CN110551205B - 可溶性人肿瘤坏死因子凋亡相关诱导配体的突变体及其制备方法和应用 - Google Patents

可溶性人肿瘤坏死因子凋亡相关诱导配体的突变体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术制药领域，具体涉及可溶性人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(sTRAIL)突变体及其制备与药学应用。本发明应用定点突变技术设计并构建了系列sTRAIL突变体，并从中筛选出可溶性表达较野生型优越的新颖突变体，含有R121A、R121S、R121C或V122A中的一种或几种突变。该sTRAIL突变体较野生型sTRAIL在大肠杆菌中的可溶性表达水平有极显著提高，且其抗肿瘤活性也有一定增强。本发明还揭示了该突变蛋白的诱导表达、可溶性提取、分离纯化和加工精制等制备方法，有效克服了现有sTRIAL生产制备和药学应用中存在的问题。

Description

可溶性人肿瘤坏死因子凋亡相关诱导配体的突变体及其制备 方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术制药领域，具体涉及可溶性人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(sTRAIL)的突变体，该突变体与野生型TRAIL相比在原核表达系统中具有更高的可溶性表达能力，利于提高制备效率、降低生产成本，同时表现出比野生型TRAIL更好的抗肿瘤活性。
背景技术
凋亡是一种进化过程中高度保守的细胞程序性死亡方式，是维持机体正常发育的重要生理机制。逃脱凋亡是恶性肿瘤发生、发展以及产生耐药性的关键因素，诱导肿瘤细胞凋亡已成为治疗肿瘤的重要策略。死亡受体(Death receptors,DRs)途径和线粒体途径是当前最为有效的诱导凋亡方式。其中，肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)超家族成员诱导的死亡受体途径被认为是最具前景的肿瘤生物治疗药物开发方向。
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor necrosis factor-related apoptosisinducing ligand,TRAIL)就是一种新近发现的TNF超家族成员，又称Apo-2L、TNFSF10或CD253等。TRAIL编码基因由Wiley于1995年从心肌cDNA文库中克隆获得，其表达产物为281个氨基酸残基组成的II型跨膜糖蛋白。该配体通过与其特异受体(TRAIL receptors,TRAIL-Rs)结合而诱导靶细胞的凋亡。迄今，已发现两类共5种TRAIL-Rs。一类为功能型受体，包括TRAIL-R1和TRAIL-R2，分别又称死亡受体4(Death receptor 4,DR4)和死亡受体5(Death receptor 5,DR5)；另一类为拮抗型受体，包括：TRAIL-R3又称诱骗受体1(Decoyreceptor 1,DcR1)、TRAIL-R4又称诱骗受体2(Decoy receptor 2,DcR2)和可溶性受体OPG(Osteoprotegerin)。其中，功能型受体DR4和DR5在转化细胞和肿瘤细胞中高表达，而抑制型受体DcR1和DcR2则主要分布于正常细胞表面。TRAIL-Rs的多样性及其表达和分布特征决定了TRAIL对多种肿瘤细胞具有选择性杀伤作用，使其表现出较TNF和FasL等同家族成员更加安全、有效地抗肿瘤活性。
C-末端的细胞外区域是TRAIL的活性部位，可被蛋白酶剪切至体液中形成可溶性单体，被称为可溶性TRAIL(soluble TRAIL,sTRAIL)。sTRAIL在体内和体外均能自聚形成二聚体、三聚体，其中三聚体形式的sTRAIL具有与完整TRAIL相当的生物学活性。近年来，众多的临床前和临床研究显示，sTRAIL能够有效诱导多种肿瘤细胞的凋亡，而对正常组织细胞没有毒性，显示出在黑色素瘤、髓母细胞瘤、乳腺肿瘤和神经胶质瘤等疾病中的治疗潜力，成为了开发新一代抗肿瘤生物技术药物的重要候选。TRAIL(aa 114-281)、TRAIL(aa 95-281)和TRAIL(aa 120-281)是最为常见的sTRAIL组成形式。
研究表明，未经糖基化修饰的sTRAIL仍能体现出安全、有效地抗肿瘤活性，因此操作简单、产率高、成本低的原核表达系统是生产该蛋白及其衍生制品的最佳载体。然而，作为外源分子的sTRAIL在大肠杆菌中常以无生物学活性的包涵体形式表达，需要经过复性才能获得最终产物。迄今为止，蛋白质的体外复性操作仍然是费时、耗资、低效且难以工业化放大的操作过程，这在很大程度上限制了相关产品的研究、开发、生产和应用。如何有效提高可溶性表达效率、优化生产制备工艺、保证产品生物学活性已成为当前基于sTRAIL开发新一代抗肿瘤生物技术药物的关键技术。当前常用于提高sTRAIL在大肠杆菌中可溶性表达效率的技术方法主要基于效率有限的下游表达条件优化。
发明内容
为了克服现有技术中存在的问题，本发明应用定点突变技术设计并构建了系列sTRAIL突变体，并从中筛选出新颖突变体，该突变体较野生型sTRAIL在大肠杆菌中的可溶性表达水平有显著提高，且其抗肿瘤活性也有一定增强。本发明还通过整合诱导表达、可溶性提取、分离纯化和加工精制等工艺步骤建立了sTRAIL突变体制备方法，有效克服了现有sTRIAL表达生产和药学应用中存在的问题。
本发明的具体技术方案如下：
可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的突变体，含有R121A、R121S、R121C或V122A突变中的一种或几种，即以人TRAIL全长氨基酸序列定位，发生突变的位点位于人TRAIL全长氨基酸序列的第121位或第122位，氨基酸由121位的Arg突变为Ala、Ser或Cys，和/或由122位的Val突变为Ala。肿瘤坏死因子相关凋亡配体的可溶性胞外区与全长TRAIL具有相同的诱导肿瘤细胞凋亡的活性，本发明中所述的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体为野生型、衍生型或重组的TRAIL或其可溶性胞外区活性片段或含有该片段的膜结合型TRAIL。优选的，所述的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体为野生型TRAIL或者TRAIL(aa 114-281)、TRAIL(aa 95-281)和TRAIL(aa 120-281)。本发明一个优选的突变体是将TRAIL可溶性片段(aa114-281)中121位氨基酸由Arg突变为Ala的突变体，称为ΔTRAIL(aa114-281:R121A)，氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，核苷酸序列如SEQ ID No:5所示。或优选ΔTRAIL(aa 95-281:R121AS，氨基酸序列如SEQ ID No:2所示，核苷酸序列如SEQ ID No:6所示。或者优选ΔTRAIL(aa 120-281:R121C)，氨基酸序列如SEQ ID No:3所示，核苷酸序列如SEQID No:7所示。或者优选ΔTRAIL(aa 120-281:V122A)，氨基酸序列如SEQ ID No:4所示，核苷酸序列如SEQ ID No:8所示。
本发明的另一目的在于提供了本发明所述突变体蛋白的制备方法，通过人工合成或基因克隆的方法制备包含本发明所述突变体的编码基因的融合基因，并在相应的宿主细胞中进行表达，所述的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞。一个优选的方案，包括如下步骤：
(1)获得包含所述突变体编码基因的融合基因；
(2)将步骤(1)所得的融合基因以及载体质粒采用相同的限制性内切酶切割，然后进行连接，获得重组表达质粒；
(3)将步骤(2)所得的重组表达质粒转化宿主细胞，形成可表达所述突变体蛋白的重组细胞；
(4)培养步骤(3)所得的重组细胞；
(5)从细胞破碎物中提取可溶性蛋白，并分离纯化得到所述突变体的融合蛋白；
(6)采用烟草蚀纹病毒蛋白酶加工步骤(5)所得融合蛋白；
(7)分离纯化得到所述的突变体。
上述步骤(1)中，包含所述突变体编码基因的融合基因包括三个基因片段(N-端的基因片段为六聚组氨酸标签的编码基因，中部的基因片段为烟草蚀纹病毒蛋白酶切割位点的编码基因，C-端的基因片段为突变体的编码基因)以及位于基因两端的限制性内切酶特异识别位点。
上述步骤(2)中，所述的载体质粒优选pET-28a(+)质粒。所述的限制性内切酶优选NcoI和HindIII。
上述步骤(3)中，所述的宿主细胞优选大肠杆菌BL21(DE3)。
上述步骤(4)中，重组细胞的培养优选采用IPTG在20℃条件下低温诱导所述融合蛋白的高效可溶性表达。
上述步骤(5)中，所述突变体融合蛋白的提取与分离纯化。优选地，包括将诱导表达后的重组细胞悬浮于非变性融合蛋白提取液中，经裂解后离心分离得到包含可溶性融合蛋白的上清溶液；采用硫酸铵分级沉淀对上清溶液中的融合蛋白进行富集；复溶包含融合蛋白的沉淀并进行镍离子亲和柱层析纯化，以咪唑浓度梯度溶液洗涤层析柱得到包含融合蛋白的洗脱峰；采用凝胶柱层析将上述洗脱峰进行脱盐处理并置换于烟草蚀纹病毒蛋白酶切割缓冲液。
上述步骤(6)中，所述的烟草蚀纹病毒蛋白酶加工融合蛋白。优选地，在包含0.1％(v/v)巯基乙醇的缓冲体中，采用烟草蚀纹病毒蛋白酶于4℃条件下切割融合蛋白24h。
上述步骤(7)中，所述的突变体分离纯化。优选的，将上述烟草蚀纹病毒蛋白酶切割后的产物经镍亲和柱层析分离去除六聚组氨酸标签的突变体蛋白。
本发明的另一目的在于提供本发明所述突变体在制备治疗或预防细胞凋亡相关疾病药物的用途。所述突变体通过与死亡受体结合将TRAIL的死亡信号传递至细胞内，从而激活凋亡酶Caspase系统，最终引起细胞凋亡。
进一步的，所述的药物可以说是抗肿瘤药物。所述药物含有本发明所述突变体作为药物活性成分以及药学上可接受的载体。
进一步的，所述药物还含有其它抗肿瘤药物和/或抗肿瘤药物增敏剂。
本发明的一个实施例中，利用定点突变、可溶性蛋白分析以及抗肿瘤活性筛选方法证明了N-端相关氨基酸位置对sTRAIL可溶性表达的影响并从中筛选到能够显著提升原核细胞中可溶性表达效率最佳的突变体ΔTRAIL(aa 114-281:R121A)(即原第121位Arg突变成Ala)。该突变体较野生型sTRAIL在大肠杆菌中可溶性表达能力提升近五倍，且显示出一定程度提升的抗肿瘤活性。
本发明所述的人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体可在大肠杆菌E.coli中进行可溶性表达，表达产物可直接从大肠杆菌E.coli破壁液上清中分离纯化得到，避免了由于形成包涵体而带来的复杂的下游变性和复性处理过程。
本发明通过分子克隆的方法，制备出(从5’-端到3’-端)包含六聚组氨酸标签、烟草蚀纹病毒蛋白酶和ΔTRAIL(aa 114-281:R121A)编码基因的融合基因，并克隆到含有T7启动子的原核表达载体pET-28a(+)的NcoI和HindIII酶切位点之间，然后将重组质粒转化宿主菌E.coli BL21进行胞内表达。工程菌诱导培养后离心收集菌泥，破壁后离心上清经硫酸铵分级沉淀和镍离子亲和柱层析纯化，得到纯度达95％以上的包含突变体的融合蛋白。经烟草蚀纹病毒蛋白酶特异性切割后，采用镍亲和柱层析分离纯化突变体蛋白。每升培养体系中得到约32mg纯度达95％以上的突变体蛋白，经N-端测序和圆二色谱等分析表明，所述突变体具有野生型分析相似的生物活性结构。
CCK-8抗肿瘤活性分析显示，本发明所述突变体对人大细胞肺癌NCI-H460细胞、人前列腺癌DU145细胞、人宫颈癌Hela细胞、人乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7细胞均表现出抗肿瘤活性。其中，突变体ΔTRAIL(aa 114-281:R121A)对人大细胞肺癌NCI-H460细胞活性最强(IC50＝44.86ng/ml)。
Annexin-V/PI流式细胞仪分析和Caspase-3酶活性测定显示，本发明所述突变体的抗肿瘤功能是通过促进靶细胞凋亡和诱导Caspase活性的机制实现，保持了野生型分子的肿瘤治疗特性。
实验动物免疫鉴定显示，本发明所述突变体的免疫原性较野生型分子未显示显著差异。
附图说明
图1为含野生型TRAIL(aa 114-281)编码基因的pET/His-TRAIL(aa 114-281)质粒的构建策略。
图2为野生型TRAIL(aa 114-281)的定点突变及表达载体构建策略。
图3为TRAIL(aa 114-281)121、122、125和126位氨基酸残基经丙氨酸(Ala,A)替代的定点突变体重组表达载体的DNA测序结果分析及比对。*为定点突变氨基酸。
图4为TRAIL(aa 114-281)121位氨基酸残基经四种不同氨基酸残基替换的定点突变体重组表达载体的DNA测序结果分析及比对。*为定点突变氨基酸
图5为野生型TRAIL(aa 114-281)与定点突变体融合蛋白的结构模式示意图。A.野生型TRAIL(aa 114-281)融合蛋白的结构模式图；B-E.TRAIL(aa 114-281)的4个位点(121R、122V、125H和126I)进行丙氨酸替换的突变体融合蛋白结构模式图；F-I.TRAIL(aa114-281)的R 121被4种氨基酸残基(D、S、G和C)定点替换的突变体融合蛋白结构模式图。
图6为野生型TRAIL(aa 114-281)及其突变体融合蛋白的可溶性表达研究结果。A-B.野生型TRAIL(aa 114-281)与8种定点突变体融合蛋白的可溶性表达SDS-PAGE检测结果：T表示菌体总蛋白，S表示菌体解裂上清，P表示菌体裂解沉淀；C-D.每1L培养体系获得的可溶性野生型TRAIL(aa 114-281)与8种定点突变体融合蛋白的含量检测结果。
图7为不同定点突变TRAIL(aa 114-281)融合蛋白的抗肿瘤活性影响的研究结果。A.His-ΔTRAIL(aa 114-281：R121A)融合蛋白的表达与分离纯化：M.蛋白质分子量标准；1.诱导表达后的细菌总蛋白；2.细胞裂解上清液可溶性蛋白；3.裂解上清的10％-50％硫酸铵沉淀总蛋白；4.亲和层析穿透峰；5-9:40、60、80、100和500mM咪唑阶段洗脱峰。B.野生型TRAIL(aa 114-281)及不同氨基酸类型的定点突变体融合蛋白的分离纯化结果：M.蛋白质分子量标准；1.纯化后的野生型TRAIL(aa 114-281)融合蛋白，2.纯化后的突变型ΔTRAIL(aa 114-281:R121A)融合蛋白，3.纯化后的突变型ΔTRAIL(aa 114-281:V122A)融合蛋白，,4.纯化后的突变型ΔTRAIL(aa 114-281:R121D)融合蛋白，5.纯化后的突变型ΔTRAIL(aa 114-281:R121S)融合蛋白，6.纯化后的突变型ΔTRAIL(aa 114-281:R121C)融合蛋白；c.野生型TRAIL(aa 114-281)及5种不同突变型定点突变体融合蛋白的抗肿瘤活性研究结果。
图8为突变体ΔTRAIL(aa 114-281：R121A)蛋白的制备与鉴定。A.突变型ΔTRAIL(aa 114-281：R121A)的表达与分离纯化：M.蛋白质分量标准；1.经诱导表达的细菌总蛋白；2.细菌裂解上清液；3.硫酸铵分级沉淀结果；4.Ni亲和柱层析纯化结果；5.TEV酶特异性切割结果；6.目的蛋白ΔTRAIL(aa 114-281：R121A)的回收结果。B:突变型ΔTRAIL(aa 114-281：R121A)与野生型分子的圆二色谱分析结果。
图9为野生型与突变体ΔTRAIL(aa 114-281：R121A)融合蛋白的体外抗肿瘤活性鉴定：A.MDA-MB-231细胞；B.DU145细胞；C.Hela细胞；D.MCF-7细胞；E.PC3细胞；F.NCI-H460细胞；。
图10为突变体ΔTRAIL(aa 114-281：R121A)蛋白及融合蛋白的抗肿瘤活性机制研究。a.细胞凋亡测定结果(Annexin-V/PI双染色法)；b.凋亡酶Caspase-3活性测定结果(分光法)。
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，该实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
下面结合具体实施例对本发明进一步说明。
下述实例中所用的材料、试剂、装置、仪器、设备等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例中采用的质粒、菌种、细胞、动物及主要试剂如下：
质粒、菌种、细胞和动物：包含TRAIL/TNFSF10基因cDNA的克隆质粒pCMV3-TNFSF10购自北京义翘神州科技有限公司；载体质粒pET-28a(+)和宿主菌E.coli BL21(DE3)为Novagen公司产品，由本实验室保存；人大细胞肺癌NCI-H460细胞、人前列腺癌DU145和PC-3细胞、人宫颈癌Hela细胞、人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞均为ATCC产品，购自中国科学院昆明细胞库；4～6周龄雌性Balb/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
主要试剂：限制性内切酶NcoI和HindIII，DNA聚合酶rTaq，dNTP，以及DNA分子量标准购自TaKaRa公司；“克隆一号”基因克隆试剂盒为湖南莱拓福生物科技有限公司产品；质粒抽提试剂盒为OMEGA公司产品；PCR产物纯化试剂盒和琼脂糖胶回收试剂盒购自上海华舜生物技术有限公司；蛋白质分子量标准及预染蛋白质Marker为Fermentas公司产品；胰蛋白胨和酵母提取物购自OXOID公司；Ni-sepharoseTM HP填料，HiTrapTM Desalting预装柱以及层析柱为GE Healthcare公司产品；小鼠抗组氨酸标签抗体购自Invitrogen公司；抗TRAIL多克隆抗体为Novus公司产品；HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体购自北京博奥森生物技术有限责任公司；其他化学试剂均符合分子生物学实验要求。
实施例1：含野生型TRAIL(aa 114-281)编码基因的pET/His-TRAIL(aa 114-281)质粒的构建
根据克隆质粒pCMV3-TNFSF10中克隆的TRAIL基因cDNA序列，分别设计两条上游引物His-TRAIL(aa 114-281)-pF1(SEQ ID No:9)和His-TRAIL(aa 114-281)-pF2(SEQ IDNo:10)，以及一条下游引物His-TRAIL(aa 114-281)-pR(SEQ ID No:11)；以pCMV3-TNFSF10为模板，采用上游引物His-TRAIL(aa 114-281)-pF1和下游引物His-TRAIL(aa 114-281)-pR为引物对，进行第一轮PCR扩增；而后，纯化扩增产物，并以此为模板，采用上游引物His-TRAIL(aa 114-281)-pF2和下游引物His-TRAIL(aa 114-281)-pR为引物对，进行第二轮PCR扩增，制备从5’→3’方向依次包含多聚组氨酸标签(简称His)、烟草蚀纹病毒蛋白酶切割序列(简称TEV)以及TRAIL可溶性片段(简称TRAIL(aa 114-281))的融合编码序列，并在基因序列两端添加了限制性内切酶NcoI和HindIII切割位点；两轮PCR扩增条件均为：94℃变性5min；94℃60s，53℃60s，72℃90s进行30个循环；72℃延伸10min；最后，使用NcoI和HindIII对融合基因片段和pET-28a(+)质粒进行双酶切及胶回收纯化，并采用T4DNA连接酶连接，进而转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布于卡那霉素抗性平板，经抗性筛选、蛋白表达验证和DNA测序鉴定等步骤，筛选包含pET/His-TRAIL(aa 114-281)质粒的阳性工程菌。上述构建流程如图1所示。
实施例2:野生型TRAIL(aa 114-281)编码基因的定点突变及融合基因的扩增
以上述构建的含有野生型TRAIL(aa 114-281)编码基因的pET/His-TRAIL(aa114-281)质粒(如图2所示，开放阅读框核苷酸序列如SEQ ID No:12，对应的氨基酸顺序如SEQ ID No:13)为模板，根据“克隆一号”基因克隆试剂盒定点突变技术原理(如图2b所示)，设计并合成突变引物(如SEQ ID No:14～31)，进行PCR扩增制备包含定点突变的融合基因大小片段。并在设计引物的同时，在大小片段两端引入限制性内切酶NcoI和HindIII切割位点，在大小片段之间引入序列同源的交叠区。
分别地：采用引物His-ΔTRAIL(aa114-281)-gpF(SEQ ID No:14)和引物His-ΔTRAIL(aa114-281:R121A)-pR(SEQ ID No:16)扩增突变体His-ΔTRAIL(aa 114-281:R121A)融合基因的5’-端小片段，采用引物His-ΔTRAIL(aa114-281:R121A)-pF(SEQ IDNo:17)和引物His-ΔTRAIL(aa114-281)-gpR(SEQ ID No:15)扩增突变体His-ΔTRAIL(aa114-281:R121A)融合基因的3’-端大片段；采用引物His-ΔTRAIL(aa114-281)-gpF(SEQ IDNo:14)和引物His-ΔTRAIL(aa114-281:V122A)-pR(SEQ ID No:18)扩增突变体His-ΔTRAIL(aa 114-281:V122A)融合基因的5’-端小片段，采用引物His-ΔTRAIL(aa114-281:V122A)-pF(SEQ ID No:19)和引物His-ΔTRAIL(aa114-281)-gpR(SEQ ID No:15)扩增突变体His-ΔTRAIL(aa 114-281:V122A)融合基因的3’-端大片段；采用引物His-ΔTRAIL(aa114-281)-gpF(SEQ ID No:14)和引物His-ΔTRAIL(aa114-281:H125A)-pR(SEQ ID No:20)扩增突变体His-ΔTRAIL(aa 114-281:H125A)融合基因的5’-端小片段，采用引物His-ΔTRAIL(aa114-281:H125A)-pF(SEQ ID No:21)和引物His-ΔTRAIL(aa114-281)-gpR(SEQID No:15)扩增突变体His-ΔTRAIL(aa 114-281:H125A)融合基因的3’-端大片段；采用引物His-ΔTRAIL(aa114-281)-gpF(SEQ ID No:14)和引物His-ΔTRAIL(aa114-281:I126A)-pR(SEQ ID No:22)扩增突变体His-ΔTRAIL(aa 114-281:I126A)融合基因的5’-端小片段，采用引物His-ΔTRAIL(aa114-281:I126A)-pF(SEQ ID No:23)和引物His-ΔTRAIL(aa114-281)-gpR(SEQ ID No:15)扩增突变体His-ΔTRAIL(aa 114-281:I126A)融合基因的3’-端大片段；采用引物His-ΔTRAIL(aa114-281)-gpF(SEQ ID No:14)和引物His-ΔTRAIL(aa114-281:R121D)-pR(SEQ ID No:24)扩增突变体His-ΔTRAIL(aa 114-281:R121D)融合基因的5’-端小片段，采用引物His-ΔTRAIL(aa114-281:R121D)-pF(SEQ ID No:25)和引物His-ΔTRAIL(aa114-281)-gpR(SEQ ID No:15)扩增突变体His-ΔTRAIL(aa 114-281:R121D)融合基因的3’-端大片段；采用引物His-ΔTRAIL(aa114-281)-gpF(SEQ ID No:14)和引物His-ΔTRAIL(aa114-281:R121S)-pR(SEQ ID No:26)扩增突变体His-ΔTRAIL(aa114-281:R121S)融合基因的5’-端小片段，采用引物His-ΔTRAIL(aa114-281:R121S)-pF(SEQ ID No:27)和引物His-ΔTRAIL(aa114-281)-gpR(SEQ ID No:15)扩增突变体His-ΔTRAIL(aa 114-281:R121S)融合基因的3’-端大片段；采用引物His-ΔTRAIL(aa114-281)-gpF(SEQ ID No:14)和引物His-ΔTRAIL(aa114-281:R121G)-pR(SEQ ID No:28)扩增突变体His-ΔTRAIL(aa 114-281:R121G)融合基因的5’-端小片段，采用引物His-ΔTRAIL(aa114-281:R121G)-pF(SEQ ID No:29)和引物His-ΔTRAIL(aa114-281)-gpR(SEQ ID No:15)扩增突变体His-ΔTRAIL(aa 114-281:R121G)融合基因的3’-端大片段；采用引物His-ΔTRAIL(aa114-281)-gpF(SEQ ID No:14)和引物His-ΔTRAIL(aa114-281:R121C)-pR(SEQID No:30)扩增突变体His-ΔTRAIL(aa 114-281:R121C)融合基因的5’-端小片段，采用引物His-ΔTRAIL(aa114-281:R121C)-pF(SEQ ID No:31)和引物His-ΔTRAIL(aa114-281)-gpR(SEQ ID No:15)扩增突变体His-ΔTRAIL(aa 114-281:R121C)融合基因的3’-端大片段。
相同地，包含定点突变的融合基因小片端的PCR扩增条件为：94℃变性5min；94℃45s，53℃45s，72℃60s进行30个循环；72℃延伸10min。包含定点突变位的融合基因大片端的PCR扩增条件为：94℃变性5min；94℃60s，53℃60s，72℃80s进行30个循环；72℃延伸10min。
实施例3：TRAIL(aa 114-281)突变体蛋白重组表达工程菌的构建
如图1所示，将上述包含相同TRAIL(aa 114-281)突变体编码基因的融合基因小、大片段克隆至pET-28a(+)的NcoI和HindIII酶切位点之间，构成能够表达不同TRAIL(aa114-281)突变体的重组表达载体。分别为：pET/His-ΔTRAIL(aa 114-281:R121A)，pET/His-ΔTRAIL(aa114-281:V122A)，pET/His-ΔTRAIL(aa 114-281:H125A)，pET/His-ΔTRAIL(aa 114-28:I126A)，pET/His-ΔTRAIL(aa 114-281:R121D)，pET/His-ΔTRAIL(aa114-281:R121S)，pET/His-ΔTRAIL(aa 114-281:R121G)和pET/His-ΔTRAIL(aa 114-281:R121C)。上述定点突变体的重组表达载体DNA测序比对结果如图3和图4所示。
其中，对应表达的His-ΔTRAIL(aa 114-281:R121A)、His-ΔTRAIL(aa 114-281:V122A)、His-ΔTRAIL(aa 114-281:H125A)、His-ΔTRAIL(aa 114-281:I126A)、His-ΔTRAIL(aa 114-281:R121D)、His-ΔTRAIL(aa 114-281:R121S)、His-ΔTRAIL(aa 114-281:R121G)、His-ΔTRAIL(aa 114-281:R121C)融合蛋白的氨基酸序列分别为SEQ ID No:32、SEQ ID No:33、SEQ ID No:34、SEQ ID No:35、SEQ ID No:36、SEQ ID No:37、SEQ ID No:38、SEQ ID No:39，融合蛋白的编码基因分别为SEQ ID No:40、SEQ ID No:41、SEQ ID No:42、SEQ ID No:43、SEQ ID No:44、SEQ ID No:45、SEQ ID No:46、SEQ ID No:47。
具体地，使用胶回收试剂盒纯化上述扩增得到的包含相同突变体编码基因的融合基因大、小片段，同时对pET-28a(+)质粒进行NcoI和HindIII双酶切及胶回收纯化。然后，采用“克隆一号”基因克隆试剂盒将上述纯化的三个基因片段进行连接，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，涂布于卡那霉素抗性平板，经抗性筛选、蛋白表达验证和DNA测序鉴定等步骤，筛选阳性工程菌，测序结果及相关比对分析如图3所示。结果表明,包含野生型TRAIL(aa114-281)及8种定点突变体的融合蛋白重组表达质粒及相应基因工程菌构建成功。上述野生型TRAIL(aa 114-281)与定点突变体融合蛋白的结构模式如图5所示。
实施例4：野生型TRAIL(aa 114-281)及其突变体的可溶性表达研究
分别将包含野生型TRAIL(aa 114-281)及突变体融合蛋白重组表达质粒的工程菌接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养，至OD600为0.6～1.0时加入0.1mM的IPTG于20℃诱导12h。4℃条件下，4000rpm离心15min收集菌体，并将菌体重悬于非变性的细胞裂解液(500mM NaCl,1mM PMSF,1mg/mL溶菌酶，50mM Tris-Cl,pH＝7.4)中，经超声破碎后收集裂解后的上清液和沉淀。联合SDS-PAGE目标蛋白分析(如图6A和B)和BCA蛋白含量测定，计算每升培养体系获得可溶性目的蛋白的多少(如图6C和D)，比较包含野生型TRAIL(aa114-281)及不同突变体的重组融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达差异，丛中甄选出可溶性表达优选的目标突变体形式。研究显示：对TRAIL(aa 114-281)的N-端121位、122位、125位以及126位进行氨基酸置换修饰可影响目标蛋白的可溶性表达能力。结果表明，用丙氨酸(Ala,A)替换121位的精氨酸(Arg,R)或122的缬氨酸(Val,V)能提高TRAIL在大肠杆菌中的可溶性表达，前者较野生型TRAIL显著提高了近5倍。进一步，利用不同类型氨基酸替换121位的精氨酸(Arg,R)的研究结果显示：非极性的丙氨酸(Ala,A)替换对于目标蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的提高作用最强，其次为极性带羟基侧链的丝氨酸(Ser,S)和带巯基侧链的半胱氨酸(Cys,C)；相反，利用极性不带电荷的甘氨酸(Gly,G)替换R121对蛋白的可溶性表达无显著影响，而利用极性带负电荷的天冬氨酸(Asp,D)替换R121能够降低可溶性表达水平。
总的看来，R121A、R121S、R121C或V122A定点突变的TRAIL分子能够提升TRAIL融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达水平，利于后续的蛋白生产和活性回收。
实施例5：不同氨基酸类型的定点替换对TRAIL(aa 114-281)抗肿瘤活性的影响研究
1.野生型TRAIL(aa 114-281)及突变体融合蛋白的快速制备
采用0.45μm滤膜过滤上述获得的细胞裂解上清液，经10-50％硫酸铵沉淀并复溶后上样Ni-SepharoseTM HP亲和层析柱，经洗涤缓冲液(500mM NaCl,20mM咪唑,50mM Tris-Cl,pH＝7.4)充分洗涤后，使用洗脱缓冲液(500mM NaCl,500mM咪唑,50mM Tris-Cl,pH＝7.4)阶段梯度(40、60、80、100、500mM咪唑)洗脱目的蛋白，收集洗脱峰并经HiTrapTMDesalting预装柱脱盐处理后，分别用SDS-PAGE(如图7A)和BCA试剂盒测定融合蛋白的纯度及含量，并保存备用。检测结果显示：经可容性表达和蛋白质分离纯化等操作，制备获得纯度大于95％的野生型TRAIL(aa 114-281)与四种氨基酸定点置换121位Arg的突变体融合蛋白和丙氨酸定点置换122位Val的突变体融合蛋白(如图7B)，分别命名为：His-ΔTRAIL(aa114-281)，His-ΔTRAIL(aa 114-281:R121A)，His-ΔTRAIL(aa 114-281:V122A)，His-ΔTRAIL(aa 114-281:R121D)，His-ΔTRAIL(aa 114-281:R121S)和His-ΔTRAIL(aa 114-281:R121C)。
2.野生型TRAIL(aa 114-281)及突变体融合蛋白的抗肿瘤活性检测
人大细胞肺癌细胞NCI-H460体外培养至汇合度80％，用0.25％的胰蛋白酶溶液消化后，以5×103个细胞/孔接种至96孔细胞培养板中，于37℃、5％CO2条件下孵育24h以使细胞充分贴壁；而后，给予终浓度为5.88nmol/L的野生型TRAIL(aa 114-281)或五种不同氨基酸定点置换121位精氨酸的突变体融合蛋白，处理24h后，加入CCK-8溶液继续培养2h后，测定OD450nm，计算细胞抑制率。检测结果(如图7B)显示：采用非极性的丙氨酸(Ala,A)替换R121不仅能够大大促进TRAIL(aa 114-281)在大肠杆菌中的可溶性表达，并且能够在一定程度上提升了其抗肿瘤活性；此外，采用带有侧链巯基的极性不带电荷半胱氨酸(Cys,C)定点置换R121亦能提高TRAIL(aa 114-281)的抗肿瘤活性，而采用极性带羟基侧链的丝氨酸(Ser,S)定点置换R121以及采用非极性的丙氨酸(Ala,A)替换V122则对抗肿瘤活性无显著影响；相反，当用极性带负电荷的天冬氨酸(Asp,D)替换R121时，TRAIL(aa 114-281)的抗肿瘤活性有所下降。
注：细胞抑制率计算公式如下：
细胞抑制率＝[(OD450nm实验孔-OD450nm空白孔)/(OD450nm对照孔-OD450nm空白孔)]×100％
实施例6：突变体ΔTRAIL(aa 114-281:R121A)的制备
1.突变体ΔTRAIL(aa 114-281:R121A)融合蛋白的诱导表达
将重组工程菌单菌落接种于50mL的LB液体培养基(含50μg/mL硫酸卡那霉素)中，在37℃、200rpm的条件下振荡过夜；按照2％(v/v)的接种量转接入2.4L发酵培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，0.1mM ZnSO4，50μg/mL硫酸卡那霉素，pH＝7.4)中，在37℃、200rpm的条件下振荡培养3h；而后，加入终浓度0.1mM的IPTG，在20℃、180rpm的条件下继续培养12h。SDS-PAGE检测目的融合蛋白的表达情况(如图5所示)，结果显示：突变体ΔTRAIL(aa 114-281:R121A)融合蛋白在所建工程菌中得以高效表达，其相对分子量与软件(http://web.expasy.org)预测理论值21.68kDa一致。
2.突变体ΔTRAIL(aa 114-281:R121A)融合蛋白的提取
在4℃条件下，4000rpm离心15min收集菌泥，经无菌PBS(pH＝7.4)洗涤后，将菌泥以10％(w/v)的比例重悬于细菌裂解液(500mM NaCl,1mM PMSF,1mg/mL溶菌酶，50mM Tris-Cl,pH＝7.4)中，冰上搅拌30min后，用超声波进行细胞破碎(功率0.2kW、超声10s、间歇20s、全程时间30min)；4℃条件下，12000rpm离心细胞破碎液30min以收集上清。SDS-PAGE分析裂解上清中目的融合蛋白的提取情况(如图6所示)，结果显示：目的融合蛋白多以可溶性形式表达，且被成功提取至无细胞上清液中。
3.突变体ΔTRAIL(aa 114-281:R121A)融合蛋白的分离纯化
首先，采用硫酸铵分级沉淀法对上述无细胞上清液中的目的融合蛋白进行富集分离。而后，将包含目的融合蛋白的沉淀物复溶于平衡缓冲液(500mM NaCl,20mM咪唑,50mMTris-Cl,pH＝7.4)中；0.45μm滤膜过滤后，以1ml/min的流速上样经相同平衡缓冲液充分平衡的Ni-sepharose HP亲和层析柱(5cm×1.6cm)；上样结束后用平衡缓冲液充分洗涤未结合蛋白，再以2ml/min的流速用低浓度咪唑缓冲液(500mM NaCl,100mM咪唑,50mMTris-Cl,pH＝7.4)洗去结合上的杂蛋白，最后以相同流速用洗脱缓冲液(500mM NaCl,500mM咪唑,50mM Tris-Cl,pH＝7.4)洗脱目的融合蛋白。SDS-PAGE分析目的蛋白的分离纯化情况(如图7A所示)，结果显示：经上述硫酸铵分级沉淀和镍亲和柱层析的纯化，包含突变体ΔTRAIL(aa 114-281:R121A)的融合蛋白得以精制，其纯度达到95％以上，能够用于后续突变体蛋白的制备。
4.融合蛋白的切割与突变体ΔTRAIL(aa 114-281:R121A)的释放
采用HiTrapTM Desalting凝胶柱层析将纯化所得的融合蛋白置换于烟草蚀纹病毒蛋白酶消化缓冲液(500mM NaCl,0.1％巯基乙醇,50mM Tris-Cl,pH＝7.4)中，按照融合蛋白质量1/20(w/w)的比例加入烟草蚀纹病毒蛋白酶(包含六聚组氨酸标签)，混合均匀后在4℃条件下切割24h。SDS-PAGE检测以融合蛋白的特异性切割情况(如图8A所示)，结果显示：多于95％的融合蛋白被烟草蚀纹病毒蛋白酶成功切割，突变体ΔTRAIL(aa 114-281:R121A)得以有效释放。
5.突变体ΔTRAIL(aa 114-281:R121A)的回收与精制
首先，将酶切体系与等体积的样品缓冲液(500mM NaCl,80mM咪唑,50mM Tris-Cl,pH＝7.4)充分混合，以0.5ml/min的流速上样经平衡缓冲液(500mM NaCl,40mM咪唑,50mMTris-Cl,pH＝7.4)充分平衡的Ni-sepharose HP亲和层析柱(2.5cm×0.7cm)，收集穿透峰中不包含六聚组氨酸标签的突变体ΔTRAIL(aa 114-281:R121A)目的蛋白，并采用HiTrapTM Desalting凝胶柱层析对突变体蛋白进行脱盐处理；然后，采用ToxinEraserTM内毒素去除试剂盒除去其中的残留内毒素。SDS-PAGE检测以突变体蛋白的制备情况(如图8A所示)，结果显示：经过上述系列步骤已成功制备了纯度大于95％的ΔTRAIL(aa 114-281:R121A)突变体蛋白，每1L培养体系可收获目的突变体蛋白31.9mg。
实施例7：突变体ΔTRAIL(aa 114-281:R121A)的性质鉴定
首先，利用12％SDS-PAGE分离制备所得的突变体蛋白，通过考马斯亮蓝染色和软件分析，测定目标蛋白的相对分子量大小并分析蛋白的均一性；在此基础上，以抗组胺酸标签抗体和抗TRAIL抗体为检测工具，运用Western-blot鉴定突变体蛋白的抗原性(如；然后，为验证突变体蛋白氨基酸组成顺序的正确性，采用Edman降解法对目的蛋白的N-端氨基酸进行了序列测定；最后，运用圆二色谱对纯化所得的突变体蛋白进行二级结构扫描(发射波长范围设定为190～350nm，时间间隔1s，使用1mm光程进行远紫外扫描)，并用CDpro软件对相关二级结构进行分析。鉴定结果表明：本发明所得突变体ΔTRAIL(aa 114-281:R121A)蛋白纯度大于95％，其相对分子量为18.47kDa(如图8A所示)，与软件(http://web.expasy.org)预测值19.41基本相符；突变体蛋白保留了野生型TRAIL原有的抗原性特征，能够与抗TRAIL多克隆抗体特异结合；同时，由于有效去除了蛋白N-端上游的六聚组氨酸标签和烟草蚀纹病毒蛋白酶切割位点，纯化制备的突变体蛋白不能为抗组胺酸标签抗体识别，且其N-端氨基酸顺序与预期设计相符，依次为：Gly1-Val2-Arg3-Glu4-Arg5-Gly6-Pro7-Gln8-Ala9-Val10-Ala11-Ala12-His13-Ile14-Thr15，其中第9位为丙氨酸(Ala,A)也证明了本发明通过定点突变技术成功替换了野生型TRAIL(aa 114-281)中原来第121位的精氨酸(Arg,R)；更为重要的是，圆二色谱扫描结构显示(如图8B所示)，本发明获得的突变体ΔTRAIL(aa 114-281:R121A)与野生型蛋白相比，具有相似的二级结构组成，表明了新型蛋白在提高可溶性表达、优化制备过程的同时更保留了其原有的组成结构，为未来的生物学研究和药学应用奠定了基础。
实施例8：突变体ΔTRAIL(aa 114-281:R121A)的抗肿瘤活性测定
分别体外培养多种人肿瘤细胞，包括：人大细胞肺癌NCI-H460细胞、人前列腺癌DU145细胞和PC3细胞、人宫颈癌Hela细胞、人乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7细胞；待细胞生长汇合度达80％时，用0.25％的胰蛋白酶溶液消化；进而，分别以5×103个细胞/孔(NCI-H460)和7.5×103个细胞/孔(DU145、Hela、MDA-MB-231和MCF-7)接种至96孔细胞培养板，于37℃、5％CO2条件下孵育24h，以使细胞充分贴壁；而后，分别给予梯度剂量的突变体蛋白ΔTRAIL(aa 114-281:R121A)，继续培养24h；最后，采用CCK-8试剂检测活细胞数，测定测定OD450nm，计算细胞抑制率(计算公式如实施例5中所示)，并采用GrapPad Prism6.0软件(GrapPad USA)计算突变体蛋白抑制肿瘤增殖的IC50值。测定结果(如图9所示)表明：本发明所获得的新型突变体ΔTRAIL(aa 114-281:R121A)保留了野生型蛋白相似的抗肿瘤活性，能够明显抑制多种类型肿瘤细胞的增殖，同时对不同肿瘤细胞的毒性表现出强弱程度的不同。其中，人大细胞肺癌NCI-H460细胞对该蛋白最为敏感(IC50＝16.83ng/ml)，而人前列腺癌细胞DU-145和宫颈癌细胞Hela则中度敏感(IC50分别为145.3ng/ml、370ng/ml)；相反，人乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7和人前列癌细胞PC-3则能抵抗突变体蛋白的凋亡诱导作用。
实施例9：突变体ΔTRAIL(aa 114-281:R121A)诱导人大细胞肺癌NCI-H460细胞凋亡的研究1.突变体ΔTRAIL(aa 114-281:R121A)诱导NCI-H460细胞凋亡的流式检测
NCI-H460细胞体外培养至汇合度80％，用0.25％的胰蛋白酶溶液消化后，以1.6×105个细胞/孔接种至6孔细胞培养板中，于37℃、5％CO2条件下孵育24h以使细胞充分贴壁；而后，给予近似IC50剂量(15ng/ml)的突变体蛋白ΔTRAIL(aa 114-281:R121A)及其融合蛋白His-ΔTRAIL(aa 114-281:R121A)，分别处理0、3、7、24h后，胰蛋白酶消化收集细胞(含上清中的细胞)；预冷PBS清洗2次后，用Annexin-V和PI对细胞进行染色处理，在Accuri C6流式细胞仪上进行细胞凋亡分析。检测结果(如图10A)显示：本发明获得的新型突变体ΔTRAIL(aa 114-281:R121A)仍然能够有效诱导靶细胞凋亡，并且呈现出明显的“时间－效应”关系；同时，在对照实验中，在N-端上游融合有六聚组氨酸标签的突变体融合蛋白表现出了更强的诱导凋亡效力，该现象与野生型TRAIL(aa 114-281)的相关文献报道抑制，显示出本研究获得的突变体ΔTRAIL(aa 114-281:R121A)也可通过N-端的主链连接修饰提高抗肿瘤活性和药学应用潜力。
2.突变体ΔTRAIL(aa 114-281:R121A)诱导NCI-H460细胞凋亡酶活化的测定
NCI-H460细胞体外培养至汇合度80％，用0.25％的胰蛋白酶溶液消化后，以2.5×106个细胞/孔接种至25cm2细胞培养瓶，于37℃、5％CO2条件下孵育24h以使细胞充分贴壁；而后，给予近似IC50剂量(15ng/ml)的突变体蛋白ΔTRAIL(aa 114-281:R121A)；处理7h后，胰蛋白酶消化收集细胞(含上清中的细胞)，采用Caspase-3Colorimetric Assay试剂盒检测细胞内凋亡酶Caspase3的活性。检测结果(如图10B)显示：本发明获得的新型突变体ΔTRAIL(aa 114-281:R121A)能够有效激活靶细胞的重要凋亡酶系Caspase3，进而诱导细胞凋亡。
序列表
<110> 云南大学
<120> 可溶性人肿瘤坏死因子凋亡相关诱导配体的突变体及其制备方法和应用
<160> 47
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 169
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Ala Val Ala Ala His Ile Thr Gly
1 5 10 15
Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu
20 25 30
Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly
35 40 45
His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile
50 55 60
His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe
65 70 75 80
Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln
85 90 95
Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys
100 105 110
Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr
115 120 125
Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile
130 135 140
Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala
145 150 155 160
Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
165
<210> 2
<211> 169
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Ser Val Ala Ala His Ile Thr Gly
1 5 10 15
Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu
20 25 30
Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly
35 40 45
His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile
50 55 60
His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe
65 70 75 80
Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln
85 90 95
Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys
100 105 110
Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr
115 120 125
Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile
130 135 140
Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala
145 150 155 160
Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
165
<210> 3
<211> 169
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Cys Val Ala Ala His Ile Thr Gly
1 5 10 15
Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu
20 25 30
Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly
35 40 45
His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile
50 55 60
His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe
65 70 75 80
Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln
85 90 95
Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys
100 105 110
Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr
115 120 125
Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile
130 135 140
Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala
145 150 155 160
Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
165
<210> 4
<211> 169
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Ala Ala Ala His Ile Thr Gly
1 5 10 15
Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu
20 25 30
Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly
35 40 45
His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile
50 55 60
His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe
65 70 75 80
Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln
85 90 95
Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys
100 105 110
Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr
115 120 125
Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile
130 135 140
Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala
145 150 155 160
Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
165
<210> 5
<211> 507
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggtgtgagag aaagaggtcc tcaggcagta gcagctcaca taactgggac cagaggaaga 60
agcaacacat tgtcttctcc aaactccaag aatgaaaagg ctctgggccg caaaataaac 120
tcctgggaat catcaaggag tgggcattca ttcctgagca acttgcactt gaggaatggt 180
gaactggtca tccatgaaaa agggttttac tacatctatt cccaaacata ctttcgattt 240
caggaggaaa taaaagaaaa cacaaagaac gacaaacaaa tggtccaata tatttacaaa 300
tacacaagtt atcctgaccc tatattgttg atgaaaagtg ctagaaatag ttgttggtct 360
aaagatgcag aatatggact ctattccatc tatcaagggg gaatatttga gcttaaggaa 420
aatgacagaa tttttgtttc tgtaacaaat gagcacttga tagacatgga ccatgaagcc 480
agtttttttg gggccttttt agttggc 507
<210> 6
<211> 507
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggtgtgagag aaagaggtcc tcagtcagta gcagctcaca taactgggac cagaggaaga 60
agcaacacat tgtcttctcc aaactccaag aatgaaaagg ctctgggccg caaaataaac 120
tcctgggaat catcaaggag tgggcattca ttcctgagca acttgcactt gaggaatggt 180
gaactggtca tccatgaaaa agggttttac tacatctatt cccaaacata ctttcgattt 240
caggaggaaa taaaagaaaa cacaaagaac gacaaacaaa tggtccaata tatttacaaa 300
tacacaagtt atcctgaccc tatattgttg atgaaaagtg ctagaaatag ttgttggtct 360
aaagatgcag aatatggact ctattccatc tatcaagggg gaatatttga gcttaaggaa 420
aatgacagaa tttttgtttc tgtaacaaat gagcacttga tagacatgga ccatgaagcc 480
agtttttttg gggccttttt agttggc 507
<210> 7
<211> 507
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggtgtgagag aaagaggtcc tcagtgcgta gcagctcaca taactgggac cagaggaaga 60
agcaacacat tgtcttctcc aaactccaag aatgaaaagg ctctgggccg caaaataaac 120
tcctgggaat catcaaggag tgggcattca ttcctgagca acttgcactt gaggaatggt 180
gaactggtca tccatgaaaa agggttttac tacatctatt cccaaacata ctttcgattt 240
caggaggaaa taaaagaaaa cacaaagaac gacaaacaaa tggtccaata tatttacaaa 300
tacacaagtt atcctgaccc tatattgttg atgaaaagtg ctagaaatag ttgttggtct 360
aaagatgcag aatatggact ctattccatc tatcaagggg gaatatttga gcttaaggaa 420
aatgacagaa tttttgtttc tgtaacaaat gagcacttga tagacatgga ccatgaagcc 480
agtttttttg gggccttttt agttggc 507
<210> 8
<211> 507
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggtgtgagag aaagaggtcc tcagagagca gcagctcaca taactgggac cagaggaaga 60
agcaacacat tgtcttctcc aaactccaag aatgaaaagg ctctgggccg caaaataaac 120
tcctgggaat catcaaggag tgggcattca ttcctgagca acttgcactt gaggaatggt 180
gaactggtca tccatgaaaa agggttttac tacatctatt cccaaacata ctttcgattt 240
caggaggaaa taaaagaaaa cacaaagaac gacaaacaaa tggtccaata tatttacaaa 300
tacacaagtt atcctgaccc tatattgttg atgaaaagtg ctagaaatag ttgttggtct 360
aaagatgcag aatatggact ctattccatc tatcaagggg gaatatttga gcttaaggaa 420
aatgacagaa tttttgtttc tgtaacaaat gagcacttga tagacatgga ccatgaagcc 480
agtttttttg gggccttttt agttggc 507
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<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cagcagcggc gaaaacctgt acttccaggg tgtgagagaa agaggtcct 49
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<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttccatgggc agcagccatc atcatcatca cagcagcggc gaaaacct 48
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttaagcttac tagccaacta aaaaggcc 28
<210> 12
<211> 567
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcg aaaacctgta cttccagggt 60
gtgagagaaa gaggtcctca gagagtagca gctcacataa ctgggaccag aggaagaagc 120
aacacattgt cttctccaaa ctccaagaat gaaaaggctc tgggccgcaa aataaactcc 180
tgggaatcat caaggagtgg gcattcattc ctgagcaact tgcacttgag gaatggtgaa 240
ctggtcatcc atgaaaaagg gttttactac atctattccc aaacatactt tcgatttcag 300
gaggaaataa aagaaaacac aaagaacgac aaacaaatgg tccaatatat ttacaaatac 360
acaagttatc ctgaccctat attgttgatg aaaagtgcta gaaatagttg ttggtctaaa 420
gatgcagaat atggactcta ttccatctat caagggggaa tatttgagct taaggaaaat 480
gacagaattt ttgtttctgt aacaaatgag cacttgatag acatggacca tgaagccagt 540
ttttttgggg cctttttagt tggctag 567
<210> 13
<211> 188
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Glu Asn Leu
1 5 10 15
Tyr Phe Gln Gly Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His
20 25 30
Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser
35 40 45
Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser
50 55 60
Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu
65 70 75 80
Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr
85 90 95
Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln
100 105 110
Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu
115 120 125
Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr
130 135 140
Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn
145 150 155 160
Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp
165 170 175
His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
180 185
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ctttaagaag gagatatacc atgggcagca gccatcatca 40
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gctcgagtgc ggccgcaagc ttactagcca actaaaaagg 40
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tgagctgcta ctgcctgagg acctct 26
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agaggtcctc aggcagtagc agctca 26
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtgagctgct gctctctgag g 21
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cctcagagag cagcagctca c 21
<210> 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ggtcccagtt atcgcagctg ctactct 27
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
agagtagcag ctgcgataac tgggacc 27
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ctggtcccag ttgcgtgagc tgctac 26
<210> 23
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gtagcagctc acgcaactgg gaccag 26
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tgagctgcta cgtcctgagg acctct 26
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agaggtcctc aggacgtagc agctca 26
<210> 26
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tgagctgcta ctgactgagg acctct 26
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
agaggtcctc agtcagtagc agctca 26
<210> 28
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tgagctgcta caccctgagg acctct 26
<210> 29
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
agaggtcctc agggtgtagc agctca 26
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tgagctgcta cgcactgagg acctct 26
<210> 31
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
agaggtcctc agtgcgtagc agctca 26
<210> 32
<211> 188
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Glu Asn Leu
1 5 10 15
Tyr Phe Gln Gly Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Ala Val Ala Ala His
20 25 30
Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser
35 40 45
Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser
50 55 60
Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu
65 70 75 80
Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr
85 90 95
Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln
100 105 110
Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu
115 120 125
Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr
130 135 140
Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn
145 150 155 160
Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp
165 170 175
His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
180 185
<210> 33
<211> 188
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Glu Asn Leu
1 5 10 15
Tyr Phe Gln Gly Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Ala Ala Ala His
20 25 30
Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser
35 40 45
Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser
50 55 60
Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu
65 70 75 80
Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr
85 90 95
Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln
100 105 110
Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu
115 120 125
Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr
130 135 140
Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn
145 150 155 160
Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp
165 170 175
His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
180 185
<210> 34
<211> 188
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Glu Asn Leu
1 5 10 15
Tyr Phe Gln Gly Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala Ala
20 25 30
Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser
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Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser
50 55 60
Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu
65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr
130 135 140
Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn
145 150 155 160
Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp
165 170 175
His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
180 185
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<211> 188
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Glu Asn Leu
1 5 10 15
Tyr Phe Gln Gly Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His
20 25 30
Ala Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser
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Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser
50 55 60
Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu
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Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr
130 135 140
Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn
145 150 155 160
Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp
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His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
180 185
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<211> 188
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Glu Asn Leu
1 5 10 15
Tyr Phe Gln Gly Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Asp Val Ala Ala His
20 25 30
Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser
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Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser
50 55 60
Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu
65 70 75 80
Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr
85 90 95
Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln
100 105 110
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115 120 125
Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr
130 135 140
Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn
145 150 155 160
Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp
165 170 175
His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
180 185
<210> 37
<211> 188
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Glu Asn Leu
1 5 10 15
Tyr Phe Gln Gly Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Ser Val Ala Ala His
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Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser
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Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu
65 70 75 80
Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr
85 90 95
Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln
100 105 110
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115 120 125
Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr
130 135 140
Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn
145 150 155 160
Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp
165 170 175
His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
180 185
<210> 38
<211> 188
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Glu Asn Leu
1 5 10 15
Tyr Phe Gln Gly Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Gly Val Ala Ala His
20 25 30
Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser
35 40 45
Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser
50 55 60
Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu
65 70 75 80
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85 90 95
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115 120 125
Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr
130 135 140
Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn
145 150 155 160
Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp
165 170 175
His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
180 185
<210> 39
<211> 188
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Glu Asn Leu
1 5 10 15
Tyr Phe Gln Gly Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Cys Val Ala Ala His
20 25 30
Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser
35 40 45
Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr
85 90 95
Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln
100 105 110
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115 120 125
Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr
130 135 140
Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn
145 150 155 160
Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp
165 170 175
His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
180 185
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<211> 567
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcg aaaacctgta cttccagggt 60
gtgagagaaa gaggtcctca ggcagtagca gctcacataa ctgggaccag aggaagaagc 120
aacacattgt cttctccaaa ctccaagaat gaaaaggctc tgggccgcaa aataaactcc 180
tgggaatcat caaggagtgg gcattcattc ctgagcaact tgcacttgag gaatggtgaa 240
ctggtcatcc atgaaaaagg gttttactac atctattccc aaacatactt tcgatttcag 300
gaggaaataa aagaaaacac aaagaacgac aaacaaatgg tccaatatat ttacaaatac 360
acaagttatc ctgaccctat attgttgatg aaaagtgcta gaaatagttg ttggtctaaa 420
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Claims (9)

1.人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的突变体，其特征在于所述突变体氨基酸序列如SEQ ID No:1-4 所示。
2.编码如权利要求1所述的突变体的基因，其特征在于所述突变体基因序列如 SEQ IDNo:5-8 所示。
3.如权利要求 1所述的人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的突变体的制备方法，其特征在于制备包含权利要求 1所述突变体的编码基因的融合基因，并在相应的宿主细胞中进行表达。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于包含如下步骤：
（1）获得包含权利要求 1所述突变体的编码基因的融合基因，所述融合基因包括三个基因片段：N-端的基因片段为六聚组氨酸标签的编码基因，中部的基因片段为烟草蚀纹病毒蛋白酶切割位点的编码基因，C-端的基因片段为如权利要求 1所述的突变体的编码基因，以及位于基因两端的限制性内切酶特异识别位点；
（2）将步骤(1)所得的融合基因以及载体质粒采用相同的限制性内切酶切割，然后进行连接，获得重组表达质粒；
（3）将步骤(2)所得的重组表达质粒转化宿主细胞，形成可表达如权利要求 1所述的突变体蛋白的重组细胞；
（4）培养步骤(3)所得的重组细胞；
（5）从细胞破碎物中提取可溶性蛋白，并分离纯化得到包含如权利要求 1所述突变体的融合蛋白；
（6）采用烟草蚀纹病毒蛋白酶加工步骤(5)所得融合蛋白；
（7）分离纯化得到如权利要求 1所述的突变体。
5.如权利要求 1所述的突变体在制备治疗或预防细胞凋亡相关疾病药物中的用途。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于所述药物是抗肿瘤药物。
7.如权利要求5所述的用途，其特征在于所述药物含有如权利要求 1所述的人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的突变体作为药物活性成分以及药学上可接受的载体。
8.如权利要求6所述的用途，其特征在于所述药物还含有其它抗肿瘤药物和/或抗肿瘤药物增敏剂。
9.权利要求1所述的一种人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的突变体可溶性表达的方法，其特征在于将所述人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体在大肠杆菌 E.coli 中进行可溶性表达，表达产物直接从大肠杆菌 E.coli 破壁液上清中分离纯化得到。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112574321B (zh) * 2020-12-30 2023-10-20 上海赛金生物医药有限公司 一种捕获单克隆抗体-肿瘤坏死因子融合蛋白的亲和纯化方法
CN115068590A (zh) * 2021-03-10 2022-09-20 四川大学华西医院 一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体的新用途

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1417229A (zh) * 2001-11-09 2003-05-14 上海中信国健药业有限公司 人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变蛋白、其制法及其药物组合物
CN102898526A (zh) * 2011-07-28 2013-01-30 山东先声麦得津生物制药有限公司 一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体融合蛋白及其制备和应用
CN105461801A (zh) * 2015-11-09 2016-04-06 中国药科大学 高活性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的突变体
CN106519040A (zh) * 2016-11-02 2017-03-22 南京大学 一种含肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的融合蛋白和其制备方法及由该蛋白自组装的纳米粒

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103555729B (zh) * 2013-10-14 2016-08-24 成都华创生物技术有限公司 一种改造的trail基因序列、表达方法及应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1417229A (zh) * 2001-11-09 2003-05-14 上海中信国健药业有限公司 人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变蛋白、其制法及其药物组合物
CN102898526A (zh) * 2011-07-28 2013-01-30 山东先声麦得津生物制药有限公司 一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体融合蛋白及其制备和应用
CN105461801A (zh) * 2015-11-09 2016-04-06 中国药科大学 高活性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的突变体
CN106519040A (zh) * 2016-11-02 2017-03-22 南京大学 一种含肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的融合蛋白和其制备方法及由该蛋白自组装的纳米粒

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