CN109021086B

CN109021086B - 一种抗菌肽天蚕素a突变体及其编码基因、制备方法和应用

Info

Publication number: CN109021086B
Application number: CN201810868364.XA
Authority: CN
Inventors: 王菊芳; 王蒙; 马毅; 傅宏鑫
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2018-08-02
Filing date: 2018-08-02
Publication date: 2021-05-14
Anticipated expiration: 2038-08-02
Also published as: CN109021086A

Abstract

本发明公开了一种抗菌肽天蚕素A突变体及其编码基因、制备方法和应用，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID No：3所示。编码上述突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示。根据设计处的抗菌肽突变体PEW300的基因序列进行分子克隆，将其基因克隆至重组表达载体中，通过与自聚集短肽ELK16融合表达，实现突变体PEW300的高效表达。然后对获得的突变体肽PEW300进行9种指示菌的抑菌性能测试，结果显示抗菌肽PEW300的抑菌性能大大提高。并且具有较强的pH、热稳定性。添加高浓度的抗菌肽PEW300也不会出现溶血现象。

Description

一种抗菌肽天蚕素A突变体及其编码基因、制备方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程和生物制药技术领域，特别涉及一种抗菌肽Cecropin A突变体的制备及应用。

背景技术

长期以来，随着抗生素的过度使用，导致细菌对抗生素的耐药现象日益严重。随着细菌对抗生素产生耐药性的普遍认识，研究和开发新型的抗菌药物迫在眉睫。由于抗菌肽具有抗菌谱广、作用机制独特、不易产生抗药性、热稳定和水溶性好等优势，使其迅速成为国内外科学家们研究和开发新型抗菌药物的热点，有望成为替代抗生素最有潜力的抗菌药物之一，具有广阔的应用前景。

目前研究和发现的抗菌肽种类繁多，结构也复杂多变，其抑菌活性也存在较大差异。大部分的天然抗菌肽都存在抗菌活性不高、热稳定性较差等缺陷。特别是部分天然抗菌肽在与细胞膜相互作用过程中会破坏真核细胞的细胞膜，对真核细胞产生毒性及破坏作用。因此，对天然抗菌肽进行分子结构改造、化学修饰以及重新设计是挖掘和开发新型抗菌肽的一个重要研究方向。通过比对分析天然抗菌肽的氨基酸序列及二级结构特点，借助相关生物信息学软件来定向改造或者全新设计出具有更高抗菌活性、更广抗菌谱、稳定性好、细胞毒性小的的新型抗菌肽。

天蚕素A抗菌肽是从惜古比天蚕(Hyatophora cecropia)等动物中发现的一类抗菌肽，属于α螺旋类抗菌肽，无分子内二硫键，不含半胱氨酸，具有强碱性的N末端和强疏水性的C末端(Bechinger B.Structure and Functions of Channel-Forming Peptides:Magainins,Cecropins,Melittin and Alamethicin[J].Journal of Membrane Biology,1997,156(3):197.)。天然的天蚕素A抗菌肽虽然对革兰氏阴性菌的抗菌性能较好，但是与其他抗菌肽相比，其抗菌活性还有很大的提高空间。另外，其对革兰氏阳性细菌的抗菌性能较弱，因此通过分子设计，定向改造设计出更强抑菌性能的天蚕素A突变体肽是研究天蚕素A抗菌肽的一个重要方向。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的不足，提供一种抗菌肽Cecropin A突变体肽。通过分析天然天蚕素A抗菌肽的氨基酸序列、理化性质及空间结构等特点，对天蚕素A抗菌肽进行分子改造，定向设计出具有更强抑菌活性、稳定性更好的抗菌肽PEW300。

本发明的另一目的在于基于上述设计的抗菌肽PEW300，对其进行高效表达并进行抗菌性能表征，提供抗菌肽PEW300的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种抗菌肽天蚕素A突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No：3所示。

编码权利要求1所述抗菌肽天蚕素A突变体的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：4所示，其DNA序列不局限于SEQ ID No：4中的DNA序列，只要该序列插入表达载体可正常转录翻译出PEW300抗菌肽的氨基酸序列即可。

一种抗菌肽天蚕素A突变体的制备方法，包括如下步骤：

(1)将上述突变体基因连接到表达载体上，得到重组表达载体；

(2)将步骤(1)中得到的重组表达载体转化到大肠杆菌表达宿主菌中，得到工程菌；

(3)步骤(2)中得到的工程菌中加入表达诱导剂(IPTG)进行诱导表达，离心收集菌体，破碎菌体，离心获得沉淀(即融合蛋白活性聚集体)，再向沉淀中加入切割诱导剂(DTT)进行诱导切割，离心收集上清，得到抗菌肽天蚕素A突变体。

优选地，步骤(2)所述重组表达载体包含突变体融合蛋白，该融合蛋白的组成为：突变体-自剪切短肽-连接肽-自聚集短肽。

优选地，所述的自剪切短肽为Mxe GyrA、DnaB、DnaE、Mtu RecA或srtAc。

优选地，所述的自聚集短肽为ELK16、18A、r18A、L6KD、类弹性蛋白多肽、口蹄疫病毒衣壳蛋白VP1、人β-淀粉样蛋白Aβ42(F19D)、麦芽糖结合蛋白突变体、纤维素结合域、酵母朊蛋白sup35NM、RNQ1、URE2或NEW1。

优选地，所述的自剪切短肽为Mxe GyrA，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

优选地，所述的自聚集短肽为ELK16，其核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。

优选地，所述的连接肽为PT linker，其核苷酸序列如SEQ ID No：5所示。

优选地，步骤(3)所述IPTG的浓度为0.1mM，在该浓度下，目的蛋白(融合蛋白)能成功实现表达，并且形成有活性的融合蛋白聚集体。DTT的浓度为10～80mM。

优选地，所述诱导表达的温度为16℃，诱导表达的时间为24h；所述诱导切割的温度为在4℃，切割时间为12h。

优选地，所述的制备方法还包括将步骤(3)中得到的抗菌肽天蚕素A突变体(小分子肽类)进一步浓缩纯化，纯化方式为乙酸纯化，所用乙酸浓度为0.1％-1％(v/v)。

所述的浓缩纯化优选为采用超滤管进行浓缩纯化。

所述的超滤管优选为1kDa的超滤管。

所述的抗菌肽天蚕素A突变体在制备抗微生物感染药物中的应用。

步骤(2)所述的大肠杆菌表达宿主菌，只要步骤(1)中所述的表达载体可在其体内表达即可，包括但不限于E.coli BL21(DE3)，E.coli MC4100，E.coli DH5α，E.coli JM109，E.coli JM110，E.coli TOP 10，E.coli BL21，E.coli BL21(DE3)/pLyS和E.coli BL21Rosetta。

步骤(1)中所述的表达载体为可在E.coli中过量表达的诱导型载体，只要其能在E.coli中具有诱导目的蛋白在菌体表达以活性聚集体的形式即可。

相对于现有技术，本发明具有如下的优点及效果：

(1)采用将突变体肽PEW300与自聚集短肽融合方式，成功实现了突变体肽PEW300的高效表达。

(2)本发明中的抗菌肽PEW300具有更强的革兰氏阴性和革兰氏阳性抑菌性能。

(3)本发明中的抗菌肽PEW300具有较强pH耐受性能，突变体PEW300在中性和碱性环境中均有较好的稳定性，其抑菌活性均不受影响，但在强酸性(pH＝2)环境中，其抑菌活性下降30％。

(4)本发明中的抗菌肽PEW300具有良好的热稳定性，在100℃的条件下，突变体PEW300的抑菌活性仍可保留80％以上。

(5)本发明中的抗菌肽PEW300没有溶血特性，当添加224ng/ul的抗菌肽PEW300至含5％脱纤羊血的哥伦比亚血琼脂平板中无任何溶血圈，具有良好的无溶血特性。

附图说明

图1是天然抗菌肽天蚕素A和抗菌肽PEW300的同源建模结果图及突变位点电子云分布图；其中，A为天然天蚕素A抗菌肽；B为抗菌肽PEW300。

图2pET30-PEW300菌落PCR鉴定图；其中，泳道1-10为挑取的10个单克隆；M为DNAmarker。

图3为融合蛋白PEW300-ELK16小量表达结果图；其中：W为破碎后的全液样品；S为破碎后的上清样品；P为破碎后的沉淀样品。No为未诱导组，IPTG为分别添加不同浓度IPTG的诱导组。

图4DTT添加浓度优化结果图；其中，0为没有添加DTT样品，10-80mM为分别添加10、20、30、40、80mM DTT样品处理组；M为蛋白标准分子量marker。

图5为不同添加量(0.1％-1％)的乙酸处理切割后样品获得高纯度的突变体肽PEW300；其中，P₁为切割后样品(添加乙酸前的样品)；S为乙酸处理后离心上清；P为乙酸处理后离心沉淀；M₁、M₂为蛋白标准分子量marker。

图6为纯化后的抗菌肽PEW300的蛋白浓度测定；其中S₁-S₄为浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ug/孔的抑酞酶标准品；泳道1和2为纯化的抗菌肽PEW300样品；M1、M2为蛋白marker。

图7为对抗菌肽PEW300的pH、热稳定性、蛋白酶稳定性及溶血性测定结果图；其中A为pH稳定性检测；B为热稳定性检测；C为蛋白酶稳定性检测；D为溶血性检测；1-4为添加28ng/ul、56ng/ul、112ng/ul、224ng/ul的突变体肽PEW300；5为阴性对照PBS；6为阳性对照0.1％的Trition X-100。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明中设计的抗菌肽PEW300是基于天然抗菌肽天蚕素A的氨基酸序列进行突变设计。天蚕素A抗菌肽的氨基酸序列在NCBI数据库中的ID为0708214A，下述实施例中有未注明具体条件的实验方法，则是按照常规的分子克隆手册所述的条件进行操作。

实施例1：抗菌肽PEW300的基因设计

(1)根据天然抗菌肽天蚕素A的氨基酸序列组成及电荷性、疏水性分析，选择非保守区域氨基酸进行氨基酸突变。为了提高抗菌肽N端的正电荷性和C端的疏水性，将第9位的Glu替换为His、第17位的Asp替换为Lys、第33位的Thr替换为Ala。最后设计的抗菌肽氨基酸序列组成如SEQ ID No：3所示。天然抗菌肽天蚕素A及突变体肽PEW300的理化性质分析如表1所示。

(2)通过对突变体肽PEW300进行同源建模，并分析突变位点处的电子云及疏水性分析，可以发现突变后的抗菌肽在N端的正电荷提高，并且在C端的疏水性有了大大的增强，为提高其抑菌性能奠定了良好的基础。天然抗菌肽天蚕素A和突变体肽PEW300的同源建模、电子云及疏水性分析结果如图1所示。

实施例2：重组表达载体pET-pew300的构建

(1)根据自聚集短肽ELK16、自剪切短肽Mxe GyrA和连接肽PT linker(PTPPTTPTPPTTPTPTP)的基因序列，在基因合成公司(上海生工)合成相应的DNA序列Mxe-PTlinker-ELK16，合成基因时分别在Mxe-PTlinker-ELK16基因片段的上游和下游引入Nde I和Xho I两个酶切位点。然后分别双酶切pET30a(+)质粒和Mxe-PT linker-ELK16基因片段，连接形成质粒pET-Mxe-PTlinker-ELK16。

(2)根据抗菌肽的基因序列，在基因合成公司(上海生工)合成其DNA序列PEW300，并将PEW300基因合成至pUC57质粒上，形成pUC57-PEW300质粒。设计如下引物(PEW300-F/PEW300-R)扩增PEW300的目的基因：

以合成的含有抗菌肽PEW300基因的质粒(pUC57-PEW300)为模板，用上述扩增引物进行PEW300目的基因的扩增，具体步骤如下：

a.PCR反应体系(50μL)：

b.PCR扩增反应程序：

c.PCR反应结束后，2％(w/v)琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到大小约为200bp的包含PEW300的基因片段，对PCR产物进行纯化回收，得到含有PEW300的基因片段，然后配制线性扩增反应体系，将回收的PEW300目的基因插入载体pET-Mxe-PTlinker-ELK16中，具体反应体系如下：

PCR反应体系(50μL)：

PCR扩增反应程序：

d.PCR反应完后，将步骤(b)中得到的PCR产物进行DpnI酶切消化，具体操作如下：

酶切反应体系(20μL)：

置于37℃恒温PCR仪中反应1h。

e.酶切反映完毕后，将酶切后的产物转化至大肠杆菌DH5α中,然后将菌液涂至含卡那霉素(终浓度为50ug/ml)的LB固体平板中，置于37度培养箱培养过夜.转化方法采用化学转化法。

f.对平板中长出的单克隆进行测序鉴定。筛选出正确携带天蚕素A基因的重组质粒pET-pew300。如图2示。

实施例3：大肠杆菌胞内表达PEW300-ELK16融合蛋白工程菌的构建

将实例1中构建的重组表达载体pET-PEW300通过化学转化的方法转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，然后将菌液涂布至含有50ug/ml的卡那霉素的LB固体平板中，37℃培养过夜。其中BL21(DE3)感受态细胞购自真知生物科技有限公司。得到含有重组质粒pET-PEW300的BL21(DE3)工程菌。

实施例4：PEW300-ELK16融合蛋白活性聚集体的制备及优化

(1)挑选实例3中的单克隆接种至LB液体培养基中进行37℃，220rpm过夜培养作为种子液。将种子液按1:100(v/v)的比例接种到4支装有新鲜LB液体培养基的试管中，置于37℃，220rpm进行培养，当OD₆₀₀＝0.6～0.8时，分别添加不同浓度的诱导剂(IPTG)进行诱导，诱导剂浓度如下：0.1、0.5、1mM。其中一支试管不添加诱导剂作为对照，然后将4支试管置于16℃的摇床中低温诱导表达24h。

表达结束后，对表达后的菌液测其OD₆₀₀值并收菌。

按照每10OD加1ml PBS buffer对上述收集的菌体进行悬浮，然后采用超声波破碎菌体。菌体破碎完毕后吸取80ul制备破碎后的全液样品，然后12000rpm离心2min获得破碎后的上清和沉淀，分别吸取80ul制备破碎后的上清和沉淀样品进行制样。

(2)将制备好的样品置于沸水浴中煮沸10min，12000rpm离心2min，跑SDS-PAGE。结果如图3所示。菌体经诱导后都有明显的目的蛋白条带(约30kDa)。说明PEW300-ELK16融合蛋白成功在大肠杆菌胞内表达。当诱导剂浓度为0.1mM时融合蛋白的表达量就达到平衡，因子最优的诱导剂浓度为0.1mM IPTG。另外。融合蛋白有部分存在于上清，但主要是以沉淀的形式存在，说明表达的融合蛋白形成了聚集体。

实施例5：高纯度抗菌肽PEW300抗菌肽的收集

(1)添加诱导剂DTT诱使自剪切短肽Mxe GyrA发生自剪切释放抗菌肽PEW300

a.挑选实例3中的单克隆接种至LB液体培养基中进行37℃，220rpm过夜培养作为种子液。将种子液按1:100(v/v)的比例接种到1L的LB液体培养基中，置于37℃，220rpm进行培养，当OD₆₀₀＝0.6～0.8时，添加诱导剂IPTG至终浓度为0.1mM，然后置于16℃摇床，220rpm诱导表达24h。

b.表达结束后，7000rpm离心30min收集菌体。超声破碎裂解细胞，12000rpm离心30min，收集破碎沉淀。然后按照每10OD添加1ml PBS buffer的比例，想破碎沉淀中加入PBSBuffer悬浮沉淀。将悬浮后的沉淀溶液平均等分成5分于离心管中，编号10、20、30、40、80。分别向5支离心管中添加不同浓度的诱导剂DTT，使其终浓度为10、20、30、40、80mM。然后将离心管置于4℃的恒温培养箱切割12h。

c.切割完毕后，对上述切割样品分别制样。跑SDS-PAGE，结果如图4所示：添加不同浓度的DTT后，融合蛋白均发生了切割，并且当DTT的添加浓度为40mM时切割已经达到饱和。从图4中的P₁也可以看到切割后成功释放出PEW300抗菌肽(约5kDa处的条带)。因此选择40mM的DTT添加浓度作为最优诱导切割浓度。

(2)乙酸处理释放高纯度的天蚕素A抗菌肽

向切割后的溶液中分别加入浓度梯度为0.1％-1％(v/v)的乙酸溶液，悬浮均匀，然后室温静置10min，12000rpm离心5min收集上清沉淀，并分别对上清和沉淀样品制样，跑SDS-PAGE。结果如图5所示：添加不同浓度的乙酸后，PEW300均有不同程度的溶解至上清中，当添加乙酸浓度至0.1％时，约99％的PEW300抗菌肽均溶解至上清中。至此，高纯度的抗菌肽PEW300已经成功收集。然后透析除去乙酸。

(3)对收集到的抗菌肽PEW300进行蛋白浓度测定

按照已知蛋白浓度的标准品作为对照，通过灰度扫描的方法计算出天蚕素A抗菌肽的蛋白浓度。如图6所示：所用的标准蛋白为抑肽酶(S₁-S₉)。从左至右蛋白浓度分别为：0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ug/孔。经灰度扫描后计算抗菌肽PEW300的浓度为：PEW300-1(泳道1)：54.56ng/ul、PEW300-2(泳道2)：56.65ng/ul。

实施例6：天然抗菌肽天蚕素A以及抗菌肽PEW300对9种指示菌MIC(最小抑菌浓度)和MBC(最小杀菌浓度)的测定

以天然抗菌肽天蚕素A(购买于sigma-Aldrich默克生物公司)抗菌肽做对比，通过添加一系列不同浓度的抗菌肽溶液(100、50、25、12.5、6.25、3.1、1.55、0.74、0.37、0.18ng/μl)来测定天蚕素A和抗菌肽PEW300对9种指示菌(大肠杆菌、绿脓杆菌、嗜麦芽假单胞菌、巨大芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、假单胞菌、金黄色葡萄球菌、地衣芽胞杆菌)的MIC(最低抑菌浓度)。以大肠杆菌为例：具体操作方法如下：

(1)菌悬液的制备

挑取大肠杆菌单克隆(E.coli ATCC 25922)于MHB固体平板(购自广东环凯微生科技有限公司)中，置于37℃培养18～24h进行活化。从活化的平板中挑取大肠杆菌菌落于装有无菌MHB液体培养基(购自广东环凯微生科技有限公司)的试管中，漩涡器混匀，使其OD₆₂₅为0.08～0.13，得到菌悬液。

(2)抑菌实验

首先，向96孔板的第2～11孔加入50μl灭菌的MHB液体培养基(购自广东环凯微生科技有限公司)，向第12孔中加入100μl的MHB液体培养基(购自广东环凯微生科技有限公司)作为阳性对照。然后在第1孔中加入100μl100ng/μl的抗菌肽溶液(化学合成肽和本发明产生的抗菌肽)，然后从第1孔中吸取50μl至第2孔、从第2孔中取50μl至第3孔，以此类推至第10孔，从第10孔吸取50μl弃掉，作为平衡。再向第2～11孔中加入50μl经上述稀释好的指示菌液(步骤(1)制备的菌悬液)，最后置于37℃培养16～20h。

(3)观察确定MIC值

用肉眼观察抑菌情况，指示菌不能生长的浓度即为抗菌肽对大肠杆菌的MIC，结果如表2所示。

(3)MBC值的测定

分别从(3)中没有明显菌悬液的样品中吸取10ul进行涂布至MHA平板中，置于37℃培养16～20h，第二天观察，没有单克隆生长的浓度即为最小致死浓度MBC。结果如表2所示。

实施例7：抗菌肽PEW300的pH、温度、蛋白酶稳定性及溶血性检测

以实施例5中获得的高纯度的抗菌肽PEW300为样品，以绿脓杆菌ATCC9027为指示菌对突变体PEW300分别进行pH、温度、蛋白酶和溶血性能检测。

(1)pH稳定性的检测

分别配制不同pH的缓冲液，具体如下：

pH＝2.0的100mM的甘氨酸-HCL冲液、pH＝4.0的100mM的乙酸钠缓冲液、pH＝6.0的100mM的磷酸钠缓冲液、pH＝8.0的100mM的Tris-HCL缓冲液、pH＝10.0的100mM的甘氨酸-NaOH缓冲液。将上述纯化的54.56ng/ul的PEW300抗菌肽分别调节至上述相应的pH缓冲液中，37℃放置4h。然后涂布，统计不同pH条件下抑菌圈的大小。结果如图7A所示。

(2)热稳定性检测

将抗菌肽PEW300分别置于4℃、20℃、40℃、60℃、80℃、100℃下反应1h，然后涂布，统计不同温度下抑菌圈的大小。结果如图7B所示。

(3)蛋白酶稳定性检测

将抗菌肽PEW300分别以质量比为10：1加入以下不同蛋白酶溶液中：

木瓜蛋白酶(500U/mg pH＝6.0)、胃蛋白酶(3000U/mg pH＝2.0)、胰蛋白酶(250U/mg pH＝8.0)、蜗牛酶(2000U/mg pH＝6.0)和蛋白酶K(40mAU/mg pH＝7.0)。然后在37℃下放置4h，涂布、统计不同蛋白酶处理后的抑菌圈大小。结果如图7C所示。

(4)溶血特性检测

分别取28-224ng/ul(28ng/ul、56ng/ul、112ng/ul、224ng/ul)的抗菌肽PEW300，以牛津杯的方式加入到哥伦比亚血琼脂平板中，37℃培养过夜，观察溶血圈大小。结果如图7D所示。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 一种抗菌肽天蚕素A突变体及其编码基因、制备方法和应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 594

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgcatcaccg gcgacgcctt agtggcactg ccggaaggcg aaagcgtgcg tattgccgat 60

atcgttccgg gtgcacgccc taacagcgat aatgcaatcg acctgaaagt gttagatcgc 120

cacggcaatc ctgttctggc cgatcgcctg tttcacagtg gcgaacatcc ggtgtacaca 180

gtgcgcaccg tggaaggtct gcgcgtgacc ggcacagcaa atcacccgct gctgtgttta 240

gtggacgttg caggcgtgcc tacactgctg tggaagctga tcgatgaaat caagccgggt 300

gactacgcag tgattcagcg cagtgccttc agcgttgatt gcgccggttt tgcacgtggc 360

aaaccggaat ttgcaccgac cacctacacc gtgggtgtgc cgggcctggt tcgtttcctg 420

gaagcacacc atcgtgatcc ggacgcacag gccattgccg atgagctgac cgacggccgc 480

ttttactatg ccaaagttgc cagcgtgaca gatgcaggtg tgcagccggt ttacagttta 540

cgcgtggata ccgccgatca cgcattcatt accaacggct tcgttagcca tgcc 594

<210> 2

<211> 99

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccgaccccac cgaccacgcc aacgccacca accaccccaa ccccgacgcc gctggaactg 60

gaactgaaac tgaaactgga actggaactg aaactgaaa 99

<210> 3

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile His Lys Val Gly Gln Asn Ile Arg

1 5 10 15

Lys Gly Ile Ile Lys Ala Gly Pro Ala Val Ala Val Val Gly Gln Ala

20 25 30

Ala Gln Ile Ala Lys

35

<210> 4

<211> 111

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aagtggaaac tgttcaagaa gattcacaaa gtgggtcaga acatccgtaa gggcatcatc 60

aaagccggtc ctgccgtggc agttgttggc caggccgccc agatcgccaa g 111

<210> 5

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccgaccccac cgaccacgcc aacgccacca accaccccaa ccccgacgcc g 51

Claims

1.一种抗菌肽天蚕素A突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No：3所示。

2.编码权利要求1所述抗菌肽天蚕素A突变体的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID No：4所示。

3.一种抗菌肽天蚕素A突变体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将权利要求2所述的突变体基因，连接到表达载体上，得到重组表达载体；

(2)将步骤(1)中得到的重组表达载体转化到大肠杆菌表达宿主菌中，得到工程菌；所述重组表达载体包含突变体融合蛋白，该融合蛋白的组成为：突变体-自剪切短肽-连接肽-自聚集短肽，所述的自剪切短肽为Mxe GyrA，自聚集短肽为ELK16；

(3)步骤(2)中得到的工程菌中加入IPTG进行诱导表达，离心收集菌体，破碎菌体，离心获得沉淀，再向沉淀中加入DTT进行诱导切割，离心收集上清，得到抗菌肽天蚕素A突变体。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，

所述的自剪切短肽的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示；

所述的自聚集短肽的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示；

所述的连接肽为PT linker，其核苷酸序列如SEQ ID No：5所示。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述IPTG的浓度为0.1mM，DTT的浓度为10～80mM。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述诱导表达的温度为16℃，诱导表达的时间为24h；所述诱导切割的温度为在4℃，切割时间为12h。

7.根据权利要求3～6任意一项所述的制备方法，其特征在于，还包括将步骤(3)中得到的抗菌肽天蚕素A突变体进一步浓缩纯化，纯化方式为乙酸纯化，所用乙酸浓度为0.1％-1％(v/v)。

8.权利要求1所述的抗菌肽天蚕素A突变体在制备抗微生物感染药物中的应用。