CN101775404A - 一种原核表达体系高表达碱性蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种原核表达体系高表达碱性蛋白的方法。该方法包括如下步骤：重组碱性蛋白表达载体的构建；重组碱性蛋白转化体的制备；重组碱性蛋白的表达；重组碱性蛋白的酶切、纯化；其中，所述重组碱性蛋白为碱性蛋白和保护多肽或片段的融合蛋白，所述碱性蛋白是指等电点为9-11的蛋白或C末端氨基酸序列带有强正电荷的蛋白或/和N末端氨基酸序列带有强正电荷的蛋白。本发明所提供原核表达体系高表达碱性蛋白的方法，为碱性蛋白生物制备提供一条廉价、方便的生产方法。

Description

一种原核表达体系高表达碱性蛋白的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种原核表达体系高表达碱性蛋白的方法。

背景技术

重组蛋白质是指利用DNA重组技术生产的蛋白质。绝大部分重组蛋白药物是人体蛋白或其突变体，主要作用机理为弥补某些体内功能蛋白的缺陷或增加人体内蛋白功能。重组蛋白生产过程包括：鉴定具有药物作用活性的目的蛋白，分离或合成编码该蛋白的基因，然后将其插入合适的载体，转入宿主细胞，构建能高效表达蛋白的菌种库或细胞库，最后扩大规模应用到发酵罐或生物反应器进行大量的目的蛋白生产。

重组药物的表达系统分为原核生物和真核生物表达系统。原核生物主要是大肠杆菌表达系统，真核生物表达系统主要有酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞等表达系统。原核表达系统工艺成熟、成本低廉，但原核表达系统如大肠杆菌比较适合于酸性蛋白的表达[Su Y，Zou Z，Feng S，et al.J Biotech.2007，129：373-382]，带有强正电荷的碱性重组蛋白本身就不适合在大肠杆菌这种原核表达体系表达，即使其基因就算是被勉强转录、翻译后，也很容易招致细胞内蛋白水解酶的攻击而破坏，得不到表达的产物，所以急需解决碱性重组蛋白原核表达体系表达问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题提供了一种原核表达体系高表达碱性蛋白的方法，为碱性蛋白生物制备提供一条廉价、方便的生产途径。

为此本发明公开了，一种原核表达体系高表达碱性蛋白的方法，包括如下步骤：

a)重组碱性蛋白表达载体的构建；

b)重组碱性蛋白转化体的制备；

c)重组碱性蛋白的表达；

d)重组碱性蛋白的酶切、纯化；

其中，所述重组碱性蛋白为碱性蛋白和保护多肽或片段的融合蛋白，所述碱性蛋白是指等电点为9-11的蛋白或C末端氨基酸序列带有强正电荷的蛋白或/和N末端氨基酸序列带有强正电荷的蛋白。

本发明的发明思路为碱性蛋白和保护多肽或片段构成融合蛋白，通过保护多肽或片段的保护作用，避免碱性蛋白在原核细胞内被蛋白水解酶降解，而得不到表达的产物。

碱性蛋白和保护多肽或片段的融合蛋白可具有下式：R2-R1、R1-R2、R1-L-R2-L-R1、R1-L-R2或R2-L-R1，其中R1保护多肽或片段，L是接头肽，R2是至少一个碱性蛋白。接头肽包括例如：(GGGGS)N或(GGGS)N或(GGS)N，其中N是大于或等于1的整数，G表示甘氨酸，S表示丝氨酸。最优化为在碱性蛋白和保护多肽或片段融合蛋白中，碱性蛋白和保护多肽或片段间带有位点专一性蛋白酶识别位点，使保护多肽或片段可以被完全去除。

在一些实施方式中，所述保护多肽或片段可为谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione-S-transferase，GST)，转录延长因子(transcription elongation factor，Nus)，硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase，TrxB)或者是麦芽糖结合蛋白(Maltose-bindingprotein，MBP)等。

在一实施方式中，所述重组碱性蛋白，为如下(a)或(b)的蛋白：

(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所述的蛋白；(b)至少与(a)中的氨基酸序列60％同源性的蛋白。

在一实施方式中，所述表达载体为pET43.1a表达载体。

在一实施方式中，所述转化体为大肠杆菌。

在一实施方式中，所述酶为凝血酶、肠激酶或Xa因子。

在一实施方式中，所述纯化采用镍柱进行亲和层析分离纯化。

另一方面，本发明还公开了按照上述制备方法生产的碱性蛋白。

本发明所提供原核表达体系高表达碱性蛋白的方法，为碱性蛋白生物制备提供一条廉价、方便的生产方法。

附图说明

图1PCR扩增的多聚精氨酸-凋亡素基因片段1.5％琼脂糖凝胶电泳图谱；

图2表达质粒R9-Apop-pET43.1a构建过程示意图；

图3表达的Nus-R9-Apoptin重组蛋白SDS-PAGE凝胶电泳图谱；

图4表达的Nus-R9-Apoptin重组蛋白Western杂交电泳图谱；

图5纯化的重组Nus-R9-Apoptin重组蛋白SDS-PAGE电泳分析图谱；

图6不同浓度重组多聚精氨酸-凋亡素对Hela细胞的存活率的影响。

具体实施方式

在本文，蛋白的同源性百分比由GAP(Needleman和Wunsh，1970)分析(GCG程序)确定，其中参数gap creation penalty＝5，gap extension penalty＝0.3。被分析的序列长度至少为15个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为15个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为50个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为50个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为100个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为100个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为250个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为250个氨基酸的区域进行测试。甚至更优选地，被分析的序列长度至少为500个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为500个氨基酸的区域进行测试。

融合蛋白的表达

本发明包括编码本发明的融合蛋白的DNA以及含有这些DNA的载体、转化体。

本发明中，使用的术语“转化体”(transformant)，即带有异源DNA分子的宿主细胞。

本发明还包括通过合成和重组技术生产本发明的融合蛋白的方法。通过本领域已知的方法可以分离和纯化多核苷酸(DNA或RNA)、载体、转化体和生物体。

用于本发明的载体可以是如噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或逆转录病毒载体。可用于克隆和/或表达本发明的多核苷酸的载体是能在需复制和/或表达多核苷酸的宿主细胞中复制和/或表达多核苷酸的载体。一般说来，多核苷酸和/或载体可用于任何原核细胞，如大肠杆菌。有关适用于多种类型宿主细胞的适当载体的例子可参见例如F.Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology.Greene Publishing Associatesand Wiley-Interscience(1992)和Sambrook et al.(1989)。可以使用含有这些多核苷酸的宿主细胞来大量表达可用于例如药物、诊断试剂、疫苗和治疗剂的蛋白质。

已开发出多种方法用于经由互补的粘性末端使多核苷酸与载体可操作相连。例如，可在欲插入载体DNA内的DNA区段添加互补的同聚体序列片段。然后通过互补同聚体尾之间的氢键连接载体和DNA区段以形成重组DNA分子。

含有一或多种限制性位点的合成接头提供了另一种连接DNA区段与载体的方法。用噬菌体T4 DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理通过内切核酸酶限制性消化产生的DNA区段，所述的两种聚合酶用其3′，5’-核酸外切活性除去突出的γ-单链末端，并用其聚合活性补平3’-凹端。因此，这些活性的联合产生了平端DNA区段。然后在能催化平端DNA分子连接的酶，如噬菌体T4 DNA连接酶的存在下将平端区段与大摩尔过量的接头分子一起保温。因此，反应产物是末端携有聚合接头序列的DNA区段。然后用适当的限制性酶裂解这些DNA区段，并连接至已用酶裂解的表达载体中，所述酶能产生与所述DNA区段相容的末端。从多个商家可以买到含有多个限制性内切核酸酶位点的合成接头。

多核苷酸插入物应该可操作地连接于同表达多核苷酸的宿主细胞相容的适当启动子上。启动子可以是强启动子和/或诱导型启动子。列举的一些启动子的例子包括噬菌体λPL启动子、大肠杆菌lac、trP、phoA、tac启动子、SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR启动子。其它适当启动子是本领域技术人员已知的。表达重组载体进一步含有转录起始、终止位点，并在转录区含有用于翻译的核糖体结合位点。重组载体表达的转录物的编码部分可包括位于起点处的翻译起始密码子和适当地位于被翻译多肽的末端的终止密码子(UAA，UGA或UAG)。

如上所述，表达载体可包括至少一个选择标记。所述标记包括用于大肠杆菌和其它细菌培养的四环素、卡那霉素或氨卞青霉素抗性基因。适当宿主的代表性例子包括但不限于：细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞；上述宿主细胞的适当培养基和培养条件是本领域已知的。

为了有效地分离纯化或分泌目标蛋白，常常还可利用便于分离纯化的标签蛋白或标签多肽(Tag)。常用的有谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferase，GST)、六聚组氨酸肽(His.Tag)、蛋白质A(protein A)和纤维素结合位点(cellulose binding domain)等。通过特殊性蛋白或多肽与目标蛋白构成融合蛋白的形式，表达后利用所述的标签蛋白或标签多肽的特殊性质可对目标蛋白进行分离和纯化。如His.Tag与Ni-ChelatingSepharose柱特异性结合。所述的标签蛋白或标签多肽可以在纯化后用位点特异性蛋白酶消化去除融合序列，如可用凝血酶、肠激酶和Xa因子等，以获得目标蛋白。

本发明还包括含有本发明的核苷酸序列的宿主细胞，所述核苷酸序列经本领域已知的技术与一或多种异源控制区(如启动子和/或增强子)可操作相连。可以选择能调节插入的基因序列的表达，或能按照所需的特殊方式修饰和加工基因产物的宿主菌株。在某些诱导物的存在下，某些启动子启动的表达会升高；因此，可以控制经基因改造的多肽的表达。另外，不同宿主细胞具有特征性的和特殊的翻译、翻译后加工和修饰(如磷酸化、裂解)蛋白质的机制。可以选择适当的细胞系以确保对表达的外源蛋白质进行合乎需要的修饰和加工。

通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它方法，即可将本发明的核酸和核酸重组载体导入宿主细胞。所述方法描述于多个标准的实验室手册中，如Davis et al.，Basic Methods In Molecular Biology(1986)。

编码本发明的所述融合蛋白的多核苷酸可以与含有选择标记的载体连接以在宿主中增殖。一般说来，可在沉淀物，如磷酸钙沉淀物或其与带电脂质的复合物中导入质粒载体。如果载体是病毒，可使用适当的包装细胞系在体外对其进行包装，再转导至宿主细胞。

通过众所周知的技术可以鉴定出被成功转化的细胞，即含有本发明的DNA重组载体的细胞。例如，可培养导入表达重组载体所得的细胞以产生所需多肽。收集并裂解细胞，使用如Southem(1975)J.Mol.Biol.95，503或Berent et al(1985)Biotech.3，208所述的方法，检测其DNA内容物中DNA的存在。或者，使用抗体检测上清液中蛋白质的存在。

通过众所周知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化本发明的所述融合蛋白较为有利，所述方法包括硫酸按或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析、疏水电荷作用层析和凝集素层析。在一些实施方案中，可使用高效液相层析(HPLC)进行纯化。

在一些实施方案中，可使用上述的一种或多种层析方法纯化本发明的所述融合蛋白。在其它实施方案中，可使用下述的一种或多种层析柱纯化本发明的所述融合蛋白，所述层析柱有：Q sepharose FF柱、SP sepharose FF柱、Q sepharose High Performance柱、Blue sepharose FF柱、Blue柱、Phenyl Sepharose FF柱、DEAE Sepharose FF、Ni-ChelatingSepharose FF柱或Methyl柱等。

另外，可使用国际公开号WO00/44772(全文列入本文作为参考)中描述的方法纯化本发明的融合蛋白。本领域技术人员可以容易地改动其中所述的方法以用于纯化本发明的融合体蛋白。可以从原核宿主经重组技术产生的产物中回收本发明的融合蛋白。

多聚精氨酸序列是目前较多的用作跨膜转运的一种PTD序列。Shiroh Futaki等4研究了TAT(48-60)，R9-TAT，P22N(14-30)，FHV coat(35-49)等蛋白转导域的转运效率，发现在PTD多肽序列中，精氨酸(R)的含量越高，跨膜效率越高。从而，采用化学合成方法合成了4-16个R串连的短肽，使其与带荧光蛋白连接后转染RAW264.7细胞，检测其跨膜转运活性。结果发现，R4(即4个R串联)几乎没有转化活性；R6和R8有最大的转化活性；而R16的转化活性剂不明显。推测这种转运效能可能是由碱性的精氨酸与膜脂形成氢键，或与膜外的磷酸肝素相互作用而导致转运的进行。Rothbard5和ShirohFutaki等发现，分支状R的串联时，R分支的形状也是决定转导的重要因素。随着R数量的增加，分支R的跨膜效率与含有相同数量R的单链多肽趋势相同，但相应的跨膜效果都有所增加。而(RG3R)4表现出了与(R2)4相同的高效跨膜率。因此，采用多聚精氨酸类PTD做跨膜转运时，R的个数是决定转运效率的主要因素。对于需要转运的不同蛋白质分子需要具体调整R的个数，以实现最佳转运效果。另外，所有这些多聚精氨酸类PTD都是通过体外人工合成的方法制备的。采用人工合成方法制备多聚精氨酸多肽需要昂贵的多肽合成仪。但如果将这种多聚精氨酸PTD序列直接采用基因工程方法表达时，又会出现表达效率极低的问题。

在一实施方式中，本发明公开了多聚精氨酸-凋亡素融合蛋白，其中所述多聚精氨酸可以是由6-13个精氨酸串联而成，典型的为8-11个精氨酸串联而成。

在一较优实施例中，本发明提供的多聚精氨酸-凋亡素融合蛋白具有序列表SEQ ID：3所示的氨基酸序列。

本发明提供的多聚精氨酸-凋亡素融合蛋白基因具有序列表SEQ ID：4所示的核苷酸序列。

本发明提供的多聚精氨酸-凋亡素融合蛋白制备方法包括以下步骤：

a.构建克隆有多聚精氨酸-凋亡素融合蛋白基因的表达质粒poly Arg-Apop-pET43.1a；

b.构建重组多聚精氨酸-凋亡素融合蛋白工程菌；

c.多聚精氨酸-凋亡素融合蛋白基因的表达和纯化。

上述a.中所述的表达质粒poly Arg-Apop-pET43.1a的构建方法是：设计5’端和3’端引物，采用PCR的方法从克隆有凋亡素全长基因的TAT-Apop-pET28a质粒中将凋亡素全长基因(第1-121位氨基酸残基)克隆，此基因的5’端和3’端两侧分别接上了BamH I和Xho I酶切位点，构成克隆有多聚精氨酸-凋亡素基因的表达质粒polyArg-Apop-pET43.1a。在这个表达质粒中，与凋亡素N-末端融合的多聚精氨酸的个数可以是6-13个，典型的是8-11个。

上述b.中所述的重组多聚精氨酸-凋亡素融合蛋白工程菌是：将已构建好的表达质粒poly Arg-Apop-pET43.1a转入大肠杆菌宿主中。大肠杆菌宿主菌株可以是BL21(DE3)，BL21(DE3)pLysS，JM109(DE3)，Rosetta(DE3)，Rosetta DE3 pLysS等。

上述c.中所述的多聚精氨酸-凋亡素融合蛋白的表达和纯化的方法是：将构建的含有poly Arg-Apop-pET43.1a表达质粒的工程菌，在添加有100ug/ml终浓度氨苄青霉素的LB培养基15-25℃振荡培养至OD600nm达到0.3-0.6左右时，加入IPTG至终浓度为0.2-2mM，诱导培养12-16hr，收集菌体进行超声破碎，离心收集上清，上镍柱进行亲和层析分离，分段收集目的蛋白组分，在已纯化的Nus Tag-多聚精氨酸-凋亡素融合蛋白溶液中，按1/10体积加入10x缓冲液[500mM Tris-HCl，pH 8.0，10mM CaCl2，1％Tween-20(v/v)]。混匀后，以每0.5mg目标蛋白加入1U肠激酶，于在37℃，水解16小时以上。然后将反应液过镍柱进行亲和层析分离，收集流出液。除菌过滤后进行蛋白含量测定，保存待用。

以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量，除非特别说明。

实施例1：

构建克隆有多聚精氨酸蛋白转导域和凋亡素基因的表达质粒R9-Apop-pET43.1a。

1.多聚精氨酸蛋白转导域和凋亡素基因的PCR扩增

(1)根据已有的凋亡素基因序列，设计亚克隆凋亡素基因的正向和反向引物：

P1：5′-GGATCCATGGTACGTCGCCGTCGTCGCCGTCGTCGCCGTGGTAACGCTCTCCAAGAAGAT-3′

P2：5′-CTCGAGTCACAGTCTTATACGCCTTTTTGCGG-3′

在正向引物P1中，导入了一个BamH I酶切位点和由9个精氨酸残基串联而成的PTD以及充当“铰链”作用的Ala残基；在反向引物P2中，导入了一个Xho I酶切位点和终止密码子TGA。

(2)PCR扩增的反应条件为：先94℃，变性5min，然后94℃，变性45s→52℃，复性30s→72℃，延伸45s，循环30次，最后72℃，5min。

(3)PCR扩增产物经1.5％琼脂糖电泳分析图谱见图1。图中，M为标准分子量DNA Marker；1为扩增得到的约400bp的多聚精氨酸-凋亡素融合蛋白基因片段。

(4)将PCR产物回收待用。

2.重组表达质粒R9-Apop-pET43.1a的构建

将PCR扩增得到的目标片段，与pMD18T载体连接，转化E.coli DH5α菌株，通过蓝白斑筛选阳性克隆，扩增，抽提质粒DNA。然后用BamH I和XhoI双酶切，胶回收产生的酶切片段。将此片段与已经用同样的酶水解、回收的pET43.1a质粒DNA连接，转入E.coli BL21(DE3)进行培养，回收重组质粒DNA，测序验证。

3.表达质粒构建过程示意图见图2。

实施例2：

Nus Tag-多聚精氨酸-凋亡素融合蛋白的表达，检测和分离纯化。

1.将带有R9-Apop-pET43.1a的E.coli BL21(DE3)重组工程菌在含氨苄青霉素的LB固体平皿上培养，挑取单克隆，在15-25℃采用含氨苄青霉素100ug/ml的LB液体培养基进行培养至OD₆₀₀＝0.3-0.6时，加入终浓度为0.2-2mM的IPTG进行诱导，继续于15-25℃继续培养12-16小时，收集菌体，超声波破碎，离心收集上清液。

2.诱导表达的菌体经超声波破碎，进行15％SDS-PAGE电泳分析，见图3。图中，1为诱导前菌体破碎上清液；2为诱导后的菌体破碎上清液；M为低分子量标准蛋白质。表达的目标蛋白分子量在76kD左右。

3.对SDS-PAGE电泳分离的样品采用免疫印迹法进行分析。一抗为小鼠His Tag抗体，二抗为羊抗小鼠IgG并经碱性磷酸酯酶标记。Western杂交电泳图谱见图4。图中，1为诱导后的菌体样品，M为低分子量标准蛋白质。表明分子量约为76kD左右的条带与His抗体有免疫识别反应。

4.将菌体超声破碎，离心得上清，调节pH至7.5-8.5，加入镍亲和层析凝胶进行柱外吸附1-2hr。吸附完毕后，将凝胶装入玻璃层析柱中经洗涤后用20-200mM咪唑分段洗脱，收集目标蛋白。洗脱的目标蛋白SDS-PAGE电泳分析结果见图5。图中，M为低分子量标准蛋白质，1为上样液，2为穿出液，3、4为20mM咪唑洗脱分段收集液，5、6为100mM咪唑洗脱分段收集液，7为200mM咪唑洗脱分段收集液。

实施例3：

Nus Tag-多聚精氨酸-凋亡素融合蛋白的肠激酶水解。

1.肠激酶(Enterokinase，light chain)能高度专一性识别Asp-Asp-Asp-Asp-Lys氨基酸序列并在Lys的C端水解多肽。在已纯化的Nus Tag-多聚精氨酸-凋亡素融合蛋白溶液中，按1/10体积加入10x缓冲液[500mM Tris-HCl，pH 8.0，10mM CaCl₂，1％Tween-20(v/v)]。混匀后，以每0.5mg目标蛋白加入1U肠激酶，于在37℃，水解16小时以上。然后将反应液过镍柱进行亲和层析分离，收集流出液。

2.用截留分子量分别为30kD和10kD的离心超滤柱进行离心超滤分离、浓缩，制备的样品即可进行药理活性分析。

实施例4：

多聚精氨酸-凋亡素融合蛋白对体外培养的细胞的诱导凋亡作用。

1.将HeLa细胞在96孔细胞培养板中于37℃培养至细胞密度达到60％左右。将表达后分离纯化得到的重组多聚精氨酸-凋亡素融合蛋白经多次透析去除咪唑。然后进行无菌过滤，加入不同体积的DMEM细胞培养基稀释成不同蛋白浓度，从最高蛋白浓度起，逐步对半降低浓度，至蛋白浓度为零，以此作为阴性对照，每组蛋白浓度取3-4个孔作为平行对照。培养24小时后，吸取培养基，加入100μl含有5ug/ml MTT的DMEM，37℃孵育4小时，吸去培养基，加入100μl DMSO溶解紫色结晶，37℃孵育10分钟，于酶标仪490nm测定吸光值。在重组多聚精氨酸-凋亡素融合蛋白浓度在50μg/ml时，HeLa细胞的存活率为35％(IC₅₀＝44μg/ml)。而同样情况下，作为阴性对照的缓冲液对Hela细胞生长影响不明显。

2.采用重组多聚精氨酸-凋亡素融合蛋白对培养的HeLa细胞诱导凋亡处理的结果见图6。以MTT法检测经不同浓度样品处理后的HeLa细胞存活率。

实施例5：

多聚精氨酸-凋亡素融合蛋白对小鼠腹水瘤动物模型的抑瘤作用。

采用C57BL/6小鼠Lewis肺癌模型验证重组多聚精氨酸-凋亡素融合蛋白对肿瘤的增殖抑制作用。实验设空白对照组，阳性对照组，试验组三个组别，每组8只动物。空白对照组在接种肿瘤后，以生理盐水腹腔注射。阳性对照组则以注射环磷酰胺溶液(20mg/kgBW/天)。试验组注射经纯化透析、无菌过滤的重组多聚精氨酸-凋亡素融合蛋白(50mg/kgBW/天)。

1.接瘤：在6周龄，体重约20g的C57BL/6(雄性)小鼠腋下接种0.2ml的Lewis肺癌细胞悬液，喂养3-4天后，观察小鼠腋下肿瘤生长情况。待注射部位的肿瘤长至直径数毫米大小时即可开始给药试验。

2.给药：采用腹腔注射的方式给药，连续给药7-8天。每天给药前进行体重测量。

3.抑瘤率测定：停止给药2天后，采用断颈法处死动物，将小鼠体内的肿瘤组织剥离，取出称重，计算抑瘤率。

抑瘤率＝(空白组平均瘤重-药物组平均瘤重)/空白组平均瘤重X100％

4.重组多聚精氨酸-凋亡素融合蛋白对Lewis肺癌的抑瘤率为35.7％，与阳性对照组接近(阳性对照组抑瘤率为47.4％)。说明试验药物对肿瘤细胞具有很好的抑制生长作用。

重组多聚精氨酸-凋亡素融合蛋白对实体瘤的抑制作用

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只欲作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。

序列表

<110>华东理工大学

<120>一种原核表达体系高表达碱性蛋白的方法

<130>说明书序列表

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>9

<212>PRT

<213>artificial sequence

<400>1

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1               5

<210>2

<211>685

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<400>2

Met Asn Lys Glu Ile Leu Ala Val Val Glu Ala Val Ser Asn Glu Lys

1               5                   10                  15

Ala Leu Pro Arg Glu Lys Ile Phe Glu Ala Leu Glu Ser Ala Leu Ala

            20                  25                  30

Thr Ala Thr Lys Lys Lys Tyr Glu Gln Glu Ile Asp Val Arg Val Gln

        35                  40                  45

Ile Asp Arg Lys Ser Gly Asp Phe Asp Thr Phe Arg Arg Trp Leu Val

    50                  55                  60

Val Asp Glu Val Thr Gln Pro Thr Lys Glu Ile Thr Leu Glu Ala Ala

65                  70                  75                  80

Arg Tyr Glu Asp Glu Ser Leu Asn Leu Gly Asp Tyr Val Glu Asp Gln

                85                  90                  95

Ile Glu Ser Val Thr Phe Asp Arg Ile Thr Thr Gln Thr Ala Lys Gln

            100                 105                 110

Val Ile Val Gln Lys Val Arg Glu Ala Glu Arg Ala Met Val Val Asp

        115                 120                 125

Gln Phe Arg Glu His Glu Gly Glu Ile Ile Thr Gly Val Val Lys Lys

    130                 135                 140

Val Asn Arg Asp Asn Ile Ser Leu Asp Leu Gly Asn Asn Ala Glu Ala

145                 150                 155                 160

Val Ile Leu Arg Glu Asp Met Leu Pro Arg Glu Asn Phe Arg Pro Gly

                165                 170                 175

Asp Arg Val Arg Gly Val Leu Tyr Ser Val Arg Pro Glu Ala Arg Gly

            180                 185                 190

Ala Gln Leu Phe Val Thr Arg Ser Lys Pro Glu Met Leu Ile Glu Leu

        195                 200                 205

Phe Arg Ile Glu Val Pro Glu Ile Gly Glu Glu Val Ile Glu Ile Lys

    210                 215                 220

Ala Ala Ala Arg Asp Pro Gly Ser Arg Ala Lys Ile Ala Val Lys Thr

225                 230                 235                 240

Asn Asp Lys Arg Ile Asp Pro Val Gly Ala Cys Val Gly Met Arg Gly

                245                 250                 255

Ala Arg Val Gln Ala Val Ser Thr Glu Leu Gly Gly Glu Arg Ile Asp

            260                 265                 270

Ile Val Leu Trp Asp Asp Asn Pro Ala Gln Phe Val Ile Asn Ala Met

        275                 280                 285

Ala Pro Ala Asp Val Ala Ser Ile Val Val Asp Glu Asp Lys His Thr

    290                 295                 300

Met Asp Ile Ala Val Glu Ala Gly Asn Leu Ala Gln Ala Ile Gly Arg

305                 310                 315                 320

Asn Gly Gln Asn Val Arg Leu Ala Ser Gln Leu Ser Gly Trp Glu Leu

                325                 330                 335

Asn Val Met Thr Val Asp Asp Leu Gln Ala Lys His Gln Ala Glu Ala

            340                 345                 350

His Ala Ala Ile Asp Thr Phe Thr Lys Tyr Leu Asp Ile Asp Glu Asp

        355                 360                 365

Phe Ala Thr Val Leu Val Glu Glu Gly Phe Ser Thr Leu Glu Glu Leu

    370                 375                 380

Ala Tyr Val Pro Met Lys Glu Leu Leu Glu Ile Glu Gly Leu Asp Glu

385                 390                 395                 400

Pro Thr Val Glu Ala Leu Arg Glu Arg Ala Lys Asn Ala Leu Ala Thr

                405                 410                 415

Ile Ala Gln Ala Gln Glu Glu Ser Leu Gly Asp Asn Lys Pro Ala Asp

            420                 425                 430

Asp Leu Leu Asn Leu Glu Gly Val Asp Arg Asp Leu Ala Phe Lys Leu

        435                 440                 445

Ala Ala Arg Gly Val Cys Thr Leu Glu Asp Leu Ala Glu Gln Gly Ile

    450                 455                 460

Asp Asp Leu Ala Asp Ile Glu Gly Leu Thr Asp Glu Lys Ala Gly Ala

465                 470                 475                 480

Leu Ile Met Ala Ala Arg Asn Ile Cys Trp Phe Gly Asp Glu Ala Thr

                485                 490                 495

Ser Gly Ser Gly His His His His His His Ser Ala Gly Lys Glu Thr

            500                 505                 510

Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser Pro Pro Pro Thr

        515                 520                 525

Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Ala Gly Ser Gly Thr Ile Asp Asp Asp

    530                 535                 540

Asp Lys Ser Pro Gly Ala Arg Gly Ser Met Val Arg Arg Arg Arg Arg

545                 550                 555                 560

Arg Arg Arg Arg Gly Asn Ala Leu Gln Glu Asp Thr Pro Pro Gly Pro

                565                 570                 575

Ser Thr Val Phe Arg Pro Pro Thr Ser Ser Arg Pro Leu Glu Thr Pro

            580                 585                 590

His Cys Arg Glu Ile Arg Ile Gly Ile Ala Gly Ile Thr Ile Thr Leu

        595                 600                 605

Ser Leu Cys Gly Cys Ala Asn Ala Arg Ala Pro Thr Leu Arg Ser Ala

    610                 615                 620

Thr Ala Asp Asn Ser Glu Ser Thr Gly Phe Lys Asn Val Pro Asp Leu

625                 630                 635                 640

Arg Thr Asp Gln Pro Lys Pro Pro Ser Lys Lys Arg Ser Cys Asp Pro

                645                 650                 655

Ser Glu Tyr Arg Val Ser Glu Leu Lys Glu Ser Leu Ile Thr Thr Thr

            660                 665                 670

Pro Ser Arg Pro Arg Thr Ala Lys Arg Arg Ile Arg Leu

        675                 680                 685

<210>3

<211>2058

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>3

atgaacaaag aaattttggc tgtagttgaa gccgtatcca atgaaaaggc gctacctcgc     60

gagaagattt tcgaagcatt ggaaagcgcg ctggcgacag caacaaagaa aaaatatgaa    120

caagagatcg acgtccgcgt acagatcgat cgcaaaagcg gtgattttga cactttccgt    180

cgctggttag ttgttgatga agtcacccag ccgaccaagg aaatcaccct tgaagccgca    240

cgttatgaag atgaaagcct gaacctgggc gattacgttg aagatcagat tgagtctgtt    300

acctttgacc gtatcactac ccagacggca aaacaggtta tcgtgcagaa agtgcgtgaa    360

gccgaacgtg cgatggtggt tgatcagttc cgtgaacacg aaggtgaaat catcaccggc    420

gtggtgaaaa aagtaaaccg cgacaacatc tctctggatc tgggcaacaa cgctgaagcc    480

gtgatcctgc gcgaagatat gctgccgcgt gaaaacttcc gccctggcga ccgcgttcgt    540

ggcgtgctct attccgttcg cccggaagcg cgtggcgcgc aactgttcgt cactcgttcc    600

aagccggaaa tgctgatcga actgttccgt attgaagtgc cagaaatcgg cgaagaagtg    660

attgaaatta aagcagcggc tcgcgatccg ggttctcgtg cgaaaatcgc ggtgaaaacc     720

aacgataaac gtatcgatcc ggtaggtgct tgcgtaggta tgcgtggcgc gcgtgttcag     780

gcggtgtcta ctgaactggg tggcgagcgt atcgatatcg tcctgtggga tgataacccg     840

gcgcagttcg tgattaacgc aatggcaccg gcagacgttg cttctatcgt ggtggatgaa     900

gataaacaca ccatggacat cgccgttgaa gccggtaatc tggcgcaggc gattggccgt     960

aacggtcaga acgtgcgtct ggcttcgcaa ctgagcggtt gggaactcaa cgtgatgacc    1020

gttgacgacc tgcaagctaa gcatcaggcg gaagcgcacg cagcgatcga caccttcacc    1080

aaatatctcg acatcgacga agacttcgcg actgttctgg tagaagaagg cttctcgacg    1140

ctggaagaat tggcctatgt gccgatgaaa gagctgttgg aaatcgaagg ccttgatgag    1200

ccgaccgttg aagcactgcg cgagcgtgct aaaaatgcac tggccaccat tgcacaggcc    1260

caggaagaaa gcctcggtga taacaaaccg gctgacgatc tgctgaacct tgaaggggta    1320

gatcgtgatt tggcattcaa actggccgcc cgtggcgttt gtacgctgga agatctcgcc    1380

gaacagggca ttgatgatct ggctgatatc gaagggttga ccgacgaaaa agccggagca    1440

ctgattatgg ctgcccgtaa tatttgctgg ttcggtgacg aagcgactag tggttctggt    1500

catcaccatc accatcactc cgcgggtaaa gaaaccgctg ctgcgaaatt tgaacgccag    1560

cacatggact cgccaccgcc aactggtctg gtcccccggg gcagcgcggg ttctggtacg    1620

attgatgacg acgacaagag tccgggagct cgtggatcca tggtacgtcg ccgtcgtcgc    1680

cgtcgtcgcc gtggtaacgc tctccaagaa gatactccac ccggaccatc aacggtgttc    1740

aggccaccaa caagttcacg gccgttggaa acccctcact gcagagagat ccggattggt    1800

atcgctggaa ttacaatcac tctatcgctg tgtggctgcg cgaatgctcg cgctcccacg    1860

ctaagatctg caactgcgga caattcagaa agcactggtt tcaagaatgt gccggacttg    1920

aggaccgatc aacccaagcc tccctcgaag aagcgatcct gcgacccctc cgagtacagg    1980

gtaagcgagc taaaagaaag cttgattacc actactccca gccgaccccg aaccgcaaaa    2040

aggcgtataa gactgtga                                                  2058

Claims (10)

1.一种原核表达体系高表达碱性蛋白的方法，包括如下步骤：

a)重组碱性蛋白表达载体的构建；

b)重组碱性蛋白转化体的制备；

c)重组碱性蛋白的表达；

d)重组碱性蛋白的酶切、纯化；

其中，所述重组碱性蛋白为碱性蛋白和保护多肽或片段的融合蛋白，所述碱性蛋白是指等电点为9-11的蛋白或C末端氨基酸序列带有强正电荷的蛋白或/和N末端氨基酸序列带有强正电荷的蛋白。

2.如权利要求1中所述的制备方法，其特征在于所述碱性蛋白和保护多肽或片段的融合蛋白可具有下式：R2-R1、R1-R2、R1-L-R2-L-R1、R1-L-R2或R2-L-R1，其中R1保护多肽或片段，L是接头肽，R2是至少一个碱性蛋白。

3.如权利要求1中所述的制备方法，其特征在于在碱性蛋白和保护多肽或片段融合蛋白中，所述碱性蛋白和保护多肽或片段间带有位点专一性蛋白酶识别位点。

4.如权利要求1中所述的制备方法，其特征在于所述保护多肽或片段可为GST，Nus，TrxB或MBP中之一。

5.如权利要求1中所述的制备方法，其特征在于所述重组碱性蛋白，为如下(a)或(b)的蛋白：

(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所述的蛋白；

(b)至少与(a)中的氨基酸序列60％同源性的蛋白。

6.如权利要求5中所述的制备方法，其特征在于所述表达载体为pET43.1a表达载体。

7.如权利要求5中所述的制备方法，其特征在于所述转化体为大肠杆菌。

8.如权利要求5中所述的制备方法，其特征在于所述酶为凝血酶、肠激酶或Xa因子。

9.如权利要求5中所述的制备方法，其特征在于所述纯化采用镍柱进行亲和层析分离纯化。

10.按照权利要求1-9任一项所述制备方法生产的碱性蛋白。

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