JP6503342B2 - ヒト起源egfドメインタンパク質及びその使用 - Google Patents
ヒト起源egfドメインタンパク質及びその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6503342B2 JP6503342B2 JP2016515625A JP2016515625A JP6503342B2 JP 6503342 B2 JP6503342 B2 JP 6503342B2 JP 2016515625 A JP2016515625 A JP 2016515625A JP 2016515625 A JP2016515625 A JP 2016515625A JP 6503342 B2 JP6503342 B2 JP 6503342B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- protein
- egf1
- rfp
- vii
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 205
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 171
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 74
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 54
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 38
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 31
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 12
- 208000027096 gram-negative bacterial infections Diseases 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 208000037487 Endotoxemia Diseases 0.000 claims description 8
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 claims description 8
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 claims description 7
- 241000588655 Moraxella catarrhalis Species 0.000 claims description 7
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 claims description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 6
- 241000607528 Aeromonas hydrophila Species 0.000 claims description 5
- 241000588917 Citrobacter koseri Species 0.000 claims description 5
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 241000588697 Enterobacter cloacae Species 0.000 claims description 4
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 155
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 121
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 118
- 102100033237 Pro-epidermal growth factor Human genes 0.000 description 53
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 48
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 41
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 35
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 33
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 28
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 25
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 25
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 24
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 22
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 21
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 20
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 20
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 15
- 102100021699 Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit B Human genes 0.000 description 14
- 101000896557 Homo sapiens Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit B Proteins 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 12
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 11
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 11
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 11
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 10
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 9
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 9
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 7
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 7
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 description 4
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 4
- 101100118545 Holotrichia diomphalia EGF-like gene Proteins 0.000 description 4
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 4
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 4
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 3
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 3
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 3
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 102100037642 Elongation factor G, mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 2
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 2
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 2
- 101000880344 Homo sapiens Elongation factor G, mitochondrial Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 241000588770 Proteus mirabilis Species 0.000 description 2
- 241000588767 Proteus vulgaris Species 0.000 description 2
- 101100226845 Strongylocentrotus purpuratus EGF2 gene Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N gamma-carboxy-L-glutamic acid Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 2
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 229940007042 proteus vulgaris Drugs 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 230000003319 supportive effect Effects 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 2
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 2
- 101710134784 Agnoprotein Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000589562 Brucella Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000012545 EGF-like domains Human genes 0.000 description 1
- 108050002150 EGF-like domains Proteins 0.000 description 1
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 241000606766 Haemophilus parainfluenzae Species 0.000 description 1
- 101001049020 Homo sapiens Coagulation factor VII Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- HLFSDGLLUJUHTE-SNVBAGLBSA-N Levamisole Chemical compound C1([C@H]2CN3CCSC3=N2)=CC=CC=C1 HLFSDGLLUJUHTE-SNVBAGLBSA-N 0.000 description 1
- NEAPKZHDYMQZCB-UHFFFAOYSA-N N-[2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]ethyl]-2-oxo-3H-1,3-benzoxazole-6-carboxamide Chemical compound C1CN(CCN1CCNC(=O)C2=CC3=C(C=C2)NC(=O)O3)C4=CN=C(N=C4)NC5CC6=CC=CC=C6C5 NEAPKZHDYMQZCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 102100029251 Phagocytosis-stimulating peptide Human genes 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 241000607764 Shigella dysenteriae Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 1
- 108010084754 Tuftsin Proteins 0.000 description 1
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 235000010357 aspartame Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229910001429 cobalt ion Inorganic materials 0.000 description 1
- XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N cobalt(2+) Chemical compound [Co+2] XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000000459 effect on growth Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 230000008472 epithelial growth Effects 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- -1 for example Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000010005 growth-factor like effect Effects 0.000 description 1
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 1
- 229940099816 human factor vii Drugs 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 229960001614 levamisole Drugs 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000036457 multidrug resistance Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000001374 post-anti-biotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002599 prostaglandin synthase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000754 repressing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 229940007046 shigella dysenteriae Drugs 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940035670 tuftsin Drugs 0.000 description 1
- IESDGNYHXIOKRW-LEOABGAYSA-N tuftsin Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O IESDGNYHXIOKRW-LEOABGAYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 1
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 1
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 1
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 1
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 150000003952 β-lactams Chemical class 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1808—Epidermal growth factor [EGF] urogastrone
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF], i.e. urogastrone
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
EGFドメイン(EGF様ドメイン、上皮成長因子様ドメイン)はタンパク質ドメインであり、前記は進化時に相対的に保存され、当該ドメインが上皮成長因子で最初に同定されたことによる呼称である。EGFドメインは、通常は30−50アミノ酸残基を含み、これまでのところ多くの動物タンパク質で同定されている(例えば、ヒト凝固第VII因子(ヒト第VII因子、hF VIII))。hF VIIは人体で天然に存在するタンパク質であり、約50kDの分子量を有する。前記の分子は以下の4つのドメインを含む:膜結合N-末端γ-カルボキシグルタミン酸ドメイン(Glaドメイン)、2つのEGFドメイン、(EGF1及びEGF2)、及びC-末端セリンプロテアーゼドメイン。ヒト凝固因子VII-EGF1ドメイン(hF VII-EGF1)は約3.9kDの分子量を有する。ヒト起源では、hF VIII-EGF1の配列と類似する配列を有する多くのアナローグもまた存在する。例えば、ヒト起源凝固因子VII-EGF2タンパク質(hF VII-EGF2)、ヒト起源凝固因子IX-EGF1タンパク質(hF IX-EGF1)、ヒト起源凝固因子IX-EGF2タンパク質(hF IX-EGF2)、ヒト起源凝固因子X-EGF1タンパク質(hF X-EGF1)、ヒト起源凝固因子X-EGF2タンパク質(hF X-EGF2)などである。現在まで、抗菌剤としてヒト起源EGFドメインタンパク質を用いる細菌感染治療についての関連報告、及びグラム陰性細菌によって引き起こされる内毒素血症を治療する医薬の調製に関する報告は存在しない。
本発明で示されるヒト起源EGFドメインタンパク質は表1に示すように称される。
本発明で用いられる工程は以下の通りである:
(1)ヒト起源EGFドメインタンパク質hF VII-EGF1をコードする遺伝子又は前記と50%を超える相同性を有する遺伝子、同様に蛍光タンパク質をコードする遺伝子をPCR増幅又は人工合成によって入手する工程、及びRFP融合タンパク質、RFP-hF VII-EGF1ヒト起源EGFドメインタンパク質をコードする融合遺伝子又は前述の融合タンパク質と50%を超える相同性を有する融合タンパク質の遺伝子をオーバーラップPCR増幅反応により入手する工程;
(2)組換え融合タンパク質をコードする上記に記載の個々の遺伝子フラグメントをそれぞれ原核細胞又は真核細胞ベクターに挿入して組換え原核細胞又は真核細胞プラスミドを構築し、続いて生成組換えプラスミドでコンピテントな細菌を形質転換して培養し、続いて正しく挿入されたフラグメントを含む組換えプラスミドを配列決定によってスクリーニングする工程;
(3)正しい配列決定結果を有する組換え原核細胞プラスミドで操作細菌を形質転換して発現させ、さらに発現タンパク質を単離及び精製し、融合タンパク質RFP-hF VII-EGF1又は該融合タンパク質と50%を超える相同性を有するタンパク質を入手する工程、又は正しい配列決定結果を有する生成組換え真核細胞プラスミドを哺乳動物細胞にトランスフェクトして培養し、真核細胞発現について安定な細胞株を樹立し、発現タンパク質を単離及び精製し、融合タンパク質RFP-hF VII-EGF1又は該融合タンパク質と50%を超える相同性を有するタンパク質を入手する工程;
(4)組換えタンパク質hF VII-EGF1又は前記と50%を超える相同性を有するタンパク質を、rTEV酵素で酵素的に消化することによって遊離させ、該タンパク質を精製する工程;
(5)組換えタンパク質hF VII-EGF1又は前記と50%を超える相同性を有するタンパク質の抗菌活性を分析する工程;
(6)組換えタンパク質hF VII-EGF1又は前記と50%を超える相同性を有するタンパク質によるリポ多糖の加水分解を銀染色によって分析する工程;
ここで、該原核細胞ベクターはpETプラスミド系(原核細胞発現プラスミド、例えばpET-14b、pET-19b、pET-21a(+)、pET-28a(+)、pET-42a(+)などが含まれる)であり、真核細胞ベクターはpcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(-)などである。
ヒト起源EGFドメインタンパク質の化学合成は、通常は専門企業に外注される。
本発明は以下の有益な作用を有する:
1.本発明で提供される1498の人工的に調製されるヒト起源EGFドメインタンパク質(表1のPRT1からPRT1498)(例えばhF VII-EGF1)は、グラム陰性細菌の外膜を加水分解することができ、さらに、前記はグラム陰性細菌に対して顕著な阻害作用を有することが実験的に示され、したがってグラム陰性細菌感染によって生じる疾患を治療する新規なクラスの治療薬を提供する。
2.本発明で提供される1498の人工的に調製されるヒト起源EGFドメインタンパク質(表1のPRT1からPRT1498)(例えばhF VII-EGF1)は、グラム陰性細菌のリポ多糖(内毒素としても知られる)を加水分解でき、したがってグラム陰性細菌によって生じる内毒素血症を治療する新規なクラスの治療薬を提供する。
3.人工的に調製される、本発明で提供される6つのヒト起源EGFドメインタンパク質(すなわちhF VII-EGF1、hF VII-EGF2、hF IX-EGF1、hF IX-EGF2、hF X-EGF1、及びhF X-EGF2)は、組織因子との結合を介する創傷部位における標的誘導局在によって創傷部位でグラム陰性細菌に対して優れた標的誘導殺菌作用を示すことができ、新規な標的誘導抗菌薬の調製における使用が期待され得る。
4.1498のヒト起源EGFドメインタンパク質(表1のPRT1からPRT1498)(例えばhF VII-EGF1)は人体で天然かつ固有の成分であり、本発明での静菌性ドメインとしてのEGFドメインタンパク質の使用は該医薬の免疫原性を効果的に低下させることができる。
5.1498の組換えヒト起源EGFドメインタンパク質(表1のPRT1からPRT1498)(例えばhF VII-EGF1)は、遺伝子操作技術を介して直接的に大腸菌細胞で適切に発現させることができるので、製造経費が低く、工業生産に適している。
本発明は実施例と連携させながら下記でさらに詳述されるであろう。以下に記載される実施例では、詳細な実験条件は特段には記載されないが、前記は、当業者に周知の通常の条件、例えば以下の文献に記載の条件及び実験工程にしたがうか(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al (Ed.), New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989;An Conventional Manual for Laboratory Animals (National Center for Standard Laboratory Animals, November, 2004);及びa Manual of Basic Technique, 5th Edition (John Wiley & Sons, Inc., 2005))、又は製造業者の推奨する条件及び実験工程にしたがう。実施例における詳細な実験方法は、タンパク質hF VII-EGF1によって例証され、他のヒト起源EGFドメインタンパク質(表1のPRT2からPRT1498)についての実験方法は、タンパク質hF VII-EGF1の実験方法を参考にして実施される。対象の発現タンパク質のヌクレオチド配列は、ウェブ(http://www.uniprot.org/又はhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/)のデータベースから入手できる。
赤色蛍光タンパク質(RFP)タグを有する融合タンパク質RFP-hF VII-EGF1の遺伝子の入手
1.下記に示すPCR増幅用プライマーを合成した(Invitrogen Biological Technology Co. Ltd.による):
(1)hF VII-EGF1 をコードするDNAフラグメントの入手
鋳型としてhF VII CDS領域を含むプラスミド(FulenGen Co. Ltd., Guangzhou)を用いプライマー2及び4によりPCR増幅を実施した。プライマー4の配列にBamHI制限部位を導入し、さらに組換えタバコモザイクウイルスプロテイナーゼ(rTEV)のための酵素切断部位及びBsp119Iの制限部位をプライマー2の配列に導入して、他のヒト起源EGFドメインタンパク質(表1のPRT2からPRT1498)の発現のために、発現能力を有する配列による取替えを容易にした。PCR反応系(50μL)は以下の通りであった:
脱イオン水:31.5μL
5x反応緩衝液:10μL
dNTPミックス:4μL
プライマー2(10 mM):1μL
プライマー4(10 mM):1μL
hF VII CDS領域を含むプラスミド(100ng/μL):2μL
プライムスター(PrimeStar)DNAポリメラーゼ:0.5μL
増幅生成物を2%アガロースゲル電気泳動で分析し、hF VII-EGF1のコード配列を含むDNAフラグメントを入手し(図1参照)、問題のフラグメントをゲル回収キット(Omegaから購入)の指示に従って回収した。
(2)タンパク質タグRFPをコードするDNAフラグメントの入手
鋳型としてRFPタンパク質の遺伝子のコード配列を含むプラスミド(Takaraから購入)を用いプライマー1及び3によりPCR増幅を実施した。プライマー1の配列にNdeI制限部位を導入した。反応系は、hF VII-EGF1をコードするDNAフラグメントの入手のための反応系を参考にして設定さた。
PCR増幅の反応条件はプライムスターDNAポリメラーゼの指示を参考に設定された:98℃で2分の前変性、以下の30サイクル(98℃で10秒の変性、55℃で15秒のアニーリング、及び72℃で1分の伸長)に続いて72℃で4分の伸長。
増幅生成物を2%アガロースゲル電気泳動で分析し、RFPのコード配列を含むDNAフラグメントを入手し、問題のフラグメントをゲル回収キット(Omegaから購入)の指示に従って回収した。
鋳型として上記に記載の2つのPCR増幅から入手したDNAフラグメントを用いてオーバーラッピングPCR増幅を実施し、融合遺伝子フラグメントRFP-hF VII-EGF1を得た。前記はRFP-TEV酵素切断部位及びヒト凝固因子VII-EGF1タンパク質のコード配列を含む。PCR反応系(50μL)は以下の通りであった:
脱イオン水:31.5μL
5x反応緩衝液:10μL
dNTPミックス:4μL
プライマー1(10 mM):1μL
プライマー4(10 mM):1μL
第一のPCR増幅から得られたhF VII-EGF1コードDNAフラグメント(100ng/μL):
2μL
プライムスター(PrimeStar)DNAポリメラーゼ:0.5μL
増幅生成物を2%アガロースゲル電気泳動で分析し、RFP-hF VII-EGF1をコードする配列を含むフラグメントを入手し(図2参照)、問題のフラグメントをゲル回収キット(Omegaから購入)の指示に従って回収した。
融合タンパク質RFP-hF VII-EGF1を発現する組換え原核細胞プラスミドの構築
1.RFP-hF VII-EGF1遺伝子フラグメント及び原核細胞発現ベクターpET19bの前処理
実施例1で入手したRFP-hF VII-EGF1遺伝子フラグメント及び原核細胞発現ベクターpET19b(Novagenの製品、このプラスミドは赤色蛍光タンパク質を保持するように改変されてある)を個々に制限エンドヌクレアーゼNdeI及びBamHI(両方ともTakara又はFermentasから購入)を用い37℃で一晩二重消化した。反応系は以下のように確立された:
二重消化完了後、反応生成物を1%アガロースゲル電気泳動で分析し、問題のフラグメントをゲル回収キット(Omegaから購入)の指示に従ってゲル画像化系から紫外線ランプの下で回収した。
(1)上記工程で入手したRFP-hF VII-EGF1及び原核細胞ベクターフラグメントを大雑把に定量し、続いて遺伝子フラグメントの分子数と原核細胞ベクターの分子数の比を3:1とする連結反応の原則に従い連結に付した。連結反応系は以下のように設定された:
(2)T4 DNAリガーゼ(Fermentasから購入)で処理される全連結反応を16℃で一晩進行させた。上記で増幅させた遺伝子フラグメントRFP-hF VII-EGF1を原核細胞発現ベクターpET19bに挿入した。組換え原核細胞プラスミドの構築は図3に模式的に示した。
(3)連結生成物で大腸菌Top10(Invitrogen社から購入)のコンピテント細胞(文献(Molecular Cloning: a Laboratory Manual)にしたがって調製)を形質転換した。連結生成物による形質転換手順の主要な工程は以下の通りであった:
1)1.5mLのエッペンドルフチューブに入れた100μLの大腸菌Top10コンピテント細胞に5μLの連結生成物をピペットで加えた。陰性コントロールは、1.5mLのエッペンドルフチューブに入れた100μLの大腸菌Top10コンピテント細胞である;
2)チューブを氷上に30分間置いた;
3)コンピテント細胞に金属浴で42℃にて90秒のショックを与えた;
4)チューブを氷浴に迅速に移して2分間冷却した;
5)900μLのSOC培地(10gペプトン、5g酵母抽出物、0.5g NaCl、0.186g KC1、0.95g MgCl2、ddH2Oに溶解して体積を980mLにし、オートクレーブして室温に冷却してから20%の無菌的グルコース水溶液を添加)を添加し、氷上に置いた;
6)チューブを180rpmで振盪しながら37℃で1時間インキュベートした;
7)細菌懸濁物を4000xgで3分間遠心分離し、200μLの上清を残して過剰な培地を除去した。200μLの残留上清を用いて細菌を再懸濁した;
8)再懸濁した形質転換体を固形LB培地(0.1g/mLのアンピシリンを含む)に均質にプレートし37℃の定常温度のインキュベータで一晩インキュベートした。
上記に記載の形質転換大腸菌Top10の単一クローンを摘みとり少量中で培養し、プラスミド抽出キット(OMEGAから購入)を用いてプラスミド抽出に付し、続いて本実施例の工程1の工程に示す二重消化を実施した。ゲル電気泳動によって分けた二重消化生成物の結果は図4に示されている。酵素消化によって生じた2つのバンドのサイズは期待される生成物のサイズと一致し、問題のプラスミドの構築の成功を示した。
二重消化によって正しいものと認定されたプラスミドを、挿入された融合遺伝子フラグメントの配列決定のために北京ゲノミクスインスチチュート(Beijing Genomics Institute)に送った。最終的に、正しい配列決定の結果を有するRFP-hF VII-EGF1遺伝子を含む組換え原核細胞プラスミドはpET19bRFP-hF VII-EGF1と称される。
赤色蛍光タンパク質(RFP)タグを有する他のヒト起源EGFドメインタンパク質(表1のPRT2からPRT1498)のRFP融合タンパク質のための融合遺伝子の入手
本発明で示されるヒト起源EGFドメインタンパク質(表1のPRT1からPRT1498)の発現される配列のいずれも公表されているので、発現能力を有するヌクレオチド配列は人工合成によって直接得ることができる。本実施例では、遺伝子フラグメントの合成はそれぞれ営利企業(例えば北京ゲノミクスインスチチュート、GENEWIZ社(GENEWIZ (Beijing) Co. Ltd.)など)に外注した。合成するときは、Bsp119I制限部位をこれら全ての遺伝子フラグメントの上流に導入して原核細胞発現プラスミドの構築を容易にした。融合タンパク質RFP-hF VII-EGF2をコードする遺伝子配列のオーバーラッピングPCR増幅の電気泳動は図5に示される。
他のヒト起源EGFドメインタンパク質(表1のPRT2からPRT1498)のRFP融合タンパク質を発現する原核細胞組換えプラスミドの構築
1.遺伝子及び原核細胞発現ベクターpET19bの前処理
他のヒト起源EGFドメインタンパク質の遺伝子フラグメント及び実施例2で構築した組換えプラスミドpET19bRFP-hF VII-EGF1を、制限エンドヌクレアーゼBsp119I及びBamHI(両方ともTakara又はFermentasから購入)を用い37℃で一晩二重消化した。
2.発現遺伝子のプラスミドへの連結及び同定のための他の工程は実施例2を参考にして実施した。
組換えプラスミドpET19bRFP-hF VII-EGF1の発現
1.実施例2で構築した組換えプラスミドpET19bRFP-hF VII-EGF1で大腸菌BL21(DE3)(Invitrogenから購入)を形質転換した。単一クローンをLB培地(0.1g/mLのアンピシリンを含む)に摘みとり、約0.6のOD600まで185rpmで振盪しながら37℃でインキュベートした。1mLの細菌懸濁物を採取し-20℃で凍結した。続いてIPTG(イソプロピル-β-D-チオガラクトシド)を残りの細菌懸濁物に0.8mMの最終濃度で添加した。インキュベーションを6時間進行させ、1mLの細菌懸濁物を採取して-20℃で凍結した。
2.上記記載のIPTG誘導前及び誘導後のサンプルをSDS-PAGE電気泳動(スタッキングゲル5%及び分離ゲル12%)によってアッセイし、問題のタンパク質の発現を分析した。結果は、タンパク質が正常に発現されることを示した。
アフィニティークロマトグラフィーによる融合タンパク質RFP-hF VII-EGF1の精製
1.細菌RFP-hF VII-EGF1-pET19bBL21-(DE3)を実施例5の方法にしたがって大規模で培養し、IPTGの添加によって誘導し、続いて175rpmで振盪しながら18℃で一晩培養した。
2.上記に記載の細菌懸濁物を4000xgで3分間遠心分離して細菌を収集した。細菌ペレットをEW緩衝液(20mMリン酸ナトリウム、500mM NaCl、1mM DTT、0.1mM PMSF(pH 7.4))に再懸濁して洗浄した。細菌懸濁物を4000xgで3分間遠心分離し上清を廃棄した。再度、細菌ペレットを10mLのEW緩衝液に再懸濁した。
3.細菌を超音波処理により破壊した(パワー:300W、超音波処理持続時間:10秒、間隔:10秒、超音波処理の合計時間:3分、氷浴中で実施)。超音波処理の完了後、細菌懸濁物を48,400xgで1時間4℃にて遠心分離した。上清を収集して氷上に置いた。
4.クロマトグラフィーカラムをCo2+精製系(Talon Metal Affinity Resin, Clontech 社の製品)の指示にしたがってプレロードし、さらにサンプルをロードした。カラムを10mLのEW緩衝液で2回洗浄し、さらにタンパク質不純物を10mMのイミダゾール溶液で洗い流した。最後に、タンパク質を100mMのイミダゾールで溶出させた。
5.緩衝液交換及び濃縮のために、問題のタンパク質を含む溶離液をトリス-Cl緩衝液(pH7.4)で限外ろ過した。限外ろ過後に、高濃度の融合タンパク質RFP-hF VII-EGF1を入手できる。発現細菌懸濁物1リットル当たり90%を超える純度を有する約15mgの問題のタンパク質を入手できることがタンパク質定量によって示された。
融合タンパク質RFP-hF VII-EGF1の酵素切断及び組換えタンパク質hF VII-EGF1の精製
1.樹脂Niカラム(GEから購入したNiカラム)を以下のように処理した:200μLのNiカラムミックスを1.5mLのEPチューブ(AxyGEN)にピペットで加え、700xgで2分間遠心分離し、樹脂Niカラム用保存料溶液(20%エタノール)を廃棄し、続いてNiカラムを1mLの脱イオン水で2回洗浄し、続いて1mLの結合緩衝液(0.5M NaCl、20mMリン酸緩衝液(pH 7.4))でNiカラムを平衡させた。
2.Niカラムの平衡後に、450μLの融合タンパク質(3μg/μL)を処理Niカラムと均質になるまで個々に混合し、バーティカルロータリーミキサー上で4℃にて1時間一緒にインキュベートした。
3.インキュベーション完了後、混合物を700xgで2分間4℃にて遠心分離した。遠心分離の完了後、遠心分離によって得られたNiビーズを500μLの結合緩衝液で2回洗浄した。洗浄完了後にNiビーズを収集した。
4.423μLの結合緩衝液でビーズを再懸濁した。再懸濁し良く混合した後、得られた混合物をrTEVプロテイナーゼ(Shanghai Sangonから購入)による4℃での切断に付した。混合物をバーティカルロータリーミキサー上に時間を10時間に限定して一晩置いた。酵素切断の完了後に、混合物を700xgで5分間4℃にて遠心分離した。遠心分離の完了後に、上清を組換えタンパク質hF VII-EGF1として収集した。rTEVによる融合タンパク質RFP-hF VII-EGF1の酵素切断後に得られた組換えタンパク質hF VII-EGF1の同定のためのTricienゲル分析図は図7に示されている。酵素切断系は以下のように設定された:
20xTEV緩衝液 22.5μL
0.1M DTT 1.5μL
タンパク質ビーズ 420μL
rTEV酵素 3μL
他の組換えヒト起源EGFドメインタンパク質(表1のPRT2からPRT1498)の原核細胞発現
実施例5−7の方法と同じ方法を用いて、他のヒト起源EGFドメインタンパク質(表1のPRT2からPRT1498)を原核細胞で発現させ、精製することができる。部分的なプロフィールは図6から25に示されている。
融合タンパク質RFP-hF VII-EGF1を発現する組換え真核細胞プラスミドの構築
1.下記に示すPCR増幅用プライマーを合成した(Invitrogen Biological Technology Co. Ltd.による)。
鋳型として実施例2で構築したプラスミドpET19bRFP-hF VII-EGF1を用いプライマー1及び2によりPCR増幅を実施した。BamHI制限酵素切断部位及びKozak配列をプライマー1の配列に導入し、XhoI制限酵素切断部位をプライマー2の配列に導入した。PCR反応は実施例1を参考に実施した。
3.融合タンパク質RFP-hF VII-EGF1の真核細胞発現用組換えプラスミドの構築
クローン化遺伝子フラグメントRFP-hF VII-EGF1及び真核細胞発現ベクターpcDNA3.1(+)(Novagenの製品)を制限エンドヌクレアーゼBamHI及びXhoI(両方ともTaKaRa又はFermentasから購入)で二重消化した。反応系は実施例2を参考にして設定した。真核細胞発現ベクターとの遺伝子フラグメントの連結、組換えプラスミドによる形質転換及び前記の同定のための工程は実施例2を参考にして実施した。
最終的に、正確な配列決定結果を示すRFP-hF VII-EGF1遺伝子を含む組換えプラスミドをpcDNA3.1-RFP-hF VII-EGF1と称した。
融合タンパク質RFP-hF VII-EGF1を発現する安定な細胞株の構築
1.細胞の調製
10%FBS(ウシ胎児血清、Hiclonyから購入)を補充したα-MEM完全培養液(L-グルタミン、リボ核酸及びデオキシリボ核酸を含む;Hiclonyから購入)でDG44細胞(ATCCから購入)を培養した。トランスフェクションの前日に、DG44細胞を4x105細胞/mLで6ウェルプレートにウェル当たり2mLでシードした。
2.細胞のトランスフェクション
リポフェクタミン(商標)(LipofectamineTM)2000キットの指示にしたがい、リポソーム法を用いて細胞にトランスフェクトした。詳細な工程は以下の通りである:
1)細胞培養液を無血清α-MEM培養液と取替える(2mL/ウェル)。
2)実施例9で構築した組換え真核細胞発現プラスミドpcDNA3.1-RFP-hF VII-EGF1を250μLのOpti-MEMと混合し、一方、10μLのリポフェクタミン(商標)2000を250μLのOpti-MEMと混合して5分間インキュベートした。
3)2つの溶液を良く混合し、20分間インキュベートした。リポソーム複合物を細胞とともにウェルに添加し、穏やかに混合し、インキュベータに置き、37℃で培養した。
4)5時間後、培養液を10%FBS補充α-MEM完全培養液と取替えた。
3.陽性細胞クローンのスクリーニング及び増量
組換えプラスミドによるトランスフェクションの24時間後に、細胞を1:2000の比率で100mmのペトリ皿に移した。スクリーニングのために、G418(Gibcoから購入)を最終濃度800μg/mLで添加した。空ベクターをトランスフェクトした細胞又はトランスフェクションを実施しなかった細胞をコントロールとして用いた。15日後、単一コロニーを24ウェルプレートに摘みとって培養し、細胞がコンフルエンシーに達したら6ウェルプレート、100mmペトリ皿に連続的に移して培養を増量させた。細胞のコンフルエンシーが90%になったとき、1:4の割合にて10%DMSO(Gibcoから購入)含有FBSで細胞を凍結した。
4.陽性細胞クローンの同定
摘みとった陽性細胞クローンをゲノムPCR及びRT-PCRによって同定した。問題のフラグメントは前記両技術によって増幅させることができ、融合遺伝子が細胞のゲノムに組み込まれていること、及び機能的mRNAが転写されることを示した。得られた安定な細胞株はDG44-RFP-hF VII-EGF1と称された。
真核細胞により発現される融合タンパク質RFP-hF VII-EGF1の収集
1.DG44-RFP-hF VII-EGF1細胞を、400μg/mLのG418を補充した10%FBS含有α-MEM完全培養液で培養し、10プレートに継代した。
2.各プレートの細胞が90%を超えるコンフルエンシーに達したときに、10%FBS含有α-MEM完全培養液をCHO無血清培養液と取替え、ビタミンK(Sigma)を最終濃度1μg/mLで補充した。
3.培養3日後に、細胞ペレットを収集し破壊した。続いて上清を遠心分離によって収集し、コバルトイオンアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、SDS-PAGE及びウェスタンブロットによって同定した。工程は実施例6の工程を参考にした。
真核細胞発現融合タンパク質RFP-hF VII-EGF1の酵素切断及びhF VII-EGF1の回収
実験方法は実施例7の方法にしたがった。
他のヒト起源EGFドメインタンパク質(表1のPRT2からPRT1498)の真核細胞発現及び前記の精製
実施例9−10の方法にしたがい、他のヒト起源EGFドメインタンパク質(表1のPRT2からPRT1498)のRFP融合タンパク質のための真核細胞発現プラスミドを構築し、これら融合タンパク質を安定的に発現する細胞株を樹立した。
実施例11−12の方法にしたがって、真核細胞発現融合タンパク質を収集し、酵素切断に付し、最終的に他のヒト起源EGFドメインタンパク質(表1のPRT2からPRT1498)を得た。
組換えタンパク質hF VII-EGF1の抗菌活性の決定
1.大腸菌DH5αを例にとった。大腸菌DH5αをLB固形培地上でストリーキングして培養した。続いて、典型的なクローンを摘みとり、通常のLB液体培地に接種し、185rpmで振盪しながら対数増殖期(OD600が約0.5)に達するまで37℃で培養した。細菌培養を4000xgで3分間遠心分離し、上清を廃棄し菌体を新しいLB培地に再懸濁した。
2.上記に記載の細菌懸濁物を希釈し、96ウェルプレートにウェル当たり100μLの総体積及び5x105CFU/mLの細菌数で接種した。
3.組換えタンパク質hF VII-EGF1を、最高のタンパク質濃度のウェルの最終タンパク質濃度が50μg/mLとなるように上記に記載のウェルに添加した。この最終濃度に基づいて、50、25及び12.5μg/mLから成るタンパク質濃度勾配が得られるまで2倍連続希釈を実施した。3列のウェルを当該各濃度勾配について整えた。
4.上記に記載の96ウェルプレートを37℃の振盪インキュベータに置き、175rpmで振盪しながら培養した。サンプルを30分毎に採取し、600nmの波長の吸収値を紫外線分光光度計下で決定し、阻害曲線を作成した。MICの判定:培養8時間後に、増殖を裸眼で観察するか、又は紫外線分光光度計下で600nmの波長で判定される。最小阻害濃度MICは、細菌の増殖がない組換えタンパク質の最低濃度と定義される。
組換えタンパク質hF VII-EGF1で処理された大腸菌DF5αの増殖曲線は図27に示される。該曲線は、組換えタンパク質hF VII-EGF1は大腸菌DH5αの増殖に対し顕著な阻害作用を発揮することを示し、MICは12.5μg/mLである。
他のヒト起源EGFドメインタンパク質(表1のPRTからPRT1498)の抗菌活性の決定
実施例14の実験手順にしたがって、他のヒト起源EGFドメインタンパク質(表1のPRT2からPRT1498)の大腸菌DH5αに対する最小阻害濃度(MIC、μg/mL)を決定した。結果は表2に示されている。
ヒト起源EGFドメインタンパク質(表1のPRT1からPRT1498)、例えば組換えタンパク質hF VII-EGF1などの多様なグラム陰性細菌の増殖に対する作用
グラム陰性細菌(例えば大腸菌BL21、緑膿菌、肺炎杆菌、エンテロバクター・クロアカエ、アエロモナス・ヒドロフィラ、 シトロバクター・ジベルスス、モラクセラ・カタラーリス、プロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス、セラチア・マルセッセンスなど)を固形LB培地にストリーキングし、それぞれ培養した。続いて、典型的なクローンを摘みとって通常の液体LB培地にそれぞれ接種し、185rpmで振盪しながらMcFarland比濁度が0.5になるまで37℃で培養した。各グラム陰性細菌の細菌培養を4000xgで3分間遠心分離し、上清を廃棄し菌体を新しいLB培地に再懸濁した。
2.上記に記載の細菌懸濁物を希釈し、96ウェルプレートにウェル当たり、細菌懸濁物の最終濃度が5x105CFU/mLとなるように接種した。
3.精製ヒト起源EGFドメインタンパク質(表1のPRT1からPRT1498)の各々を上記ウェルの各々に添加し、2倍段階濃度希釈に付した。
4.上記に記載の96ウェルプレートを37℃の振盪インキュベータに置き、175rpmで振盪しながら培養した。MICの判定:培養10時間後に、増殖を裸眼で観察するか、又は紫外線分光光度計下で600nmの波長で判定した。最小阻害濃度MICは、細菌の増殖がない組換えタンパク質の最低濃度と定義される。結果は表3に示される。
ヒト起源EGFドメインタンパク質(表1のPRTからPRT1498)、例えば組換えタンパク質hF VII-EGF1などによって加水分解される内毒素(LPS)の銀染色検出
1.入手したヒト起源EGFドメインタンパク質(表1のPRTからPRT1498)、例えば組換えタンパク質hF VII-EGF1と一緒に大腸菌EH100 LPS(Sigma)サンプルをそれぞれインキュベートした。コントロールグループはTBS緩衝液と一緒にインキュベートしたLPSサンプルであった。インキュベーションは一晩続けた。続いて遠心分離を実施してペレットを収集した。
2.LPSのための1xのローディング緩衝液(10g/L SDS、100g/Lシュクロース、0.5%β-メルカプトエタノール、10mg/Lブロモフェノールブルーを含む0.05Mトリス-HCl(pH6.8))を処理ペレットのサンプルと混合し、金属浴にて5分間100℃でインキュベートした。
3.分離ゲル(15%)は良く混合して調製した。分離ゲルの上部に水を重層した。分離ゲルは4mol/Lの尿素(Bio-Rad)を含み厚さは1.0mmを有する。詳細な組成は以下の通りである:1.15mLの脱イオン水、2.5mLの30%アクリルアミド、1.3mLの1.5mol/Lトリス-HCl (pH8.8、10%のSDSを含む)、50μLの10%過硫酸アンモニウム、4μLのTEMED。
4.以下のように5%のスタッキングゲルを調製した:下記(1.42 mLの脱イオン水、0.33mLの30%アクリルアミド、0.25mLの1mol/Lトリス-HCl(pH6.8、10%のSDSを含む)、20μLの10%過硫酸アンモニウム、2μLのTEMED)をよく混合して注ぎ入れた。10ウェルの櫛を迅速に挿入した。
5.ゲルを調製した後でサンプルをロードした。続いて、ゲルを120Vの電圧で泳動してサンプルを分離させた。泳動後、ゲルを採取して銀染色を開始した。ゲルをトレーに移し脱イオン水で徹底的に洗浄し、続いてゲルを3回脱イオン水で洗浄した。
6.洗浄完了後、ゲルを酸化のために50mLの固定溶液(30%アルコール、10%氷酢酸、7g/L過ヨウ素酸)で室温にて25分間固定した。固定完了後に、ゲルを毎回脱イオン水で3回5分間洗浄した。
7.洗浄完了後、ゲルを100mLのAgNO3(1g/L)中で室温にて40分間染色した。染色完了後、ゲルを1回ddH2Oで洗浄した。
8.ゲルを予め氷上で冷却した50mLのNa2CO3(30g/L)に移した(前記には可視化直前に0.02%のホルムアルデヒドが添加される)。バンドが出現したとき、又は暗色になり始めたとき、6mLの氷酢酸を添加して反応を停止させた。前記停止溶液を停止反応完了時に除去し、ゲルを脱イオン水中で維持した。
銀染色図は図28に示すようにタンパク質hF VII-EGF1で例証した。hF VII-EGF1で処理した後、LPSバンドは明瞭に減少し弱くなり、タンパク質hF VII-EGF1はLPSの大半を除去することを示した。表1のPRT2からPRT1498の銀染色図は図28の銀染色図と類似する。このことは、本発明に記載するヒト起源EGFドメインタンパク質(表1のPRT1からPRT1498)はLPSを加水分解でき、グラム陰性細菌によって生じる内毒素血症を治療する医薬の調製で用いることができることを示している。
Claims (9)
- グラム陰性細菌感染を治療する医薬の製造のための、ヒト起源EGFドメインタンパク質又は該ヒト起源EGFドメインタンパク質を含む医薬組成物の使用であって、前記ヒト起源EGFドメインタンパク質のアミノ酸配列は配列表の配列番号:1〜配列番号:1498のいずれか1つに記載される、前記使用。
- グラム陰性細菌感染によって生じる内毒素血症を治療する医薬の製造のための、ヒト起源EGFドメインタンパク質又は該ヒト起源EGFドメインタンパク質を含む医薬組成物の使用であって、前記ヒト起源EGFドメインタンパク質のアミノ酸配列は配列表の配列番号:1〜配列番号:1498のいずれか1つに記載される、前記使用。
- 前記タンパク質のアミノ酸配列が、配列表の配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:108、配列番号:109、配列番号:1472、配列番号:1473、配列番号:1474、配列番号:1475、配列番号:1476、配列番号:1477、配列番号:1478又は配列番号:1479に記載されたことを特徴とする、請求項1又は2に記載の使用。
- 前記タンパク質が、原核細胞若しくは真核細胞組換えプラスミドによって発現されるか、又は化学合成によって調製されることを特徴とする、請求項1から3のいずれか1項に記載の使用。
- 前記グラム陰性細菌が、大腸菌、緑膿菌、肺炎杆菌、エンテロバクター・クロアカエ、アエロモナス・ヒドロフィラ、 シトロバクター・ジベルスス、モラクセラ・カタラーリス、プロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス及びセラチア・マルセッセンスから選択される1以上であることを特徴とする、請求項1から4のいずれか1項に記載の使用。
- グラム陰性細菌のリポ多糖を加水分解する方法であって、前記リポ多糖をヒト起源EGFドメインタンパク質又は該ヒト起源EGFドメインタンパク質を含む組成物で処理する工程を含み、前記ヒト起源EGFドメインタンパク質のアミノ酸配列は配列表の配列番号:1〜配列番号:1498のいずれか1つに記載される、前記方法。
- 前記タンパク質のアミノ酸配列が、配列表の配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:108、配列番号:109、配列番号:1472、配列番号:1473、配列番号:1474、配列番号:1475、配列番号:1476、配列番号:1477、配列番号:1478又は配列番号:1479に記載されたことを特徴とする、請求項6に記載の方法。
- 前記タンパク質が、原核細胞若しくは真核細胞組換えプラスミドによって発現されるか、又は化学合成によって調製されることを特徴とする、請求項6又は7に記載の方法。
- 前記グラム陰性細菌が、大腸菌、緑膿菌、肺炎杆菌、エンテロバクター・クロアカエ、アエロモナス・ヒドロフィラ、 シトロバクター・ジベルスス、モラクセラ・カタラーリス、プロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス及びセラチア・マルセッセンスから選択される1以上であることを特徴とする、請求項6から8のいずれか1項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310206726.6 | 2013-05-29 | ||
CN201310206726 | 2013-05-29 | ||
CN201410182727.6A CN104211799B (zh) | 2013-05-29 | 2014-04-30 | 人源egf结构域蛋白及其应用 |
CN201410182727.6 | 2014-04-30 | ||
PCT/CN2014/077789 WO2014190860A1 (zh) | 2013-05-29 | 2014-05-19 | 人源egf结构域蛋白及其应用 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2016520599A JP2016520599A (ja) | 2016-07-14 |
JP2016520599A5 JP2016520599A5 (ja) | 2017-06-29 |
JP6503342B2 true JP6503342B2 (ja) | 2019-04-17 |
Family
ID=51987987
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016515625A Active JP6503342B2 (ja) | 2013-05-29 | 2014-05-19 | ヒト起源egfドメインタンパク質及びその使用 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9833497B2 (ja) |
EP (1) | EP3006460B1 (ja) |
JP (1) | JP6503342B2 (ja) |
CN (2) | CN104211799B (ja) |
WO (1) | WO2014190860A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015131061A1 (en) * | 2014-02-28 | 2015-09-03 | Baxalta Incorporated | Peptides and methods of use |
US10550163B2 (en) | 2014-04-03 | 2020-02-04 | The Regents Of The University Of California | Peptide fragments of netrin-1 and compositions and methods thereof |
AU2018293925A1 (en) * | 2017-06-30 | 2020-01-16 | Monash University | A method of treatment |
AR121035A1 (es) | 2019-04-01 | 2022-04-13 | Lilly Co Eli | Compuestos de neuregulina-4 y métodos de uso |
WO2022217037A1 (en) * | 2021-04-09 | 2022-10-13 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Compositions and methods for treatment of chronic lung diseases |
EP4198045A1 (en) * | 2021-12-16 | 2023-06-21 | Université de Lille | Antimicrobial peptides, variants and chemical analogues thereof and their uses |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030138795A1 (en) * | 2001-06-14 | 2003-07-24 | Shujian Wu | Polynucleotide encoding a novel human growth factor with homology to epidermal growth factor, BGS-8, expressed highly in immune tissue |
WO2004108763A2 (en) * | 2003-06-05 | 2004-12-16 | Canadian Blood Services | Mutants of the factor vii epidermal growth factor domain |
WO2005111070A2 (en) * | 2004-05-13 | 2005-11-24 | Regents Of The University Of Minnesota | Mucin3 egf-like domains |
US20110212108A1 (en) * | 2008-05-09 | 2011-09-01 | The Regents Of The University Of California | Neuregulin/erbb signaling and integrin |
WO2010006136A2 (en) * | 2008-07-09 | 2010-01-14 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Adenovirus targeting |
WO2010151736A1 (en) * | 2009-06-25 | 2010-12-29 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Chimeric factor vii molecules |
TW201217526A (en) * | 2010-07-09 | 2012-05-01 | Biogen Idec Hemophilia Inc | Chimeric clotting factors |
-
2014
- 2014-04-30 CN CN201410182727.6A patent/CN104211799B/zh active Active
- 2014-05-19 US US14/894,417 patent/US9833497B2/en active Active
- 2014-05-19 CN CN201480042519.4A patent/CN105683216B/zh active Active
- 2014-05-19 EP EP14803694.0A patent/EP3006460B1/en active Active
- 2014-05-19 WO PCT/CN2014/077789 patent/WO2014190860A1/zh active Application Filing
- 2014-05-19 JP JP2016515625A patent/JP6503342B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN105683216A (zh) | 2016-06-15 |
EP3006460A1 (en) | 2016-04-13 |
EP3006460B1 (en) | 2020-08-26 |
US9833497B2 (en) | 2017-12-05 |
JP2016520599A (ja) | 2016-07-14 |
CN105683216B (zh) | 2021-03-26 |
EP3006460A4 (en) | 2017-05-10 |
WO2014190860A1 (zh) | 2014-12-04 |
CN104211799A (zh) | 2014-12-17 |
CN104211799B (zh) | 2017-12-26 |
US20160184396A1 (en) | 2016-06-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6503342B2 (ja) | ヒト起源egfドメインタンパク質及びその使用 | |
Zeng et al. | Identification and functional characterization of novel scorpion venom peptides with no disulfide bridge from Buthus martensii Karsch | |
Li et al. | Preliminary study on a potential antibacterial peptide derived from histone H2A in hemocytes of scallop Chlamys farreri | |
Bridle et al. | Evidence of an antimicrobial-immunomodulatory role of Atlantic salmon cathelicidins during infection with Yersinia ruckeri | |
KR20230057487A (ko) | 게놈 조정을 위한 방법 및 조성물 | |
Yin et al. | Cloning, expression and antimicrobial activity of an antimicrobial peptide, epinecidin-1, from the orange-spotted grouper, Epinephelus coioides | |
Larsen et al. | Molecular characterisation of a goose-type lysozyme gene in Atlantic cod (Gadus morhua L.) | |
Dong et al. | β-Defensin in Nile tilapia (Oreochromis niloticus): sequence, tissue expression, and anti-bacterial activity of synthetic peptides | |
Lu et al. | Identification and characterization of a novel cathelicidin from ayu, Plecoglossus altivelis | |
KR20200116933A (ko) | 인간 심근세포에서 디스트로핀 돌연변이를 교정하기 위한 조성물 및 방법 | |
González et al. | Molecular characterization and protein localization of the antimicrobial peptide big defensin from the scallop Argopecten purpuratus after Vibrio splendidus challenge | |
KR20100082203A (ko) | 박테리아 특이적 넓은 항균 활성을 갖는 신규한 리신 단백질 | |
WO2018220616A2 (en) | Genetic systems that defend against foreign dna and uses thereof | |
KR102224897B1 (ko) | 신규한 폴리펩타이드 및 이를 포함하는 그람음성균에 대한 항생제 | |
Yu et al. | Expression and functional characterization of PGRP6 splice variants in grass carp Ctenopharyngodon idella | |
CN110592057B (zh) | 嵌合裂解酶ILTphg和编码此酶的多核苷酸 | |
JP2024063082A (ja) | 皮膚疾患の治療のための組成物及び方法 | |
Wickramaarachchi et al. | Genomic characterization and expression analysis of complement component 9 in rock bream (Oplegnathus fasciatus) | |
US20160030528A1 (en) | Antimicrobial muramidase | |
CN109021086B (zh) | 一种抗菌肽天蚕素a突变体及其编码基因、制备方法和应用 | |
AU2003260224A2 (en) | A genomic approach to identification of novel broad-spectrum antimicrobial peptides from bony fish | |
Wang et al. | Characterization, expression, and antimicrobial activity of histones from Japanese flounder Paralichthys olivaceus | |
Zhu et al. | Cloning and characterization of the LEF/TCF gene family in grass carp (Ctenopharyngodon idella) and their expression profiles in response to grass carp reovirus infection | |
Han et al. | Rac1 GTPase is a critical factor in phagocytosis in the large yellow croaker Larimichthys crocea by interacting with tropomyosin | |
Li et al. | A myxovirus resistance like protein involved in CgIFNLP mediated immune response of oyster Crassostrea gigas |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170519 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20170519 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180205 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20180502 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180730 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20181030 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20181228 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190110 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20190228 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20190325 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6503342 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |