KR101871219B1 - Trail 막투과 펩타이드 유사 돌연변이체, 제조방법 및 응용 - Google Patents

Trail 막투과 펩타이드 유사 돌연변이체, 제조방법 및 응용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 일종의 TRAIL돌연변이체를 제공하며, 상기 돌연변이체는 야생형 TRAIL 단백질 세포막 외부 단편의 114~281번째 자리의 아미노산 서열의 포지션이며, 그중 상기 포지션의 114~121번째 자리의 아미노산은 8개의 아르기닌으로 돌연변이시켜며, 상기 TRAIL 돌연변이체는 종양치료에 사용된다.

Description

Trail 막투과 펩타이드 유사 돌연변이체, 제조방법 및 응용{TRAIL MULTANT MEMBRANE-PENETRATING PEPTIDE-ALIKE, PREPARATION METHOD AND APPLICATION}
본 발명은 유전자 공학 약물 분야, 특히 TRAIL 막투과 유사 돌연변이체, 제조방법 및 응용에 관한 것으로서, 본 발명인 TRAIL 돌연변이체는 다수의 상이한 유형의 종양에 대하여 탁월한 치료작용을 지닌, 잠재력이 매우 큰 차세대 고효율 종양세포 사멸 유도 약물이다.
1. 종양치료에 이용되는 Apo 2L/TRAIL의 발전과 의미
종양 괴사 인자-관련 세포 사멸-유도 리간드(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)는 종양 괴사 인자(Tumor necrosis factor, TNF) 상과(superfamily)의 구성원으로서, 그 유전자 서열은 각각 1995년 Wiley 등 및 1996년 Pitti 등에 의해 독립 클론으로 획득되었고, 후자는 이를 아폽틴 2 리간드(Apo 2 Ligand, Apo 2L)라고 명명하였다. 이후의 연구에서, Apo 2L과 TRAIL은 실질적으로 동일한 단백질임이 실증되었으며, 따라서 관례상 이를 Apo 2L/TRAIL이라 칭할 수 있다. TRAIL의 기능은 먼저 생물체의 선천성 또는 획득성 면역 조절제 역할을 하고, 그 다음은 세포 외원성 사멸 경로 중 면역 감시로서 항종양 작용을 발휘한다. TRAIL의 최대 장점은 다양한 종양세포 사멸을 선택적으로 유도할 수 있고 정상 세포에는 거의 독성이 없다는 것이다. 연구 자료에서 체외 또는 체내를 막론하고 Apo 2L/TRAIL이 각종 유래의 결(직)장암, 폐암, 유선암, 전립선암, 췌장암, 신장암, 중추신경계통의 종양, 갑상선암, 림프종, 백혈병 및 다발성 골수종 등을 포함하는 인체 종양세포계에 대하여 모두 사멸을 유도하는 작용을 갖는다는 것이 밝혀졌다.
발견 이후 지금까지 약 20년 동안, TRAIL은 줄곧 중요한 잠재적 항종양 약물로써 개발되었으며, TRAIL의 임상실험은 국외에서는 이미 Ⅱ기로 진입하였고, 국내에서는 이미 Ⅲ기가 완료되었다. 다량의 체내외 실험에서 TRAIL은 종양 특이성 세포 독성을 지니며, 특히 소량의 화학요법 약물과 연용될 때 모두 뚜렷한 시너지 및 효과 증진 작용을 나타낸다는 것이 실증되었다. 반대로, 연구에서 유기체 중 사멸기전의 부족으로 인한 TRAIL 저항성은 종양세포의 급속한 생장 및 전이와 명확한 관계가 있음이 발견되었다.
종양은 고도의 이질성 질병 그룹으로서, 종래의 조직기관, 병리변화에 따른 분류 방법은 이미 종양의 진단과 치료에 부적합하며, 현재의 연구방향은 상이한 종양 세포의 유전자 발현, 분자의 형결정을 밝혀, 환자에게 더욱 표적성을 지닌 치료를 제공하는데 있다. 항종양 약물에 대한 인식이 깊어지면서 사람들은 세포 독성 약물, 분자 표적지향 약물 또는 모노클론 항체를 막론하고, 작용을 발휘하는 과정에서 모두 종양세포 사멸 경로의 활성화에 관련되어 있으며, 종양세포 사멸의 신호 통로를 유도하는 과정이 이러한 약물이 작용을 발휘하는 중추 및 중요한 일환이고, 사멸 도피는 바로 종양의 발생과 발전 및 약물 내성의 중요 기전임을 이해하게 되었다.
2. 종양치료에 이용되는 Apo 2L/TRAIL의 결함과 대책
최근 진전 상황은, Apo 2L/TRAIL에만 의존하여 다수의 상이한 유형의 종양을 치료하기에는 아직 많이 부족한 것으로 보인다. 재조합 인간 Apo 2L/TRAIL 또는 TRAIL 수용체 DR4/DR5의 호전적 단일클론 항체가 Ⅰ기 임상치료에서 고무적인 결과를 얻었다고는 하나, 이어서 실시된 Ⅱ기 임상연구에서는 오히려 명확한 임상 효과를 나타내지 못하였고, 다량의 연구에서, 정상세포 및 대략 절반(심지어 60%까지) 이상의 연속 종양세포주가 TRAIL에 대해 약물 내성을 나타낸다는 것이 밝혀졌다. Roberta di peitro와 Giorgia zauli의 총론에 따르면, Apo 2L/TRAIL은 이미 연구된 92주의 초대 또는 연속 종양세포 중의 61주에 대해 민감하여, 민감율은 66.3%이었으며, 나머지 31주에 대해서는 약물 내성을 보여, 약물 내성율은 33.7%이었다. TRAIL의 정상세포에 대한 내성은 생리학적 의미가 있으며, TRAIL은 체내에서 정확한 제어를 유지하여, 생장 발육 과정에서 노화되거나 퇴화 및 전환된 세포를 제거하는 것에만 작용을 발휘하고, 정상세포는 죽이지 않으며, 거의 모든 TRAIL 민감성 종양세포는 그 사멸 신호 통로 중의 각 부분 및 요소에서 모두 유사한 완전성과 기능을 구비하는 반면, 모든 TRAIL 약물 내성 종양세포는 모두 사멸 신호 통로 중의 약간의 부분 및 요소에 결함과 변이가 존재하며, 이러한 결함과 변이가 이러한 약물 내성을 지닌 종양세포의 사멸 임계치를 비정상적으로 상승시켜 사멸 제거로부터 비교적 쉽게 도피하여 지속적으로 생장 증식하게 된다.
다량의 연구에서, Apo 2L/TRAIL을 단독으로 사용할 경우 다수의 종양세포에 대해 고효율의 억제 및 사멸 작용이 발생하지 않음이 실증되었다. 그 원인을 살펴보면, 종양세포 사멸 신호 통로는 하나의 대단히 복잡하고 방대한 시스템으로서, 그 중 수많은 사멸촉진 요소가 포함되어 있을 뿐만 아니라, 다량의 사멸억제 인자도 포함되어 있어, 이 두 방면의 요소의 상호작용이 종양세포의 최후 귀착을 결정한다. 사멸 신호 통로의 건전성과 기능은 종양세포 사멸의 필요 조건이나, 충분 조건은 아니다. 다수의 상이한 유형의 약물, 분자 또는 유전자 개입은 모두 TRAIL의 종양세포에 대한 민감성을 강화시킬 수 있으며, 이러한 약물은 상이한 유형의 화학요법 약물, 천연산물, 저분자 키나아제 억제제 등을 포함한다. 이들은 각각 세포외 사멸 신호 통로(예를 들어 DRs 발현의 상향조절, DRs의 세포막 상의 지질 다량 미세 영역에서의 응집과 재분포 강화, TRAIL/DRs 복합물의 세포막에서의 엔도시토시스 증강, DISC의 TRAIL/DRs 복합물로의 모집 촉진, 초기 단계의 Caspase(Caspase 8) 활성의 활성화, 사멸 길항 인자 FLIP, XIAP와 IAPs의 활성 억제 등) 또는 미토콘드리아 사멸 신호 통로(예를 들어 미토콘드리아 막전위의 탈분극화 강화, 미토콘드리아 투과성 증가와 Cyt c, Smac 또는 ARTs 방출 촉진, Bid의 tBid로의 분해 촉진, Bax, Bad의 올리고머화 촉진, 사멸 길항 Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1, survivin 인자 억제 등)를 강화하거나 또는 기타 세포 생존 신호 통로(예를 들어 ERK/PI3K/AKt, MEK, Jak-STAT3, MAPK, NF-κB등) 또는 몇몇 통로의 연합을 억제하여 TRAIL이 유도하는 종양세포 사멸 활성을 증강시킨다.
TRAIL 및 그 수용체 작동성(agonistic) 모노클론 항체 약물의 개발과정이 잠시 좌절되었으나, 세포 사멸 신호 통로 경로가 완전히 밝혀지고, 사멸/내성의 상호 전환 관계가 완전히 게시됨에 따라, 사멸 신호 통로에 기초한 표적지향 항종양 약물의 연구개발은 결코 멈춰 있지 않다. 현재 연구가 비교적 많이 이루어지고 있는 것은 TRAIL과 세포독성의 연합 응용이다. 그러나 대다수의 실험에서 이러한 연합이 단지 TRAIL에 대해 상대적으로 민감한 종양세포만에만 뚜렷한 시너지 및 효과 증진 작용을 발생시킬 뿐, 다수의 상이한 약물 내성 기전이 발생시키는 약물 내성 현상을 완전히 역전시킬 수 없음이 밝혀졌다. TRAIL과 세포독성 약물은 두 가지 상이한 약물 유형에 속하여, 약물 품종 투여량, 약물 투여 경로, 작용 방식이 상이하고 차이가 있어, 단일하고, 안정적이며, 제어 가능한 신약으로 개발될 가능성이 비교적 낮고, 또한 TRAIL과 세포독성 약물을 연용한 후, 독성 부작용이 여전히 존재하기 때문에, 그 장점이 분명하지 않다.
3. Apo 2L/TRAIL 막투과 펩타이드 유사 돌연변이체의 설계 구상
사멸 단백질 작용이 최종적으로 효과를 일으키는 핵심 부위는 세포막 내이며, 세포막은 치료성 생물 활성물질이 세포내로 운반되는 생물학적 장벽이다. 사멸 단백질의 친수성으로 인해, 생물활성분자가 세포막 내로 자유롭게 진입할 수 없어 그 작용의 발휘와 실제 응용에 제약이 있다. 막투과 펩타이드는 세포막 투과 기능을 갖는 크기가 대부분 20~30개의 아미노산인 양전하를 지닌 양이온성 짧은 펩타이드이며, 근 수십년 동안 발전되온 신형 약물 운반 및 전달 기술로서, 단백질 전달 영역(Protein transduction domain, PTD)이라고도 칭한다.
1988년, Green과 Frankel은 인간 면역 결핍 바이러스(HIV-1)의 trans 활성 단백질 TAT가 막을 투과하여 세포질과 세포핵 내로 전이될 수 있음을 처음으로 실증하였다. 그 중 하나의 아르기닌 리치 TAT 폴리펩타이드(GRKKRRQRRRGY)는 막투과 단백질 전달 기능을 가지며, 다수의 다원성 물질을 매개할 수 있어, 유전자, 단백질, 폴리펩타이드, 화학합성된 나노 입자 등이 세포막, 심지어 세포핵 내로 진입할 수 있다. 이후 잇달아 초파리의 호메오박스 전사인자 ANTP, 단순포진 바이러스Ⅰ형(HSV-1) 전사인자 VP22, Transpotan, 폴리아르기닌 등 서열이 세포막 투과 능력을 가진다는 것이 발견되었으며, 현재 이미 수백종의 막투과 성능을 구비한 펩타이드 구간이 발견되었다.
상이한 표준에 따라, 막투과 펩타이드를 각기 다른 종류로 분류할 수 있다. 구조적인 특징으로 논하면, 초기에는 막투과 펩타이드를 단순히 (1) 전형적인 구조를 갖지 않은 다량의 양이온을 지닌 TAT, penetratin 등과 같은 막투과 펩타이드; (2) 단백질 신호 서열 유래의 양친성 α나선형 펩타이드로 구분하였다. 유래로 분류할 경우, 막투과 펩타이드는 천연에 존재하는 것과 인공 합성 2종류로 구분되고, 또한 (1) penetratin, TAT와 pVEC 등과 같은 단백질 유래의 막투과 펩타이드, 이들은 통상적으로 단백질을 운반하는 최소 유효 단편(fragment), 즉 단백질 형질도입부와 막 전좌 서열을 갖는다. (2) MAP와 Arg(7) 등과 같은 모델(Model) 막투과 펩타이드, 이들은 결정된 양친성 α나선을 형성하거나 또는 이미 알려진 막투과 펩타이드 구조를 모방하기 위해 인공적으로 합성된 것이다. 막투과 펩타이드 구조에 따라 합성된 폴리아르기닌과 폴리라이신은 그 막투과 능력이 TAT 단백질의 도입 활성보다 훨씬 높다. (3) PEP-1, MPG와 Transportan 등과 같은 인공적으로 설계, 합성된 막투과 펩타이드, 이들은 통상적으로 키메라성 폴리펩타이드로서, 하나의 소수성 부분과 하나의 친수성 부분을 함유하며, 예를 들어 PEP-1(KETWW ETWWT EWSQP KKKRK V)은 하나의 소수성 트립토판 모티프가 풍부한 프래그먼트(KETWW ETWWT EW), 하나의 스페이서(SQP), 하나의 친수성 라이신 모티프가 풍부한 영역(KKKRKV)을 포함한다. 이러한 펩타이드 단편은 보다 많은 장점을 구비하며, PEP-1은 목적 거대분자와 공유 결합할 필요 없이, 직접 목적 거대분자와 혼합 후 즉시 천연 배좌(confomation) 단백질을 효과적으로 세포에 도입할 수 있다.
막투과 기능을 갖는 펩타이드의 아미노산 구조의 핵심은 그 주요 분자 성분이 알칼리성이 풍부한 아미노산, 예를 들어 아르기닌, 라이신과 히스티딘이라는 것이다. 알칼리성 아미노산은 이러한 막투과 단백질 성분의 중요 특징이다. 이러한 아미노산은 강한 양전하를 지녀 음전하를 지닌 세포막 지질분자와 상호작용하여 막투과 과정을 매개할 수 있으며, 그 중 아르기닌 잔기(residue)는 단백질 세포내 내재화 과정에서 중요한 역할을 한다. 현재, 폴리아르기닌-형질도입 단백질 엔도시토시스에 관한 작용 메커니즘은 두 가지 관점이 존재한다. 하나는 아르기닌을 통해 세포막과 지질의 이중층에 일시적으로 포어를 형성하여 단백질을 세포에 직접 도입하는 것이고, 두번째는 대음세포작용, 엔도시토시스 작용, 카베올린 매개형, 클라트린 매개형, 식세포 작용 및 엔도좀 교류 등의 메커니즘을 포함하여 다양한 형식으로 매개되는 세포 엔도시토시스 작용을 통해 단백질을 세포에 도입하는 것이다. TRAIL은 종양세포막 지질 다량 미세 영역에서 사멸 수용체의 응집과 재분포를 유도하며, TRAIL-DR4/5 복합물의 엔도시토시스 작용을 통하거나 또는 통하지 않고 Fas 관련 사멸 구조(Fas-Associated death domain, FADD)와 Caspase-8을 모집하여, 사멸 유도 신호 복합물(Death inducing signaling complex, DISC)로 조립하고, Caspase-8의 분해(cleaving)를 통해 사멸 효과의 폭포 캐스케이드 과정을 가동한다. 대부분의 문헌에서는 TRAIL-DR4/5 복합물의 내재화는 사멸 신호를 지속적으로 증폭시키는데 필수적이라고 여기고 있다. 전통적으로 외원 단백질은 막투과와의 융합으로 발현되며, 발현되는 융합 단백질은 단백질 분자의 공간 배좌를 변경시켜 생물 활성을 상실하게 된다. 또한 융합 단백질은 고유의 단백질 분자의 항원성을 증가시켜 안전성 위험을 가져온다.
우리는 TRAIL 단백질의 가용성 단편(114~281aa)의 코딩 아미노산 서열의 N단 중 몇개의 아미노산을 선택적으로 돌연변이시켜, TRAIL 단백질에 막투과 펩타이드와 유사한 아미노산 서열이 형성되도록 하였으며, 즉 TRAIL에 대해 막투과 펩타이드 유사 돌연변이를 실시하여 현재 이미 10여종의 상이한 막투과 펩타이드 유사 돌연변이체를 획득하였다. 본 발명은 기존의 막투과 펩타이드 융합 단백질 설계 구상을 돌파하여, TRAIL 야생형 단백질 세포막 외부 단편 중 114~281번째 자리의 아미노산 코딩 서열 N단의 114번째 자리의 발린, 116번째 자리의 글루타메이트, 118번째 자리의 글리신, 119번째 자리의 프롤린, 120번째 자리의 글루타민을 각각 선택적으로 아르기닌으로 돌연변이시켜, TRAIL 단백질의 114~121번째 자리의 아미노산이 8개의 연속되는 아르기닌 서열을 형성하도록 하였다. 내생의 8개의 연속되는 아르기닌 서열은 TRAIL 세포막 외부 단편 중 N단의 아미노산 서열의 변경을 최소화시켜(원래의 제115번째 자리, 제 117번째 자리, 제121번째 자리의 아르기닌 서열은 보류), TRAIL 단백질의 공간 배좌와 생물 활성을 최대한 유지시키고, 또한 막투과 기능을 갖는 연속되는 8개의 아르기닌 서열 형성을 구축하여, 우리는 본 발명의 막투과 펩타이드 유사 돌연변이체를 TRAIL-Mu3이라 명명하였다. 막투과 펩타이드 유사 돌연변이체는 일종의 막투과 펩타이드 융합 단백질의 참신한 설계 구상이다.
종래 기술의 결함에 대하여, 본 발명의 목적은 TRAIL 야생형 단백질의 항종양 활성을 최대한으로 강화시킬 수 있고, 특히 다수의 약물 내성 종양세포의 TRAIL 야생형 단백질에 대한 약물 내성을 역전시킬 수 있는 신형 TRAIL 막투과 펩타이드 유사 돌연변이체를 제공하고자 하는데 있다. 제조된 돌연변이체 단백질은 세포막을 투과하여 세포질에 직접 진입함으로써 신속하게 효력을 발생시킬 수 있을 뿐만 아니라, 사멸 수용체/돌연변이 단백질 복합물의 세포막 지질 다량 미세 영역에서의 응집과 내재화를 촉진시켜 외원성 사멸 신호 경로의 형질도입을 강화시킬 수 있다. TRAIL 막투과 펩타이드 유사 돌연변이체는 다수의 상이한 유형의 종양에 대해 탁월한 치료작용을 지닌, 잠재력이 매우 큰 차세대 고효율 종양세포 사멸 유도 약물이다.
상기 목적을 구현하기 위하여, 본 발명이 채택한 기술방안은 다음과 같다. TRAIL 막투과 펩타이드 유사 돌연변이체에 있어서, 상기 돌연변이체는 TRAIL 야생형 단백질 세포막 외부 단편(fragment) 중 114~121번째 자리의 아미노산 코딩 서열을 VRERGPQR로부터 RRRRRRRR로 선택적으로 개조하여, 114번째 자리는 발린으로부터 아르기닌으로 돌연변이시키고, 116번째 자리는 글루타메이트로부터 아르기닌으로 돌연변이시키며, 118번째 자리는 글리신으로부터 아르기닌으로 돌연변이시키고, 119번째 자리는 프롤린으로부터 아르기닌으로 돌연변이시키며, 120번째 자리는 글루타민으로부터 아르기닌으로 돌연변이시켜, 돌연변이체 단백질의 N단이 연속되는 8개의 아르기닌 코딩 서열을 이루도록 함으로써, 막투과 펩타이드 유사 구조를 포함하는 단백질을 형성한다.
또한, 상기 돌연변이체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2와 같다.
또한, 상기 돌연변이체를 인코딩하는 cDNA 서열은 SEQ ID NO:1과 같다.
본 발명의 두 번째 목적은 이하 단계를 포함하는 TRAIL 막투과 펩타이드 유사 돌연변이체의 제조방법을 제공하고자 하는데 있다.
A. cDNA 단편의 증폭과 클로닝;
B. 발현 벡터의 구축과 감정;
C. 재조합 TRAIL 단백질의 융합 발현;
D. TRAIL 단백질의 정제;
E. TRAIL 단백질의 감정.
또한, 단계B에서, 상기 발현 벡터의 구축과 감정 단계는
B1. 원핵(prokaryotic) 발현 벡터 중 대응되는 융합 태그 서열을 잘라내는 단계;
B2. 최적화 후 TRAIL 막투과 펩타이드 유사 돌연변이체 단백질을 인코딩하는 cDNA 서열을 원핵 발현 벡터에 클로닝하여 고효율의 가용성 비융합 발현을 획득하는 단계를 포함한다.
또한, 단계 B1에서, 상기 원핵 발현 벡터는 pET32a 또는 pTWIN 1이다.
또한, 단계 C에서, 상기 재조합 단백질의 발현 시, 유도 온도는 18~24℃이다.
또한, 단계 D에서, 상기 TRAIL 단백질의 정제 단계는
D1. 양이온 교환수지를 제1 단계 정제에 사용하여 세균 파쇄 후 상청액 중의 목적 단백질을 포착하는 단계;
D2. 수산화인회석 수지를 제 2단계 중등도 정제에 사용하여 단백질 순도를 더 높이고 내독소를 제거하는 단계;
D3. 음이온 교환수지를 최종 단계의 미세 정제에 사용하여 제품이 공업화 확대 및 향후 임상응용 수요를 만족시키도록 하는 단계를 포함한다.
본 발명의 세 번째 목적은 TRAIL 막투과 펩타이드 유사 돌연변이체를 항종양 약물중에 응용하고자 하는데 있다.
본 발명의 종양세포 사멸 유도 작용 메커니즘은, TRAIL 막투과 펩타이드 유사 돌연변이체가 막투과 작용을 통해 종양세포 내로 신속하게 진입하여 세포 사멸을 유도하는 작용을 발휘하도록 하는 것이다. 이밖에, TRAIL 막투과 펩타이드 유사 돌연변이체는 또한 사멸 수용체의 세포막 지질 다량 미세영역에서의 응집, 재분포/또는 TRAIL-DR4/DR5 복합물의 내재화 작용을 효과적으로 촉진시켜 외원성 사멸 신호 경로의 도입을 강화시킬 수 있다.
본 발명의 유익한 효과는 다음과 같다.
1. 완전히 새로운 단백질 구조로서, 최소의 돌연변이 위치점을 이용하여, 단백질 구조에 대한 영향을 최소화하고, 획득되는 기능은 최대화시켰다. TRAIL 막투과 펩타이드 유사 돌연변이체는 단지 5개의 불연속 위치점의 돌연변이를 통해서만 형성되며, 위치점의 돌연변이가 단백질의 아미노기 단부에 발생하기 때문에, 단백질의 생물활성과 안정성에 대한 영향은 비교적 작으나, 오히려 막투과 펩타이드 융합 단백질을 능가하는 막투과 능력을 획득한다.
2. 높은 단백질 발현 및 가용성 발연 비율을 지니며, 고효율 원핵 발현 벡터 pET32a 또는 pTWIN 1의 개조 형식을 이용하여, 발현 벡터는 18~24℃의 비교적 넓은 유도 온도 범위 내에서 모두 TRAIL 야생형 단백질보다 높은 발현 수준과 가용성 발연 비율을 획득할 수 있으며, 가용성 단백질 비율은 80%~100%에 달한다.
3. TRAIL 야생형 단백질의 정제 제조 공정과 달리, 본 발명의 공정의 유효성, 회수율 및 제품 품질이 뚜렷하게 향상되었으며, 특이성 친화 크로마토그래피 정제방법을 이용하지 않기 때문에, 정제 비용이 상응하게 절감되어 확대 가능한 잠재력이 현저하여 향후 임상 수요를 완전히 만족시킬 수 있다.
4. 광범위한 체외 생물 활성을 지니며, TRAIL 막투과 펩타이드 유사 돌연변이체를 TRAIL 야생형 단백질과 비교해보면, 검출된 거의 모든 종양세포 유형 중, 항종양 활성이 모두 뚜렷하게 향상되었으며, 특히 TRAIL 야생형 단백질에 대해 약물 내성을 지닌 종양세포주의 경우, 이러한 세포의 TRAIL 야생형 단백질에 대한 저항성을 뚜렷하게 역전시킬 수 있어 보다 강한 치료작용을 지닌다.
본 발명의 실시예 또는 종래 기술 중의 기술방안을 보다 명확하게 설명하기 위하여, 이하 실시예 또는 종래 기술에 대한 묘사에 필요한 도면을 간단히 소개한다. 아래에 묘사되는 도면은 단지 본 발명의 약간의 실시예에 불과하다는 것은 자명하며, 본 분야의 보통 기술자에게 있어서, 창조적인 노력을 하지 않는다는 것을 전제로, 이러한 도면에 따라 기타 도면을 획득할 수도 있다.
도 1: TRAIL-Mu3 단편 PCR 생성물의 전기영동도; 전기영동 조건: 3% Agarose, 전압 100V, 20min; Lane 1: TRAIL-Mu3 단편 PCR 생성물 전기영동 밴드; M: DL2000(밴드 분자량은 위에서 아래로 순차적으로 2000bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp, 100bp이다), 샘플 로딩량은 5㎕이고, PCR 생성물 샘플 로딩량은 5㎕이다;
도 2: pMD19/TRAIL-Mu3 효소절단 감정 전기영동도; 전기영동 조건: 1% Agarose, 전압 150V, 30min; Lane 1~7: pMD19/TRAIL-Mu3 균종에서 추출된 플라스미드의 효소 절단후의 전기영동도; M:GeneRuler1kb DNA Ladder(밴드 분자량은 위에서 아래로 순차적으로 10000bp, 8000bp, 6000bp, 5000bp, 4000bp, 3500bp, 3000bp, 2500bp, 2000bp, 1500bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp이다); 감정된 생성물의 샘플 로딩량은 모두 10㎕이고, Marker 샘플 로딩량은 5㎕이다;
도 3: TRAIL-Mu3과 pET32a, pTWIN1 플라스미드 NdeI, EcoRI 효소 절단 후의 전기영동도; 전기영동 조건: 1% Agarose, 전압 150V, 25min; Lane 1: TRAIL-Mu3 효소 절단 후 겔 회수 전기영동 밴드; lane 2: pET32a 효소 절단 후 겔 회수 전기영동 밴드; lane 3: pTWIN1 효소절단 후 겔 회수 전기영동 밴드; M: GeneRuler1kb DNA Ladder(밴드 분자량은 위에서 아래로 순차적으로 10000bp, 8000bp, 6000bp, 5000bp, 4000bp, 3500bp, 3000bp, 2500bp, 2000bp, 1500bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp이다);샘플 로딩량은 5㎕이고, PCR 생성물 샘플 로딩량은 모두 3㎕이다;
도 4 pET32a/TRAIL-Mu3 플라스미드 XbaI와 EcoRI 효소절단 감정 전기영동도; 전기영동 조건: 1% Agarose, 전압 150V, 30min; Lane1~7: pET32a/TRAIL-Mu3 균종에서 추출된 플라스미드의 효소 절단후의 전기영동도; M:GeneRuler1kb DNA Ladder(밴드 분자량은 위에서 아래로 순차적으로 10000bp, 8000bp, 6000bp, 5000bp, 4000bp, 3500bp, 3000bp, 2500bp, 2000bp, 1500bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp이다); 감정된 생성물의 샘플 로딩량은 모두 10㎕이고, Marker 샘플 로딩량은 5㎕이다;
도 5: pTWIN1/TRAIL-Mu3 플라스미드 XbaI와 EcoRI 효소절단 감정 전기영동도; 전기영동 조건: 1% Agarose, 전압 150V, 30min; Lane1~8: pTWIN1/TRAIL-Mu3 균종에서 추출된 플라스미드의 효소 절단후의 전기영동도; M:GeneRuler1kb DNA Ladder(밴드 분자량은 위에서 아래로 순차적으로 10000bp, 8000bp, 6000bp, 5000bp, 4000bp, 3500bp, 3000bp, 2500bp, 2000bp, 1500bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp이다); 감정된 생성물의 샘플 로딩량은 모두 10㎕이고, Marker 샘플 로딩량은 5㎕이다;
도 6: pET32a/TRAIL-Mu3 발현 SDS-PAGE 전기영동도; 전기영동 조건: 15%의 겔, 200V, 35min; Lane 1: pET32a/TRAIL-Mu3 유도 전 전기영동 밴드, lane 2: pET32a/TRAIL-Mu3 유도 후 전기영동 밴드, lane 3: pET32a/TRAIL-Mu3 세균 파쇄 후 상청 전기영동 밴드, lane 4: pEt32a/TRAIL-Mu3 세균 파쇄 후 침전 전기영동 밴드, M: Unstained Protein Molecular Weight Marker(밴드 분자량은 위에서 아래로 순차적으로 116.0KDa, 66.2KDa, 45.0KDa, 35.0KDa, 25.0KDa, 18.4KDa, 14.4KDa이다), Marker 샘플 로딩량은 5㎕이고, 기타 샘플 로딩량은 모두 20㎕이다;
도 7: pTWIN1/TRAIL-Mu3 발현 SDS-PAGE 전기영동도; 전기영동 조건: 15%의 겔, 200V, 35min; Lane 1: pTWIN1/TRAIL-Mu3 유도 전 전기영동 밴드, lane 2: pTWIN1/TRAIL-Mu3 유도 후 전기영동 밴드, lane 3: pTWIN1/TRAIL-Mu3 세균 파쇄 후 상청 전기영동 밴드, lane 4: pTWIN1/TRAIL-Mu3 세균 파쇄 후 침전 전기영동 밴드, M: Unstained Protein Molecular Weight Marker(밴드 분자량은 위에서 아래로 순차적으로 116.0KDa, 66.2KDa, 45.0KDa, 35.0KDa, 25.0KDa, 18.4KDa, 14.4KDa이다), Marker 샘플 로딩량은 5㎕이고, 기타 샘플 로딩량은 모두 20㎕이다;
도 8: 양이온 교환 과정 SDS-PAGE 전기영동도; 전기영동 조건: 15%의 겔, 200V, 50min; Lane 1: 양이온 교환 원액, lane 2: 양이온 교환 침투액, lane 3: 양이온 교환 용리액, lane 4: 양이온 교환 NaOH 용리액, M: Unstained Protein Molecular Weight Marker(밴드 분자량은 위에서 아래로 순차적으로 116.0KDa, 66.2KDa, 45.0KDa, 35.0KDa, 25.0KDa, 18.4KDa, 14.4KDa이다), Marker 샘플 로딩량은 5㎕이고, 기타 샘플 로딩량은 모두 20㎕이다;
도 9: 수산화인회석 과정 SDS-PAGE 전기영동도; 전기영동 조건: 15%의 겔, 200V, 50min; Lane1: 수산화인회석 샘플로딩 원액, lane 2: 수산화인회석 침투액, lane 3: 수산화인회석 NaCl 용리액, lane 4: 수산화인회석 인산 래디컬 용리액, lane 5: 수산화인회석 NaOH 용리액, M: Unstained Protein Molecular Weight Marker(밴드 분자량은 위에서 아래로 순차적으로 116.0KDa, 66.2KDa, 45.0KDa, 35.0KDa, 25.0KDa, 18.4KDa, 14.4KDa이다), Marker 샘플 로딩량은 5㎕이고, 기타 샘플 로딩량은 모두 20㎕이다;
도 10: 음이온 교환 과정 SDS-PAGE 전기영동도; 전기영동 조건: 15%의 겔, 200V, 50min; Lane 1: 음이온 교환 원액, lane 2: 음이온 교환 침투액, lane 3: 2M의 NaCl 용리액, lane 4: 0.5M의 NaOH 용리액, M: Unstained Protein Molecular Weight Marker(밴드 분자량은 위에서 아래로 순차적으로 116.0KDa, 66.2KDa, 45.0KDa, 35.0KDa, 25.0KDa, 18.4KDa, 14.4KDa이다), Marker 샘플 로딩량은 5㎕이고, 기타 샘플 로딩량은 모두 20㎕이다;
도 11: Western blot 감정결과도; lane 1: pET32a/Mu3-TRAIL 세균 파쇄 상청 western blot 결과도; Lane 2: pET32a/TRAIL 세균 파쇄 상청 western blot 결과도; lane 3: BL21(DE3) 공균(vacant vacteria) 세균 파쇄 상청 western blot 결과도; M: Thermo Scientific PageRulerPrestained Protein Ladder(밴드 분자량은 위에서 아래로 순차적으로 170Kd, 130Kd, 100Kd, 70Kd, 55Kd, 40Kd, 35Kd, 25Kd, 15Kd, 10Kd이다).
이하 본 발명의 실시예 중의 도면을 결합하여, 본 발명의 실시예 중의 기술방안에 대하여 명확하고 완전하게 설명할 것이다. 물론, 묘사되는 실시예는 모든 실시예가 아닌, 본 발명의 일부 실시예일 뿐이다. 본 발명의 실시예를 기초로, 본 분야의 보통 기술자가 창조적인 노력을 하지 않는다는 전제 하에 획득된 기타 실시예는 모두 본 발명의 보호범위에 속한다.
실시예 1
TRAIL 막투과 펩타이드 유사 돌연변이체의 서열 및 프라이머 설계
TRAIL 야생형 단백질 세포막 외부 단편의 114~121번째 자리의 아미노산 코딩 서열을 선택적으로 VRERGPQR로부터 RRRRRRRR로 개조하였다. 즉 114번째 자리는 발린으로부터 아르기닌으로 돌연변이시키고, 116번째 자리는 글루타메이트로부터 아르기닌으로 돌연변이시키며, 118번째 자리는 글리신으로부터 아르기닌으로 돌연변이시키고, 119번째 자리는 프롤린으로부터 아르기닌으로 돌연변이시키며, 120번째 자리는 글루타민으로부터 아르기닌으로 돌연변이시켜, 5부분의 돌연변이 위치점에서 돌연변이체 단백질의 N단이 연속되는 8개의 아르기닌 코딩 서열을 이루도록 함으로써, 막투과 펩타이드 유사 구조를 포함하는 단백질을 형성하였다.
돌연변이체를 인코딩하는 cDNA는 SEQ ID NO:1과 같으며, 돌연변이체 아미노산은 SEQ ID NO:2와 같다.
프라이머 합성은 다음과 같다.
업스트림 프라이머 Mu3-TR-NdeI는 SEQ ID NO:3에 나타낸 바와 같고;
다운스트림 프라이머 TR-Eco-R은 SEQ ID NO:4에 나타낸 바와 같다.
실시예 2
PCR로 TRAIL-Mu3 단편을 증폭시켜, T vector와 결합시키고, 결합 생성물의 단일 균락을 픽킹(picking) 및 감정하였다.
pMD19/TRAIL 플라스미드를 템플릿으로 사용하여 PCR로 TRAIL-Mu3 단편을 돌연변이 증폭시켜, T vector와 결합시키고, 결합 생성물의 단일 균락을 픽킹 및 감정하였다. 프라이머 설계는 실시예 1을 참조하며, pMD19/TRAIL 플라스미드는 실험실에서 자체적으로 준비하였다.
실험 단계
一. TRAIL-Mu3 목적 단편(fragment)의 PCR 증폭
1. pMD19/TRAIL 플라스미드를 템플릿으로 사용하여, Mu3-TR-NdeI/TR-Eco-R 프라이머쌍으로 TRAIL-Mu3 목적 단편을 증폭시킨다. 표 1에 따라 반응체계를 제조하며, 반응체계는 50㎍이다.
TRAIL-Mu3 PCR 반응체계(50㎕)
시약 반응체계
정제된 pMD19/TRAIL 플라스미드 1㎕
10×Ex Taq Buffer(Mg2+ free) 5㎕
dNTP Mix(2.5mM each) 4㎕
25mM MgCl2 3㎕
TaKaRa Ex Taq 1㎕
프라이머 Mu3-TR-NdeI(10pmol/㎕) 1㎕
프라이머 TR-Eco-R(10pmol/㎕) 1㎕
RNase-Free Water 34㎕
2. 와류 진동으로 고르게 혼합하고, 단시간에 원심분리하여 용액을 튜브 바닥에 수집한다.
3. PCR 증폭 반응 조건은 표 2를 참조한다.
TRAIL-Mu3 PCR 반응조건
단계 온도 시간
예비변성(predegeneration) 94℃ 1min
변성(degeneration) 94℃ 30s 25cycles
퇴화 58℃ 30s 25cycles
연신 72℃ 45s 25cycles
종연신? 72℃ 3min
4. 전기영동, 사진촬영
5. PCR 증폭된 TRAIL-Mu3 목적 단편을 Omega 겔 회수 키트를 이용하여 겔 회수하고, 50㎕의 초순수로 용리시켜, 전기영동 및 사진촬영하여 준비해 둔다.
二. 겔 회수 목적 단편의 pMD19 T vector 결합
1. TaKaRa pMD19-T Vector 키트를 이용하여 겔 회수 목적 단편을 결합시키며, 결합 체계는 표 3을 참조한다.
TRAIL-Mu3와 pMD19T의 결합 반응 체계(10㎕)
시약 반응체계
pMD19 T vector 1㎕
목적 단편（TRAIL-Mu3） 4㎕
결합 효소（sol I） 5㎕
2. 16℃의 금속욕에서 하룻밤동안 인큐베이팅한다.
3. 결합 생성물 10㎕을 100㎕의 Top 10 형질전환 수용성 세포에 투입하여 30min 동안 빙욕시킨다.
4. 42℃ 수욕에서 90초간 열충격시킨다.
5. 얼음 위에 놓고 2분 동안 인큐베이팅한다.
6. 500㎕의 SOC 배지를 투입하고, 37℃에서 45분 동안 진동 배양한다.
7. 전환된 형질전환 수용성 세포를 원심분리한 후, 슈퍼클린벤치에서, 400㎕을 버리고, 나머지 약 100㎕의 배지는 세균을 균일하게 블로우하여, 모두 Amp를 함유한 LB 고체 배지에 도포하고, 37℃에서 하룻밤 배양한다.
三. 단일 균락의 픽킹(picking) 및 효소절단 감정
(1) 단일 균락의 픽킹
1. 다수의 멸균 시험관을 준비하여, 시험관에 암피실린 LB 액체 배지 100ml를 투입한다.
2. 배지를 각 시험관에 약 4ml씩 나누어 담는다.
3. 균락이 이미 생장한 플레이트에, 충분히 달궈진 겸자로 무균 피펫 팁을 클램핑하여 플레이트에서 생장한 균락을 픽업하며, pMD19/TRAIL-Mu3는 7개를 픽업하여, 피펫팁을 LB 액체 배지가 담긴 시험관에 투입한다.
4. 각 시험관을 묶은 후, 셰이커 클램프에 담아 충분히 고정시키고, 37℃에서 220rpm으로 하룻밤 진동시킨다.
(2) 플라스미드 추출
1. 균액을 1ml씩 취하여 각각 원심분리관에 담고, 10000g을 1min 동안 원심분리하여 상청을 최대한 흡취한다.
2. 남은 균체가 침전된 원심분리관에 250㎕의 Solution I(RNAase A 미리 투입)을 첨가하여 세균 침전을 철저히 현탁시킨다.
3. 250㎕의 Solution II을 첨가하고 온화하게 혼합하여 균체를 충분히 분해시킨다. 이때 균액은 맑고 점성이 생기게 되며, 5min 안에 이 단계를 완료한다.
4. 원심분리관에 350㎕의 Solution III을 첨가하고, 즉시 거꾸로 하여 균일하게 혼합한다. 이때 백색의 유모성 침전이 나타나며, 13000g을 10min 동안 원심분리하면, 이때 원심분리관 저부에 침전이 형성된다.
5. 단계 5에서 획득된 상청을 모두 2개의 수집관에 장입된 HiBind Miniprep 흡착 컬럼에 나누어 주입하되, 침전이 흡출되지 않도록 주의한다. 10000g을 1min 동안 원심분리하고, 수집관 중의 폐액을 버린 후, 흡착 컬럼을 수집관에 다시 장입한다.
6. 수집관에 500㎕의 Buffer HB를 주입하고, 10000g을 1min 동안 원심분리한 다음, 수집관 중의 폐액을 버리고, 흡착 컬럼을 수집관에 다시 장입한다.
7. 수집관에 700㎕의 Wash Buffer를 주입하고, 10000g을 1min 동안 원심분리한 다음, 수집관 중의 폐액을 버리고, 흡착 컬럼을 수집관에 다시 장입한다.
8. 단계 7을 반복한다.
9. 흡착 컬럼을 다시 수집관에 장입하고, 13000g을 2min 동안 원심분리하여 흡착 컬럼을 건조시키고, 수집관 중의 폐액을 버린다.
10. 각 흡착 컬럼을 새로운 1.5ml Ep관에 담고, 각 흡착막의 중간부위에 65㎕의 Elution Buffer를 공중에서 적가하여, 실온에 몇 분간 방치한 다음, 13000g 이상을 1min 동안 원심분리하여, 플라스미드 용액을 1.5ml의 Ep관에 수집한다.
11. 각각 60㎕의 플라스미드 DNA를 수득하여, -20℃에서 플라스미드를 보관한다.
(3) 효소 절단 감정
1. pMD19/TRAIL-Mu3 플라스미드를 EcoR I, HindIII로 이중효소 절단한다.효소절단 반응체계는 표 4를 참조한다.
pMD19/TRAIL-Mu3 효소절단 반응체계(10㎕)
시약 부피
pMD19/TRAIL-Mu3 DNA 5㎕
EcoR I 0.5㎕
Hind III 0.5㎕
10×M Buffer 1㎕
dH2O 3㎕
2. Ep관을 다용도 인큐베이터에 담고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이팅한다.
3. 효소절단 종료 후 전기영동 감정한다.
(4) 효소절단이 정확하게 이루어진 결합에 성공한 균종을 선택하여, 글리세롤 균종을 보관하고, 서열 분석(sequencing)하고, 서열 분석이 정확한 균종을 보관한다.
실험 결과
一. 목적 단편의 PCR 증폭 결과
Mu3-TR-NdeI/TR-Eco-R 프라이머쌍으로 TRAIL-Mu3 목적 단편을 돌연변이 증폭시킨 결과, 단편의 분자량 크기는 500bp 정도로 도 1에 나타난 바와 같으며, 상기 PCR 반응조건에 따라 목적 유전자가 획득되었다.
2. pMD19 T vector와의 결합 및 전환 결과
1) 플레이트에 균락이 생장하였으나, 밀도가 높지 않았다.
2) 픽업된 단일 균락은 이튿날 일부 시험관에서 세균이 생장하였고, 밀도가 정상이었다.
3) 효소절단 방법으로 플라스미드를 감정하고, pMD19/TRAIL-Mu3 플라스미드는 EcoRI, HindIII로 이중효소절단 감정할 수 있으며, 결합에 성공한 플라스미드는 효소절단 후 2.7Kb 정도의 벡터 단편 및 500bp 정도의 목적 단편이 나타나게 된다. 도 2에 도시된 바와 같이, pMD19/TRAIL-Mu3 4#, 5#, 6#, 8# 4개의 샘플은 양성 클론이다. 양성 클론을 베이징 유전체학 연구소(BGI)로 보내 서열 분석하였으며, 서열이 완전히 정확한 TRAIL-Mu3 목적 유전자 서열 플라스미드를 함유한 균종을 획득하였다.
실시예 3
TRAIL-Mu3 목적 단편을 각각 pET32a 또는 pTWIN1과 결합하여, 결합 생성물의 단일 균락을 픽킹 및 감정하였다.
각각 NdeI와 EcoRI로 TRAIL-Mu3 목적 단편과 벡터 pET32a 또는 pTWIN1을 이중 효소 절단하였다. TRAIL-Mu3 단편을 Trx 융합 태그 서열이 절제된 벡터 pET32a 또는 Intein 서열이 절제된 벡터 pTWIN1과 결합시키고, Top10 형질전환 수용성(competent) 세포에 전환 도입시킨 후, 단일 클론을 픽킹하여, XbaI과 EcoRI로 이중효소절단 감정하였다. TRAIL-Mu3 목적 단편은 실시예 2로부터 얻은 것이고, 벡터 pET32a 또는 pTWIN1은 실험실에서 자체적으로 준비하였다.
실험 단계
一. 목적 단편 TRAIL-Mu3과 pET32a 또는 pTWIN1 플라스미드의 이중효소절단 후 결합(Ligation)
1. NdeI과 EcoRI로 벡터와 목적 유전자 단편을 이중효소절단한다. 효소절단 체계는 표 5를 참조하며, 반응체계는 100㎕이다.
TRAIL-Mu3과 pET32a 또는 pTWIN1의 이중효소절단 반응체계(100㎕)
시약 부피
DNA명칭 pET32a 또는 pTWIN1 플라스미드 TRAIL-Mu3 DNA
DNA 50㎕ 45㎕
NdeI 5㎕ 3㎕
EcoRI 5㎕ 3㎕
10×H Buffer 10㎕ 10㎕
dH2O 30㎕ 39㎕
2. Ep관을 다용도 인큐베이터에 담고, 30℃에서 2시간 동안 인큐베이팅한다.
3. OMEGA의 겔 회수 키트로 겔 회수를 실시하고, 벡터와 목적 단편은 각각 30㎕의 초순수로 용리한 후, 전기영동 및 사진촬영한다.
4. 겔 회수 목적 단편과 벡터를 결합하며, 결합 체계는 표 6을 참조한다.
TRAIL-Mu3과 pET32a 또는 pTWIN1의 결합 반응체계(10㎕)
시약 반응체계 반응체계
벡터（pET32a） 1㎕ -
벡터（pTWIN1） - 1㎕
TRAIL-Mu3 4㎕ 4㎕
결합효소（sol I） 5㎕ 5㎕
5. 16℃의 금속욕에서 하룻밤동안 인큐베이팅한다.
6. 결합 생성물 10㎕을 100㎕의 Top 10 형질전환 수용성(competent) 세포에 투입하여 30min 동안 빙욕시킨다.
7. 42℃ 수욕에서 90초간 열충격시킨다.
8. 얼음 위에 놓고 2분 동안 인큐베이팅한다.
9. 500㎕의 SOC 배지를 투입하고, 37℃에서 45분 동안 진동 배양한다.
10. 전환된 형질전환 수용성 세포를 원심분리한 후, 슈퍼클린벤치에서, 400㎕을 버리고, 나머지 약 100㎕의 배지는 세균을 균일하게 블로우하여, 모두 Amp를 함유한 LB 고체 배지에 도포하고, 37℃에서 하룻밤 배양한다.
11. 세균을 균일하게 블로우하고, 모두 Amp를 함유한 LB 고체 배지에 도포하여, 37℃에서 하룻밤 배양한다.
二. 단일 균락의 픽킹(picking) 및 효소절단 감정
(1) 단일 균락의 픽킹
1. 다수의 멸균 시험관을 준비하여, 시험관에 암피실린 LB 액체 배지 100ml를 투입한다.
2. 배지를 각 시험관에 약 4ml씩 나누어 담는다.
3. 균락이 생장한 플레이트에, 충분히 달궈진 겸자로 무균 피펫팁을 클램핑하여 플레이트에서 생장한 균락을 픽업하며, pET32a/TRAIL-Mu3 플레이트에서 8개 를 픽킹하거나 또는 pTWIN1/TRAIL-Mu3 플레이트에서 5개를 픽킹한다. 피펫팁을 LB 액체 배지가 담긴 시험관에 투입한다.
4. 각 시험관을 묶은 후, 셰이커 클램프에 담아 충분히 고정시키고, 37℃에서 220rpm으로 하룻밤 진동시킨다.
(2) 플라스미드 추출
1. 균액을 1ml씩 취하여 각각 원심분리관에 담는다. 10000g을 1min 동안 원심분리하여 상청을 최대한 흡취한다.
2. 남은 균체가 침전된 원심분리관에 250㎕의 Solution I(RNAase A 미리 투입)을 첨가하여 세균 침전을 철저히 현탁시킨다.
3. 250㎕의 Solution II을 첨가하고 온화하게 혼합하여 균체를 충분히 분해시킨다. 이때 균액은 맑고 점성이 생기게 되며, 5min 안에 이 단계를 완료한다.
4. 원심분리관에 350㎕의 Solution III을 첨가하고, 즉시 거꾸로 하여 균일하게 혼합한다. 이때 백색의 유모성 침전이 나타나며, 13000g을 10min 동안 원심분리하면, 이때 원심분리관 저부에 침전이 형성된다.
5. 단계 5에서 획득된 상청을 모두 2개의 수집관에 장입된 HiBind Miniprep 흡착 컬럼에 나누어 주입하되, 침전이 흡출되지 않도록 주의한다. 10000g을 1min 동안 원심분리하고, 수집관 중의 폐액을 버린 후, 흡착 컬럼을 수집관에 다시 장입한다.
6. 수집관에 500㎕의 Buffer HB를 주입하고, 10000g을 1min 동안 원심분리한 다음, 수집관 중의 폐액을 버리고, 흡착 컬럼을 수집관에 다시 장입한다.
7. 수집관에 700㎕의 Wash Buffer를 주입하고, 10000g을 1min 동안 원심분리한 다음, 수집관 중의 폐액을 버리고, 흡착 컬럼을 수집관에 다시 장입한다.
8. 단계 7을 반복한다.
9. 흡착 컬럼을 다시 수집관에 장입하고, 13000g을 2min 동안 원심분리하여, 수집관 중의 폐액을 버린다.
10. 각 흡착 컬럼을 새로운 1.5ml Ep관에 담고, 각 흡착막의 중간부위에 65㎕의 Elution Buffer를 공중에서 적가하여, 실온에 몇 분간 방치한 다음, 13000g 이상을 1min 동안 원심분리하고, 플라스미드 용액을 1.5ml의 Ep관에 수집한다.
11. 각각 60㎕의 플라스미드 DNA를 획득하여, -20℃에서 플라스미드를 보관한다.
(3) 효소절단 감정
1. pET32a/TRAIL-Mu3 또는 pTWIN1/TRAIL-Mu3 플라스미드를 XbaI와 EcoRI로 이중효소절단한다. 효소절단 반응체계는 표 7을 참조한다.
pET32a/TRAIL-Mu3 또는 pTWIN1/TRAIL-Mu3 효소절단 반응체계(10㎕)
시약 부피
pET32a/TRAIL-Mu3 플라스미드 5㎕ -
pTWIN1/TRAIL-Mu3 플라스미드 - 5㎕
XbaI 0.5㎕ 0.5㎕
EcoRI 0.5㎕ 0.5㎕
10×M Buffer 1㎕ 1㎕
dH2O 3㎕ 3㎕
2. Ep관을 다용도 인큐베이터에 담고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이팅한다.
3. 효소절단 종료 후 전기영동 감정한다.
(4) 효소절단이 정확하게 이루어진 결합에 성공한 균종을 선택하여, 글리세롤 균종을 보관하고, 서열 분석한다.
실험 결과
一. 이론적으로 TRAIL-Mu3과 pET32a 및 pTWIN1을 NdeI과 EcoRI로 이중효소절단한 후, 크기가 각각 약 500bp, 5.4kb, 6.6kb 정도인 목적 단편을 획득하였으며, 도3에 나타난 바와 같이, 효소절단 후 겔 회수는 모두 예상한 단일 밴드를 획득하였다.
二. TRAIL-Mu3 목적 단편의 각 pET32a 또는 pTWIN1과의 결합 및 전환 결과
1. 플레이트에 균락이 생장하였고, 밀도가 정상이었다.
2. 픽업된 단일 균락은 이튿날 일부 시험관에서 세균이 생장하였고, 밀도가 정상이었다.
3. 효소절단 방법으로 플라스미드를 감정하며, pET32/TRAIL-Mu3 또는 pTWIN1/TRAIL-Mu3 플라스미드를 XbaI과 EcoRI로 이중효소절단 감정하였다. 결합에 성공한 플라스미드는 효소절단 후 5.4Kb 정도 및 6.6Kb 정도의 벡터 단편 및 550bp 정도의 목적 단편이 나타나게 된다. 도 5에 도시된 바와 같이, pTWIN1/TRAIL-Mu3의 3개의 샘플은 양성 클론이고, 도 4에 도시된 바와 같이, pET32a/TRAIL-Mu3의 4개의 샘플은 양성이며, 양성 플라스미드를 베이징 유전체학 연구소(BGI)로 보내 서열 분석하고, 서열이 완전히 정확한 플라스미드 균종을 보관하였다.
실시예 4
pTWIN1/TRAIL-Mu3 또는 pET32a/TRAIL-Mu3 발현 실험
실시예 3에서 획득한 서열 분석이 정확한 플라스미드를 수용성(competent) 대장균 BL21(DE3)으로 전환시키고, 각각 하나의 단일균을 취하여 발현 실험을 실시하고 발현 효과를 고찰하였다.
실험단계
一. 플라스미드 전환 및 균종의 보관
1. LB 배지 100ml를 제조하여 121℃에서 20min 동안 멸균한다.
2. pTWIN1/TRAIL-Mu3 또는 pET32a/TRAIL-Mu3 플라스미드를 각각 1㎕씩 취하여 100㎕의 BL21(DE3) 형질전환 수용성 세포에 투입하고, 30min 동안 빙욕시킨다.
3. 42℃ 수욕에서 90초간 열충격시킨다.
4. 얼음 위에 놓고 3분 동안 인큐베이팅한다.
5. 20㎕의 전환된 형질전환 수용성 세포를 모두 Amp를 함유한 LB 고체 배지에 도포하여, 37℃에서 하룻밤 배양한다.
6. 이튿날 플레이트에 균락이 생장한 후, 플레이트에서 하나의 단일 균락을 픽킹하여 50ml의 LB(Amp+)에 투입하고, 37℃에서 하룻밤 배양한다.
7. 글리세롤 균 20가지를 보관한다. 글리세롤 종농도는 15%이며, -20℃에서 보관한다.
二. 균종의 발현
1. 하룻밤 배양한 pTWIN1/TRAIL-Mu3 또는 pET32a/TRAIL-Mu3 배양액을 취하여 각각 1000㎕씩 50ml의 LB(Amp+) 배지에 접종한다. 접종 후 37℃에서, 250rpm으로 3h 동안 요동 배양 후, 배양 온도를 24℃로 낮춘다. 1%의 비율로 0.1M의 IPTG를 첨가하여 배양을 유도하며, 유도 전 0.5ml의 샘플을 취하여 원심분리시켜 상청을 제거하고, 50㎕의 H20를 첨가하여 재현탁 후, 50㎕의 2×loading buffer를 첨가하여 유도 후 전기영동 샘플을 제조한다.
2. 하룻밤 유도 후 균을 회수하여, A600값을 검출하고, 150㎕의 샘플을 취하여 원심분리시켜 상청을 제거한 다음, 50㎕의 H20를 첨가하여 재현탁 후, 50㎕의 2×loading buffer를 첨가하여 유도 후 전기영동 샘플을 제조하며, 나머지 균액은 5430R형 원심분리기를 이용하여, 12000rpm으로 5min 동안 원심분리시킨다.
3. 50ml의 배양액을 원심분리시켜 균체를 획득하고, 8ml의 50mM Na2HPO4 용액으로 재현탁한 후, 초음파로 세균 파쇄를 실시한다. 세균 파쇄 조건은 Φ6 프로브, 200W 펄스로 2초간 세균 파쇄 후 2초 중지하며 총 10min 동안 순환 반복한다.
4. 세균 파쇄액을 1ml 취하여 12000rmp으로 10min 동안 원심분리시키고, 상청과 침전을 분리하여, 침전은 1ml의 H2O로재현탁하고, 상청과 침전 재현탁액을 각각 20㎕씩 취하여, 30㎕의 H2O 및 50㎕의 2×loading buffer를 첨가하여 전기영동 샘플을 제조한다.
5. 제조된 전기영동 샘플을 비등수욕에서 10min 동안 처리하고, 5430R형 원심분리기와 A-45-30-11형 로터를 이용하여 12000rpm으로 10min 동안 원심분리하고, 각각 상청 10㎕씩을 취하여 전기영동한다.
실험 결과
실험 전기영동도는 도 6(pTWIN1/TRAIL-Mu3), 도 7(pET32a/TRAIL-Mu3)을 참조하면 모두 비교적 강한 발현이 있을 뿐만 아니라, 대부분의 발현 생성물은 세균 파쇄 후 상청에서 가용성 발현비율이 높았다.
실시예 5
TRAIL-Mu3 단백질의 정제 제조
TRAIL-Mu3의 다량의 랩스케일(lab scale) 공정에 대한 탐색에 따라, 우리는 TRAIL-Mu3 단백질 정제 공정을 구축하였으며, SP-HP 양이온교환, 수산화인회석, 음이온 교환 침투 3 단계법을 이용하여 TRAIL-Mu 단백질을 회분(batch) 정제하여 체내외 활성 분석용 샘플을 획득하였다.
실험 단계
一. 균체 파쇄 및 원심분리
1. 10g의 TRAIL-Mu3 발현 균체를 취하여, Na2CO3, 글리세롤, Tween 20, DTT 및 NaCl을 첨가하여, 상기 물질의 종농도가 각각 20mM, 5%, 0.1%, 1mM, 500mM이 되도록 하고, H2O를 별도로 첨가하여 총 부피가 80ml에 이르도록 한다.
2. 균액을 초음파로 세균 파쇄하며, 세균 파쇄 조건은 Φ10 프로브, 500W 펄스로 2초간 세균 파쇄 후 2초 중지하며 총 15min 동안 세균을 파쇄한다.
3. 5430R형 원심분리기와 F-35-6-30형 로터를 이용하여 7850rpm으로 40min 동안 원심분리하고, 상청을 취하여 0.45㎛의 여과막으로 여과한 후 컬럼 로딩 샘플로 사용한다.
二. 단백질 정제용액 및 컬럼 준비
1. 이하 용액을 제조한다.
(1) 양이온 교환 완충액 A: 20mM의 Na2CO3-NaHCO3, 0.5M의 NaCl, 5%의 글리세롤, 0.1%의 Tween 20, 1mM의 DTT, pH를 10.40으로 조절한다.
(2) 양이온 교환 완충액 B: 20mM의 Na2CO3-NaHCO3, 1.5M의 NaCl, 5%의 글리세롤, 0.1%의 Tween 20, 1mM의 DTT, pH를 10.20으로 조절한다.
(3) 0.5M의 NaOH.
(4) 2M의 NaCl.
(5) 수산화인회석 예비 평형화 용액(pre-equilibration solution): 500mM의 Na2HPO4-NaH2PO4, pH를 7.0으로 조절한다.
(6) 수산화인회석 평형화 용액: 10mM의 Na2HPO4-NaH2PO4, 6ppm의 Ca2+, pH를 7.0으로 조절한다.
(7) SNS 완충액: 25mM의 Tris, 25mM의 NaCl, 10mM의 Na2HPO4-NaH2PO4,pH를 7.75로 조절한다.
(8) 수산화인회석 완충액 A: 10mM의 Na2HPO4-NaH2PO4,15ppm의 Ca2+, pH를 7.0으로 조절한다.
(9) 수산화인회석 완충액 B: 10mM의 Na2HPO4-NaH2PO4,15ppm의 Ca2+, 1.5M의 NaCl, pH를 7.0으로 조절한다.
(10) 음이온교환 완충액: 20mM의 Na2HPO4-NaH2PO4, 0.06M의 NaCl, 0.3M의 글리신, pH를 7.0으로 조절한다.
(11) 희석액: 15mM의 Na2HPO4-NaH2PO4,9ppm의 Ca2+, pH를 4.5으로 조절한다.
2. SP Sepharose Fast Flow 겔 크로마토그래피 컬럼을 사용하여, 5CV 순수로 컬럼상의 잔존 에탄올을 세정한 다음, 5CV의 상응하는 평형화 완충액으로 평형화한다.
3. MPC HCT XK16 Grad 겔 크로마토그래피 컬럼을 사용하여, 1CV 순수로 컬럼 상의 NaOH를 세정하여 희석시킨 다음, 5CV 예비 평형화 완충액으로 평형화하고, 평형화 완충액으로 평형화한다.
4. Sephadex G-25 medium 겔 크로마토그래피 컬럼을 사용하여, 5CV 순수로 컬럼상의 잔존 에탄올을 세정한 다음, 5CV의 음이온교환 완충액으로 평형화한다.
5. Q Sepharaose Fast Flow 겔 크로마토그래피 컬럼을 사용하여, 5CV 순수로 컬럼상의 잔존 에탄올을 세정한 다음, 5CV의 음이온교환 완충액으로 평형화한다.
三. 양이온교환 정제
이하 정제 단계에 따라 양이온교환 정제를 실시한다. 정제 기산 동안 모든 침투 및 용리 성분을 수집하여 전기영동 분석용으로 준비한다.
1. 평형화: 양이온교환 A 완충액으로 SP Sepharose Fast Flow 크로마토그래피 컬럼을 UV 안정화될 때까지 평형화한다.
2. 샘플 제조 및 샘플 로딩: 파쇄 세균을 취하여 상청을 원심분리시키고, 샘플을 로딩한다.
3. 세정: 2CV의 양이온교환 완충액 A로 컬럼을 세척하여 잔류 미결합 단백질을 제거한다.
4. 용리: 3CV의 양이온교환 완충액 B를 이용하여 목적 단백질을 용리시킨다.
5. NaOH 세정: 2CV의 0.5M NaOH 용액으로 컬럼을 세척한다.
6. 재평형화(Reequilibration): 5CV의 양이온교환 완충액 A를 이용하여 컬럼을 재평형화한다.
四. 수산화인회석의 정제
이하 정제 단계에 따라 수산화인회석을 정제한다. 정제 기간 동안 모든 침투 및 용리 성분을 수집하여 전기영동 분석용으로 준비한다.
1. 평형화: 수산화인회석 평형화 완충액을 사용하여 MPC HCT XK16 Grad 크로마토그래피 컬럼을 UV 안정화될 때까지 평형화한다.
2. 샘플 제조 및 샘플 로딩: 양이온 교환 용리액 샘플을 취하여, 2배 희석액을 첨가하여, 500mM의 NaCl이 함유된 샘플로 희석하고 로딩한다.
3. 세정: 2CV의 수산화인회석 평형화 완충액으로 컬럼을 세척하여 잔류 미결합 단백질을 제거한다.
4. SNS: 6CV의 SNS 완충액으로 컬럼을 세척하고 pH를 제어한다.
5. NaCl의 용리: 2CV의 수산화인회석 완충액 A를 사용하여 컬럼을 평형화한 후, 5CV의 수산화인회석 완충액 B로 목적 단백질을 용리한다.
6. 인산 래디컬 용리: 2CV의 수산화인회석 평형화 완충액으로 컬럼 상의 NaCl에 의해 용리되지 않은 단백질 또는 불순물을 평형화한다.
7. 물세척: 0.5CV의 무균수로 컬럼을 세척하고, 인산삼나트륨 침전이 형성되는 것을 방지한다.
8. NaOH 세정: 5CV의 0.5M NaOH 용액으로 나머지 불순물을 용리하고 컬럼을 보관한다.
五. 음이온교환 정제
이하 정제 단계에 따라 양이온교환 정제를 실시한다. 정제 기간 동안 모든 침투 및 용리 성분을 수집하여 전기영동 분석용으로 준비한다.
1. 평형화: 음이온교환 완충액으로 Q Sepharose Fast Flow 크로마토그래피 컬럼을 UV 안정화될 때까지 평형화한다.
2. 샘플 제조 및 샘플 로딩: 수산화인회석 정제 용리 샘플을 취하여, Sephadex G-25 medium 크로마토그래피 컬럼을 통해 완충액을 음이온교환 완충액으로 치환 후, 샘플을 로딩한다.
3. 평형화 용액 세정: 1CV의 음이온교환 완충액으로 컬럼을 세척하여 컬럼에미결합된 목적 단백질을 제거한다.
4. NaCl 세정: 2CV의 2M NaCl로 컬럼을 세척하여 컬럼에 결합된 단백질을 제거한다.
5. NaOH 세정: 2CV의 0.5M NaOH 용액으로 컬럼을 세척한다.
6. 재평형화(Reequilibration): 음이온교환 완충액을 이용하여 컬럼을 재평형화한다.
실험 결과
각 단계의 정제과정에서 샘플의 전기영동 결과는 도 8, 9, 10을 참조한다. 제 1 단계에서 농도가 2.273mg/ml인 SP의 용리액 15ml를 수집한 결과, 목적 단백질의 순도가 이미 매우 높게 검출되었으며, 제 2단계에서 농도가 2.080mg/ml인 수산화인회석 용리액 12ml을 수집한 결과, 잔여 불순물 단백질과 일부 발열원이 제거되는 작용이 있었으며, 제 3단계에서 농도가 0.846mg/ml인 음이온 교환 침투액 20ml은 주로 발열원을 제거하였다. 본 실시예의 실험 조작을 여러 차례 반복하여 체외 생물학적 활성 평가를 하기에 충분한 단백질량을 획득하였다.
실시예 6
TRAIL-Mu3 단백질의 Western Blot 검출
TRAIL-Mu3은 야생형 TRAIL N단의 5개 위치점을 돌연변이시켜 획득한 것이므로, TRAIL의 항원 결정요인이 여전히 남아있어 TRAIL의 다중클론성 항체와 특이성 결합을 일으킬 수 있으며, 따라서 TRAIL 다중클론성 항체를 이용하여 검출 감정을 실시할 수 있다.
실험 단계
一. 샘플 제조
1. 실시예 5로 정제된 TRAIL-Mu3 단백질을 -20℃로부터 해동시킨 후, 제공되는 농도에 따라 초순수를 사용하여 1mg/ml농도로 희석시킨다. 샘플 50㎕을 취하여 50㎕의 2×loading buffer를 첨가하여 전기영동 샘플을 제조한다. 각각 10㎕씩 취하여 전기영동하며, 즉 샘플 로딩량은 5ug이다.
2. 대조샘플인 TRAIL-20131204 동결건조품(실험실 자체 준비)을 1ml의 PBS로 용해시키고, 샘플 50㎕을 취하여 50㎕의 2×loading buffer를 첨가하여 전기영동 샘플을 제조한다. 각각 10㎕씩 취하여 전기영동하며, 즉 샘플 로딩량은 5ug이다.
二. 검출 과정
샘플을 15%의 SDS-PAGE 전기영동으로 분리 후, PVDF막으로 전이시킨다. 먼저 4℃에서 밀봉하여 하룻밤 지난 후, 1차 항체[토끼 항 인체(1:500)]와 실온에서 2시간 동안 인큐베이팅한 다음, 2차 항체[양 항 토끼 IgG-HRP(1:5000)]와 실온에서 2시간 동안 인큐베이팅하고, 마지막으로 증강형 화학발광(ECL)을 이용하여 검출한다. 구체적인 단계는 다음과 같다.
1. 15%의 SDS-PAGE 전기영동으로 단백질을 분리하고; 겔을 추출하여 겔의 가장자리를 제거하고, 15min 동안 TBST 완충액에 침지시킨다.
2. PVDF막을 사용한 막전이(습식 전이): PVDF막을 사용하기 전 반드시 15초간 메탄올에 약간 적신 다음 증류수에 1~3min 동안 침지시키고, 이어서 막전이 완충액에서 평형화시킨다. 막전이 클립에 부극에서 정극까지 순차적으로 스폰지 패드, 여과지(4~8장), 목적 겔, PVDF막, 여과지(4~8장), 스폰지 패드를 깔고, 기포를 배출한 후, 클립을 단단히 조여 막전이 탱크에 담는다. 전압은 40v이고 시간은 45min이다.
3. 막 밀봉: 막을 밀봉액(3%의 BSA)에서 4℃ 조건 하에 밀봉시켜 하룻밤 지난 후, 이튿날 취출하여 실온에서 30min 동안 요동하고, 비특이성 결합 위치점을 밀봉한다.
4. 1차 항체 인큐베이션: 일차 항체를 밀봉액으로 작업농도[토끼 항 인체 TRAIL 다중클론성 항체(1:500)]까지 희석시키고, 막과 함께 요동하여 실온에서 2h 동안 인큐베이팅한다.
5. 막 세정: TBST로 회당 10min간 세정한다. 10×10cm의 막은 세척액이 50ml 이상 필요하다.
6. 2차 항체 인큐베이션: HRP 표기된 2차 항체를 밀봉액으로 작업농도[양 항 토끼 IgG-HRP(1:5000)]까지 희석시키고, 막과 함께 요동시켜 실온에서 2h 동안 인큐베이팅한다.
7. 막 세정: TBST로 회당 10min간 3회 세정한다. 10×10cm의 막은 세척액이 50ml 이상 필요하다.
8. 발색:(1) 등부피의 Solution A와 Solution B를 혼합하여 충분한 검출 혼합액(0.125ml/cm2) 을 제조한다. 검출 혼합액은 제조 후 즉시 사용하며, 실온에서 1h 내에 안정을 유지할 수 있다. (2) 세정을 거친 블로팅 막에 남은 여분의 세정액을 제거하되, 막을 건조시키지 않아야 한다. 단백질이 있는 막의 일면에 검출 혼합액을 부가하고, 남은 검출 혼합액을 제거한 후, 코닥 겔 이미징 Image Station 4000R에 놓고 X-ray로 노광시킨다. 1차 노광시간은 1min을 선택하고, 이미지 결과에 따라 노광 시간을 조정한다. 컴퓨터로 이미지를 기록한다.
9. 결과 판단: 양성 결과는 뚜렷한 색 밴드가 나타나고, 음성 결과는 발색이 없다.
실험 결과
도 11에 나타난 바와 같이, TRAIL-Mu3 및 TRAIL 대조품은 양성반응을 나타내고, 음성 대조품은 음성 반응을 나타내었다.
실시예 7
단백질 TRAIL-Mu3 및 TRAIL 생물활성 분석
CCK-8 검출 키트를 응용하여 TRAIL-Mu3 및 야생형 TRAIL 2개의 단백질 샘플의 32개 종양세포주에 대한 체외 항증식 활성 IC50 값을 검출하여 그 체외 생물활성을 평가하였다.
재료와 방법
검출용 세포주의 공급처는 모두 중국 과학원 상하이 세포 뱅크 또는 미국 ATCC이다.
세포주 명칭 세포 공급처
1 췌장암 세포
（5）		 MIAPaCa-2 미국 ATCC로부터 구입
2 CFPAC-1 중국 과학원 상하이 세포뱅크로부터 구입
3 Panc 05.04 미국 ATCC로부터 구입
4 BxPC-3 중국 과학원 상하이 세포뱅크로부터 구입
5 PANC-1 중국 과학원 상하이 세포뱅크로부터 구입
6 폐암 세포
（5）		 NCI-H460 중국 과학원 상하이 세포뱅크로부터 구입
7 A 549 중국 과학원 상하이 세포뱅크로부터 구입
8 NCI-H522 미국 ATCC로부터 구입
9 H146 미국 ATCC로부터 구입
10 NCI-H226 미국 ATCC로부터 구입
11 결(직)장암 세포（5） HCT-15 중국 과학원 상하이 세포뱅크로부터 구입
12 COLO 205 중국 과학원 상하이 세포뱅크로부터 구입
13 SW620 중국 과학원 상하이 세포뱅크로부터 구입
14 HT-29 중국 과학원 상하이 세포뱅크로부터 구입
15 HCT 116 중국 과학원 상하이 세포뱅크로부터 구입
16 유선암 세포
（5）		 MDA-MB-435s 미국 ATCC로부터 구입
17 MDA-MB-231 미국 ATCC로부터 구입
18 MCF-7 미국 ATCC로부터 구입
19 T47D 미국 ATCC로부터 구입
20 ZR-75-1 중국 과학원 상하이 세포뱅크로부터 구입
21 골수유래 종양세포（6） Molt4 미국 ATCC로부터 구입
22 K562 중국 과학원 상하이 세포뱅크로부터 구입
23 RPMI8226 미국 ATCC로부터 구입
24 HL-60 중국 과학원 상하이 세포뱅크로부터 구입
25 L540cy 중국 과학원 상하이 세포뱅크로부터 구입
26 OPM-2 중국 과학원 상하이 세포뱅크로부터 구입
27 뇌종양 세포
（3）		 U87-MG 미국 ATCC로부터 구입
28 SH-Sy5y-2 미국 ATCC로부터 구입
29 U251 미국 ATCC로부터 구입
30 골, 연골 종양세포
（3）		 U-20S 미국 ATCC로부터 구입
31 SaoS-2 미국 ATCC로부터 구입
32 HT1080 중국 과학원 상하이 세포뱅크로부터 구입
시약과 소모재
Cell Counting Kit-8(Cat# CK04-13, Dojindo)
96-well 배양판(Cat#3599, Corning Costar)
소태아혈청(Cat#10099-141, GIBCO)
배지(GIBCO로부터 구입)
데스크탑식 마이크로플레이트 리더 SpectraMax M5 Microplate Reader(Molecular Devices)
2개의 단백질 샘플: 실시예 5를 통해 제조하거나 실험실에서 자체적으로 준비한다.
실험 단계
1. 시약 제조
배지의 제조
세포주 명칭 배지 및 배양 조건 접종 밀도
1 췌장암 세포（5） MIAPaCa-2 DMEM＋10%FBS＋2.5% horse serum；CO2，5%；37.0℃ 5 x103/well
2 CFPAC-1 IMDM＋10%FBS；CO2，5%；37.0℃ 7 x103/well
3 Panc 05.04 RPMI-1640＋15%FBS＋10ug/mL human recombinant insulin＋4.5g/L glucose；CO2， 5%；37.0℃ 4.5 x103/well
4 BxPC-3 RPMI-1640＋10%FBS＋1mM sodium pyruvate；CO2，5%；37.0℃ 4x103/well
5 PANC-1 DMEM＋10%FBS；CO2，5%；37.0℃ 5 x103/well
6 폐암
세포（5）		 NCI-H460 RPMI-1640＋10% FBS；CO2，5%；37.0℃ 8 x103/well
7 A 549 DMEM＋10%FBS；CO2，5%；37.0℃ 5 x103/well
8 NCI-H522 RPMI-1640＋10% FBS；CO2，5%；37.0℃ 8 x103/well
9 H146 RPMI-1640＋10% FBS；CO2，5%；37.0℃ 12 x103/well
10 NCI-H226 RPMI-1640＋10% FBS；CO2，5%；37.0℃ 8 x103/well
11 결(직)장암 세포（5） HCT-15 RPMI 1640＋10% FBS；CO2，5%；37.0℃ 4 x103/well
12 COLO 205 RPMI 1640＋10% FBS；CO2，5%；37.0℃ 20 x103/well
13 SW620 Leibovitz's L-15＋10%FBS；without CO2，37.0℃ 8 x103/well
14 HT-29 DMEM＋10% FBS；CO2，5%；37.0℃ 5 x103/well
15 HCT 116 DMEM＋10% FBS；CO2，5%；37.0℃ 4 x103/well
16 유선암 세포（5） MDA-MB-435s RPMI-1640＋10% FBS；CO2，5%；37.0℃ 8 x103/well
17 MDA-MB-231 RPMI-1640＋10% FBS ; CO2, 5%; 37.0℃ 8 x103/well
18 MCF-7 RPMI-1640＋10% FBS；CO2，5%；37.0℃ 8 x103/well
19 T47D RPMI-1640＋10% FBS+ 0.2 Units/ml bovine insulin；CO2，5%；37.0℃ 10 x103/well
20 ZR-75-1 RPMI-1640＋10% FBS；CO2，5%；37.0℃ 8 x103 /well
21 골수유래
종양세포
(6）		 Molt4 IMDM＋20%FBS；CO2，5%；37.0℃ 13 x103/well
22 K562 RPMI-1640＋10%FBS＋1mM sodium pyruvate；CO2，5%；37.0℃ 7 x103/well
23 RPMI8226 MEM＋10%FBS＋1mM sodium pyruvate；CO2，5%；37.0℃ 6 x103/well
24 HL-60 EMEM＋10% FBS；CO2，5%；37.0℃ 10 x103/well
25 L540cy MEGM＋100ng/ml cholera toxin；CO2，5%；37.0℃ 6 x103/well
26 OPM-2 DMEM＋10%FBS；CO2，5%；37.0℃ 8 x103/well
27 뇌종양 세포（3） U87-MG IMDM＋20%FBS；CO2，5%；37.0℃ 8 x103/well
28 SH-Sy5y-2 DMEM＋10%FBS ; CO2, 5%; 37.0℃ 8 x103/well
29 U251 EMEM＋10% FBS；CO2，5%；37.0℃ 10 x103/well
30 골연골 종양세포（3） U-20S IMDM＋20%FBS；CO2，5%；37.0℃ 8 x103/well
31 SaoS-2 RPMI-1640＋10%FBS＋1mM sodium pyruvate；CO2，5%；37.0℃ 7 x103/well
32 HT1080 MEM＋10%FBS＋1mM sodium pyruvate；CO2， 5%；37.0℃ 6 x103/well
단백질 샘플의 제조
무균의 PBS 완충액으로 2개의 단백질 샘플을 종농도가 5mg/ml이 되도록 희석하고, 여과하여 세균을 제거한다.
2. IC50 실험
a) 대수(logarithmic) 생장기 세포를 수집하고 계수하여, 완전한 배지로 세포를 재현탁하고, 세포 농도를 적합한 농도(세포 밀도 최적화 실험 결과에 따라 결정한다)로 조정하여, 96-well 플레이트에 접종하며, 각 웰당 100㎕의 세포 현탁액을 투입한다. 세포(5%의 CO2를 필요로하지 않는 SW620 세포 제외)는 37℃, 100%의 상대습도로, 5%의 CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 인큐베이팅한다.
b) 무균 PBS 완충액으로 검출할 단백질 샘플을 5mg/ml로 희석한 후 8회 구배(gradient) 희석하고, 25㎕/well로 세포를 주입한다. 화합물의 종농도는 1mg/ml로부터 0까지, 총 10개의 농도점으로 3배 구배 희석시키고; 초보적인 실험 결과에 따라, 단백질 샘플의 작용 종농도를 상응하게 조정한다.
c) 세포(5%의 CO2를 필요로하지 않는 SW620 세포 제외)는 37℃, 100%의 상대습도로, 5%의 CO2 인큐베이터에서 48시간 동안 인큐베이팅한다.
d) 배지를 흡착 폐기하고, 10%의 CCK-8이 함유된 완전한 배지를 투입하여 37℃의 인큐베이터에 넣고 2-4시간 동안 인큐베이팅한다.
e) 가볍게 진동시킨 후 SpectraMax M5 Microplate Reader에서 450nm 파장 부위의 흡광도를 측정하고, 650nm 부위의 흡광도를 기준으로 억제율을 계산한다.
3. 데이터 처리
하기 식으로 약물의 종양 세포 생장에 대한 억제율을 계산한다: 종양세포 생장 억제율 %=[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100%
As: 샘플의 OA/RLU(세포 + CCK-8 + 측정할 화합물)
Ac: 음성 대조의 OA/RLU(세포 + CCK-8)
Ab: 양성 대조의 OA/RLU(배지 + CCK-8)
소프트웨어 Graphpad Prism 5를 운용하고, 계산공식 log(inhibitor) vs. normalized response-Variables slope을 이용하여 IC50 곡선 피팅을 실시하여 IC 50값을 산출한다.
실험 결과
본 실험은 2개의 단백질 샘플(TRAIL-Mu3와 야생형 TRAIL)의 5개의 췌장암 세포주(MIAPaCa-2, CFPAC-1, Panc 05.04, BxPC-3,PANC-1), 5개의 폐암 세포주(NCI-H460,A549, NCI-H522, H146, NCI-H226), 5개의 결(직)장암 세포주(HCT-15, COLO 205, SW620, HT-29, HCT 116), 5개의 유선암 세포주(MDA-MB-435s, MDA-MB-231, MCF-7, T47D, ZR-75-1), 6개의 골수유래 종양세포주(Mo1t4, K562, RPMI8226, HL-60, L540cy, OPM-2), 3개의 뇌종양 세포주(U87-MG, SH-Sy5y-2, U251) 및 3개의 골, 연골 종양세포주(U-20S, SaoS-2, HT1080)에 대한 체외 항세포증식 활성을 테스트하였다. 실험 결과는 아래 표와 같다.
32주 종양세포의 IC50값 비교（㎍/mL）
세포 종류 세포주 TRAIL-Mu3 TRAIL
1 췌장암 세포（5） MIAPaCa-2 0.0004157 0.008
2 CFPAC-1 0.08251 ＞100
3 Panc 05.04 0.004653 0.015
4 BxPC-3 0.04881 ＞100
5 PANC-1 0.00281 ＞100
6 폐암 세포（5） NCI-H460 0.002388 0.002
7 A 549 4.12 ＞100
8 NCI-H522 8.156 ＞100
9 H146 3.002 ＞100
10 NCI-H226 ＞10 ＞100
11 결(직)장암 세포
（5）		 HCT-15 0.000792 0.008
12 COLO 205 0.002134 0.008
13 SW620 0.001869 0.008762
14 HT-29 0.03005 ＞100
15 HCT 116 0.001543 0.015
16 유선암 세포（5） MDA-MB-435s 0.0005316 0.001
17 MDA-MB-231 0.004246 0.003
18 MCF-7 0.0006789 ＞100
19 T47D ＞10 ＞100
20 ZR-75-1 0.01776 ＞100
21 골수유래 종양세포（6） Molt4 0.001837 ＞100
22 K562 0.01147 ＞100
23 RPMI8226 0.1512 ＞100
24 HL-60 0.1174 1.465
25 L540cy 0.4588 ＞100
26 OPM-2 ＞10 ＞100
27 뇌종양 세포（3） U87-MG ＞10 ＞100
28 SH-Sy5y-2 ＞10 ＞100
29 U251 ＞10 ＞100
30 골연골 종양세포
（3）		 U-20S ＞10 ＞100
31 SaoS-2 0.01985 ＞100
32 HT1080 0.005441 0.02901
실험 결과
TRAIL 막투과 펩타이드 유사 돌연변이체인 TRAIL-Mu3를 TRAIL 야생형 단백질과 비교해보면, 검출된 거의 모든 종양세포 유형에서(다소간의 결(직)장암 세포, 다수의 폐암 세포, 다수의 췌장암 세포, 다수의 유선암 세포, 다수의 골수유래 종양세포, 다수의 골, 연골세포 포함) 항종양 활성이 모두 뚜렷하게 향상되었고, 특히 TRAIL 야생형 단백질 약물 내성을 지닌 종양 세포주에 대하여, 이러한 세포들의 TRAIL 야생형 단백질에 대한 저항을 뚜렷하게 역전시킬 수 있어, 보다 강한 치료작용을 지닌다.
이상의 설명은 단지 본 발명의 바람직한 실시예일뿐, 결코 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니며, 본 발명의 정신과 원칙 안에서 실시되는 모든 수정, 동등한 치환, 개선 등은 모두 본 발명의 보호범위 내에 포함되어야 한다.
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Claims (9)

  1. TRAIL 막투과 펩타이드 유사 돌연변이체에 있어서,
    상기 돌연변이체는 TRAIL 야생형 단백질 세포막 외부 단편(fragment) 중 114~121번째 자리의 아미노산 코딩 서열을 VRERGPQR로부터 RRRRRRRR로 선택적으로 개조하여, 114번째 자리는 발린으로부터 아르기닌으로 돌연변이시키고, 116번째 자리는 글루타메이트로부터 아르기닌으로 돌연변이시키며, 118번째 자리는 글리신으로부터 아르기닌으로 돌연변이시키고, 119번째 자리는 프롤린으로부터 아르기닌으로 돌연변이시키며, 120번째 자리는 글루타민으로부터 아르기닌으로 돌연변이시켜, 돌연변이체 단백질의 N단이 연속되는 8개의 아르기닌 코딩 서열을 이루도록 함으로써, 막투과 펩타이드 유사 구조를 포함하는 단백질을 형성하는, 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 2인 TRAIL 막투과 펩타이드 유사 돌연변이체.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 돌연변이체를 인코딩하는 cDNA 서열은 SEQ ID NO: 1인 것을 특징으로 하는 TRAIL 막투과 펩타이드 유사 돌연변이체.
  4. TRAIL 막투과 펩타이드 유사 돌연변이체의 제조방법에 있어서,
    A. cDNA 단편의 증폭과 클로닝;
    B. 발현 벡터의 구축과 확인;
    C. 재조합 TRAIL 단백질의 융합 및 발현;
    D. TRAIL 단백질의 정제;
    E. TRAIL 단백질의 확인;의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제1항의 TRAIL 막투과 펩타이드 유사 돌연변이체의 제조방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    단계 B에서, 상기 발현 벡터의 구축과 확인 단계는
    B1. 원핵(prokaryotic) 발현 벡터 중 대응되는 융합 태그 서열을 잘라내는 단계;
    B2. 최적화 후 TRAIL 막투과 펩타이드 유사 돌연변이체 단백질을 인코딩하는 cDNA 서열을 원핵 발현 벡터에 클로닝하여 고효율의 가용성 비융합 발현을 획득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 TRAIL 막투과 펩타이드 유사 돌연변이체의 제조방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    단계 B1에서, 상기 원핵 발현 벡터는 pET32a 또는 pTWIN 1인 것을 특징으로 하는 TRAIL 막투과 펩타이드 유사 돌연변이체의 제조방법.
  7. 제 4항에 있어서,
    단계 C에서, 상기 재조합 단백질의 발현 시, 유도 온도는 18~24℃인 것을 특징으로 하는 TRAIL 막투과 펩타이드 유사 돌연변이체의 제조방법.
  8. 제 4항에 있어서,
    단계 D에서, 상기 TRAIL 단백질의 정제 단계는
    D1. 양이온 교환수지를 제1 단계 정제에 사용하여 세균 파쇄 후 상청액 중의 목적 단백질을 포착하는 단계;
    D2. 수산화인회석 수지를 제 2단계 중등도 정제에 사용하여 단백질 순도를 더 높이고 내독소를 제거하는 단계;
    D3. 음이온 교환수지를 최종 단계의 미세 정제에 사용하여 제품이 공업화 확대 및 향후 임상응용 수요를 만족시키도록 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 TRAIL 막투과 펩타이드 유사 돌연변이체의 제조방법.
  9. 제 1항 또는 제 3항의 TRAIL 막투과 펩타이드 유사 돌연변이체를 함유하는 항종양제.
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