殖抑制，改善Aβ1‑42对突触的毒性作用，缓解Aβ1‑42诱导的SH‑SY5Y细胞凋亡，说明该截短肽在制备治疗阿尔茨海默病方面、以及作为β‑淀粉样多肽抑制剂的应用。

Description

一种神经连接蛋白1的截短蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及生物领域，具体讲，涉及神经连接蛋白1的截短蛋白及其应用。

背景技术

神经连接蛋白1(Neuroligin-1，NL1)是一种存在于兴奋性突触内的突触后蛋白，与突出前蛋白Neurexin形成突触粘附对，共同维持突触的效能、稳定可塑性以及长期记忆的形成，NL1功能的改变所导致的突触结构和功能障碍与AD发病密切相关。体内外文献表明，AD患者脑内NL1结构受损，其中主要的受损分子机制为Aβ通过与NL1胞外区胆碱酯酶样结构域的相互作用损伤突触后蛋白。因此，NL1被认为是Aβ作用于兴奋性突触的潜在靶点。而可溶性NL1细胞外片段则可作为Aβ清除剂，保护海马神经元突触免受Aβ寡聚体的损伤。

课题组前期已成功构建可溶性NL-1的胞外结构片段(1-691aa)，该片段包括有AChE同源的区域。但该片段(1-691aa)由于蛋白分子量较大，在体内易降解或与Aβ的结合率低。因此，有必要对NL-1的结构进行生物信息学分析，筛选到“高效”的截短型蛋白，即“高效”与野生型的NL-1(wtNL-1)竞争结合Aβ，将具有更重要的意义。近年来，全球蛋白类药物的研发已涉及到各个领域。考虑到NL对Aβ的作用和蛋白类药物在临床上的潜在应用价值。因此，如果能依据NL结构筛选出能特异性结合Aβ的截短型NL蛋白，将会在AD的防治方面具有重要意义。但也要考虑到截短蛋白类药物具有稳定性差、体内半衰期短和不易通过生物膜等缺点，因此，最终制备的“高效”的截短型蛋白必须要克服以上缺点，并能够与野生型的NL-1(wtNL-1)竞争结合Aβ，发挥其应有的生物学活性，进而阻止过量Aβ引起的AD，为将来治疗AD在临床上的应用提供可能。

发明内容

本发明的发明目的在于提供一种神经连接蛋白1(Neuroligin-1)截短蛋白。

为了完成本发明的发明目的，采用的技术方案为：

本发明涉及一种神经连接蛋白1的截短蛋白，所述神经连接蛋白1的截短蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明涉及编码上述的神经连接蛋白1的截短蛋白的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

其中，5号蛋白核苷酸序列如下：

catggcggcagctacatggaaggcaccggcaatctgtatgatggtagcgttctcgcgagttacggcaacgttatcgtgatcacggtgaactaccgtctgggtgtgctgggttttctcagtacgggtgaccaagccgcgaagggcaattatggtctgctggatctcatccaagcgctgcgctggacgagcgaaaatatcggctttttcggcggtgacccgctgcgtattacggtgtttggtagcggcgcgggtggtagttgtgtgaatctgctcaccctcagtcactatagtgagggcaaccgctggagcaatagcacgaaaggtctgtttcagcgtgccattgcgcagagcggtaccgcgctgagcagctgggcggttagctttcaaccagcgaaatacgcccgtatgctggccaccaaagtgggctgcaacgtgagcgatacggtggaactcgttgagtgcctccagaagaagccgtacaaggagctggttgatcaagatatccagccggcccgctatcatatcgccttcggcccagtgattgatggcgacgtgatcccggacgacccgcagattctgatggagcaaggcgagttcctcaactacgacatcatgctgggcgtgaatcaaggcgagggcctcaaattcgtggagaatatcgtggacagcgatgatggcatcagtgccagtgacttcgatttcgccgtgagcaatttcgtggataatctctatggttatccagagggcaaggacgttctgcgtgagaccatcaagttcatgtacacggactgggcggatcgtcataatccggaaacccgccgtaagacgctgctggcgctgttcaccgatcatcagtgggttgcgccggccgtggcgaccgcggatctgcacagcaatttcggcagtccaacgtatttctacgcgttctaccaccactgccaaacggatcaagttccagcgtgggccgatgccgcccatggcgatgaagtgcca

本发明涉及含有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的原核表达载体。

本发明涉及一种重组工程菌，包含上述的重组表达载体系统。

可选的，所述重组工程菌为转染有重组表达载体系统的感受态大肠杆菌C43。

本发明涉及采用上述的重组工程菌诱导表达神经连接蛋白1截短蛋白的方法，其特征在于，所述重组工程菌37℃培养2h加IPTG诱导，IPTG的浓度为0.1mmol/L，诱导时间为12h。

本发明涉及如上述的截短蛋白在制备治疗阿尔茨海默病中的应用。

本发明涉及一种β-淀粉样多肽抑制剂，所述β-淀粉样多肽抑制剂中含有如权利要求1所述的截短蛋白。

本发明至少具有以下有益的效果：

本发明经实验发现，通过筛选获得的截短蛋白能缓解Aβ1-42对SH-SY5Y细胞的增殖抑制，改善Aβ1-42对突触的毒性作用，缓解Aβ1-42诱导的SH-SY5Y细胞凋亡，说明该截短肽在制备治疗阿尔茨海默病方面、以及作为β-淀粉样多肽(Amyloidβ-peptide)抑制剂的应用。

附图说明

图1为NL1细胞外区域、重复基序和特征的预测分析图；

图2为STRING数据库分析预测NL1功能伙伴的分析图；

图3为预测蛋白质翻译后修饰功能区域的示意图；

图4为质粒中目的片段、载体、酶切位点结构示意图；

图5为5种NL1细胞外截短片段PCR扩增产物的电泳图；其中，M:DS 5000Marker；1-5:tNL1①-⑤片段；

图6为5种截短片段双酶切的电泳图；其中，M:DS 5000Marker；1-5:tNL1①-⑤双酶切产物；

图7为5种截短片段菌液PCR鉴定图，其中，M:DS 5000Marker；1-5:tNL1①-⑤菌液PCR产物；

图8为tNL1①-⑤重组质粒PCR鉴定图；其中，M:DS 5000Marker；1-5:tNL1①-⑤质粒PCR鉴定；

图9为tNL1①-⑤重组质粒双酶切鉴定图；其中，M:DS 5000Marker；1-5:tNL1①-⑤质粒双酶切鉴定；

图10为tNL1重组蛋白①-⑤诱导表达检测图；其中，M：蛋白分子Marker；C、SN：④、⑤、①、③、②号全菌、上清液；

图11为tNL1重组蛋白诱导表达优化后的电泳图；其中，M：蛋白分子Marker；C、SN、F、B分别是诱导后tNL1①-⑤截短蛋白的全菌、上清液、流穿液、清洗后beads；

图12为tNL1①-⑤的洗脱后的电泳图；M：蛋白分子Marker；E、E'、B：tNL1①、②、③、⑤、④的两次洗脱液和洗脱后beads；

图13为1号tNL1作用于细胞MTT检测统计图；

图14为2号tNL1作用于细胞MTT检测统计图；

图15为3号tNL1作用于细胞MTT检测统计图；***:p<0.05；

图16为4号tNL1作用于细胞MTT检测统计图；***:P<0.05；

图17为5号tNL1作用于细胞MTT检测统计图；***:P<0.01，#：P<0.05；

图18为5号tNL1prescission protease酶切图；从左至右依次为：Maker、纯化后的5号tNL-1、酶切后的5号tNL-1、gst标签蛋白；

图19为PSD95蛋白Western blot检测；其中：M、C、B、A：Maker、对照组、造模组(10μmol/LAβ1-42)、加药组(Aβ1-42+40μg/L 5号tNL-1)；

图20为PSD95蛋白Western blot检测统计结果；模型组比较，*P<0.05；

图21为Bcl2、Bax蛋白Western blot检测结果图；其中：M、C、B、A：Maker、对照组、造模组(10μmol/LAβ1-42)、加药组(Aβ1-42+40μg/L5号tNL-1)；

图22为Bcl2、Bax蛋白Western blot检测统计结果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例实验通过生物信息学分析、DNA分子克隆、蛋白质纯化、蛋白免疫印迹、细胞实验技术手段，成功构建出tNL-1原核表达载体，并获得了转染有该tNL-1原核表达载体的重组工程菌，制备得到了截短蛋白，并通过细胞实验验证了生物活性。

本发明实施例通过使用在线工具Protparam预测蛋白质基本理化性质发现，NL1蛋白质细胞外区域含有2073位氨基酸，分子质量(Molecular weight)76877.19kD，分子式为C₃₄₆₈H₅₃₀₂N₉₁₂O₁₀₂₁S₂₄，等电点(Theoretical pI)5.30。体外半衰期(Estimated half-life)(哺乳动物网织红细胞)为30h，酵母菌(体内)20h，大肠杆菌(体内)10h。Cys、Thr和Gly在NL1氨基酸组成中占比相对较高。不稳定指数(Instability index)为44.15，归类为不稳定氨基酸。脂肪族指数(Aliphatic index)：28.75。平均亲水性(Grand average ofhydropathicity(GRAVY))：0.756，定义为疏水性氨基酸，可推断NL1蛋白质细胞外区域为疏水性蛋白质，在维持蛋白质三级结构稳定中起着重要作用。

本发明实施例通过运用SMART软件预测NL1细胞外区域、重复基序和特征，分析显示其包含了一个共酯酶(胆碱酯酶-羧酸酯酶)结构域COesterase(51-606)；一个水解酶结构域Abhydrolase(176-282)和一个跨膜区Transmembrane region(677-699)，如表1和图1所示。

表1预测结构域，重复基序和特征

神经连接蛋白属于一类含有胆碱酯酶样结构域(CLD，Cholinesterase-likedomain)的分子家族，称为胆碱酯酶样粘附分子(CLMS)，其中包括谷胱甘肽、神经肌动蛋白和胶质细胞凝集素。与胆碱酯酶不同的是，神经连接蛋白在位于CLD内的催化三联体中缺少一个残基，这使得它们在酶学上没有活性。因此，CLD不是介导酶-底物相互作用，而是参与受体-配体相互作用。

本发明实施例从STRING数据库分析蛋白质相互作用，预测功能伙伴。突触组织复合物是跨突触粘附分子，具有维持突触前和突触后稳定性的能力，被认为是突触形成、成熟、维持和可塑性的重要分子信号。神经连接蛋白(NLGN)-神经氨酸酶(NRXs)复合物是研究最多的突触组织复合物之一，该复合物的突变是易患自闭症和精神分裂症等认知障碍的遗传决定因素。内源性NL1几乎完全位于兴奋性突触的突触后膜，它可与PDZ蛋白如PSD-95和S-SCAM相互作用。这些相互作用使神经配体蛋白1与其他蛋白偶联，如TARP家族成员、GKAP、Shank(支架柄蛋白)、Cortactin、SynGAP和谷氨酸受体，如图2所示。Shank是神经元突触正常形成和功能所必需的，通过与DLG4(PSD-95，突触后密度95蛋白)的相互作用与NLGN细胞粘附分子相连，以促进细胞骨架和信号复合物的突触后稳定。

本发明实施例运用PTMcode软件分析蛋白质翻译后修饰位点，发现该蛋白中有12个蛋白修饰位点(磷酸化位点4个，N-糖基化位点4个，O-GalNAc糖基化位点2个，O-联糖基化位点2个)，如图3、表2。体外研究表明，阻断NL1 N-糖基化可增加其与Neuroxin-1β结合的能力。分析后预测其中有8个修饰位点两两相关联，根据此关联设计截短体。

表2 NL1翻译后修饰

编号	功能位点1	位点1	功能位点2	位点2
					功能关联1	O-联糖基化	666	N-联糖基化	283
功能关联2	O-乙酰葡糖胺糖基化	666	N-联糖基化	283
					功能关联3	磷酸化	713	N-联糖基化	109
功能关联4	磷酸化	699	N-联糖基化	323
					功能关联5	磷酸化	699	N-联糖基化	109
功能关联6	N-联糖基化	323	N-联糖基化	109
					功能关联7	O-联糖基化	663	O-乙酰葡糖胺糖基化	663
功能关联8	O-联糖基化	666	O-乙酰葡糖胺糖基化	666

本发明实施例基于以上生物信息学结果，构建pGEx-6P1-tNL1重组表达载体。已知NL1细胞外片段长691个氨基酸，2073bp。本发明实施例设计了五个截短片段。设计引物对目的基因进行PCR扩增，获得目的基因片段，获得重组质粒；分别转入感受态细胞中，获得了5种截短肽。

氨基酸序列如表3所示：

表3

本发明实施例以人神经母细胞瘤细胞SHSY-5Y作为实验对象，MTT法检测1-5号截短蛋白其对细胞活力的影响。实验结果显示，5号截短肽可显著缓解Aβ对SH-SY5Y细胞模型的增殖抑制。将5号截短肽继续作用于SH-SY5Y细胞模型发现，5号截短肽能通过缓解Aβ1-42对SH-SY5Y细胞突触毒性作用，5号截短肽能通过调节Bcl-2/Bax的表达活性缓解Aβ1-42诱导的SH-SY5Y细胞凋亡，从而完成本发明实施例。

具体的，在蛋白表达纯化过程中，本发明实施例还对诱导表达的条件进行了筛选，针对不同的诱导温度：37℃(+IPTG)、37℃(-IPTG)、25℃、16℃)，不同诱导时机：分别培养2h、3h、4h、5h后加0.3mM IPTG，不同的IPTG浓度：0.1mM、0.2mM、0.3mM和0.4mM进行筛选。

经实验发现：37℃培养2h加IPTG诱导为最佳诱导时机，IPTG诱导浓度为0.1mmol/L，最佳诱导时间为12h。摸索纯化条件，当诱导温度一定时，通过不断改变接菌时间、诱导浓度，得到大小与预期一致的截短蛋白，见图11，其37℃培养2h加IPTG诱导为最佳诱导时机，IPTG诱导浓度为0.1mmol/L，最佳诱导时间为12h。

给出以下实验所需的原料的来源和仪器型号。

实验材料

1、细胞株与质粒

人神经母细胞瘤SHSY-5Y细胞株从武汉普诺赛生命科技有限公司购买。pGEx-6P1载体从苏州金唯智生物科技公司购买。

2、主要仪器设备如表4：

表4

3、主要试剂与耗材如表5：

表5

4、抗体及试剂盒如表6：

表6

实施例1

1分子克隆构建pGEx-6P1-tNL1重组质粒与鉴定

2.1分析质粒中目的片段、载体、酶切位点结构示意图，其中，图4为质粒中目的片段、载体、酶切位点结构示意图，其中，重组质粒包含XhoI、BamHI酶切位点，GST蛋白标签。

1.2pGEx-6P1-tNL1重组表达载体构建与鉴定

基于以上生物信息学结果，构建pGEx-6P1-tNL1重组表达载体。已知NL1细胞外片段长691个氨基酸，2073bp。实验设计的截短片段分别为①.NL 283-666(1149bp)；②.NL109-691(1746bp)；③.NL 323-691(1104bp)；④.NL 260-510(750bp)；⑤.NL 180-510(990bp)。

1.3PCR方法扩增、获得目的基因片段

加入引物对目的基因进行PCR扩增，引物设计如表7所示：

表7

对其产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，出现与目的基因分别相等大小的DNA条带，如图5和图6所示。图5为5种NL1细胞外截短片段PCR扩增产物电泳图，图6为5种截短片段双酶切电泳图。

试剂盒回收目的基因片段。通过BamHI和XhoI双酶切目的片段获得与预期大小一致的带有粘性末端的目的条带。

1.4重组质粒菌液PCR鉴定

通过T4连接酶将pGEx-6P1载体与tNL1酶切产物在4℃连接过夜，连接体系为15μL体系，包括T4连接酶1μL、10X T4连接酶buffer 1.5μL，pGEx-6P1载体1μL，tNL1酶切产物11.5μL。该连接产物转化DH5α感受态细胞，菌落进行菌液PCR筛选阳性克隆，如图7所示，挑取阳性克隆培养。

1.5筛选菌液PCR阳性克隆

挑点培养提质粒，使用DNA小提试剂盒提取tNL1重组质粒，进行质粒PCR验证，如图8。质粒使用BamHI、XhoI内切酶进行质粒双酶切验证得到与预期大小一致的两个条带，如图9，并送公司测序，测序结果显示成功构建pGEx-6P-1-tNL1①-⑤重组质粒。

实施例2蛋白表达纯化：

1、tNL1蛋白表达检测

构建并得到重组质粒pGEx-6P-1-tNL1，将其分别转入感受态细胞C43(DE3)中，将挑菌培养的LB培养基按1:200转接到灭菌的LB培养基(含氨苄青霉素+)，当OD600值达到0.6-0.8时，以IPTG诱导菌液，收集菌体、洗涤重悬，超声破碎至液体清亮，离心收集上清，制样进行SDS-PAGE检测。结果表明：tNL1①-⑤重组蛋白分别在68kd、90kd、66kd、53kd、62kd左右表达，全菌表达较高，上清中可溶表达含量较低，如图10。因此推测构建的5种蛋白大部分呈包涵体表达。

2、tNL1蛋白诱导表达条件优化后

摸索纯化条件，当诱导温度一定时，通过不断改变接菌时间、诱导浓度，得到大小与预期一致的截短蛋白，见图11，其37℃培养2h加IPTG诱导为最佳诱导时机，IPTG诱导浓度为0.1mmol/L，最佳诱导时间为12h。

3、tNL1重组蛋白的纯化、洗脱

GST亲和层析法纯化重组蛋白，使用GSH蛋白洗脱缓冲液洗脱蛋白4次并收集，SDS-PAGE结果分析：经GST纯化成功得到截短型tNL1重组蛋白，如图12。

实施例3：MTT检测1-5号截短蛋白对细胞增殖的影响

为了评估目标蛋白对Aβ诱导的细胞毒性的保护作用，选择SHSY-5Y作为实验对象，MTT法检测1-5号截短蛋白其对细胞活力的影响，以此作为蛋白在体外实验有效的作用依据，计算细胞存活率，生存率公式：实验组OD-空白组OD)/(模型组OD-空白组OD)×100％。

4.1酶标仪检测吸收光度值

1号截短蛋白作用于细胞MTT检测统计图如表8和图13所示；

表8 1号截短蛋白不同处理组对细胞增殖的影响(

％)

2号截短蛋白作用于细胞MTT检测统计图如表9和图14所示；

表9 2号截短蛋白不同处理组对细胞增殖的影响(

％)/>

3号截短蛋白作用于细胞MTT检测统计图如表10和图15所示；

表10 3号截短蛋白不同处理组对细胞增殖的影响(

％)

4号截短蛋白作用于细胞MTT检测统计图如表11和图16所示:

表11 4号截短蛋白不同处理组对细胞增殖的影响(

％)

5号截短蛋白作用于细胞MTT检测统计图如表12和图17所示；

表12 5号截短蛋白不同处理组对细胞增殖的影响(

％)

4.2MTT结果统计分析

设空白对照组、模型组(10μmol/L Aβ1-42)、实验组(Aβ+20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL 1-5号tNL-1蛋白)作用于细胞24h后，MTT法检测结果显示：(1)与对照组相比，Aβ处理组(模型组)细胞生存率显著降低，结果有统计学意义；与模型组相比，实验组5号截短蛋白缓解Aβ对SH-SY5Y细胞模型的的增殖抑制，结果有统计学意义。

实施例4：Prescission Protease酶切5号纯化蛋白

GST标签蛋白结合于纯化柱并用洗涤液充分洗涤后，再用10倍柱床体积PreScission Protease的酶切缓冲液平衡柱子。PreScission Protease的酶切缓冲液的组分为50mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mM EDTA，1mM DTT；将稀释好的1ml PreScissionProtease泵入纯化柱中，4℃保持4-8h(为确保酶切完全，可以4℃酶切过夜)。

实验结果如图18所示。根据图18可知：第一泳道为maker，第二泳道为带gst标签的截短蛋白5号，第三泳道为经过PreScission Protease酶切后去掉gst标签的截短蛋白5号，第四泳道为切掉的gst标签。

实施例5：截短蛋白5号对细胞突触相关蛋白的影响

突触后致密蛋白95(PSD95)是突触后致密区内含量最多的蛋白之一,影响着突触结构和功能的重塑。免疫印迹(Western blot)法检测PSD95蛋白相对表达水平。取经过培养与传代后的SH-SY5Y细胞，经胰蛋白酶消化后，吸取细胞悬液于15mL离心管内，以1500r/min离心5min，弃上清液，收集细胞，以MEM/F12重悬，以细胞密度3×10⁵个/孔接种于六孔板中，待细胞贴壁后，分三组，分别为对照组、造模组、加药组，加入10μmol/LAβ1-42，对照组加入等体积无血清培养基，造模24小时后，加药组加入40μg/L的5号t-NL-1，对照组加入等体积无血清培养基，继续培养24h后，弃掉旧培养基。以体积分数为0.25％的胰蛋白酶液消化细胞并离心后，弃上清，加入0.5mL PBS轻轻吹打沉淀的细胞，制作细胞悬液，每孔加入100μL细胞裂解液，12000rpm离心10分钟，取上清，用Nanodrop 2000进行蛋白定量。进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，每孔蛋白上样20μg，上样体积20μL。电泳后转移至硝酸纤维膜90min，用质量分数为5.00％脱脂牛奶室温封闭2h。将该膜与一抗室温孵育2h，TBST漂洗3次，每次10分钟。再将其与二抗在室温下反应1h，以TBST漂洗3次，经ECL反应液显影后，检测PSD95蛋白相对表达水平，为该蛋白条带的灰度值与内参β-actin灰度值的比值。实验重复3次。实验结果如图19和图20所示。

由图19和图20可知：与Aβ组相比，tNL-1组PSD95蛋白的表达上调(p<0.05)，以上实验数据表明5号tNL-1能通过缓解Aβ1-42对SH-SY5Y细胞突触毒性作用。

实施例6：截短蛋白5号对Aβ_1-42诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的影响

免疫印迹法检测BCL-2和BAX蛋白相对表达水平。Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2assaciated X protein，Bax)是一种促细胞凋亡蛋白，一般情况下，Bax表达水平越高，则更加有利于促进细胞凋亡的发生，而B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)是一种抗细胞凋亡蛋白。当Bax和Bcl-2比例改变时，可以调节细胞凋亡情况，当Bcl-2过表达时，细胞具有抗凋亡作用；相反，当Bax占优势时，细胞易发生凋亡。Western blot方法同上，Westernblot结果如图21和图22所示。

由图21和图22可知：与control组相比，Aβ组细胞中Bax蛋白的表达上调，Bcl-2蛋白的表达下调，且Bcl-2/Bax的比例下调(P<0.05)。与Aβ组相比，tNL-1组Bax蛋白的表达下调，Bcl-2蛋白的表达上调，且Bcl-2/Bax的比例上调(P<0.05)以上实验数据表明5号tNL-1能通过调节Bcl-2/Bax的表达活性缓解Aβ1-42诱导的SH-SY5Y细胞凋亡。

本申请虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本申请构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本申请的保护范围应当以本申请权利要求所界定的范围为准。

序列表

<110> 牡丹江医学院

<120> 一种神经连接蛋白1的截短蛋白及其应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 331

<212> PRT

<213> homo sapiens（human）

<400> 1

His Gly Gly Ser Tyr Met Glu Gly Thr Gly Asn Leu Tyr Asp Gly Ser

1 5 10 15

Val Leu Ala Ser Tyr Gly Asn Val Ile Val Ile Thr Val Asn Tyr Arg

20 25 30

Leu Gly Val Leu Gly Phe Leu Ser Thr Gly Asp Gln Ala Ala Lys Gly

35 40 45

Asn Tyr Gly Leu Leu Asp Leu Ile Gln Ala Leu Arg Trp Thr Ser Glu

50 55 60

Asn Ile Gly Phe Phe Gly Gly Asp Pro Leu Arg Ile Thr Val Phe Gly

65 70 75 80

Ser Gly Ala Gly Gly Ser Cys Val Asn Leu Leu Thr Leu Ser His Tyr

85 90 95

Ser Glu Gly Asn Arg Trp Ser Asn Ser Thr Lys Gly Leu Phe Gln Arg

100 105 110

Ala Ile Ala Gln Ser Gly Thr Ala Leu Ser Ser Trp Ala Val Ser Phe

115 120 125

Gln Pro Ala Lys Tyr Ala Arg Met Leu Ala Thr Lys Val Gly Cys Asn

130 135 140

Val Ser Asp Thr Val Glu Leu Val Glu Cys Leu Gln Lys Lys Pro Tyr

145 150 155 160

Lys Glu Leu Val Asp Gln Asp Ile Gln Pro Ala Arg Tyr His Ile Ala

165 170 175

Phe Gly Pro Val Ile Asp Gly Asp Val Ile Pro Asp Asp Pro Gln Ile

180 185 190

Leu Met Glu Gln Gly Glu Phe Leu Asn Tyr Asp Ile Met Leu Gly Val

195 200 205

Asn Gln Gly Glu Gly Leu Lys Phe Val Glu Asn Ile Val Asp Ser Asp

210 215 220

Asp Gly Ile Ser Ala Ser Asp Phe Asp Phe Ala Val Ser Asn Phe Val

225 230 235 240

Asp Asn Leu Tyr Gly Tyr Pro Glu Gly Lys Asp Val Leu Arg Glu Thr

245 250 255

Ile Lys Phe Met Tyr Thr Asp Trp Ala Asp Arg His Asn Pro Glu Thr

260 265 270

Arg Arg Lys Thr Leu Leu Ala Leu Phe Thr Asp His Gln Trp Val Ala

275 280 285

Pro Ala Val Ala Thr Ala Asp Leu His Ser Asn Phe Gly Ser Pro Thr

290 295 300

Tyr Phe Tyr Ala Phe Tyr His His Cys Gln Thr Asp Gln Val Pro Ala

305 310 315 320

Trp Ala Asp Ala Ala His Gly Asp Glu Val Pro

325 330

<210> 2

<211> 993

<212> DNA

<213> homo sapiens（human）

<400> 2

catggcggca gctacatgga aggcaccggc aatctgtatg atggtagcgt tctcgcgagt 60

tacggcaacg ttatcgtgat cacggtgaac taccgtctgg gtgtgctggg ttttctcagt 120

acgggtgacc aagccgcgaa gggcaattat ggtctgctgg atctcatcca agcgctgcgc 180

tggacgagcg aaaatatcgg ctttttcggc ggtgacccgc tgcgtattac ggtgtttggt 240

agcggcgcgg gtggtagttg tgtgaatctg ctcaccctca gtcactatag tgagggcaac 300

cgctggagca atagcacgaa aggtctgttt cagcgtgcca ttgcgcagag cggtaccgcg 360

ctgagcagct gggcggttag ctttcaacca gcgaaatacg cccgtatgct ggccaccaaa 420

gtgggctgca acgtgagcga tacggtggaa ctcgttgagt gcctccagaa gaagccgtac 480

aaggagctgg ttgatcaaga tatccagccg gcccgctatc atatcgcctt cggcccagtg 540

attgatggcg acgtgatccc ggacgacccg cagattctga tggagcaagg cgagttcctc 600

aactacgaca tcatgctggg cgtgaatcaa ggcgagggcc tcaaattcgt ggagaatatc 660

gtggacagcg atgatggcat cagtgccagt gacttcgatt tcgccgtgag caatttcgtg 720

gataatctct atggttatcc agagggcaag gacgttctgc gtgagaccat caagttcatg 780

tacacggact gggcggatcg tcataatccg gaaacccgcc gtaagacgct gctggcgctg 840

ttcaccgatc atcagtgggt tgcgccggcc gtggcgaccg cggatctgca cagcaatttc 900

ggcagtccaa cgtatttcta cgcgttctac caccactgcc aaacggatca agttccagcg 960

tgggccgatg ccgcccatgg cgatgaagtg cca 993

<210> 3

<211> 384

<212> PRT

<213> homo sapiens（human）

<400> 3

Asn Ser Thr Lys Gly Leu Phe Gln Arg Ala Ile Ala Gln Ser Gly Thr

1 5 10 15

Ala Leu Ser Ser Trp Ala Val Ser Phe Gln Pro Ala Lys Tyr Ala Arg

20 25 30

Met Leu Ala Thr Lys Val Gly Cys Asn Val Ser Asp Thr Val Glu Leu

35 40 45

Val Glu Cys Leu Gln Lys Lys Pro Tyr Lys Glu Leu Val Asp Gln Asp

50 55 60

Ile Gln Pro Ala Arg Tyr His Ile Ala Phe Gly Pro Val Ile Asp Gly

65 70 75 80

Asp Val Ile Pro Asp Asp Pro Gln Ile Leu Met Glu Gln Gly Glu Phe

85 90 95

Leu Asn Tyr Asp Ile Met Leu Gly Val Asn Gln Gly Glu Gly Leu Lys

100 105 110

Phe Val Glu Asn Ile Val Asp Ser Asp Asp Gly Ile Ser Ala Ser Asp

115 120 125

Phe Asp Phe Ala Val Ser Asn Phe Val Asp Asn Leu Tyr Gly Tyr Pro

130 135 140

Glu Gly Lys Asp Val Leu Arg Glu Thr Ile Lys Phe Met Tyr Thr Asp

145 150 155 160

Trp Ala Asp Arg His Asn Pro Glu Thr Arg Arg Lys Thr Leu Leu Ala

165 170 175

Leu Phe Thr Asp His Gln Trp Val Ala Pro Ala Val Ala Thr Ala Asp

180 185 190

Leu His Ser Asn Phe Gly Ser Pro Thr Tyr Phe Tyr Ala Phe Tyr His

195 200 205

His Cys Gln Thr Asp Gln Val Pro Ala Trp Ala Asp Ala Ala His Gly

210 215 220

Asp Glu Val Pro Tyr Val Leu Gly Ile Pro Met Ile Gly Pro Thr Glu

225 230 235 240

Leu Phe Pro Cys Asn Phe Ser Lys Asn Asp Val Met Leu Ser Ala Val

245 250 255

Val Met Thr Tyr Trp Thr Asn Phe Ala Lys Thr Gly Asp Pro Asn Gln

260 265 270

Pro Val Pro Gln Asp Thr Lys Phe Ile His Thr Lys Pro Asn Arg Phe

275 280 285

Glu Glu Val Ala Trp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Asp Gln Leu Tyr Leu

290 295 300

His Ile Gly Leu Lys Pro Arg Val Lys Glu His Tyr Arg Ala Asn Lys

305 310 315 320

Val Asn Leu Trp Leu Glu Leu Val Pro His Leu His Asn Leu Asn Asp

325 330 335

Ile Ser Gln Tyr Thr Ser Thr Thr Thr Lys Val Pro Ser Thr Asp Ile

340 345 350

Thr Phe Arg Pro Thr Arg Lys Asn Ser Val Pro Val Thr Ser Ala Phe

355 360 365

Pro Thr Ala Lys Gln Asp Asp Pro Lys Gln Gln Pro Ser Pro Phe Ser

370 375 380

<210> 4

<211> 583

<212> PRT

<213> homo sapiens（human）

<400> 4

Asn Ala Thr Gln Phe Ala Pro Val Cys Pro Gln Asn Ile Ile Asp Gly

1 5 10 15

Arg Leu Pro Glu Val Met Leu Pro Val Trp Phe Thr Asn Asn Leu Asp

20 25 30

Val Val Ser Ser Tyr Val Gln Asp Gln Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu

35 40 45

Asn Ile Tyr Val Pro Thr Glu Asp Asp Ile Arg Asp Ser Gly Gly Pro

50 55 60

Lys Pro Val Met Val Tyr Ile His Gly Gly Ser Tyr Met Glu Gly Thr

65 70 75 80

Gly Asn Leu Tyr Asp Gly Ser Val Leu Ala Ser Tyr Gly Asn Val Ile

85 90 95

Val Ile Thr Val Asn Tyr Arg Leu Gly Val Leu Gly Phe Leu Ser Thr

100 105 110

Gly Asp Gln Ala Ala Lys Gly Asn Tyr Gly Leu Leu Asp Leu Ile Gln

115 120 125

Ala Leu Arg Trp Thr Ser Glu Asn Ile Gly Phe Phe Gly Gly Asp Pro

130 135 140

Leu Arg Ile Thr Val Phe Gly Ser Gly Ala Gly Gly Ser Cys Val Asn

145 150 155 160

Leu Leu Thr Leu Ser His Tyr Ser Glu Gly Asn Arg Trp Ser Asn Ser

165 170 175

Thr Lys Gly Leu Phe Gln Arg Ala Ile Ala Gln Ser Gly Thr Ala Leu

180 185 190

Ser Ser Trp Ala Val Ser Phe Gln Pro Ala Lys Tyr Ala Arg Met Leu

195 200 205

Ala Thr Lys Val Gly Cys Asn Val Ser Asp Thr Val Glu Leu Val Glu

210 215 220

Cys Leu Gln Lys Lys Pro Tyr Lys Glu Leu Val Asp Gln Asp Ile Gln

225 230 235 240

Pro Ala Arg Tyr His Ile Ala Phe Gly Pro Val Ile Asp Gly Asp Val

245 250 255

Ile Pro Asp Asp Pro Gln Ile Leu Met Glu Gln Gly Glu Phe Leu Asn

260 265 270

Tyr Asp Ile Met Leu Gly Val Asn Gln Gly Glu Gly Leu Lys Phe Val

275 280 285

Glu Asn Ile Val Asp Ser Asp Asp Gly Ile Ser Ala Ser Asp Phe Asp

290 295 300

Phe Ala Val Ser Asn Phe Val Asp Asn Leu Tyr Gly Tyr Pro Glu Gly

305 310 315 320

Lys Asp Val Leu Arg Glu Thr Ile Lys Phe Met Tyr Thr Asp Trp Ala

325 330 335

Asp Arg His Asn Pro Glu Thr Arg Arg Lys Thr Leu Leu Ala Leu Phe

340 345 350

Thr Asp His Gln Trp Val Ala Pro Ala Val Ala Thr Ala Asp Leu His

355 360 365

Ser Asn Phe Gly Ser Pro Thr Tyr Phe Tyr Ala Phe Tyr His His Cys

370 375 380

Gln Thr Asp Gln Val Pro Ala Trp Ala Asp Ala Ala His Gly Asp Glu

385 390 395 400

Val Pro Tyr Val Leu Gly Ile Pro Met Ile Gly Pro Thr Glu Leu Phe

405 410 415

Pro Cys Asn Phe Ser Lys Asn Asp Val Met Leu Ser Ala Val Val Met

420 425 430

Thr Tyr Trp Thr Asn Phe Ala Lys Thr Gly Asp Pro Asn Gln Pro Val

435 440 445

Pro Gln Asp Thr Lys Phe Ile His Thr Lys Pro Asn Arg Phe Glu Glu

450 455 460

Val Ala Trp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Asp Gln Leu Tyr Leu His Ile

465 470 475 480

Gly Leu Lys Pro Arg Val Lys Glu His Tyr Arg Ala Asn Lys Val Asn

485 490 495

Leu Trp Leu Glu Leu Val Pro His Leu His Asn Leu Asn Asp Ile Ser

500 505 510

Gln Tyr Thr Ser Thr Thr Thr Lys Val Pro Ser Thr Asp Ile Thr Phe

515 520 525

Arg Pro Thr Arg Lys Asn Ser Val Pro Val Thr Ser Ala Phe Pro Thr

530 535 540

Ala Lys Gln Asp Asp Pro Lys Gln Gln Pro Ser Pro Phe Ser Val Asp

545 550 555 560

Gln Arg Asp Tyr Ser Thr Glu Leu Ser Val Thr Ile Ala Val Gly Ala

565 570 575

Ser Leu Leu Phe Leu Asn Ile

580

<210> 5

<211> 369

<212> PRT

<213> homo sapiens（human）

<400> 5

Asn Val Ser Asp Thr Val Glu Leu Val Glu Cys Leu Gln Lys Lys Pro

1 5 10 15

Tyr Lys Glu Leu Val Asp Gln Asp Ile Gln Pro Ala Arg Tyr His Ile

20 25 30

Ala Phe Gly Pro Val Ile Asp Gly Asp Val Ile Pro Asp Asp Pro Gln

35 40 45

Ile Leu Met Glu Gln Gly Glu Phe Leu Asn Tyr Asp Ile Met Leu Gly

50 55 60

Val Asn Gln Gly Glu Gly Leu Lys Phe Val Glu Asn Ile Val Asp Ser

65 70 75 80

Asp Asp Gly Ile Ser Ala Ser Asp Phe Asp Phe Ala Val Ser Asn Phe

85 90 95

Val Asp Asn Leu Tyr Gly Tyr Pro Glu Gly Lys Asp Val Leu Arg Glu

100 105 110

Thr Ile Lys Phe Met Tyr Thr Asp Trp Ala Asp Arg His Asn Pro Glu

115 120 125

Thr Arg Arg Lys Thr Leu Leu Ala Leu Phe Thr Asp His Gln Trp Val

130 135 140

Ala Pro Ala Val Ala Thr Ala Asp Leu His Ser Asn Phe Gly Ser Pro

145 150 155 160

Thr Tyr Phe Tyr Ala Phe Tyr His His Cys Gln Thr Asp Gln Val Pro

165 170 175

Ala Trp Ala Asp Ala Ala His Gly Asp Glu Val Pro Tyr Val Leu Gly

180 185 190

Ile Pro Met Ile Gly Pro Thr Glu Leu Phe Pro Cys Asn Phe Ser Lys

195 200 205

Asn Asp Val Met Leu Ser Ala Val Val Met Thr Tyr Trp Thr Asn Phe

210 215 220

Ala Lys Thr Gly Asp Pro Asn Gln Pro Val Pro Gln Asp Thr Lys Phe

225 230 235 240

Ile His Thr Lys Pro Asn Arg Phe Glu Glu Val Ala Trp Thr Arg Tyr

245 250 255

Ser Gln Lys Asp Gln Leu Tyr Leu His Ile Gly Leu Lys Pro Arg Val

260 265 270

Lys Glu His Tyr Arg Ala Asn Lys Val Asn Leu Trp Leu Glu Leu Val

275 280 285

Pro His Leu His Asn Leu Asn Asp Ile Ser Gln Tyr Thr Ser Thr Thr

290 295 300

Thr Lys Val Pro Ser Thr Asp Ile Thr Phe Arg Pro Thr Arg Lys Asn

305 310 315 320

Ser Val Pro Val Thr Ser Ala Phe Pro Thr Ala Lys Gln Asp Asp Pro

325 330 335

Lys Gln Gln Pro Ser Pro Phe Ser Val Asp Gln Arg Asp Tyr Ser Thr

340 345 350

Glu Leu Ser Val Thr Ile Ala Val Gly Ala Ser Leu Leu Phe Leu Asn

355 360 365

Ile

<210> 6

<211> 251

<212> PRT

<213> homo sapiens（human）

<400> 6

Ser Gly Ala Gly Gly Ser Cys Val Asn Leu Leu Thr Leu Ser His Tyr

1 5 10 15

Ser Glu Gly Asn Arg Trp Ser Asn Ser Thr Lys Gly Leu Phe Gln Arg

20 25 30

Ala Ile Ala Gln Ser Gly Thr Ala Leu Ser Ser Trp Ala Val Ser Phe

35 40 45

Gln Pro Ala Lys Tyr Ala Arg Met Leu Ala Thr Lys Val Gly Cys Asn

50 55 60

Val Ser Asp Thr Val Glu Leu Val Glu Cys Leu Gln Lys Lys Pro Tyr

65 70 75 80

Lys Glu Leu Val Asp Gln Asp Ile Gln Pro Ala Arg Tyr His Ile Ala

85 90 95

Phe Gly Pro Val Ile Asp Gly Asp Val Ile Pro Asp Asp Pro Gln Ile

100 105 110

Leu Met Glu Gln Gly Glu Phe Leu Asn Tyr Asp Ile Met Leu Gly Val

115 120 125

Asn Gln Gly Glu Gly Leu Lys Phe Val Glu Asn Ile Val Asp Ser Asp

130 135 140

Asp Gly Ile Ser Ala Ser Asp Phe Asp Phe Ala Val Ser Asn Phe Val

145 150 155 160

Asp Asn Leu Tyr Gly Tyr Pro Glu Gly Lys Asp Val Leu Arg Glu Thr

165 170 175

Ile Lys Phe Met Tyr Thr Asp Trp Ala Asp Arg His Asn Pro Glu Thr

180 185 190

Arg Arg Lys Thr Leu Leu Ala Leu Phe Thr Asp His Gln Trp Val Ala

195 200 205

Pro Ala Val Ala Thr Ala Asp Leu His Ser Asn Phe Gly Ser Pro Thr

210 215 220

Tyr Phe Tyr Ala Phe Tyr His His Cys Gln Thr Asp Gln Val Pro Ala

225 230 235 240

Trp Ala Asp Ala Ala His Gly Asp Glu Val Pro

245 250

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaaattggat ccaatagcac gaaaggtctg ttt 33

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaaattctcg agtcaactga acgggctcgg ctgttg 36

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaaattggat ccaatgcgac ccagttcgcg ccg 33

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaaattctcg agtcagatgt tcagaaacag cagact 36

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gaaattggat ccaacgtgag cgatacggtg gaa 33

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gaaattctcg agtcagatgt tcagaaacag cagact 36

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gaaattggat ccagcggcgc gggtggtagt tgt 33

<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gaaattctcg agtcatggca cttcatcgcc atgggc 36

<210> 15

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gaaattggat cccatggcgg cagctacatg gaa 33

<210> 16

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gaaattctcg agtcatggca cttcatcgcc atgggc 36

Claims

1.一种神经连接蛋白1的截短蛋白，其特征在于，所述神经连接蛋白1的截短蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.含有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的原核表达载体，所述SEQ ID NO:2所示核苷酸序列为编码如权利要求1所述的神经连接蛋白1的截短蛋白的核苷酸序列。

3.一种重组工程菌，包含如权利要求2所述的重组表达载体系统。

4.根据权利要求3所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌为转染有重组表达载体系统的感受态大肠杆菌C43。

5.采用如权利要求3所述的重组工程菌诱导表达神经连接蛋白1截短蛋白的方法，其特征在于，所述重组工程菌37℃培养2h加IPTG诱导，IPTG的浓度为0.1mmol/L，诱导时间为12h。

6.如权利要求1所述的截短蛋白在制备用于治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。

7.一种β-淀粉样多肽抑制剂，其特征在于，所述β-淀粉样多肽抑制剂中含有如权利要求1所述的截短蛋白。