CN100519577C - 重组白喉毒素及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了重组白喉毒素及其制备方法和应用，白喉毒素DAB389与α-促黑素细胞激素两者之间添加了以(Gly4Ser)2组成的连接肽，为了重组毒素纯化的方便，添加上前缀体，扩增出前缀体+DAB389(Gly4Ser)2-αMSH基因片段，构建pET28a/前缀体+DAB389(Gly4Ser)2-αMSH表达质粒，转化到大肠杆菌中表达，经IPTG诱导，获得含有前缀体+DAB389(Gly4Ser)2-αMSH的表达蛋白，再经过纯化、Xa因子酶切、分离获得DAB389(Gly4Ser)2-αMSH的融合蛋白，本发明通过实验证明：重组白喉毒毒素具有纯化方便，减少成本，收率高，提高重组毒素活性的优点；同时对恶性黑色素瘤具有特异性攻击和杀伤的特性，而对正常细胞无伤害，达到有效治疗恶性黑色素瘤疾病的目的。
Description
技术领域
本发明涉及一种免疫重组毒素及其制备方法和应用，更具体地说是一种重组白喉毒素及制备方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤是严重威胁人类健康和生存的主要疾病之一，目前世界死亡人数中有12％死于癌症。全球恶性肿瘤发病率总体上处于增长趋势。据资料显示，至90年代末，癌症死亡率成为人类健康的第一杀手。在城镇居民中，癌症由70年代占死因的11.2％上升到现在的18.14％，已居死因的首位，对人类健康与生命构成越来越大的威胁。
目前传统的肿瘤治疗手段主要是手术、放疗、化疗，但还远不尽人意。各国一直积极致力于探索一种新的、更安全有效、特异性更好且毒副作用更小的肿瘤治疗方法，引发了克癌新思路——肿瘤靶向治疗方法。肿瘤靶向治疗是定向攻击肿瘤细胞而非正常细胞的治疗方法，也是当今医学、生物学领域最热门的课题之一。
早在1906年，德国化学家Erhlich就提出了导向治疗的概念。将肿瘤特异性的抗体与细菌外毒素偶联制备出能特异性杀伤肿瘤的“魔弹”。直到20世纪70年代，随着生物工程技术的发展，以及一些可作为“弹头部分”的毒素的筛选和纯化，导向药物才有了较大的发展，从而诞生了第一代免疫毒素。
重组毒素也称免疫毒素，第一代的免疫毒素是通过化学偶联方法制备的。将肿瘤特异性抗体、细胞因子等导向物质与毒性分子如动植物毒素、放射性元素用化学偶联的方法制成。但由于连接键不稳定，易被降解，半衰期短，免疫原性强，制备工艺复杂等诸多问题而使其临床应用受到很大限制。第二代的免疫重组毒素是继单克隆抗体导向药物出现后的新型生物导弹。利用基因重组技术融合载体部分基因(包括单抗、抗体片段、细胞因子等)和毒素部分基因，经表达、纯化制备的免疫重组毒素。导向药物(重组毒素)中的毒性成分多采用细菌毒素，由于它们的结构与功能的特殊性而使它们极易穿透实体瘤，对肿瘤细胞的特异性毒性作用较强。
相对于传统的肿瘤治疗方法，靶向治疗有着无可争辩的优势：1、它克服了放疗、化疗在杀伤肿瘤细胞的同时对正常细胞也不加选择地造成严重损害的缺陷；2、它对任何时期的肿瘤细胞均有杀伤作用；3、由于它具有高效的催化机制，故很少量的分子就足以促使肿瘤细胞死亡。
现在，国外对重组毒素的研究技术力量雄厚，以IL-2受体为靶点的DAB389-IL2(商品名ONTAK)，已通过美国FDA批准正式上市销售，DAB389-TGFα、DAB389-EGF等已进入二期、三期临床，且已收到良好的效果。国内最近几年也有大量基因工程的生物制品面世，如干扰素、白介素等。国内的白喉毒素重组毒素、绿脓杆菌外毒素重组毒素也有专利申请及产品出现，如：LHRH-PE40对癌症的治疗效果显著，它能有效地克服第一代免疫毒素的缺陷，目前已显示出了广阔的应用前景。将会有很好的社会效应和经济效益。
白喉毒素(DT)是由感染β棒状噬菌体的白喉杆菌产生的外毒素。完整的DT分子由535个氨基酸组成，分子量为58kDa。根据其结构和功能特点，自N端向C端分为三个结构区：催化区(C区)，由1～193氨基酸残基组成；跨膜区(T区)，由205～378氨基酸残基组成；受体结合区(R区)，由386～535氨基酸残基组成。R区能与真核细胞表面DT受体结合，T区在R区与受体结合后插入细胞膜中，使C区进入细胞内。C区含有ADP依赖的核糖体转移酶活性，能催化NAD+的ADP核糖基向延长因子2(EF-2)转移，生成烟酰胺，使EF-2失活，阻断细胞蛋白质的合成。利用DT分子的3个功能区在空间上相互独立的特点，可通过基因重组将R区删除，取而代之为能特异性识别肿瘤细胞表面受体的配基如细胞因子、单克隆抗体等，此种结构即为重组毒素，它通过受体-配体相互作用而结合在肿瘤细胞的表面，再利用白喉毒素具有极强的细胞毒性，抑制蛋白质合成，最终导致细胞死亡。重组毒素的特点是对正常细胞不产生毒性，但可通过与肿瘤表面受体结合而特异性杀伤肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的目的。
申请号为01138705.X和01138706.8中国专利申请构建了带有接头序列的受体导向性嵌合毒素和白喉毒素-促性腺激素释放素嵌合蛋白质，试验表明上述两种重组毒素均具有良好的靶向特异性，对一些癌症有良好的治疗效果，但对于恶性黑色素瘤却没有效果，为此有必要构建出针对黑色素瘤有靶向特异性的重组毒素。
发明内容
本发明的目的提供一种重组白喉毒素，它包括：毒素分子白喉毒素DAB389、连接肽(Gly4Ser)2、导向分子促黑素细胞激素αMSH，其碱基序列如序列表中SEQ ID NO.1。
本发明另一个目的是提供一种重组白喉毒素基因片段，由His·Tag+Ser+Gly+Xafactor+DAB389(Gly4Ser)2-αMSH构成，其碱基序列如序列表中SEQ ID NO.2，His·Tag+Ser+Gly+Xa factor中的His·Tag是亲和标记，Ser+Gly是连接小肽，Xa factor是Xa因子的酶切识别序列，将此His·Tag+Ser+Gly+Xa factor复合体统称为前缀体。
本发明又一个目的是提供一种重组白喉毒素制备方法，该方法包括：
1、化学合成含前缀体+IDAB389+(Gly4Ser)2的上游引物(SEQ ID NO.3)、含αMSH反向序列的下游引物(SEQ ID NO.4)，利用pET28a/DAB389(Gly4Ser)2-EGF为模板，扩增出含前缀体+DAB389(Gly4Ser)2-αMSH的基因片段，纯化回收，得回收片段；
2、取回收片段加入pMD-18T vector中，用T4DNA连接酶连接，连接产物转化至大肠杆菌中，筛选阳性重组质粒，获得含有前缀体+DAB389(Gly4Ser)2-αMSH片段的重组质粒，双酶切此重组质粒和表达载体pET28a(+)，回收两者的酶切片段，将前缀体+DAB389(Gly4Ser)2-αMSH基因片段和pET28a质粒片段混合、连接，将连接产物转化至大肠杆菌中，筛选阳性菌落培养，提取质粒DNA；
3、将重组质粒pET28a/前缀体+DAB389(Gly4Ser)2-αMSH转化至表达菌中，诱导表达，收集菌体；
4、采用超声波裂解，使菌体细胞破碎，离心，收集上清、硫酸铵盐析、亲和层析纯化及Xa因子切割重组毒素表达蛋白、回收，获得去掉前缀体的DAB389(Gly4Ser)2-αMSH融合蛋白。
做为一种改进，重组白喉毒素制备方法步骤3所述的重组质粒pET28a/前缀体+DAB389(Gly4Ser)2-αMSH质粒的最佳表达菌种为BL21(λDE3)；最适宜的培养基为M9B2。
前缀体+DAB389(Gly4Ser)2-αMSH的最佳诱导表达温度和时间为30℃ 6小时，诱导剂IPTG的最佳用量为1.4mmol/L。
本发明再一个目的重组白喉毒素或一种重组白喉毒素基因片段在生产抗黑色素瘤药物的应用。
本发明采用了截短的白喉毒素DAB389做为效应部分，它是由白喉毒素的前386个氨基酸及第484～486位3个氨基酸组成的，分子量比白喉毒素DT小得多，分子量对于实体瘤的疗效影响是非常大的，这主要是因为实体瘤内压非常高，毒素分子量越大，进入实体瘤内部就越困难，减小免疫毒素的分子量既保证了活性又提高实体瘤抑瘤率；
选用αMSH为导向部分，α-促黑素细胞激素(Alpha-melanocyte stimulatinghormone，αMSH)是促黑素细胞激素的一种，它由13个氨基酸组成，分子量1 430Da，来源于其前体激素阿黑皮素原(POMC)。除垂体外，表皮内角质形成细胞(KC)，黑素细胞(MC)和朗罕细胞均可产生αMSH和相关肽类。αMSH序列为丝-酪-丝-蛋-谷-谷-苯丙-精-色-甘-赖-脯-缬〔αMSH(1-13)〕；是一种神经内分泌激素，除促进黑素细胞增殖、分化及黑素形成外，在体内发挥着许多生理作用。该激素还具有强有力的抗炎、调节免疫的作用；在人类的病理状态下，αMSH在血浆中及炎症部位的浓度显著增高，提示αMSH水平升高可能是机体对抗炎症的一种天然手段，αMSH与其受体结合，发挥抗炎作用，还具有显著的退热、抗炎和免疫调节作用，是神经免疫调节中的关键性物质之一；αMSH是指能够与细胞表面上的MSH受体特异性结合的天然MSH及其类似物或衍生物，它的受体广泛存在于很多肿瘤细胞的表面，尤其是恶性黑色素瘤的表面，αMSH受体在癌细胞上的过度表达成为控制癌细胞的靶点，αMSH可以特异结合在癌细胞表面的受体，因此αMSH很适合作为免疫毒素的载体，携带毒素，特异的杀伤癌细胞。动物及人体研究已证实，α-MSH及其衍生物毒性低、副作用轻微，易耐受，抗炎作用强而广泛，无明显不良反应，具有潜在的临床应用前景；因此αMSH可用于肿瘤，尤其是恶性黑色素瘤靶向药物的制备；
本发明在白喉毒素DAB389与α-促黑素细胞激素两者之间添加了以(Gly4Ser)2组成的小连接肽，融合基因表达后新接入的接头部分不产生新的抗原性，同时也不能影响其两侧肽链原有的抗原性，柔性连接肽的存在可使它两端的蛋白功能区正确的折叠，从而产生正确的生物结构和空间结构，使重组蛋白的伸展性更好，亲水性高。
为了重组毒素纯化的方便，添加上前缀体，扩增出前缀体+DAB389(Gly4Ser)2-αMSH基因片段，构建pET28a/前缀体+DAB389(Gly4Ser)2-αMSH表达质粒，转化到大肠杆菌中表达，经IPTG诱导，获得含有前缀体+DAB389(Gly4Ser)2-αMSH的表达蛋白，再经过纯化、Xa因子酶切、分离获得DAB389(Gly4Ser)2-αMSH的融合蛋白。本发明通过实验证明：重组的毒素具有纯化方便，减少成本，收率高，提高重组毒素活性的优点；同时对恶性黑色素瘤具有特异性攻击和杀伤的特性，而对正常细胞无伤害，达到有效治疗恶性黑色素瘤疾病的目的。
附图说明
附图1显示本发明用于表达融合蛋白的重组表达质粒pET28a/前缀体+DAB389(Gly4Ser)2-αMSH的构建策略。
附图2显示本发明编码前缀体+DAB389(Gly4Ser)2-αMSH片段的DNA序列的PCR扩增产物的1％琼脂糖凝胶电泳图谱，其中泳道1是DNA分子量标志物，泳道2、3是编码前缀体+DAB389(Gly4Ser)2-αMSH片段的DNA片段。
附图3显示本发明含前缀体+DAB389(Gly4Ser)2-αMSH重组毒素表达产物的SDS-PAGE分析，其中泳道1是蛋白质分子量标志物；泳道2是宿主细胞大肠杆菌BL21(λDE3)的全菌；泳道3是包含前缀体+DAB389(Gly4Ser)2-αMSH重组毒素的全菌超声裂解上清；泳道4是包含前缀体+DAB389(Gly4Ser)2-αMSH重组毒素的全菌超声裂解沉淀；泳道5是包含前缀体+DAB389(Gly4Ser)2-αMSH重组毒素的全菌蛋白。
附图4显示纯化的包含前缀体+DAB389(Gly4Ser)2-αMSH重组毒素的表达产物的SDS-PAGE分析，泳道1是蛋白质分子量标志物；泳道2是纯化脱盐后的表达蛋白。
附图5显示用Xa因子酶切后得到的DAB389(Gly4Ser)2-αMSH融合蛋白的SDS-PAGE分析结果，泳道1是蛋白质分子量标志物，泳道2是前缀体+DAB389(Gly4Ser)2-αMSH表达蛋白，泳道3是用Xa因子酶切后得到的DAB389(Gly4Ser)2-αMSH融合蛋白。
附图6显示本发明的DAB389(Gly4Ser)2-αMSH融合蛋白对人恶性黑色素瘤细胞A375、人肺癌细胞A549的特异性杀伤活性，其中6.1是DAB389(Gly4Ser)2-αMSH融合蛋白对A375细胞的细胞毒性作用，6.1.1对照组；6.2是DAB389(Gly4Ser)2-αMSH融合蛋白对A549细胞的细胞毒性作用，6.2.1为对照组。
附图7显示本发明的DAB389(Gly4Ser)2-αMSH融合蛋白对恶性黑色素瘤细胞A375、肺癌细胞A549的半抑制浓度(IC50)。
具体实施方式
实施例1：重组质粒pET28a/前缀体+DAB389(Gly4Ser)2-αMSH的构建。
本实施例描述用于表达本发明重组毒素的重组表达质粒pET28a/前缀体+DAB389(Gly4Ser)2-αMSH的构建策略和基本方法，请参见附图1；
为了完成本发明，可以使用本领域技术人员已知的基因融合技术制备本发明的重组毒素蛋白质。为此，可按照已知的DNA重组技术(如参见Sambrook etal，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1989)完成各种DNA操作。pET28a/DAB389(Gly4Ser)2EGF由张国利提供，质粒pET28a(+)(Novagen)、受体菌JM109、BL21(DE3)均购自Novagen公司。PCR试剂盒、DNA Marker DL-2000、DNA回收试剂盒、限制性内切酶、T4DNA连接酶、Ex Taq DNA聚合酶、IPTG、pMD18-T载体、蛋白质分子量标志物购自TakaRa公司，引物合成及序列分析由大连宝生物公司完成；马抗白喉毒素阳性血清由张国利提供，HRP标记的鼠抗马二抗由长春金科龙公司提供；
1)引物的设计与合成
参考Collier RJ(Mol Microbiol.1988，2(2)：293-296)报道的DAB389基因的核苷酸序列及张国利等(中国免疫学杂志.2004，20(3)：171-172)报道的序列，设计并合成2条引物，化学合成含前缀体+DAB389+(Gly4Ser)2上游引物—Primer1(SEQ ID NO.3)、含αMSH反义序列的下游引物—Primer 2(SEQ ID NO.4)(大连宝生物公司)，用pET28a/DAB389(Gly4Ser)2EGF为模板，PCR扩增前缀体+DAB389(Gly4Ser)2αMSH基因片段，为利于克隆，Primer 1和Primer 2中分别引入Nco I和EcoR I酶切位点；
Primer 1：5’catg ccatgg gcagc catcatcatcatcatcac agcgggc attgagggtcgc ggcgctgatgatgttgttg 3’
Nco I His.Tag Ser Gly Xa factor
Primer 2：5’cg gaattcttataccggtttaccccagcggaagtgttccatgctgtagctggatccacctccgcctga 3’
EcoR I
2)PCR扩增片段
以pET28a/DAB389(Gly4Ser)2EGF为模板，PCR扩增前缀体+DAB389(Gly4Ser)2αMSH基因片段，反应条件为94℃，60s，58℃，70s，72℃，80s，30个循环；72℃，600s，4℃，300s，1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增的结果(见附图2)，将PCR产物回收、纯化；
PCR反应体系
3)pMD18T/前缀体+DAB389(Gly4Ser)2-αMSH质粒的构建
回收DNA片段克隆到pMD18-T载体上，得到pMD18T/前缀体+DAB389(Gly4Ser)2-αMSH质粒，转化于感受态大肠杆菌JM 109，提取质粒用核酸内切酶Nco I和EcoR I双酶切进行鉴定，筛选出含有前缀体+DAB389(Gly4Ser)2αMSH片段的重组质粒；
连接反应体系
4)重组质粒pET28a/前缀体+DAB389(Gly4Ser)2-αMSH的构建
pET28a(+)和克隆质粒pMD18T/前缀体+DAB389(Gly4Ser)2-αMSH质粒分别用Nco I和EcoR I双酶切，然后分别纯化回收目的片段，用T4DNA连接酶进行连接，构建重组表达质粒pET28a/前缀体+DAB389(Gly4Ser)2-αMSH质粒，转化于感受态JM109中，构建重组菌株，提取质粒，酶切鉴定，以保证目的片段插入的准确性；
连接反应体系
5)DNA序列分析
大量提取pET28a/前缀体+DAB389(Gly4Ser)2-αMSH质粒，对重组质粒中的插入片段进行核苷酸序列测定，保证插入片段的正确性；测序结果表明，重组质粒中所含的碱基序列如SEQ ID NO.2所述。
实施例2：重组质粒表达蛋白质的表达及鉴定
本实施例描述本发明的重组毒素在大肠杆菌宿主细胞中的诱导表达。
用实施例1中制得的重组质粒pET28a/前缀体+DAB389(Gly4Ser)2-αMSH转化感受态大肠杆菌BL21(λDE3)菌株(Novagen)，挑取阳性菌落，按常规方法37℃培养，当OD600nm＝0.6时，降低培养温度至最佳诱导温度30℃并向培养物中加入IPTG诱导剂进行诱导表达，诱导剂IPTG的最佳用量为1.4mmol/L，诱导6小时；收集BL21(λDE3)菌体细胞并悬浮在10倍体积含有20mmol/LTris-HCL溶液中，超声裂解后分别取上清和沉淀物进行SDS-PAGE电泳分析；分析结果表明，表达产物中存在一条分子量约46.17KDa的条带，重组毒素以胞内可溶形式与包涵体形式同时表达(参见附图3)；
通过用免疫印迹分析法鉴定表达产物，结果显示，表达产物与马抗白喉毒素出现特异性反应条带。
实施例3：融合蛋白质的纯化
使用盐析、Cu Chelating Sepharose Fast Flow亲和层析、脱盐、Xa因子酶切等方法纯化获得融合蛋白；
在菌裂解上清液中，加入硫酸铵使其浓度达到55％，4℃放置1h后离心，用20mmol/LTris-Cl(含2mmol/LEDTA，pH 8.0)溶解目的蛋白沉淀，离心收集上清样品，用SDS-PAGE对样品进行分析检测。用Cu Chelating Sepharose Fast Flow层析纯化蛋白，样品上样，以A(20mmol/L Tris-Cl，0.5mol/L NaCl，pH 7.5)→B(A液+50mmol/L咪唑)进行梯度洗脱(流速为3mL/min，时间90min)，收集各组分峰成份进行SDS-PAGE分析；将目的蛋白溶液过Superdex G-25柱脱盐，收集溶液，紫外分光光度计分析和高效液相色谱分析，得到纯度为90.53％，浓度为1.5347mg/mL的表达蛋白(见附图4)；用Xa factor酶切表达蛋白，用G-25分离，得到纯度达到93.26％的DAB389(Gly4Ser)2-αMSH融合蛋白(见附图5)，然后用此融合蛋白进行细胞活性分析。
实施例4：DAB389(Gly4Ser)2-αMSH融合蛋白的体外细胞毒性试验
本实施例旨在试验本发明的重组毒素融合蛋白对各种培养的人体癌细胞毒性。
人肠癌细胞系Lovo、人宫颈癌细胞系HeLa、人白血病细胞系JurKet、人T细胞淋巴瘤Hut102、人肺癌细胞系A549、人胃癌细胞系BGC823、人皮肤恶性黑色素瘤A375以及狗肾细胞DK、地鼠肾细胞BHK共九种细胞系，均可从中国典型培养物保藏中心(CCTCC)或中国药品生物制品检定所购得；对培养细胞进行光镜观察；
将纯化的融合蛋白DAB389(Gly4Ser)2-αMSH，定量过滤除菌，分别加入不同细胞孔中，第一孔加目的蛋白10μL(平行3孔)，以下各孔依次加入20μL(平行3孔)，然后添加不同量的培养基，使之总体积为100μL，每个梯度设三个平行孔；实验设空白对照(加等体积的空菌蛋白和培养基)。37℃ 5％ CO2条件下培养36h，取出放于倒置显微镜下观察结果；结果发现，DAB389(Gly4Ser)2-αMSH融合蛋白对人皮肤恶性黑色素瘤A375细胞系生长有明显的抑制作用，对人肺癌细胞系A549的杀伤作用次之(见附图6)，随着蛋白浓度的增加，细胞的死亡数目也逐渐增多，实验组细胞大部分变圆、色暗、折光性差、甚至裂解死亡；对人肠癌细胞系Lovo、人宫颈癌细胞系HeLa、人白血病细胞系JK、人胃癌细胞系BGC823、人T细胞淋巴瘤Hut102无效果；对狗肾细胞DK、地鼠肾细胞BHK这两种正常细胞则无伤害，细胞生长正常没有明显的变化；充分体现了融合蛋白特异性肿瘤细胞毒性作用。
重组毒素对肿瘤细胞半抑制浓度IC50的确定，调节细胞数至2×104个/孔接种于96孔细胞培养板，并按常规方法37℃、5％ CO2培养箱中2h使之贴壁，按等倍稀释法将不同浓度的纯蛋白样品加入各细胞孔中，使之总体积为100μL，5％ CO2，37℃条件下培养72h，倒置显微镜下观察结果，在各孔中分别加入100μLXTT染色试剂，37℃作用4min，于490nm波长下，使用酶标仪测定吸光值计算半抑制浓度IC50；结果表明，本发明的融合毒素可结合人皮肤恶性黑色素瘤A375细胞的表面上，致死作用十分明显；空白对照组实验细胞均无影响。融合蛋白对人皮肤恶性黑色素瘤A375、人肺癌细胞A549的IC50分别为：4.672μg/mL和7.243μg/mL(见附图7)。
实施例5：DAB389(Gly4Ser)2-αMSH对动物的药效实验
本实施旨在进一步观察对荷瘤裸鼠的实体瘤的抑瘤效果，为确定药理、毒理学实验剂量提供依据。
裸鼠(雌)20只购自军事医学科学院实验动物中心，给每只裸鼠背部皮下注射1×106个A375细胞；接种15天后，发现背部有0.5×0.5cm以上的突起时，将裸鼠随机分成两组，10只为一组；一组为实验组，一组为对照组。实验组每只隔天尾静脉注射DAB389(Gly4Ser)2-αMSH纯品0.2mL(相当于纯品2μg)，对照组每只隔天尾静脉注射生理盐水0.2mL；注射5次；停药5天后将两组实验动物处死，称量瘤重，并计算抑瘤率；结果显示抑瘤率为64％，抑瘤效果明显。
SEQUENCE LISTING
<110>吉林农业大学
<120>重组白喉毒素及其制备方法和应用
<160>4
<210>1
<211>1233
<212>DNA
<213>人工
<400>1
<210>2
<211>1275
<212>DNA
<213>人工
<400>2
<210>3
<211>70
<212>DNA
<213>人工
<400>3
<210>4
<211>68
<212>DNA
<213>人工
<400>4
Claims (3)
1、一种重组白喉毒素基因片段，其特征在于：其碱基序列如序列表中SEQ ID NO.2所述。
2、一种重组白喉毒素制备方法，该方法依次包括：
(1)、化学合成含前缀体+DAB389+(Gly4Ser)2的上游引物，其碱基序列如序列表中SEQID NO.3所述，含αMSH反向序列的下游引物，其碱基序列如序列表中SEQ ID NO.4所述，利用pET28a/DAB389(Gly4Ser)2-EGF为模板，扩增出含前缀体+DAB389(Gly4Ser)2-αMSH的基因片段，其碱基序列如序列表中SEQ ID NO.2所述，纯化回收，得回收片段；
(2)、取回收片段加入pMD-18T vector中，用T4DNA连接酶连接，连接产物转化至大肠杆菌中，筛选阳性重组质粒，获得含有前缀体+DAB389(Gly4Ser)2-αMSH片段的重组质粒，双酶切此重组质粒和表达载体pET28a(+)，回收两者的酶切片段，将前缀体+DAB389(Gly4Ser)2-αMSH基因片段和pET28a质粒片段混合、连接，将连接产物转化至大肠杆菌中，筛选阳性菌落培养，提取质粒DNA；
(3)、将重组质粒pET28a/前缀体+DAB389(Gly4Ser)2-αMSH转化至BL21(λDE3)中，采用培养基M9B2培养，诱导剂IPTG用量为1.4mmol/L诱导表达，表达温度30℃和时间为6小时，收集菌体；
(4)、采用超声波裂解，使菌体细胞破碎，离心，收集上清、硫酸铵盐析、亲和层析纯化及Xa因子切割重组毒素表达蛋白、回收，获得去掉前缀体的DAB389(Gly4Ser)2-αMSH融合蛋白。
3、根据权利要求2所述的一种重组白喉毒素制备方法制备的重组白喉毒素在生产抗肺癌药物的应用。
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| DAB389-Linker-LHRH重组毒素的构建及生物活性的初步测定. 岳玉环.东北师大学报（自然科学版），第38卷第2期. 2006 * |
| 白喉毒素-(Gly4Ser)2-α促黑素重组蛋白的研究. 李泽鸿.中国肿瘤生物治疗杂志，第12卷第1期. 2005 |
| 白喉毒素-(Gly4Ser)2-α促黑素重组蛋白的研究. 李泽鸿.中国肿瘤生物治疗杂志，第12卷第1期. 2005 * |
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