CN102021173B

CN102021173B - 可溶性截短的人trail活性蛋白的制备方法

Info

Publication number: CN102021173B
Application number: CN2010102430896A
Authority: CN
Inventors: 王行国; 叶青; 陈凡
Original assignee: Hubei University
Current assignee: Hubei University
Priority date: 2010-07-30
Filing date: 2010-07-30
Publication date: 2012-11-07
Anticipated expiration: 2030-07-30
Also published as: CN102021173A

Abstract

本发明提出了一种可溶性截短的人TRAIL蛋白的制备方法，其步骤为：A)、根据Genebank发表的人TRAIL蛋白可溶性蛋白的氨基酸序列，按细菌遗传密码的偏好性设计并合成寡聚DNA单链片段，B)、三次PCR合成完整的双链DNA，C)、利用T-载扩增，并将扩增的双链DNA片段插入表达载体并筛选阳性转化子，D)、截短人TRAIL蛋白在大肠杆菌中低温表达，E)、用三步法对该蛋白纯化，F)、截短人TRAIL蛋白的测定。本发明实现了在大肠杆菌细胞内高效表达截短人TRAIL蛋白及其纯化制备技术，克服了现有技术中易形成不溶性包涵体的问题。该方法操作简单、发酵时间短、纯化容易并保证该蛋白无任何修饰，蛋白达到电泳纯。可以直接用于生化、分子生物学、肿瘤学的研究工作以及肿瘤治疗的临床前期或临床药物的开发。

Description

可溶性截短的人TRAIL活性蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及的是生物工程技术，特别是表达和制备可溶性截短的人TRAIL活性蛋白的方法。

背景技术

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)，亦称凋亡素2配体(Apo2 ligand，Apo2L)。TRAIL是继TNF和FasL之后被发现的第三个肿瘤坏死因子超家族的成员。人的TRAIL基因定位于染色体3q26，全长1769bp，编码281个氨基酸，蛋白相对分子质量为32.5kd，等电点为7.63，其中241个氨基酸位于胞膜外侧，称作可溶性TRAIL片段，功能部位为119-241位氨基酸。膜结合型TRAIL和可溶性TRAIL蛋白在体外均能诱导多种肿瘤细胞凋亡，正常组织对TRAIL蛋白均不敏感。鉴于TRAIL蛋白在肿瘤治疗中的潜在应用价值，人们试图将TRAIL蛋白可溶性片段开发成一种新的抗肿瘤药物。为获取较高纯度的TRAIL蛋白，人们尝试在各种真核或原核表达系统中表达TRAIL蛋白，并带上不同的标签便于纯化。在酵母等真核生物中表达，虽可获得一定量的TRAIL蛋白，但成本较高且容易造成TRAIL蛋白的基团修饰；在大肠杆菌等原核生物中表达，由于过量表达造成蛋白折迭不正常形成包涵体，可溶性蛋白产量很低。包涵体虽可通过变性复性工艺获得复性的TRAIL蛋白，但仅适用于抗体制备而不适宜用作抗肿瘤药物。另外，带有标签的重组TRAIL蛋白虽有利于蛋白的纯化，但最新的研究发现，修饰或加上标鉴可改变TRAIL蛋白的生物学活性和功能，如带His-标签的重组TRAIL蛋白不仅作用于肿瘤细胞而且作用于正常细胞。因此，无论对于开展TRAIL蛋白抗肿癌功能或机理的研究还是开发抗肿瘤药物，制备未修饰、不带任何标签的天然TRAIL蛋白或截短的TRAIL蛋白尤为重要

发明内容

本发明提出了一种在大肠杆菌中高效表达可溶性TRAIL蛋白活性片段的方法和纯化制备技术。根据细菌遗传密码的偏好性人工合成编码截短的人TRAIL蛋白的DNA，插入通用的表达载体，并利用通用的大肠杆菌作宿主在17℃以下低温表达的技术思路，在大肠杆菌细胞内实现了截短的天然人TRAIL蛋白高效表达，克服了常规截短的天然人TRAIL蛋白高效表达时形成大量的不溶性包涵体问题。同时建立了三步法纯化的蛋白制备技术，成功纯化出高纯度的天然可溶性人TRAIL蛋白。

本发明是这样实现的。具体操作步骤为：

A、人工合成编码截短的人TRAIL蛋白的DNA。人工合成24种DNA单链片段。根据Genbank发表的人TRAIL可溶性蛋白的氨基酸序列，按细菌遗传密码的偏好性设计24种寡聚DNA单链片段，并人工合成全部24种DNA单链片段。该片段为12种正链片段，12种负链片段，每种DNA片段约45个核苷酸长，每一片段与相邻片段之间具有8-10个核苷酸的重叠且能相互配对；

B、三轮PCR合成完整的双链DNA片段。将24种DNA单链片段分成2-3组，每组50μl的体系中加入浓度为10μM的每种寡聚DNA单链片段1.5μl、10×PCR反应缓冲液5μl、2.5mM dNTPs 4μl、Taq DNA聚合酶0.4μl，并补加ddH₂O至50μl，进行第一轮PCR。在PCR仪上94℃变性、52℃复性、72℃延伸，共扩增20个循环。使用PCR清洁试剂盒对PCR产物进行回收。每组取2μl第一轮回收的PCR产物，加入10×PCR反应缓冲液5μl、2.5mM dNTPs 4μl、Taq DNA聚合酶0.2μl，并补加ddH₂O至50μl并进行第二轮PCR。在PCR仪上94℃变性、52℃复性、72℃延伸，扩增30个循环。使用PCR清洁试剂盒对PCR产物进行回收。每组取2.5μl第二轮回收的PCR产物，加入10×PCR反应缓冲液5μl、2.5mM dNTPs4μl、带限制性内切酶位点的5’-和3’-端引物各1.5μl、Taq DNA聚合酶0.4μl，并补加ddH₂O至50μl进行第三轮PCR。在PCR仪上94℃变性、52℃复性、72℃延伸，扩增30个循环。使用PCR清洁试剂盒回收PCR产物，得到全长完整的双链DNA片段。

C、利用T-载体扩增，将全长DNA片段克隆并转化：将0.5μl回收的第三轮PCR产物与2μl T-载体连接缓冲液、0.2μl pMD18-T载体DNA混合，加ddH₂O至5μl，混匀后16℃保温4小时。取3μl连接反应液，按常规CaCl₂法转化E.coliTop10。用含有50μg/ml氨苄青霉素的LB平板(蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g、琼脂1.5g、加水至1L、pH7.0)37℃培养12小时筛选阳性菌落。将单个阳性菌落送商业公司检测插入的DNA序列，验证克隆的DNA片段的序列是正确的。

D、在大肠杆菌中高效低温表达截短的人TRAIL蛋白

(1)将测序正确的阳性菌落接种至5ml含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g、加水至1L、pH7.0)中37℃培养12小时，并用质粒DNA抽提试剂盒抽提T-载体重组质粒DNA。将20μl T-载体重组质粒和pET23a表达载体DNA分别与5μl 10×H缓冲液、2μl NdeI、2μl XhoI和21μlddH₂O混合，37℃酶切反应4小时。用1％琼脂糖凝胶电泳分离限制性内切酶消化样品，在紫外灯下用刀片切出目的DNA片段，然后按DNA片段回收试剂盒的方法回收双酶切的编码截短人TRAIL蛋白的DNA片段和表达载体DNA。然后在25μl的体系中，加入2.5μl 10×T4DNA连接酶反应缓冲液，并按1∶5的比例加入限制性内切酶消化过的pET23a质粒DNA和编码截短人TRAIL蛋白的DNA片段，再加入1μl T4DNA连接酶。16℃水浴12小时，使其形成重组表达质粒。

(2)利用常规的CaCl₂法制备E.coli BL21(DE3)感受态细胞，然后将5-10μl上述连接反应混合物与100μl感受态细胞混合，冰浴30分钟。42℃热休克1.5分钟后立即置冰上5分钟。加入900μl新鲜LB培养基后在37℃摇床上培养45分钟，摇床转速为150rpm。然后将细菌涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12小时。平板上长出的单个菌落即为阳性转化子。

(3)将单个的阳性转化子接种到5ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养12小时，活化后菌液按1∶100接入在含有50μg/m1氨苄青霉素的LB培养基的摇瓶中17℃以下摇动培养，摇床转速为250rpm。当OD₆₀₀值达到0.6时加入终浓度为0.5mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导8-20小时。细胞经4500rpm离心15分钟后收集并悬浮在含有1mM DTT和5％甘油的50mMTris-HCl缓冲液中(pH7.4)，超声波破碎，12000rpm离心收集上清液。(4)分别取15μl上清液和沉淀悬浮液上样，经10％SDS-PAGE电泳(120V，1.5小时)后，考马斯亮蓝染色1小时。可溶性TRAIL蛋白占总蛋白的30％以上，且全都位于上清液，沉淀中未见截短人TRAIL蛋白。

E、用三步法对截短的人TRAIL蛋白纯化：

(1)硫酸铵分级分离：在50ml上清粗酶液中加入硫酸铵至终浓度40％，4℃放置2-12小时，12,000rpm离心15分钟，去除沉淀。在离心后的上清液中加入硫酸铵至终浓度60％，4℃放置4-12小时，12,000rpm离心15分钟，移去上清液。用20ml 50mM Tris-HCl(pH7.5)悬浮沉淀物，并用50mM Tris-HCl(pH7.5)4℃透析除去硫酸铵。

(2)离子交换层析：将样品上样至50mM Tris-HCl(pH7.5)平衡的CM-Sepharose阳离子层析柱(柱直径3cm、柱床高15cm)，并用0-0.8M NaCl进行梯度洗脱，流速为2ml/min。自动化收集洗脱峰。目的蛋白经10％SDS-PAGE电泳鉴定。

(3)疏水层析：在上一步纯化后获得的蛋白溶液中加入40％硫酸铵，混匀后直接上样Buty1-Sepharose层析柱(柱直径3cm、柱床高15cm)。上样前用40％(NH₄)₂SO₄-50mM Tris-HCl(pH7.5)缓冲液平衡层析柱。上样后用40％-0硫酸铵进行梯度洗脱，流速为2ml/min。自动化收集洗脱峰，使用10％SDS-PAGE电泳检测鉴定目的蛋白。在实验室摇瓶发酵条件下，从1L培养物中可获得30mg左右纯蛋白。

F、截短人TRAIL蛋白的生物活性测定

用含10％胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5％CO₂条件下培养HepG2肝癌细胞和原代培养的肝细胞。待细胞生长复盖培养瓶底面积85％时收获细胞，并用10％胎牛血清的DMEM培养基重新悬浮至1×10⁴细胞/ml，然后往96孔板中每室加入100μl细胞悬液。在37℃、5％CO₂条件下培养4小时使细胞贴壁。加入纯化的截短人TRAIL蛋白并使其终浓度分别为0-1000ng/ml，同时补入新鲜的含10％胎牛血清的DMEM培养基至总体积180μl，在37℃、5％CO₂条件下培养18小时。每孔加入20μl 5mg/mlMTT(噻唑蓝)溶液，继续培养4小时。小心移出孔内溶液后，加入150μl二甲亚砜，并置摇床上低速振荡10分钟，然后用酶标仪测定OD₅₇₀吸光值，实验设三个重复和多个阴性对照。最后根据公式计算各组的抑制率：

抑制率＝[(实验组OD₅₇₀-对照组OD₅₇₀)/对照组OD₅₇₀]×100％

本发明具有的优点：

1、充分利用细菌遗传密码有利真核基因在遗传背景清晰的大肠杆菌中有效表达和17℃以下低温条件有助于过量表达蛋白质折迭的特点，实现了截短人TRAIL蛋白的可溶性表达。使用该法表达不带任何标签的截短人TRAIL蛋白使可溶性蛋白提高到100％。该法简单、发酵时间短，可使用通用的表达载体和宿主，不需要改造载体或宿主细胞。

2、本发明还建立了三步法(硫酸铵分级分离、离子交换层析和疏水层析)纯化不带任何标签的截短人TRAIL蛋白，程序简单且收得率高，可达到电泳纯的纯度。

3、本发明纯化的不带任何标签的截短人TRAIL蛋白保持了天然TRAIL蛋白的活性，可直接用于生化、分子生物学、肿瘤学的研究工作，还有利于规模化发酵生产截短人TRAIL蛋白用于肿瘤治疗的临床前期或临床药物的开发。

附图说明

图1为本发明的截短人TRAIL蛋白在E.coli中表达结果电泳图。

其中M：标准分子量；1：上清，37℃诱导表达结果；2：沉淀，37℃诱导表达结果；3：沉淀，25℃诱导表达结果；4：上清，25℃诱导表达结果；5：上清，17℃诱导表达结果；6：沉淀，17℃诱导表达结果

图2为本发明的截短人TRAIL蛋白对HepG2肝癌细胞的抑制率曲线，

具体实施方式

实施例1：截短人TRAIL蛋白(111-281位氨基酸)片段的制备

首先按Genbank发表的人TRAIL蛋白的111-281位氨基酸肽段的氨基酸序列并根据细菌遗传密码的偏好性设计和人工合成24对DNA单链核苷酸序列(见核苷酸序列表中的人工合成引物1-24)，用上面陈述的三轮PCR方法合成编码人TRAIL蛋白的111-281位氨基酸肽段的双链DNA。第一轮PCR为94℃变性30s、52℃复性45s、72℃延伸60s，共扩增20个循环；第二轮PCR为94℃变性5min，再在94℃变性30s、52℃复性45s、72℃延伸60s，共扩增30个循环；第三轮PCR为94℃变性5min后，94℃变性30s、52℃复性45s、72℃延伸60s，共扩增30个循环。与pMD18-T载体DNA连接后形成重组质粒，转化E.coli Top10细菌，用含50μg/ml氨苄青霉素的LB平板筛选阳性转化子。DNA测序显示插入的DNA片段正确(见核苷酸序列表中的人工合成序列25)。

用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切扩增后的重组质粒DNA和pET23a质粒DNA，酶切缓冲液为10×H反应缓冲液。37℃酶切4小时。酶切混合物经1％琼脂糖凝胶电泳后回收编码TRAIL蛋白111-281位氨基酸肽段的533bp DNA片段和3.5kb的线性pET23a质粒DNA。然后将两种回收的DNA片段按5份目的DNA片段：1份线性pET23a质粒DNA的比例混合，并用T4DNA连接酶在16℃条件下连接过夜。然后将连接反应混合物直接转化E.coli BL21(DE3)，用含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板筛选阳性转化子。按上述D步骤17℃表达目的蛋白，上清液中可溶性目的蛋白为100％，沉淀中占0％。如果在25℃或37℃条件下表达，上清液中可溶性目的蛋白分别占18％和0％，沉淀中分别为82％和100％。(见附图1)。

按上述步骤E使用三步法(即硫酸铵分级分离、CM-Sepharose阳离子交换层析和Butyl-Sepharose疏水层析)纯化目的蛋白，从1L培养物中可获得30mg电泳纯的纯蛋白。

按步骤F测活的结果显示，纯化的截短人TRAIL蛋白对HepG2肝癌细胞有明显的诱导细胞凋亡的效应，在0-400ng/ml范围内抑制率呈线性关系。在37℃条件下作用18小时，1000ng/ml截短人TRAIL蛋白可引起75％HepG2肝癌细胞凋亡(见附图2)。截短人TRAIL蛋白172氨基酸肽段对正常细胞未见诱导细胞凋亡的效应。

核苷酸序列表

<110>湖北大学

<120>可溶性截短的人TRAIL活性蛋白的制备方法

<140>201010243089.6

<141>2010-7-30

<160>25

<210>1

<211>45

<212>DNA

<213>人工合成引物TA1

<220>

<222>(1)...(45)

<400>1

CCATATGTCT CCGCTTGTTC GTGAACGTGG TCCGCAGCGT GTTGC 45

<210>2

<211>43

<212>DNA

<213>人工合成引物TA2

<220>

<222>(1)...(43)

<400>2

TGCTCACATC ACTGGTACTC GTGGTCGTTC TAACACTCTTT CTT 43

<210>3

<211>44

<212>DNA

<213>人工合成引物TA3

<220>

<222>(1)...(44)

<400>3

CTCCGAACTC TAAAAACGAA AAAGCTCTTG GTCGTAAAAT CAAC 44

<210>4

<211>44

<212>DNA

<213>人工合成引物TA4

<220>

<222>(1)...(44)

<400>4

TCTTGGGAAT CTTCTCGTTC TGGTCACTCT TTCCTTTCTA ACCT 44

<210>5

<211>44

<212>DNA

<213>人工合成引物TA5

<220>

<222>(1)...(44)

<400>5

TCACCTTCGT AACGGTGAAC TTGTTATCCA CGAAAAAGGT TTCT 44

<210>6

<211>44

<212>DNA

<213>人工合成引物TA6

<220>

<222>(1)...(44)

<400>6

ACTACATCTA CTCTCAGACT TACTTCCGTT TCCAGGAAGA AATC 44

<210>7

<211>44

<212>DNA

<213>人工合成引物TA7

<220>

<222>(1)...(44)

<400>7

AAAGAAAACA CTAAAAACGA TAAACAGATG GTTCAGTACA TCTA 44

<210>8

<211>44

<212>DNA

<213>人工合成引物TA8

<220>

<222>(1)...(44)

<400>8

CAAATACACT TCTTACCCGG ACCCGATCCT TCTTATGAAA TCTG 44

<210>9

<211>44

<212>DNA

<213>人工合成引物TA9

<220>

<222>(1)...(44)

<400>9

CTCGTAACTC TTGCTGGTCT AAAGATGCTG AATACGGTCT TTAC 44

<210>10

<211>44

<212>DNA

<213>人工合成引物TA10

<220>

<222>(1)...(44)

<400>10

TCTATCTACC AGGGTGGTAT CTTCGAACTT AAAGAAAACG ATCG 44

<210>11

<211>44

<212>DNA

<213>人工合成引物TA11

<220>

<222>(1)...(44)

<400>11

TATCTTCGTT TCTGTTACTA ACGAACACCT TATCGATATG GATC 44

<210>12

<211>44

<212>DNA

<213>人工合成引物TA12

<220>

<222>(1)...(44)

<400>12

ACGAGGCTTC TTTCTTCGGT GCTTTCCTTG TTGGTTGATG ATGA 44

<210>13

<211>44

<212>DNA

<213>人工合成引物TA1-2

<220>

<222>(1)...(44)

<400>13

ACGAGTACCA GTGATGTGAG CAGCAACACG CTGCGGACCA CGTT 44

<210>14

<211>44

<212>DNA

<213>人工合成引物TA2-3

<220>

<222>(1)...(44)

<400>14

TTTTCGTTTT TAGAGTTCGG AGAAGAAAGA GTGTTAGAAC GACC 44

<210>15

<211>44

<212>DNA

<213>人工合成引物TA3-4

<220>

<222>(1)...(44)

<400>15

CAGAACGAGA AGATTCCCAA GAGTTGATTT TACGACCAAG AGCT 44

<210>16

<211>44

<212>DNA

<213>人工合成引物TA4-5

<220>

<222>(1)...(44)

<400>16

AAGTTCACCG TTACGAAGGT GAAGGTTAGA AAGGAAAGAG TGAC 44

<210>17

<211>44

<212>DNA

<213>人工合成引物TA5-6

<220>

<222>(1)...(44)

<400>17

TAAGTCTGAG AGTAGATGTA GTAGAAACCT TTTTCGTGGA TAAC 44

<210>18

<211>44

<212>DNA

<213>人工合成引物TA6-7

<220>

<222>(1)...(44)

<400>18

TATCGTTTTT AGTGTTTTCT TTGATTTCTT CCTGGAAACG GAAG 44

<210>19

<211>44

<212>DNA

<213>人工合成引物TA7-8

<220>

<222>(1)...(44)

<400>19

GTCCGGGTAA GAAGTGTATT TGTAGATGTA CTGAACCATC TGTT 44

<210>20

<211>44

<212>DNA

<213>人工合成引物TA8-9

<220>

<222>(1)...(44)

<400>20

TTAGACCAGC AAGAGTTACG AGCAGATTTC ATAAGAAGGA TCGG 44

<210>21

<211>44

<212>DNA

<213>人工合成引物TA9-10

<220>

<222>(1)...(44)

<400>21

AGATACCACC CTGGTAGATA GAGTAAAGAC CGTATTCAGC ATCT 44

<210>22

<211>44

<212>DNA

<213>人工合成引物TA10-11

<220>

<222>(1)...(44)

<400>22

GTTAGTAACA GAAACGAAGA TACGATCGTT TTCTTTAAGT TCGA 44

<210>23

<211>37

<212>DNA

<213>人工合成引物TA11-12

<220>

<222>(1)...(37)

<400>23

AGAAAGAAGC CTCGTGATCC ATATCGATAA GGTGTTC 37

<210>24

<211>39

<212>DNA

<213>人工合成引物TA12-13

<220>

<222>(1)...(39)

<400>24

CCTCGAGTCA TCATCAACCA ACAACAAGGA AAGCACCGA 39

<210>25

<211>525

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<222>(1)...(525)

<400>25

atg tct ccg ctt gtt cgt gaa cgt ggt ccg cag cgt gtt gct gct 45

Met Ser Pro Leu Val Arg Glu Arg Gly pro Gln Arg Val Ala Ala

1 5 10 15

cac atc act ggt act cgt ggt cgt tct aac act ctt tct tct ccg 90

His Ile thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro

20 25 30

aac tct aaa aac gaa aaa gct ctt ggt cgt aaa atc aac tct tgg 135

Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp

35 40 45

gaa tct tct cgt tct ggt cac tct ttc ctt tct aac ctt cac ctt 180

Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe leu Ser Asn Leu His Leu

50 55 60

cgt aac ggt gaa ctt gtt atc cac gaa aaa ggt ttc tac tac atc 225

Arg Asn Gly Glu leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile

65 70 75

tac tct cag act tac ttc cgt ttc cag gaa gaa atc aaa gaa aac 270

Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe gln Glu Glu Ile lys Glu Asn

80 85 90

Act aaa aac gat aaa cag atg gtt cag tac atc tac aaa tac act 315

Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr

95 100 105

tct tac ccg gac ccg atc ctt ctt atg aaa tct gct cgt aac tct 360

Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser

110 115 120

tgc tgg tct aaa gat gct gaa tac ggt ctt tac tct atc tae cag 405

Cys trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln

125 130 135

ggt ggt atc ttc gaa ctt aaa gaa aac gat cgt atc ttc gtt tct 450

Gly Gly ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn asp Arg Ile Phe Val Ser

140 145 150

gtt act aac gaa cac ctt atc gat atg gat cac gag gct tct ttc 495

Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe

155 160 165

ttc ggt gct ttc ctt gtt ggt tga tga tga 525

Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly - - -

170

Claims

1.一种可溶性截短的人TRAIL活性蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

A、人工合成编码截短的人TRAIL蛋白的DNA ：根据Genbank发表的人TRAIL蛋白可溶性蛋白的氨基酸序列，按细菌遗传密码的偏好性设计24种寡聚DNA单链片段，人工合成全部DNA单链片段；该片段为12种正链片段，12种负链片段，每一片段与相邻片段之间具有8-10个核苷酸的重叠且能相互配对，所述的24种单链片段是核苷酸序列表中的人工合成引物1-24；

B、三轮PCR合成完整的双链DNA片段：将24种DNA单链片段分成2-3组，每组50μl的体系中分别加入浓度为10μM的每种寡聚DNA单链片段1.5μl、10×PCR反应缓冲液5μl、2.5mM dNTPs 4μl、Taq DNA聚合酶0.4μl，并补加ddH₂O至50μl，进行第一轮PCR，共扩增20个循环，回收PCR产物；每组取2μl第一轮回收的PCR产物，加入10×PCR反应缓冲液5μl、2.5mM dNTPs 4μl、Taq DNA聚合酶0.2μl，并补加ddH₂O至50μl进行第二轮PCR，共扩增30个循环，回收PCR产物；每组取2.5μl第二轮回收的PCR产物，加入10×PCR反应缓冲液5μl、2.5mM dNTPs 4μl、带限制性内切酶位点的5’-和3’-端引物各1.5μl、Taq DNA聚合酶0.4μl，并补加ddH₂O至50μl进行第三轮PCR，共扩增20个循环，回收PCR产物，得到全长完整的双链DNA片段；

C、利用T-载体扩增，将全长DNA片段克隆并转化：将0.5μl回收的第三轮PCR产物与2μl T-载体连接缓冲液、0.2μl pMD18-T载体DNA混合，加ddH₂O至5μl，混匀后16℃保温4小时，取3μl连接反应液，按常规CaCl₂法转化E.coli Top10，用含有50μg/ml氨苄青霉素的LB平板37℃培养12小时筛选阳性菌落，将单个阳性菌落送商业公司检测插入的DNA序列正确性；

D、在大肠杆菌中高效低温表达截短的人TRAIL蛋白

(1)将测序正确的阳性菌落接种至5ml含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养12小时，并用质粒DNA抽提试剂盒抽提T-载体重组质粒DNA，分别将20μl T-载体重组质粒和pET23a表达载体DNA与5μl 10×H缓冲液、2μl NdeI、2μl XhoI和21μl ddH₂O混合，37℃酶切反应4小时，用1％琼脂糖凝胶电泳分离限制性内切酶消化样品，在紫外灯下用刀片切出目的DNA片段，然后按DNA片段回收试剂盒的方法回收目的DNA片段，然后在25μl的体系中，加入2.5μl 10×T4 DNA连接酶反应缓冲液，并按1∶5的比例加入限制性内切酶消化过的pET23a质粒DNA和编码截短人TRAIL蛋白的DNA片段，再加入1μl T4 DNA连接酶，16℃水浴4-12小时形成重组表达质粒；

(2)利用常规的CaCl₂法制备E.coli BL21(DE3)感受态细胞，然后将5-10 μl上述连接反应混合物与100μl感受态细胞混合，冰浴30分钟，42℃热休克1.5分钟后立即置冰上5分钟，加入900 μl新鲜LB培养基后在37℃摇床上培养45分钟，摇床转速为150rpm，然后将细菌涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12小时，平板上长出的单个菌落即为阳性转化子；

(3)将单个的阳性转化子接种到5ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养12小时，活化后菌液按1∶100接入在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基的摇瓶中17℃摇动培养，摇床转速为250rpm，当OD₆₀₀值达到0.6时加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导8-20小时，细胞经4500rpm离心15分钟后收集并悬浮在含有1mM DTT和5％甘油的50mM Tris-HCl缓冲液中，其pH为7.4，超声波破碎，12000rpm离心收集上清液；

E、截短人TRAIL蛋白的三步法纯化

在50ml上清粗酶液中加入硫酸铵至终浓度40％，4℃放置2小时，12,000rpm离心15分钟，去除沉淀，在离心后的上清液中加入硫酸铵至终浓度60％，4℃放置4-12小时，12,000rpm离心15分钟，移去上清液，用pH为7.5的20ml 50mM Tris-HCl悬浮沉淀物，并用pH 7.5的50mM Tris-HCl，4℃透析除去硫酸铵；

然后将上一步的样品上样至pH为7.5的50mM Tris-HCl，平衡的CM-Sepharose阳离子层析柱并用0-0.8M NaCl进行梯度洗脱，流速为2ml/min，自动收集洗脱流出液，蛋白经10％SDS-PAGE电泳鉴定；

在含有截短人TRAIL蛋白的蛋白溶液中加入40％硫酸铵后，直接上样Butyl-Sepharose层析柱，所用平衡用缓冲液为40％(NH₄)₂SO₄-50mM Tris-HCl，其pH为7.5，用40％-0硫酸铵进行梯度洗脱，流速为2ml/min，自动收集洗脱流出液，10％SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度。