CN105683216B - 人源egf结构域蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
公开了人源EGF结构域蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：1498任一项所示。所述人源EGF结构域蛋白能用于治疗革兰氏阴性菌感染及内毒素血症。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，特别涉及人源EGF结构域蛋白及其在制药中的应用。
背景技术
革兰氏阴性菌泛指在革兰氏染色反应中呈现红色的细菌。由于细胞壁结构的不同，在革兰氏染色过程中，不同的染料造成了其与革兰氏阳性菌着色的不同(阳性菌为紫色)。革兰氏阴性菌以大肠杆菌为代表，还有变形杆菌、痢疾杆菌、肺炎杆菌、布氏杆菌、流感(嗜血)杆菌、副流感(嗜血)杆菌、卡他(摩拉)菌、不动杆菌属等等。该类细菌的致病能力往往与其细胞壁的特殊组分——脂多糖(又叫内毒素)相关。在人体当中，脂多糖会诱导机体产生大量细胞因子并激活免疫系统，最终形成有机体对病原菌的先天性免疫应答。例如红肿就是细胞因子大量产生并释放导致的。
在革兰氏阴性菌感染的治疗中，除了清除感染灶及用相应的支持对症治疗外,还需使用抗生素。目前主要采用的是氨基糖苷类、β-内酰胺类等抗生素。这些抗生素对各种革兰氏阴性菌有强大杀菌作用，而且对于铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌等常见革兰氏阴性杆菌都具有较长时间的抗生素后效应。除了抗生素以外，如前列腺素合成酶抑制剂、左旋咪唑、吞噬肽等也被用于革兰氏阴性菌感染的治疗。然而，随着抗生素的广泛应用，临床出现的抗生素滥用现象导致细菌的耐药性已经从单类耐药发展成为多重耐药,使大量原本能够有效替代的二线抗生素无效。其次，抗菌药物在杀/抑菌的同时会诱导内毒素的产生，增加了疾病的治疗难度，所以尽管不断有新的杀伤力强的抗生素问世及先进的支持疗法出现，革兰氏阴性菌感染所致的内毒素血症的处理仍是临床上棘手的问题，尤其是其20～30％的死亡率更是令人难以接受。据报道脂多糖是导致革兰氏阴性菌感染后发生的一系列毒性反应的主要病源物。虽然抗生素对清除细菌具有较好的效果，但对已游离于血液中的脂多糖以及由其持续刺激靶细胞产生的多种有害细胞因子无能为力，所以临床选用抗菌药物时应对药敏实验结果及其诱导内毒素释放的特性进行综合考虑。第三，因为脂多糖在革兰氏阴性菌的细胞壁表面，使得很多旧型抗生素不能有效抑制此类细菌。基于这些原因，近年来人们正在积极开拓治疗革兰氏阴性菌感染的新领域。
抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是指具有抗菌活性的短肽，这类活性肽多数具有热稳定性、强碱性及广谱抗菌等特点。目前人们已经从不同的生物体中鉴定出约2000多个AMPs，这些AMPs经诱导而合成，在机体抵抗病原体的入侵方面起着重要的作用，被认为是生物非特异性免疫功能的重要防御成分。因此寻找新型抗革兰氏阴性菌的APMs成为研究的热点与难点。
EGF结构域(EGF-like domains，表皮生长因子样结构域)是在进化上相对保守的蛋白结构域，因其首次在表皮生长因子(epidermal growth factor)中被发现而得名。EGF结构域通常包含30-50个氨基酸残基，目前人们已经在大量的动物蛋白中发现该结构域。例如：人凝血因子Ⅶ(human factorⅦ，hFⅦ)。hFⅦ是人体天然存在的蛋白，分子量约为50kD。其分子包含四个结构域：N末端膜结合的γ羧基谷氨酸结构域(Gla结构域)，两个EGF结构域(EGF1、EGF2)和一个C端丝氨酸蛋白酶结构域。其中人凝血因子Ⅶ-EGF1结构域(hFⅦ-EGF1)大小约为3.9kD。人源中还存在着与hFⅦ-EGF1序列相类似的多种物质，如人源凝血因子Ⅶ-EGF2蛋白(hFⅦ-EGF2)、人源凝血因子Ⅸ-EGF1蛋白(hFⅨ-EGF1)、人源凝血因子Ⅸ-EGF2蛋白(hFⅨ-EGF2)、人源凝血因子Ⅹ-EGF1蛋白(hFⅩ-EGF1)、人源凝血因子Ⅹ-EGF2蛋白(hFⅩ-EGF2)等等，迄今为止，尚未见以人源EGF结构域蛋白作为抑菌药物治疗细菌感染的相关报道及制备治疗革兰氏阴性菌所致的内毒素血症的药物的报道。
发明内容
本发明的目的之一是提供人工制备的人源EGF结构域蛋白，本发明的另一目的是证明所述人源EGF结构域蛋白对革兰阴性菌具有抑制作用，人源EGF结构域蛋白对内毒素的水解及清除作用，以便开发出一类治疗革兰氏阴性菌感染的新型药物及治疗革兰氏阴性菌所致的内毒素血症的药物。
本发明所述人源EGF结构域蛋白，其氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：1498中所述的任一氨基酸序列。
本发明所述人源EGF结构域蛋白，其命名如表1所示。
表1本发明所述人源EGF结构域蛋白的命名
上述人源EGF结构域蛋白，由原核重组质粒或真核重组质粒表达而成，或通过化学合成制备。
本发明所使用的方法：
(1)通过PCR扩增或者人工合成的方法获取编码hFⅦ-EGF1人源EGF结构域蛋白的基因，以及编码荧光蛋白的基因；通过重叠PCR扩增反应，获得编码融合蛋白RFP-hFⅦ-EGF1人源EGF结构域蛋白的RFP融合蛋白基因；
(2)将上述编码重组融合蛋的基因片段分别插入到原核载体或真核载体中构建原核重组质粒或真核重组质粒，再将重组质粒转化至感受态细菌中进行培养，然后筛选出含有正确插入片段的重组质粒测序；
(3)将测序结果正确的原核重组质粒转化入工程菌中进行表达，分离纯化表达的蛋白即获得融合蛋白RFP-hFⅦ-EGF1；或将真核重组质粒转染至哺乳动物细胞进行培养，建立稳定细胞系进行真核表达，然后分离纯化的蛋白即获融合蛋白RFP-hFⅦ-EGF1；
(4)采用rTEV酶酶切释放出重组hFⅦ-EGF1蛋白，并对其进行纯化；
(5)重组hFⅦ-EGF1蛋白的抑菌活性检测；
(6)重组hFⅦ-EGF1蛋白水解脂多糖的银染检测；
所述原核载体为pET质粒系统，所述pET质粒系统包括pET-14b、pET-19b、pET-21a(+)、pET-28a(+)、pET-42a(+)等原核表达质粒；所述真核载体为pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(-)等。
人源EGF结构域蛋白的化学合成通常委托专业公司。
实验表明：本发明所述hFⅦ-EGF1蛋白等1498种人源EGF结构域蛋白(表1中的PRT1～PRT1498)能够水解革兰氏阴性菌的脂多糖(又称内毒素，为革兰氏阴性菌外膜的主要成分)，破坏细胞结构的稳定性，进而起到杀菌的作用。同时，hFⅦ-EGF1、hFⅦ-EGF2、hFIX-EGF1、hFIX-EGF2、hFX-EGF1、hFX-EGF2等人源EGF结构域蛋白与组织因子具有很强的结合作用。当有机体受到创伤时，组织因子会大量暴露于伤口处，使得这类结构域蛋白随之聚集在伤口处，起到对伤口的靶向抑菌作用。抑菌活性检测表明：hFⅦ-EGF1蛋白等1498种人源EGF结构域蛋白(表1中的PRT1～PRT1498)对革兰阴性菌具有明显的抑制作用，上述重组蛋白对大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21、绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、嗜水气单胞菌、异型枸橼酸杆菌、卡他莫拉菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、粘质沙雷氏杆菌的最低抑菌浓度(MIC)见下述实施例中的表2和表3。
本发明所述hFⅦ-EGF1蛋白等1498种人源EGF结构域蛋白(表1中的PRT1～PRT1498)能够水解革兰氏阴性菌的脂多糖(又称内毒素，见实施例17)，而脂多糖是导致内毒素血症的主要病源物，因而本发明所述hFⅦ-EGF1蛋白等1498种人源EGF结构域蛋白(表1中的PRT1～PRT1498)可在制备治疗革兰氏阴性菌所致的内毒素血症的药物中应用。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供的人工制备的hFⅦ-EGF1蛋白等1498种人源EGF结构域蛋白(表1中的PRT1～PRT1498)，能够水解革兰氏阴性菌的外膜破坏其细胞结构的稳定性，实验证明对革兰阴性菌具有明显的抑制作用，因而为革兰氏阴性菌感染所致疾病提供了一类新型治疗药物。
2、本发明提供的人工制备的hFⅦ-EGF1蛋白等1498种人源EGF结构域蛋白(表1中的PRT1～PRT1498)，能够水解革兰氏阴性菌的脂多糖(又称内毒素)，因而为革兰氏阴性菌所致的内毒素血症提供了一类新型治疗药物。
3、本发明提供的人工制备的hFⅦ-EGF1、hFⅦ-EGF2、hFIX-EGF1、hFIX-EGF2、hFX-EGF1、hFX-EGF2等6种人源EGF结构域蛋白，能够通过与TF的结合靶向定位在有机体伤口部位，对伤口部位的革兰氏阴性菌具有良好的靶向杀菌效果，有望用于制备新型的靶向抗菌药物。
4、hFⅦ-EGF1蛋白等1498种人源EGF结构域蛋白(表1中的PRT1～PRT1498)是人体中固有的天然成分，本发明以其为抑菌结构域可以有效降低药物的免疫源性。
5、由于可以直接通过基因工程技术在大肠杆菌工程菌细胞内准确表达重组hFⅦ-EGF1蛋白等1498种人源EGF结构域蛋白(表1中的PRT1～PRT1498)，因而生产成本较低，有利于工业化生产。
附图说明
图1是实施例1中编码重组蛋白hFⅦ-EGF1基因序列PCR扩增电泳图，图中，1泳道：DNA分子量标记(Marker1,购自天根公司)；2泳道：编码hFⅦ-EGF1的序列。箭头指向扩增的目的片段。
图2是实施例1中编码融合蛋白RFP-hFⅦ-EGF1基因序列的重叠PCR扩增电泳图，图中，1泳道：DNA分子量标记(1kb,购自天根公司)；2泳道：编码RFP-hFⅦ-EGF1的序列。
图3是实施例2中原核重组质粒pET19bRFP-hFⅦ-EGF1的示意图，其中，逆时针序列为正向基因片段，顺时针为反向基因片段。
图4是实施例2中重组质粒pET19bRFP-hFⅦ-EGF1的限制性内切酶酶切片段电泳鉴定图，其中，1泳道：DNA分子量标记(1kb，购自天根公司)；2泳道：用限制性内切酶双酶切重组质粒pET19bRFP-hFⅦ-EGF1后所得的pET19b载体片段和编码蛋白RFP-hFⅦ-EGF1的DNA片段。
图5是实施例3中编码融合蛋白RFP-hFⅦ-EGF2基因序列的重叠PCR扩增电泳图，图中，1泳道：DNA分子量标记(1kb，购自天根公司)；2泳道：编码RFP-hFⅦ-EGF2的序列。
图6是实施例5和实施例8中重组质粒pET19bRFP-hFⅦ-EGF1、pET19bRFP-FⅦ-EGF2在大肠杆菌中诱导表达RFP-hFⅦ-EGF1、RFP-hFⅦ-EGF2融合蛋白的SDS-PAGE分析图，其中，1泳道：蛋白质分子量标记(Unst.Protein Marker，购自Themo Scientific)；2泳道：诱导之前未表达RFP-hFⅦ-EGF1融合蛋白的菌体总蛋白；3泳道：诱导表达RFP-hFⅦ-EGF1融合蛋白后的菌体总蛋白；4泳道：诱导之前未表达RFP-hFⅦ-EGF2融合蛋白的菌体总蛋白；5泳道：诱导表达RFP-hFⅦ-EGF2融合蛋白后的菌体总蛋白。箭头指示为表达出的融合蛋白。
图7是实施例7和实施例8中经rTEV酶切RFP-hFⅦ-EGF1、RFP-hFⅦ-EGF2融合蛋白后得到的重组hFⅦ-EGF1、hFⅦ-EGF2蛋白的Tricien胶鉴定分析图，其中，1泳道：蛋白质低分子量标记(PageRuler Unstained Low Range Protein Ladder，购自ThemoScientific)；2泳道：rTEV酶切后得到的重组hFⅦ-EGF2蛋白；3泳道：rTEV酶切后得到的重组hFⅦ-EGF1蛋白，箭头指向酶切后所得的目的蛋白。
图8是实施例8中重组质粒pET21ahFⅨ-EGF1-RFP在大肠杆菌中诱导表达RFP-hFⅨ-EGF1的SDS-PAGE分析图，其中，1泳道：蛋白质分子量标记(Unst.Protein Marker，购自Themo Scientific)；2泳道：诱导之前未表达RFP-hFⅨ-EGF1融合蛋白的菌体总蛋白。3泳道：诱导表达RFP-hFⅨ-EGF2融合蛋白后的菌体总蛋白。箭头指示为表达出的融合蛋白。
图9是实施例8中重组质粒pET21ahFⅨ-EGF2-RFP在大肠杆菌中诱导表达RFP-hFⅨ-EGF2融合蛋白的SDS-PAGE分析图，其中，1泳道：蛋白质分子量标记(Unst.ProteinMarker，购自Themo Scientific)；2泳道：诱导之前未表达RFP-hFⅨ-EGF2融合蛋白的菌体总蛋白；3泳道：诱导表达RFP-hFⅨ-EGF2融合蛋白后的菌体总蛋白。箭头指示为表达出的融合蛋白。
图10是实施例8中重组质粒pET21ahFⅩ-EGF1-RFP在大肠杆菌中诱导表达RFP-hFⅩ-EGF1融合蛋白的SDS-PAGE分析图，其中，1泳道：蛋白质分子量标记(Unst.ProteinMarker，购自Themo Scientific)；2泳道：诱导之前未表达RFP-hFⅩ-EGF1融合蛋白的菌体总蛋白；3泳道：诱导表达RFP-hFⅩ-EGF1融合蛋白后的菌体总蛋白。箭头指示为表达出的融合蛋白。
图11是实施例8中重组质粒pET21ahFⅩ-EGF2-RFP在大肠杆菌中诱导表达RFP-hFⅩ-EGF2融合蛋白的SDS-PAGE分析图，其中，1泳道：蛋白质分子量标记(Unst.ProteinMarker，购自Themo Scientific)；2泳道：诱导之前未表达RFP-hFⅩ-EGF2融合蛋白的菌体总蛋白；3泳道：诱导表达RFP-hFⅩ-EGF2融合蛋白后的菌体总蛋白。箭头指示为表达出的融合蛋白。
图12是实施例8中重组质粒pET21ahDelta and Notch-like epidermal growthfactor-related-EGF1-RFP在大肠杆菌中诱导表达RFP-Delta and Notch-like epidermalgrowth factor-related-EGF1融合蛋白的SDS-PAGE分析图，其中，1泳道：蛋白质分子量标记(Unst.Protein Marker，购自Themo Scientific)；2泳道：诱导之前未表达RFP-Deltaand Notch-like epidermal growth factor-related-EGF1融合蛋白的菌体总蛋白；3泳道：诱导表达RFP-Delta and Notch-like epidermal growth factor-related-EGF1融合蛋白后的菌体总蛋白；4泳道：纯化后RFP-Delta and Notch-like epidermal growthfactor-related-EGF1融合蛋白。箭头指示为表达出的融合蛋白。
图13是实施例8中重组质粒pET21ahZonadhesin-EGF1-RFP在大肠杆菌中诱导表达RFP-Zonadhesin-EGF1融合蛋白的SDS-PAGE分析图，其中，1泳道：蛋白质分子量标记(Unst.Protein Marker，购自Themo Scientific)；2泳道：诱导之前未表达RFP-Zonadhesin-EGF1融合蛋白的菌体总蛋白；3泳道：诱导表达RFP-Zonadhesin-EGF1融合蛋白后的菌体总蛋白；4泳道：纯化后RFP-Zonadhesin-EGF1融合蛋白。箭头指示为表达出的融合蛋白。
图14是实施例8中重组质粒pET21ahEGF,latrophilin and seven transmembranedomain-containing protein 1-EGF2-RFP在大肠杆菌中诱导表达RFP-EGF,latrophilinand seven transmembrane domain-containing protein 1-EGF2融合蛋白的SDS-PAGE分析图，其中，1泳道：蛋白质分子量标记(Precision Plus Protein Standards，购自BIO-RAD)；2泳道：诱导之前未表达RFP-EGF,latrophilin and seven transmembrane domain-containing protein 1-EGF2融合蛋白的菌体总蛋白；3泳道：诱导表达RFP-EGF,latrophilin and seven transmembrane domain-containing protein 1-EGF2融合蛋白后的菌体总蛋白；4泳道：纯化后RFP-EGF,latrophilin and seven transmembranedomain-containing protein 1-EGF2融合蛋白。箭头指示为表达出的融合蛋白。
图15是实施例8中重组质粒pET21ahProstaglandin G/H synthase 1-EGF1-RFP在大肠杆菌中诱导表达RFP-Prostaglandin G/H synthase 1-EGF1融合蛋白的SDS-PAGE分析图，其中，1泳道：蛋白质分子量标记(Unst.Protein Marker，购自Themo Scientific)；2泳道：诱导之前未表达RFP-Prostaglandin G/H synthase 1-EGF1融合蛋白的菌体总蛋白；3泳道：诱导表达RFP-Prostaglandin G/H synthase 1-EGF1融合蛋白后的菌体总蛋白；4泳道：纯化后RFP-Prostaglandin G/H synthase 1-EGF1融合蛋白。箭头指示为表达出的融合蛋白。
图16是实施例8中重组质粒pET21ahNeurexin-1-EGF1-RFP在大肠杆菌中诱导表达RFP-Neurexin-1-EGF1融合蛋白的SDS-PAGE分析图，其中，1泳道：蛋白质分子量标记(Unst.Protein Marker，购自Themo Scientific)；2泳道：诱导之前未表达RFP-Neurexin-1-EGF1融合蛋白的菌体总蛋白；3泳道：诱导表达RFP-Neurexin-1-EGF1融合蛋白后的菌体总蛋白；4泳道：纯化后RFP-Neurexin-1-EGF1融合蛋白。箭头指示为表达出的融合蛋白。
图17是实施例8中重组质粒pET21ahEGF-containing fibulin-likeextracellular matrix protein 1-EGF1-RFP在大肠杆菌中诱导表达RFP-EGF-containingfibulin-like extracellular matrix protein 1-EGF1融合蛋白的SDS-PAGE分析图，其中，1泳道：蛋白质分子量标记(Precision Plus Protein Standards，购自BIO-RAD)；2泳道：诱导之前未表达RFP-EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein1-EGF1融合蛋白的菌体总蛋白；3泳道：诱导表达RFP-EGF-containing fibulin-likeextracellular matrix protein 1-EGF1融合蛋白后的菌体总蛋白；4泳道：纯化后RFP-EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1-EGF1融合蛋白。箭头指示为表达出的融合蛋白。
图18是实施例8中重组质粒pET21ahNetrin-3-EGF1-RFP在大肠杆菌中诱导表达RFP-Netrin-3-EGF1融合蛋白的SDS-PAGE分析图，其中，1泳道：蛋白质分子量标记(Unst.Protein Marker，购自Themo Scientific)；2泳道：诱导之前未表达RFP-Netrin-3-EGF1融合蛋白的菌体总蛋白；3泳道：诱导表达RFP-Netrin-3-EGF1融合蛋白后的菌体总蛋白；4泳道：纯化后RFP-Netrin-3-EGF1融合蛋白。箭头指示为表达出的融合蛋白。
图19是实施例8中重组质粒pET21ahPutative EGF-like module-containingmucin-like hormone receptor-like 4-EGF2-RFP在大肠杆菌中诱导表达RFP-PutativeEGF-like module-containing mucin-like hormone receptor-like 4-EGF2融合蛋白的SDS-PAGE分析图，其中，1泳道：蛋白质分子量标记(Precision Plus Protein Standards，购自BIO-RAD)；2泳道：诱导之前未表达RFP-Putative EGF-like module-containingmucin-like hormone receptor-like 4-EGF2融合蛋白的菌体总蛋白；3泳道：诱导表达RFP-Putative EGF-like module-containing mucin-like hormone receptor-like 4-EGF2融合蛋白后的菌体总蛋白；4泳道：纯化后RFP-Putative EGF-like module-containing mucin-like hormone receptor-like 4-EGF2融合蛋白。箭头指示为表达出的融合蛋白。
图20是实施例8中重组质粒pET21ahProtransforming growth factor alpha-EGF1-RFP在大肠杆菌中诱导表达RFP-Protransforming growth factor alpha-EGF1融合蛋白的SDS-PAGE分析图，其中，1泳道：蛋白质分子量标记(Precision Plus ProteinStandards，购自BIO-RAD)；2泳道：诱导之前未表达RFP-Protransforming growth factoralpha-EGF1融合蛋白的菌体总蛋白；3泳道：诱导表达RFP-Protransforming growthfactor alpha-EGF1融合蛋白后的菌体总蛋白；4泳道：纯化后RFP-Protransforminggrowth factor alpha-EGF1融合蛋白。箭头指示为表达出的融合蛋白。
图21是实施例8中重组质粒pET21ahDelta-like protein 4-EGF2-RFP在大肠杆菌中诱导表达RFP-Delta-like protein 4-EGF2融合蛋白的SDS-PAGE分析图，其中，1泳道：蛋白质分子量标记(Precision Plus Protein Standards，购自BIO-RAD)；2泳道：诱导之前未表达RFP-Delta-like protein 4-EGF2融合蛋白的菌体总蛋白；3泳道：诱导表达RFP-Delta-like protein 4-EGF2融合蛋白后的菌体总蛋白；4泳道：纯化后RFP-Delta-likeprotein 4-EGF2融合蛋白。箭头指示为表达出的融合蛋白。
图22是实施例8中重组质粒pET21ahNidogen-1-EGF1-RFP在大肠杆菌中诱导表达RFP-Nidogen-1-EGF1融合蛋白的SDS-PAGE分析图，其中，1泳道：蛋白质分子量标记(Precision Plus Protein Standards，购自BIO-RAD)；2泳道：诱导之前未表达RFP-Nidogen-1-EGF1融合蛋白的菌体总蛋白；3泳道：诱导表达RFP-Nidogen-1-EGF1融合蛋白后的菌体总蛋白；4泳道：纯化后RFP-Nidogen-1-EGF1融合蛋白。箭头指示为表达出的融合蛋白。
图23是实施例8中重组质粒pET21ahUromodulin-like 1-EGF3-RFP在大肠杆菌中诱导表达RFP-Uromodulin-like 1-EGF3融合蛋白的SDS-PAGE分析图，其中，1泳道：蛋白质分子量标记(Precision Plus Protein Standards，购自BIO-RAD)；2泳道：诱导之前未表达RFP-Uromodulin-like 1-EGF3融合蛋白的菌体总蛋白；3泳道：诱导表达RFP-Uromodulin-like 1-EGF3融合蛋白后的菌体总蛋白；4泳道：纯化后RFP-Uromodulin-like 1-EGF3融合蛋白。箭头指示为表达出的融合蛋白。
图24是实施例8中重组质粒pET21ahSushi,von Willebrand factor type A,EGFand pentraxin domain-containing protein 1-EGF2-RFP在大肠杆菌中诱导表达RFP-Sushi,von Willebrand factor type A,EGF and pentraxin domain-containingprotein 1-EGF2融合蛋白的SDS-PAGE分析图，其中，1泳道：蛋白质分子量标记(PrecisionPlus Protein Standards，购自BIO-RAD)；2泳道：诱导之前未表达RFP-Sushi,vonWillebrand factor type A,EGF and pentraxin domain-containing protein 1-EGF2融合蛋白的菌体总蛋白；3泳道：诱导表达RFP-Sushi,von Willebrand factor type A,EGFand pentraxin domain-containing protein 1-EGF2融合蛋白后的菌体总蛋白；4泳道：纯化后RFP-Sushi,von Willebrand factor type A,EGF and pentraxin domain-containing protein 1-EGF2融合蛋白。箭头指示为表达出的融合蛋白。
图25是实施例8中重组质粒pET21ahProtocadherin Fat 2-EGF1-RFP在大肠杆菌中诱导表达RFP-Protocadherin Fat 2-EGF1融合蛋白的SDS-PAGE分析图，其中，1泳道：蛋白质分子量标记(Precision Plus Protein Standards，购自BIO-RAD)；2泳道：诱导之前未表达RFP-Protocadherin Fat 2-EGF1融合蛋白的菌体总蛋白；3泳道：诱导表达RFP-Protocadherin Fat 2-EGF1融合蛋白后的菌体总蛋白；4泳道：纯化后RFP-ProtocadherinFat 2-EGF1融合蛋白。箭头指示为表达出的融合蛋白。
图26是实施例9中真核重组质粒pcDNA3.1-RFP-hFⅦ-EGF1的示意图，其中，逆时针序列为正向基因片段，顺时针为反向基因片段。
图27是实施例14中重组hFⅦ-EGF1蛋白对大肠杆菌DH5α作用的生长曲线。
图28是实施例17中重组hFⅦ-EGF1蛋白水解E.coli EH100LPS的银染检测图谱，其中1泳道：蛋白预染marker；2泳道：未经处理的E.coli EH100LPS；3泳道：hFⅦ-EGF1作用后的E.coli EH100LPS。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明。下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook等著的分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，实验动物常规手册(国家实验动物规范中心,2004年11月)：基本技术指南第五版(John Wiley&Sons，Inc，2005)中所述的条件及实验步骤，或按照制造厂商所建议的条件及实验步骤。实施例中的具体实验方法以hFⅦ-EGF1蛋白为例，其他人源EGF结构域蛋白(表1中的PRT2～PRT1498)的实验方法参照hFⅦ-EGF1蛋白的实验方法进行。表达目的蛋白的基因核苷酸序列可以从网上数据库(http://www.uniprot.org/或http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得。
实施例1：获取带红色荧光蛋白(RFP)标签的融合蛋白RFP-hFⅦ-EGF1的基因
1、合成如下所示PCR扩增引物(由英俊生物技术有限公司合成)：
引物1：
5’-TAACATATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATA-3’
NdeI
引物2：
5’-GAAAACCTGTACTTCCAGGGTCAATTCGAAGATGGGGACCAGTGTGCCTC-3’
重组蛋白酶(rTEV)酶切位点 Bsp119I
引物3：
5’-CCTGGAAGTACAGGTTTTCCTTGTACAGCTCGTC-3’
引物4：
5’-TATGGATCCTTACTCACAGTTCCGGCCCTCGAA-3’
BamHI
2、PCR扩增获取hFⅦ-EGF1及RFP的编码序列
(1)获取编码hFⅦ-EFG1的DNA片段
以含有hFⅦCDS区的质粒(广州复能基因有限公司)为模板，用引物2和引物4进行PCR扩增。引物4序列中引入BamH I酶切位点，引物2序列中引烟草花叶病毒重组蛋白酶(rTEV)酶切位点，以及Bsp119I酶切位点，方便更换为表达其他人源EGF结构域蛋白(表1中的PRT2～PRT1498)的表达序列。反应体系(50μL)如下：
PCR扩增条件参照PrimeStar DNA聚合酶(购自Takara公司)的说明书设置：98℃预变性2min，98℃变性10sec，55℃复性15sec，72℃延伸30sec，30个循环后72℃延伸4min。
扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳分析，得到含有hFⅦ-EFG1编码序列的DNA片段(见图1)，并按胶回收试剂盒(购自Omega公司)的说明回收片段。
(2)获取编码RFP蛋白标签的DNA片段
以含有RFP蛋白基因编码序列的质粒(购自Takara公司)为模板，用引物1和引物3进行PCR扩增。引物1序列中引入Nde I酶切位点，反应体系参考获取编码hFⅦ-EFG1的DNA片段的体系进行配制。
PCR扩增条件参照PrimeStar DNA聚合酶说明书设置：98℃预变性2min，98℃变性10sec，55℃复性15sec，72℃延伸1min，30个循环后72℃延伸4min。
扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳分析，得到含有RFP编码序列的DNA片段，并按胶回收试剂盒(购自Omega公司)的说明回收片段。
3、重叠PCR扩增编码融合蛋白RFP-hFⅦ-EGF1的基因
以上述两次PCR扩增得到的DNA片段为模板，用引物1和引物4进行重叠PCR扩增得到含有RFP-TEV酶切位点-人凝血因子Ⅶ-EFG1蛋白编码序列的融合基因片段RFP-hFⅦ-EGF1。反应体系(50μL)如下：
PCR扩增条件参照PrimeStar DNA聚合酶说明书设置：98℃预变性2min，98℃变性10sec，55℃复性15sec，72℃延伸1.5min，30个循环后72℃延伸4min。
扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳分析，得到编码融合蛋白RFP-hFⅦ-EGF1的片段(见图2)，并按胶回收试剂盒(购自Omega公司)的说明回收片段。
实施例2：表达融合蛋白RFP-hFⅦ-EGF1的原核重组质粒的构建
1、RFP-hFⅦ-EGF1基因与pET19b原核表达载体的预处理
用限制性内切酶Nde I及BamH I(均购自TaKaRaFermentas公司)双酶切实施例1获得的RFP-hFⅦ-EGF1基因片段与原核表达载体pET19b(Novagen公司产品，该质粒经过改造，携带红色荧光蛋白编码基因)，37℃过夜，反应体系如下：
双酶切结束后，反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统的紫外灯下，按胶回收试剂盒(购自Omega公司)的说明回收片段。
2、RFP-hFⅦ-EGF1基因与pET19b原核表达载体的连接与转化
(1)将上述步骤中所获得的RFP-hFⅦ-EGF1基因片段及原核载体片段粗略定量后，按基因片段与原核载体的分子数比为3︰1的连接反应原则进行连接实验，反应体系如下：
(2)整个反应过程在T4DNA连接酶(购自Fermentas公司)作用下在16℃反应过夜。使上述扩增的RFP-hFⅦ-EGF1基因片段插入到pET19b原核表达载体中，所构建的原核重组质粒结构图见图3。
(3)将连接产物转化大肠杆菌Top10(Invitrogen公司)的感受态细胞(按《分子克隆操作指南》自制)。连接产物的转化方法主要步骤如下：
1)取连接产物5μL加入大肠杆菌Top10的感受态细胞100μL置于1.5mL Ep管中，阴性对照为大肠杆菌Top10的感受态细胞100μL置于1.5mL Ep管中；
2)置于冰上30min；
3)42℃金属浴90s；
4)快速将管转至冰浴中，冷却2min；
5)加900μL SOC培养基(蛋白胨10g，酵母浸出物5g，NaCl 0.5g，KCl 0.186g，MgCl20.95g，用ddH2O溶解后定容于980mL，高压灭菌，待冷却至室温后加入无菌20％葡萄糖20mL)，置于冰上；
6)37℃，180rpm振摇培养1h；
7)将菌液4000×g离心3min，留200μL上清，倒去多余培养基后，用余下的200μL重悬细菌；
8)将重悬的转化细菌均匀涂布于含0.1g/mL氨苄青霉素的固体LB培养基上，置37℃恒温培养箱培养过夜。
3、重组质粒的鉴定
挑取上述转化的大肠杆菌Top10单克隆小量培养后用质粒提取试剂盒(购自OMEGA)提取质粒，进行本实施例步骤中1所述的双酶切鉴定。双酶切产物经凝胶电泳鉴定后，结果如图4。酶切产物所形成的两条带，与预期产物大小相符，说明质粒构建成功。
将双酶切鉴定无误的质粒送北京华大基因研究中心对插入的融合基因片段进行测序，最后将测序结果正确的含RFP-hFⅦ-EGF1基因的原核重组质粒命名为pET19bRFP-hFⅦ-EGF1。
实施例3：获取带红色荧光蛋白(RFP)标签的其他人源EGF结构域蛋白(表1中的PRT2～PRT1498)的RFP融合蛋白基因
由于本发明所述的人源EGF结构域蛋白(表1中的PRT2～PRT1498)的表达序列皆已公布，所以可以通过人工合成的方法直接获得核酸表达序列，本实施例中，基因片段的合成分别委托华大基因、金唯智生物科技(北京)有限公司等公司进行。在合成时，这些基因片段上游皆携带Bsp119I酶切位点，方便构建原核表达质粒。编码融合蛋白RFP-hFⅦ-EGF2基因序列的重叠PCR扩增电泳图如图5所示。
实施例4：表达其他人源EGF结构域蛋白(表1中的PRT2～PRT1498)的RFP融合蛋白原核重组质粒的构建
1、基因与pET19b原核表达载体的预处理
用限制性内切酶Bsp119I及BamH I(均购自TaKaRaFermentas公司)双酶切实施例3获得的其他人源EGF结构域蛋白基因片段与实施例2构建的pET19bRFP-hFⅦ-EGF1重组质粒，37℃过夜。
2、其他步骤参照实施例2进行质粒与表达基因的连接与鉴定。
实施例5：pET19bRFP-hFⅦ-EGF1重组质粒的表达
1、将实施例2构建的重组质粒pET19bRFP-hFⅦ-EGF1转化大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen)，挑取单克隆于含0.1g/mL氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃、185rpm振荡培养至OD600≈0.6，取1mL菌液冻于-20℃。然后在剩余的菌液中加入终浓度0.8mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)继续培养6h，取1mL菌液冻于-20℃。
2、将上述IPTG诱导前、诱导后的样品在5％的浓缩胶和12％的分离胶中进行SDS-PAGE电泳检测，分析目的蛋白的表达情况(见图6)，结果显示蛋白正常表达。
实施例6：RFP-hFⅦ-EGF1融合蛋白的亲和层析纯化
1、按照实施例5中的方法大规模培养RFP-hFⅦ-EGF1-pET19bBL21-(DE3)细菌，并添加IPTG诱导，于18℃、175rpm震荡培养过夜。
2、将上述菌液4000×g离心3min收集菌体。用EW buffer(20mM磷酸钠，500mMNaCl，1mM DTT，0.1mM PMSF，pH7.4)重悬洗涤菌体沉淀。4000×g离心3min，弃上清。再用10mL EW buffer重悬菌体。
3、超声波破碎菌体(功率：300W；超声时间：10s；间隔时间：10s；总超声时间：3min；冰浴中进行)。超声结束后，将菌液于4℃48400×g离心1h，收集上清，置于冰上。
4、按Co2+纯化系统(Talon Metal Affinity Resin，Clontech公司产品)说明书预装层析柱，并上样。10ml EW洗涤柱子两次，并用10mM咪唑溶液清洗杂蛋白。最后以100mM咪唑洗脱蛋白。
5、将含有目的蛋白的洗脱液用Tris-Cl缓冲液(pH 7.4)进行超滤，置换buffer并浓缩。超滤后可得高浓度的RFP-hFⅦ-EGF1融合蛋白。蛋白定量显示，每升表达菌液可得纯度在95％以上的目的蛋白约15mg。
实施例7：RFP-hfⅦ-EGF1融合蛋白的酶切与重组hFⅦ-EGF1蛋白的纯化
1、处理Reasin镍柱(NI柱购自GE)，取NI柱mix取200μL于1.5mL EP管(AxyGEN)，700×g离心2min，去掉Reasin镍柱储存液(20％的乙醇)。然后用1mL去离子水将NI柱洗涤两次，接着用1mL Binding buffer(0.5M NaCl，20mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4)将NI柱平衡。
2、NI柱平衡以后，将3μg/μL 450μL的融合蛋白分别与处理好的NI柱混匀，于4℃条件下在垂直旋转仪上共孵育1h。
3、孵育结束以后，700×g4℃离心3min。离心结束后，用500μL Binding Buffer将离心得到的NI beads洗涤两次。洗涤结束后得到Ni beads。
4、将Beads用423μL的Binding buffer重悬，重悬混匀以后。用rTEV酶(购自上海生工)在4℃条件下对蛋白酶切。垂直旋转仪上旋转过夜，时间控制在10h。酶切结束后，于4℃700×g离心5min。离心结束后收集上清，即为重组hFⅦ-EGF1蛋白。经rTEV酶切RFP-hFⅦ-EGF1融合蛋白后得到的重组hFⅦ-EGF1蛋白的Tricien胶鉴定分析图见图7。酶切体系如下：
实施例8：其他重组人源EGF结构域蛋白(表1中的PRT2～PRT1498)的原核表达纯化
参照实施例5～7进行，其他人源EGF结构域蛋白(表1中的PRT2～PRT1498)可按照同样方法进行原核表达纯化。部分图谱如图6至图25所示。
实施例9：表达融合蛋白RFP-hFⅦ-EGF1的真核重组质粒的构建
1、合成如下所示PCR扩增引物，(由英俊生物技术有限公司合成)：
引物1：TAAGGATCCTGCAGAGATTTCATCATGCATCATCATCAT
BamHI cozak
引物2：TATCTCGAGTTACTCACAGTTCCGG
XhoI
2、PCR扩增体系
以实施例2构建的pET19bRFP-hFⅦ-EGF1质粒为模板，用引物1和引物2进行PCR扩增。引物1序列中引入BamH I酶切位点cozak序列，引物2序列中引入Xho I酶切位点。PCR反应参照实施例1进行。
3、真核表达融合蛋白RFP-hFⅦ-EGF1重组质粒的构建
用限制性内切酶BamH I及Xho I(均购自TaKaRaFermentas公司)双酶切克隆的RFP-hFⅦ-EGF1基因片段以及真核表达载体pcDNA3.1(+)(Novagen公司产品)，反应体系参照实施例2。基因与真核表达载体的连接与转化以及重组质粒的鉴定步骤参照实施例2进行。
最后将测序结果正确的含RFP-LhFⅦ-EGF1基因的重组质粒命名为pcDNA3.1-RFP-hFⅦ-EGF1。重组质粒结构图见图26。
实施例10：表达融合蛋白RFP-hFⅦ-EGF1的稳定细胞系的构建
1、细胞准备
将DG44细胞(购自ATCC)培养于添加了10％FBS(胎牛血清，购自Hiclony)的α-MEM完全培养基(含L-谷氨酰胺，核糖核酸及脱氧核糖核酸，购自Hiclony)中。转染前一天在六孔板中接种DG44细胞4×105个/mL，每孔2mL。
2、细胞转染
采用脂质体法转染细胞，方法按照LipofectamineTM2000试剂(购自Invitrogen)说明书进行。具体步骤如下：
1)细胞培养基换成无血清α-MEM培养基，2mL/孔。
2)取实施例9构建的真核表达重组质粒pcDNA3.1-RFP-hFⅦ-EGF14.0μg，与250μLOpti-MEM混合，同时将10μL LipofectamineTM2000与250μL Opti-MEM混合，静置5min。
3)将2种溶液充分混合，静置20min，将脂质体复合物加入细胞孔中，轻轻混匀，放入37℃培养箱培养。
4)5h后，将培养基更换为添加了10％FBS的α-MEM完全培养基。
3、阳性细胞克隆筛选及扩大
重组质粒转染24h后，细胞以1︰2000比例转入100mm培养皿中培养，加入终浓度为800μg/mL的G418(购自Gibco)筛选，以转染空载体和未转染组作对照。15天后挑取单克隆转入24孔板培养，待细胞长满后依次转入6孔板，100mm培养皿扩大培养,待细胞融合度达90％时1︰4冻存于含10％DMSO(购自Gibco)的FBS中。
4、阳性细胞克隆鉴定
对挑取的阳性细胞克隆进行基因组PCR和RT-PCR技术检测，均可扩增出目的片段,说明融合基因已整合在细胞基因组并有功能性mRNA转录，将获得的稳定细胞系分别命名为DG44-RFP-hFⅦ-EGF1。
实施例11：真核表达融合蛋白RFP-hFⅦ-EGF1的收集
1、在添加有400μg/mL G418的含10％FBS的α-MEM完全培养基中培养DG44-RFP-hFⅦ-EGF1细胞并传代至10板。
2、当每板细胞融合度均达90％以上时将10％FBS的α-MDM完全培养基换为CHO无血清培养基，并添加终浓度1μg/mL Vitamin-K(Sigma)。
3、培养3天后，收集细胞沉淀，破碎后离心取上清，采用钴离子亲和层析法进行纯化并通过SDS-PAGEWestern Blot进行鉴定，步骤参照实施例6。
实施例12：真核表达融合蛋白RFP-hFⅦ-EGF1的酶切与hFⅦ-EGF1的回收。
实验方法参照实施例7。
实施例13：其他人源EGF结构域蛋白(表1中的PRT2～PRT1498)的真核表达与纯化
参照实施例9～10的方法，构建其他人源EGF结构域蛋白(表1中的PRT2～PRT1498)的RFP融合蛋白的真核表达质粒，并建立稳定表达的细胞系。
参照实施例11～12的方法，收集真核表达的融合蛋白并进行酶切，最终获得其他人源EGF结构域蛋白(表1中的PRT2～PRT1498)。
实施例14：重组hFⅦ-EGF1蛋白抑菌活性检测
1、以大肠杆菌DH5α为例，将DH5α在LB固体培养基上画线培养后，挑取典型菌落接种于普通LB液体培养基中，于37℃、185rpm振荡培养直至达到对数生长期(OD600≈0.5)。4000×g离心3min，弃上清，用新鲜LB培养基重悬菌体。
2、将上述菌液稀释后接种在96孔板上，每孔总体积为100μL，菌量约为5×105CFU/mL。
3、将重组hFⅦ-EGF1蛋白添加至上述孔中，使最高浓度孔的蛋白终浓度为50μg/mL。以此浓度为基础，2倍梯度稀释，直至蛋白形成浓度为50、25、12.5μg/mL的浓度梯度。每个浓度梯度设3个平行孔。
4、将上述96孔板置于37℃，175rpm摇床振荡培养，每隔30min取样，在紫外分光光度计下检测600nm波长处的吸光值，做出抑菌曲线。MIC判定：培养8h后观察生长现象，肉眼观察或以紫外分光光度计在600nm波长下进行判定，以无细菌生长的最小重组蛋白浓度为最小抑制浓度MIC。
重组hFⅦ-EGF1蛋白对大肠杆菌DH5α作用的生长曲线见图27，该曲线显示重组hFⅦ-EGF1蛋白对大肠杆菌DH5α的生长具有明显的抑制作用，其MIC为12.5μg/mL。
实施例15：其他人源EGF结构域蛋白(表1中的PRT2～PRT1498)的抑菌活性检测
参照实施例14中的实验方法，测定其他人源EGF结构域蛋白(表1中的PRT2～PRT1498)对大肠杆菌DH5α的最小抑制浓度(MIC,μg/mL)，结果如表2所示：
表2人源EGF结构域蛋白对大肠杆菌DH5α的MIC(μg/mL)
从上表可知，人源EGF结构域蛋白(表1中的PRT1～PRT1498)对大肠杆菌DH5α均具有抑制作用。
实施例16：重组hFⅦ-EGF1蛋白等人源EGF结构域蛋白(表1中的PRT1～PRT1498)对多种革兰氏阴性菌的生长情况的影响
1、将大肠杆菌BL21、绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、嗜水气单胞菌、异型枸橼酸杆菌、卡他莫拉菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、粘质沙雷氏杆菌等革兰氏阴性菌在LB固体培养基上画线培养后，挑取典型菌落接种于普通LB液体培养基中，于37℃、185rpm振荡培养直至麦氏比浊度为0.5。4000×g离心3min，弃上清，用新鲜LB培养基重悬菌体。
2、将上述菌液稀释后接种在96孔板上，每孔菌液终浓度约为5×105CFU/mL。
3、将所纯化的人源EGF结构域蛋白(表1中的PRT1～PRT1498)添加至上述孔中，并2倍浓度梯度稀释。每个浓度梯度设3个平行孔。
4、将上述96孔板置于37℃175rpm摇床振荡培养。MIC判定：培养10h后观察生长现象，肉眼观察或以紫外分光光度计在600nm波长下进行判定，以无细菌生长的最小重组蛋白浓度为最小抑制浓度MIC，结果见表3：
表3人源EGF结构域蛋白对多种革兰氏阴性菌的MIC(μg/mL)
结论：从上表可知，本发明所述重组人源EGF结构域蛋白(表1中的PRT1～PRT1498)对大肠杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、嗜水气单胞菌、异型枸橼酸杆菌、卡他莫拉菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、粘质沙雷氏杆菌等多种革兰氏阴性菌均具有抑制作用。
实施例17：银染检测重组hFⅦ-EGF1蛋白等人源EGF结构域蛋白(表1中的PRT1～PRT1498)水解的内毒素(LPS)
1、用所获得的重组hFⅦ-EGF1蛋白等人源EGF结构域蛋白(表1中的PRT1～PRT1498)分别处理E.coli EH100LPS(Sigma)样品，对照组为TBS缓冲液作用LPS样品，孵育过夜，然后离心收集沉淀；
2、用LPS 1×loading buffer(0.05mol/L的Tris-HCl，含10g/L SDS，100g/L蔗糖，0.5％β-巯基乙醇，10mg/L溴酚蓝，pH 6.8)与处理后处理后的沉淀样品混合，100℃金属浴上孵育5分钟；
3、15％分离胶(含4mol/L尿素，1.0mm厚Bio-Rad具体配置如下：去离子水1.15mL，30％丙烯酰胺2.5mL，1.5mol/L Tris-HCl(PH8.8，含10％SDS)1.3mL，10％过硫酸铵50μL，TEMED 4μL)混匀，制胶，水封压平分离胶；
4、5％浓缩胶配制：去离子水1.42mL，30％丙烯酰胺0.33mL，1mol/L Tris-HCl(pH6.8，含10％SDS)0.25mL，10％过硫酸铵20μL，TEMED 2μL)混匀，灌胶，迅速插上10孔梳子；
5、待胶制好后，点样，然后以120V的电压跑胶分离；跑胶结束后，开始银染，将胶剥下来到一个用去离子水洗净的盒子中,然后用去离子水将胶洗涤3次；
6、洗涤结束后，用50mL固定液(30％乙醇，10％冰乙酸，7g/L高碘酸)于室温固定氧化25min。固定结束后，用去离子水洗涤凝胶3次，5min/次；
7、洗涤结束后，于室温下用100mL 1g/L的AgNO3染色40min。结束后用ddH2O洗一次；
8、用50mL在冰上预冷的30g/L Na2CO3，当在显色时加入0.02％甲醛，显色，当出现条带时或条带开始变黑时加入6mL的冰乙酸终止反应；待终止反应结束后，去掉终止液，用去离子水保存凝胶。
银染图谱以hFⅦ-EGF1蛋白为例，如图28。经过hFⅦ-EGF1处理后，LPS条带明显减少并变弱，说明hFⅦ-EGF1蛋白清除了大部分LPS。表1中的PRT2～PRT1498的银染图谱类似于图28，说明本发明所述人源EGF结构域蛋白(表1中的PRT1～PRT1498)具有水解LPS的作用，可在制备治疗革兰氏阴性菌所致的内毒素血症的药物中应用。
Claims (9)
1.人源EGF结构域蛋白或含有人源EGF结构域蛋白的药物组合物在制备治疗革兰氏阴性菌所致疾病的药物中的应用，其中，所述人源EGF结构域蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:1498任一项所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述人源EGF结构域蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:1472、SEQ ID NO:1473、SEQ ID NO:1474、,SEQ IDNO:1475、SEQ ID NO:1476、SEQ ID NO:1477、SEQ ID NO:1478或SEQ ID NO:1479所示。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其中，所述人源EGF结构域蛋白由原核重组质粒或真核重组质粒表达而成，或通过化学合成制备。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其中，所述革兰氏阴性菌所致疾病为内毒素血症。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其中，所述革兰氏阴性菌选自大肠杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、嗜水气单胞菌、异型枸橼酸杆菌、卡他莫拉菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、粘质沙雷氏杆菌中一种或多种。
6.人源EGF结构域蛋白或含有人源EGF结构域蛋白的组合物在制备水解革兰氏阴性菌的脂多糖的产品中的应用，其中，所述人源EGF结构域蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO:1-SEQ ID NO:1498任一项所示。
7.根据权利要求6所述的应用，其中，所述人源EGF结构域蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:1472、SEQ ID NO:1473、SEQ ID NO:1474、,SEQ IDNO:1475、SEQ ID NO:1476、SEQ ID NO:1477、SEQ ID NO:1478或SEQ ID NO:1479所示。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其中，所述人源EGF结构域蛋白由原核重组质粒或真核重组质粒表达而成，或通过化学合成制备。
9.根据权利要求6所述的应用，其中，所述革兰氏阴性菌选自大肠杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、嗜水气单胞菌、异型枸橼酸杆菌、卡他莫拉菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、粘质沙雷氏杆菌中一种或多种。
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |