CN101125891A - 一种用于肿瘤局部介入治疗的tat-peⅲ融合蛋白及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于肿瘤局部介入治疗的TAT－PEIII融合蛋白，它由人类免疫缺陷病毒的TAT PTD与铜绿假单胞菌外毒素A的III区组成。本发明还提供一种用于肿瘤局部介入治疗的TAT－PEIII融合蛋白的制备方法。用本发明方法所得TAT－PEIII融合蛋白保留了免疫毒素对肿瘤细胞的高杀伤活性，同时具有转导效率高、分子量小的优点，克服了免疫毒素的局限性。用于介入治疗，可以避免TAT－PEIII融合蛋白在治疗过程中对正常组织细胞的损害。

Description

一种用于肿瘤局部介入治疗的TAT-PEⅢ融合蛋白及制备方法

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白，更具体地说，本发明涉及一种用于肿瘤局部介入治疗的TAT-PEIII融合蛋白。同时，本发明还涉及一种所述TAT-PEIII融合蛋白的制备方法。

背景技术

肿瘤严重威胁着人类的生命健康。放疗、化疗等常规治疗方法在治疗肿瘤的同时也杀伤正常细胞，副作用极大。肿瘤的生物治疗是不同于手术、放疗和化疗的一种全新的肿瘤治疗方法，不仅可以克服放疗、化疗手段的上述缺点，而且能够显著提高治疗效果，因此受到医学研究人员的广泛关注。

利用免疫毒素进行导向治疗是生物治疗的一个重要途径。免疫毒素是可以识别和选择性破坏某些特定细胞功能的一类融合蛋白，由靶向区和细胞毒区两部分组成。靶向区多为抗体或细胞因子，细胞毒区多选择铜绿假单胞菌外毒素A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A，PE)的部分片段。

PE是分子量为66KD的单链蛋白质，通过对延伸因子-2的ADP-核糖基化抑制真核细胞的蛋白质合成而导致细胞死亡，是自然界存在的毒性最强的分子之一，杀细胞作用远高于化学抗癌药物，因此，免疫毒素是目前研究最多的导向药物。

PE由613个氨基酸组成，含有三个不同的结构域：Ia区是细胞受体结合区，Ib区具有连接调节作用，II区是跨膜转位区，III区是酶活性区。常用于构建免疫毒素的PE片段是PE40(Ia区缺失)和PE38(Ia及部分Ib缺失)。美国国立癌症研究所Kihara等构建了一种微型免疫毒素，分子中仅含TGFα和PE的III区(PEIII)，对表达TGF受体的细胞具有较高的细胞毒活性，并对荷瘤小鼠具有明显的肿瘤消退效应，表明PEIII也能有效地用于构建免疫毒素。

免疫毒素作为一种新型治疗药物具有广阔的应用前景，但是在临床应用中仍然面临许多挑战。首先，免疫毒素的穿透性有待提高，尤其在实体瘤的治疗中，药物的穿透性至关重要。其次，研制免疫毒素时应尽量控制其分子大小，减小免疫毒素的分子量。单克隆抗体是构建免疫毒素时最常用的导向分子，但完整的单抗分子量大，通常有150KD左右；即便近年经过改进的单链抗体，分子大小也有25KD左右。

因此，为克服现有技术的局限性，在现有导向治疗的研究基础上，若能构建一种既保留免疫毒素的高细胞毒性、又具有很强穿透性的小分子物质，再借助现代靶向治疗技术直接作用于肿瘤组织，无疑对增强肿瘤治疗效果，减轻全身毒副作用都具有重要意义。

穿膜肽(penetratin)是近年发现的一类具有细胞生物膜穿透功能的小分子肽类物质，其中来源于人类免疫缺陷病毒HIV-1 Tat的蛋白转导域(proteintransduction domain，PTD)能够高效穿过生物膜的结构域，将与其共价连接的多肽、蛋白质及DNA等分子跨膜导入几乎所有的组织和细胞，转导效率很高而且对细胞没有损伤。Tat蛋白PTD的核心序列由11个氨基酸组成，其序列为YGRKKRRQRRR，是目前为止所发现的Tat PTD最短的序列，其转导能力不比全长Tat序列差。Schwarze等研究发现Tat PTD可介导相对分子量15KD-200KD的蛋白从细胞外向细胞内直接跨膜转运，表明Tat PTD具有广谱的蛋白转导作用。

原发性肝癌是临床常见的恶性肿瘤，我国每年死于肝癌约11万人，占全世界肝癌死亡人数的45％。对于不能手术切除的中晚期肝癌，介入治疗是目前最好的治疗方法。现用各种肝癌介入治疗药物或由于在肿瘤组织内扩散差，或由于局部杀毒力不强等缺点，只适合于小肝癌，较大肿瘤效果往往不佳，寻找合适的局部介入治疗药物是近来肝癌治疗研究的一个方向。

介入治疗技术提高药物治疗靶向性，对于目前尚无根治方法的恶性肿瘤，介入治疗可将几种最有效的抗癌药搭配在一起，通过导管技术找到肿瘤的供养动脉，把抗癌药和栓塞剂直接注入肿瘤组织，发挥最大的抗肿瘤作用，对全身毒副作用小，同时将肿瘤的供血血管阻塞，使肿瘤失去血供“饿死”。本发明所述TAT-PEIII融合蛋白，作为介入治疗抗癌药物，可用于包括肝癌在内的多种肿瘤的局部介入治疗。所述TAT-PEIII融合蛋白保留了免疫毒素对肿瘤细胞的高杀伤活性，具有转导效率高、分子量小的优点，克服了免疫毒素的局限性。用于介入治疗，可以避免TAT-PEIII融合蛋白在治疗过程中对正常组织细胞的损害。同时也能有效解决免疫毒素穿透性弱的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于肿瘤局部介入治疗的TAT-PEIII融合蛋白，它由人类免疫缺陷病毒的TAT PTD与铜绿假单胞菌外毒素A的III区组成。

本发明的另一个目的是提供一种用于肿瘤局部介入治疗的TAT-PEIII融合蛋白的制备方法，将Tat PTD与PEIII融合制得。

本发明的目的还在于提供一种载体为pQE-TAT-PEIII的重组质粒。

本发明提供了一种用于肿瘤局部介入治疗的TAT-PEIII融合蛋白，它由人类免疫缺陷病毒的TAT PTD与铜绿假单胞菌外毒素A的III区组成。HIV-1AY358073株TAT蛋白PTD序列对应的核苷酸序列为：tat ggc agg aag aag cga aga cagaga cga aga。在这11个氨基酸中，有6个精氨酸(R)，兼顾精氨酸在HIV-1和E.Coli的使用偏嗜性，将HIV-1AY358073株TAT蛋白PTD序列中两个精氨酸的使用密码cga替换为cgt；除精氨酸外，其余5个氨基酸的密码使用情况均不含有大肠埃希菌(E.Coli)的稀有密码子，可以保留原核苷酸序列。因此，我们用于构建pQE-TAT-PEIII重组质粒的HIV Tat PTD的核苷酸序列为：tat ggcagg aag aag cgt aga cag aga cgt aga。

本发明提供的用于肿瘤局部介入治疗的TAT-PEIII融合蛋白具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

本发明还提供一种编码上述用于肿瘤局部介入治疗的TAT-PEIII融合蛋白的DNA序列，其具有SEQ ID NO：2所示的序列或者编码相同蛋白质的与其具有遗传密码简并性的序列。

本发明提供了一种TAT-PEIII融合蛋白的制备方法，将Tat PTD与PEIII融合制得。包含下列步骤：

确定人类免疫缺陷病毒的TAT PTD氨基酸所对应的核苷酸序列；

选择加在Tat PTD两侧的甘氨酸的密码子；

扩增同时含有Tat PTD和PEIII片断的目的基因。

其中，用于构建pQE-TAT-PEIII重组质粒的HIV Tat PTD的核苷酸序列优选为：tat ggc agg aag aag cgt aga cag aga cgt aga。优选的甘氨酸的密码子为ggc。优选的目的基因长度为729bp。优选的扩增方法为使用PCR方法。

本发明提供了一种表达目的蛋白的重组质粒，即pQE-TAT-PEIII。优选利用PvuII、HindIII酶切位点，将目的基因克隆于原核表达载体pQE-31中制得。更优选经位于PEIII目的片段5’端的Pst I和3’端的HindIII双酶切，即为线性化的pQE-TAT载体，还可用于克隆其它的目的片段。

本发明将来源于人类免疫缺陷病毒HIV-1Tat的蛋白转导域(proteintransduction domain，PTD)与铜绿假单胞菌外毒素A的III区(PEIII)融合，构建pQE-TAT-PEIII重组质粒，经表达、纯化得到具有抑瘤活性的TAT-PEIII融合蛋白。

TAT融合蛋白系统是一种很好的蛋白传送工具，打破了蛋白质通常只能通过细胞表面受体和信号转导途径将所携带的生物信息传递到细胞内的规律，在临床应用大分子药物治疗脑血管疾病、肿瘤疾病中具有广阔的应用前景。同时也能有效解决免疫毒素穿透性弱的问题。本发明利用TAT介导蛋白质的方法，将Tat PTD的编码基因与外源蛋白基因连接，表达融合蛋白，所得到的TAT-PEIII融合蛋白不仅保留了TAT原有的穿透力，而且不影响外源蛋白的活力。

本发明采用MTT法测定了TAT-PEIII融合蛋白的体外抑瘤活性，结果表明TAT-PEIII融合蛋白对B16细胞具有明确的细胞毒作用；同时建立小鼠B16黑色素瘤模型，检测TAT-PEIII融合蛋白的体内抑瘤活性，其结果显示TAT-PEIII融合蛋白具有一定的抗肿瘤作用。

本发明所述TAT-PEIII融合蛋白，可用于包括肝癌在内的多种肿瘤的局部介入治疗。所述TAT-PEIII融合蛋白保留了免疫毒素对肿瘤细胞的高杀伤活性，具有转导效率高、分子量小的优点，克服了免疫毒素的局限性。用于介入治疗，可以避免TAT-PEIII融合蛋白在治疗过程中对正常组织细胞的损害。

附图说明

图1表示pQE-TAT-PEIII重组质粒构建图；

图2A表示TAT-PEIII-PCR扩增产物电泳，其中1.1kb DNAMarker(10000-250bp)；2.TAT-PEIII-PCR products；

图2B表示pQE-TAT-PEIII重组质粒双酶切鉴定，其中1.1kb DNA Marker(10000-250bp)；2.pQE-TAT-PEIII经Pst I/HindIII双酶切；

图3表示pQE-TAT-PEIII重组质粒构建的测序峰图；

图中1.pQE-31载体序列，从左向右依次为：翻译起始密码ATG，RGS·6×His标签；2.BamHI酶切位点酶切后补平的序列；3.PvuII酶切位点酶切后的序列；4.甘氨酸序列；5.HIV Tat PTD 11个氨基酸的碱基序列；6.甘氨酸序列；7.PstI酶切位点序列；8.PEIII的序列；

图4表示IPTG诱导表达pQE-TAT-PEIII阳性重组子的SDS-PAGE分析；

其中，1：低分子量蛋白标准；2-5：pQE-TAT-PEIII质粒经IPTG诱导后；6：pQE-31载体诱导后；

图5表示TAT-PEIII融合蛋白的亲和层析(Ni-NTA resin)纯化，图中1，through peak of sample；2，elution peak with buffer D；

图6表示TAT-PEIII融合蛋白亲和层析纯化的SDS-PAGE电泳，图中1：低分子量蛋白标准；2：pQE-31载体诱导后；3：pQE-TAT-PEIII诱导表达产物；4：TAT-PEIII融合蛋白亲和层析穿过峰；5、6：TAT-PEIII融合蛋白亲和层析洗脱峰；

图7表示MTT比色法测定TAT-PEIII融合蛋白对B16细胞的影响；

具体实施方式

试剂与材料

一、质粒、菌株与细胞株

表达质粒pQE-31为德国Qiagen公司同名产品，pUCm-T载体为上海生工产品，重组了PE全长基因的pQE-PE重组质粒由本室构建，大肠埃希菌JM109以及B16黑色素瘤细胞株由本室保存。

二、主要试剂

试剂名称                                   试剂来源

BamHI                                      美国MBI公司

HindIII                                    日本Takara公司

PvuII                                      日本Takara公司

PstI                                       日本Takara公司

Ex Taq DNA聚合酶                           日本Takara公司

T4DNA连接酶(T4 DNA Ligase)                 美国Promega公司

T4DNADNA多聚酶(T4 DNA Polymerase)          美国MBI公司

Ni-NTA亲和树脂(Ni-NTA agarose)             德国Qiagen公司

苯甲基磺酰氟(PMSF)                         上海生工

还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)    美国Amresco分装

小牛血清                                   成都哈里公司

DMEM培养液                                 美国Gibco公司

胰酶(trypsin)                              美国BIOSOURCE公司

四甲基偶氮唑盐(MTT)                        美国BBI公司

二甲基亚砜(DMSO)                           成都科龙化工试剂厂

丙三醇(甘油)                               北京红星化工厂

Hoechst33342染料             北京晶美生物公司

碘化丙啶(PI)                 北京晶美生物公司

实施例一、pQE-TAT-PEIII重组质粒的分子设计

1.在将HIV Tat PTD核心序列的11个氨基酸转换为对应的核苷酸序列时，要兼顾HIV的密码子使用偏嗜性，并且排除大肠埃希菌的稀有密码子，以利于HIV Tat PTD在大肠埃希菌中的正确高效表达。同时，在TAT 11个氨基酸的两侧各加1个甘氨酸，以保证键的自由旋转(free bond rotation)。

(1)HIV Tat PTD 11个氨基酸所对应的核苷酸序列的确定：

在NCBI网站，查找到多个HIV-1分离株的基因序列，其中，AY358073的TAT蛋白PTD的氨基酸序列为YGRKKRRQRRR，与用于穿膜的TAT PTD序列完全一致。HIV-1AY358073株TAT蛋白PTD序列对应的核苷酸序列为：tat ggc agg aagaag cga aga cag aga cga aga。在这11个氨基酸中，有6个精氨酸(R)，其对应的核苷酸序列为第3、6、7、9、10、11位的氨基酸；兼顾精氨酸在HIV-1和E.Coli的使用偏嗜性，将HIV-1 AY358073株TAT蛋白PTD序列中两个精氨酸(第6、10位)的使用密码cga替换为cgt；除精氨酸外，其余5个氨基酸的密码使用情况均不含有大肠埃希菌(E.Coli)的稀有密码子，可以保留原核苷酸序列。因此，用于构建pQE-TAT-PEIII重组质粒的HIV Tat PTD的核苷酸序列为：tat ggc agg aag aag cgt aga cag aga cgt aga。

(2)加在TAT PTD两侧的甘氨酸的密码子选择：

兼顾甘氨酸在HIV-1和E.Coli的使用偏嗜性，选择ggc作为甘氨酸的使用密码。

2.根据GenBank公布的PE碱基序列，针对PE的III区设计特异性引物。在上游引物的5’端依次引入保护碱基(CAT)、PvuII酶切位点(CAG^CTG)、与HIV TatPTD核心序列的11个氨基酸相对应的碱基序列、PstI酶切位点(CTGCA^G)，设计的上游引物长度达74bp，序列为：P_TAT：5’-CATCAGCTGGCTATGGCAGGAAGAAGCGTAGACAGAGACGTAGAGGCCTGCAGTTCCTCGGCGACGGCGGCGAC-3’。

下游引物为P2，序列为：5’-GCGCAAGCTTCAGTTACTTCAGG-3’。

5’端引入HindIII酶切位点。

设计的引物委托上海生工生物工程公司合成。

3.为了减少目的蛋白中的外源序列，通常尽量选用载体多克隆位点两侧的酶切位点来克隆目的片段，pQE-31多克隆位点两侧的酶切位点分别是BamH I和HindIII。经DNAStar软件分析，HindIII在拟插入的目的片段PEIII中没有切点，可用；BamHI在PEIII中有切点，因此不能直接使用。为此，本研究拟先用BamHI对pQE-31进行酶切，再用T4DNA Polymerase补平粘端，与经过平端酶(PvuII)酶切的目的片段进行连接，以克隆目的片段。

4.利用PvuII、HindIII酶切位点，将目的基因克隆于原核表达载体pQE-31中，重组质粒命名为pQE-TAT-PEIII。

5.pQE-TAT-PEIII重组质粒经位于PEIII目的片段5’端的PstI和3’端的HindIII双酶切后，即为线性化的pQE-TAT载体，还可用于克隆其它的目的片段。

实施例二、PCR扩增同时含有Tat PTD和PEIII的目的基因

1.PCR扩增及产物回收

反应体系如下：

pQE-PE重组质粒模板            1μl

P_TAT(8.3μmol/L)              2μl

P2(6.7μmol/L)                2μl

dNTPs(每个2.5mmol/L)          1μl

Ex Taq DNA聚合酶(5U/μl)      0.5μl

10×PCR buffer                5μl

25mmol/L MgCl₂     4μl

50％甘油           5μl

DMSO               2.5μl

ddH₂O              27μl

                            

Total              50μl

PCR反应条件：94℃，2min；94℃，40sec，→48℃，40sec，→72℃，1min，2个循环；94℃，40sec，→58℃，40sec，→72℃，1min，20个循环；72℃，10min。

电泳证实扩增出了与预期大小相符的目的片段后，采用胶回收试剂盒回收纯化目的片段，-20℃保存备用。

在PCR扩增的上游引物中，引入了Tat PTD的碱基序列，通过PCR扩增，可以实现Tat PTD和PEIII片段目的基因的融合

结论：

以pQE-PE重组质粒为模板，用5′端引入HIV Tat PTD核心序列的P_TAT和5′端引入HindIII酶切位点的P2为引物，进行PCR扩增反应，1％琼脂糖凝胶电泳显示，在700bp左右有一清晰条带，与设计的片段大小(729bp)相符(见图2-1)。

实施例三、pUCm-T-TAT-PEIII重组质粒的构建

1.pUCm-T载体与TAT-PEIII PCR产物的连接反应

pUCm-T载体                      1μl

PCR产物(TAT-PEIII)              3μl

10×buffer for T4 DNA Ligase    1μl

T4 DNA Ligase(5U/μl)           1μl

PEG4000                         1μl

ddH₂O         3μl

                         

Total         10μl

反应条件：16℃，16h，→65℃，10min。

2.连接产物转化大肠埃希菌JM109

取5μl连接产物转化到100μl JM109感受态细胞中，取200μl转化产物涂布LB(AMP)平板(表面涂布X-gal和IPTG)，37℃孵育18h。

3.筛选阳性重组子

从转化平板上随机挑取8个白色菌落，分别接种于3ml LB(AMP)液体培养基，37℃振摇培养18h。碱裂解法少量提取质粒，用PvuII、HindIII进行双酶切鉴定，酶切体系如下：

质粒DNA                8μl

PvuII(12U/μl)         0.5μl

HindIII(15U/μl)       0.5μl

10×M buffer           1μl

                                

Total                  10μl

反应条件：37℃，3h。酶切产物行1％琼脂糖凝胶电泳分析，同时对筛选到的重组质粒进行核苷酸测序鉴定。

实施例四、pQE-TAT-PEIII重组质粒的构建(参见图1)

1.BamH I酶切pQE-31质粒及酶切产物回收

pQE-31质粒的BamH I酶切反应体系：

pQE-31质粒           67μl

BamH I(10U/μl)      5μl

10×buffer             8μl

                                  

Total                  80μl

反应条件：37℃，3h。采用1％琼脂糖凝胶电泳、胶回收试剂盒回收上述pQE-31经BamHI酶切线性化质粒，回收产物溶于30μl ddH₂O中，于-20℃保存备用。

2.3’突出端补平

反应体系如下：

pQE-31/BamHI线性化质粒              30μl

5×buffer                           8μl

dNTPs(每个2.5mmol/L)                1.5μl

T4 DNA Polymerase                   0.8μl

                                             

Total                               40.3μl

混匀后置于PCR仪中，反应条件：11℃，20min，→70℃，10min。

采用1％琼脂糖凝胶电泳、胶回收试剂盒回收补平的pQE-31/BamHI线性化质粒，回收产物溶于25μl ddH₂O中，于-20℃保存备用。

3.HindIII酶切及酶切产物回收

反应体系如下：

补平的pQE-31/BamHI线性化质粒           25μl

HindIII(15U/μl)                       2μl

10×M buffer                           3μl

                                              

Total                                  30μl

反应条件：37℃，3h。采用1％琼脂糖凝胶电泳、胶回收试剂盒回收上述pQE-31经BamHI及HindIII酶切的线性化质粒，回收产物溶于20μl ddH₂O中，于-20℃保存备用。

4.pUCm-T-TAT-PEIII重组质粒的双酶切反应：

反应体系如下：

pUCm-T-TAT-PEIII质粒        48μl

PvuII(12U/μl)              3μl

HindIII(15U/μl)            3μl

10×M buffer                6μl

                                      

Total                       60μl

反应条件：37℃，3h。采用1％琼脂糖凝胶电泳、胶回收试剂盒回收纯化，回收产物溶于20μl ddH₂O中，于-20℃保存备用。

5.双酶切产物连接反应

反应体系如下：

pQE-31片段                      6μl

TAT-PEIII片段                   8μl

T4DNA Ligase(5U/μl)            1μl

10×buffer for T4DNA Ligase     1.6μl

                                          

Total                           16.6μl

混匀后置于PCR仪中，反应条件：16℃，16h，→65℃，10min。

6.连接产物转化JM109

取10μl连接产物转化到100μl JM109感受态细胞中，涂布LB(AMP)平板，37℃孵育18h，观察菌落生长情况。

7.阳性重组子的筛选、鉴定

挑取转化平板上的菌落，接种于4ml含AMP的LB液体培养基中，37℃振摇培养18h，碱裂解法少量提取质粒，用PstI、HindIII进行酶切鉴定，同时对筛选到的重组质粒进行核苷酸测序鉴定。

结论：

pQE-TAT-PEIII重组质粒双酶切及核苷酸测序鉴定

将TAT-PEIII的PCR纯化产物与pUCm-T载体连接，筛选到的阳性pUCm-T-TAT-PEIII重组质粒经PvuII/HindIII双酶切后、回收纯化，与经BamHI酶切、3’突出端补平、HindIII酶切的pQE-31质粒片段进行连接，连接产物转化JM109细菌感受态细胞，挑取菌落，提取质粒DNA，用PstI/HindIII进行双酶切鉴定，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳，结果见图2-2。由图可见，阳性重组质粒可切出预期大小片段(理论值为645bp)。对重组质粒进行核苷酸测序，结果表明，重组质粒的序列和阅读框均正确，与我们最初的分子设计完全吻合(见图3)。

实施例五、目标蛋白的放大表达及包涵体制备

依照小规模培养法，各种成分按比例增加到2000ml，用LB培养基对pQE-TAT-PEIII/JM109工程菌进行培养和表达，以扩大产量。按如下方法制备包涵体：

1.8000rpm离心收集表达菌体，每升培养物可产生3～4g湿细胞沉淀。按每克细胞沉淀加3ml buffer A充分混悬细菌，13000g离心10min。

2.将沉淀重悬于10倍体积的buffer A中，加入8μl 100mmol/L PMSF。在冰浴中超声破菌，设置条件为：工作3sec，间歇2sec，全程40min，取样涂片，用显微镜观察破菌情况。

3.超声结束后，加Triton X-100，使终浓度为0.1％，混匀，4℃静置30min。

4.13000g离心1h。弃上清，将沉淀重悬于3倍体积的buffer A中。

5.13000g离心10min。将沉淀重悬于3倍体积的buffer A中。

6.13000g离心20min。将沉淀重悬于9倍体积含0.1％β-巯基乙醇的buffer B中，4℃冰箱放置2h，不时摇动以溶解包涵体。将裂菌液上清及沉淀溶解液上清取样行SDS-PAGE电泳分析。

结论：

pQE-TAT-PEIII重组质粒在JM109中的诱导表达

将pQE-TAT-PEIII重组质粒转化大肠埃希菌JM109，筛选到了表达稳定的pQE-TAT-PEIII/JM109工程菌。将筛选到的阳性工程菌pQE-TAT-PEIII/JM109过夜培养后，次日按1∶50的比例扩大培养至A₆₀₀≈0.6，加入IPTG至终浓度为100μmol/L，37℃诱导表达5h，取适量的表达菌行SDS-PAGE电泳，结果如图4所示，从图中可见阳性重组子在约27kDa处有一条蛋白带，此蛋白与推测的融合蛋白分子量大小相符，为序列正确的阳性重组子表达产物。实施例六、TAT-PEIII融合蛋白的亲和层析纯化

1.用Qiagen公司的Ni-NTA纯化系统，采用pH洗脱的方法对目标蛋白进行亲和层析纯化。

2.取2ml填料，离心去掉保存液，并用buffer B(pH8.0)洗涤两次，再用其重悬填料，然后装柱，采用buffer B平衡柱子，取经0.22μm滤膜过滤的TAT-PEIII包涵体溶解液上清3ml上样，续以buffer C(pH 6.3)冲洗杂蛋白，待UV值回归基线后，用buffer D(pH4.5)洗脱目标融合蛋白，收集UV＞0.05的峰，最后用buffer B净化平衡柱子。

将上述各步留取的样品作SDS-PAGE电泳分析。

结论：

TAT-PEIII融合蛋白的Ni-NTA亲和柱层析

从亲和层析纯化图谱(图5)可见，加入pH4.5的buffer D后，出现一洗脱峰；SDS-PAGE电泳显示(图6)，在亲和层析穿过峰中无目标蛋白质存在，洗脱峰中含分子量约27kD的蛋白质，与TAT-PEIII融合蛋白理论分子量相符，说明在载量范围内，亲和层析柱可完全捕获该融合蛋白；且捕获的融合蛋白纯度高，基本无杂蛋白存在，表明采用亲和层析可实现TAT-PEIII融合蛋白的一步纯化。

实施例七、目标蛋白的透析复性

TAT-PEIII融合蛋白的等电点为8.44，在pH9.0的透析液中进行复性。

1.调整亲和层析洗脱蛋白的浓度为0.1mg/ml，将稀释后的变性蛋白溶液装入预先处理好的透析袋(截留分子量1.4kD)中。

2.将透析袋放入一只装有400ml透析液I的烧杯中，4℃，搅拌透析3～4h。更换新的透析液I，重复此步骤两次。

3.将透析袋放入400ml透析液II中，4℃，搅拌透析3～4h。更换新的透析液II，重复此步骤两次。

4.将透析袋放入400ml 0.01mol/L的PBS中，4℃，搅拌透析3～4h。

5.将透析袋放入400ml灭菌去离子水中，4℃，搅拌透析3～4h。

6.将透析袋中溶液合并，冷冻干燥。用0.01mol/L的PBS溶解，0.22um滤膜过滤除菌，采用BCA法进行蛋白浓度测定。

实施例八、BCA法测定目标蛋白浓度

将已复性的蛋白浓缩冻干，TAT-PEIII冻于产物，用0.01mol/L的PBS溶解，0.22um滤膜过滤除菌，从中取2μl加入到98μl ddH2O中，以ddH2O为空白对照调零，在Smart Spec 3000分光光度计上采用BCA法进行蛋白含量测定。测得TAT-PEIII样品浓度为1.866mg/ml。

用该样品做活性鉴定。

实施例九、TAT-PEIII融合蛋白的体外抑瘤活性检测

(一)MTT法检测TAT-PEIII融合蛋白的体外抑瘤活性

1.细胞准备

B16细胞的培养、传代与冻存参照《细胞培养》的方法进行。

2.MTT检测：①将B16细胞以每孔10³～10⁴个细胞接种于96孔板，每孔200μl。培养24h～36h后，吸弃上清，每孔加入细胞培养液150μl，再加入不同浓度的TAT-PEIII融合蛋白，每种浓度以及对照各设3个复孔。每孔终体积为200μl，于37℃，5％CO2孵箱培养36h。②吸弃上清，以PBS洗一遍，每孔加入MTT(5mg/ml)20μl和细胞培养液180μl，继续培养4h。③吸弃每孔上清，加入150μl DMSO，终止培养，轻柔振荡混匀10min。④在680型酶标仪上以490nm波长测各孔光吸收值(OD)。⑤实验结果以细胞存活率表示：细胞存活率(％)＝(试验组OD值/对照组OD值)×100％。一般以细胞存活率对药物浓度对数作图并按作图法求出半数抑制浓度值(IC50)。

参见图7。采用MTT法测定了TAT-PEIII融合蛋白对肿瘤细胞的体外抑瘤活性，结果表明TAT-PEIII融合蛋白对B16黑色素瘤细胞的半数抑制浓度(IC50值)为21.62μg/ml。

(二)TAT-PEIII融合蛋白对B16细胞作用的形态学检测

荧光显微镜观察：

PE分子的细胞毒功能非常强大，III区是毒性功能区，具有ADP-核糖基转移酶活性，通过对延伸因子-2的ADP-核糖基化抑制细胞的蛋白质合成而导致细胞死亡。而多细胞生物的细胞死亡存在两种不同形式：细胞凋亡与细胞坏死。细胞凋亡在一定情况下可转化为细胞坏死，但两者在形态学、生化代谢、分子机制、结局和意义等方面存在本质的区别。毒素分子通常以细胞坏死的形式引起细胞死亡。本文拟采用Hoechst/PI双染色法来检测TAT-PEIII融合蛋白究竟以何种形式引起B16细胞死亡。

染色方法：参照MTT实验的IC50结果，向一瓶生长良好的B16细胞中加入500μl 2.5mg/ml的TAT-PEIII融合蛋白，37℃，5％CO2孵箱中培养36h后，800rpm离心5min收集药物处理细胞，加入PBS，调细胞浓度至1×10⁶以上。从中吸取40μl至1.5mlEp管中，加入3～5μl Hoechst(终浓度10μg/ml)，37℃温育20～30min；再加入PI 3～5μl(终浓度10μg/ml)，4℃静置10～20min；取一滴于洁净载玻片上，加盖玻片，置荧光显微镜下观察。以未经TAT-PEIII融合蛋白处理的正常B16细胞为对照，同上染色。

采用Hoechst/PI双染色法进行形态学观察，结果显示，未经过干预的正常对照组仅见极少数细胞凋亡或坏死，可能为正常的细胞程序性死亡或机械操作引起的坏死。而与TAT-PEIII融合蛋白共孵育36h的B16细胞可见大量凋亡、坏死，表明TAT-PEIII融合蛋白对B16细胞具有明确的细胞毒作用；结果显示，多数细胞同时出现凋亡与坏死，提示死细胞大多源于凋亡后期的继发性坏死。

实施例十、TAT-PEIII融合蛋白的体内抑瘤活性检测

(一)荷瘤动物模型的建立

建立小鼠B16黑色素瘤模型，接种B16黑色素瘤细胞5×10⁵个/只的小鼠全部有肿瘤长出，一周成瘤率100％；荷瘤两周时，从40只荷瘤鼠中剔除成瘤不良的10只小鼠，将其余30只荷瘤鼠随机分为两组：A组为对照组，B组为治疗组，15只/组。

(二)荷瘤小鼠分组、给药治疗及观察

将成功荷瘤的小鼠随机分为两组，15只/组。

A组为对照组：植入肿瘤，观察黑色素瘤的生长情况。

B组为治疗组：荷瘤两周后开始给药，每天一次；参照MTT实验的IC50结果，每次向瘤体内直接注入TAT-PEIII融合蛋白约70μg。

4周后，所有动物均处死，取出黑色素瘤，称取瘤重。实体瘤的疗效以瘤重抑制百分率表示。计算方法为：瘤重抑制百分率＝(1-试验组瘤重/对照组瘤重)×100％。中草药抑制率大于30％，合成药大于40％，且有统计学意义，重复3次，疗效稳定，则评定有一定的抗肿瘤作用。

荷瘤两周后开始给药。每天一次，每次向瘤体内直接注入TAT-PEIII融合蛋白约70μg。给药时，对于直径小于2cm的肿瘤，细针穿刺至肿瘤的中心进行单点注射即可；而对于直径大于2cm的肿瘤，则沿穿刺路径由远及近连续注射或在两个路径上分别进行连续注射，以尽可能实现整个瘤体完全的药物转导。治疗过程中，未见荷瘤小鼠出现明显的全身不良反应。治疗4周后停药，停药次日处死小鼠，解剖皮下瘤块，称重。实体瘤的疗效以瘤重抑制百分率表示。TAT-PEIII蛋白对BALB/C小鼠黑色素瘤的瘤重抑制百分率＝(1-试验组瘤重/对照组瘤重)×100％＝52.75％，结果显示TAT-PEIII融合蛋白具有一定的抗肿瘤作用。

序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学

<120>一种用于肿瘤局部介入治疗的TAT-PEIII融合蛋白及制备方法

<130>7P99054-CN

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>242

<212>PRT

<213>TAT-PEIII融合蛋白的氨基酸序列

<400>1

Met Arg Gly Ser His His His His His His Thr Asp Pro Gly Tyr Gly

1               5                   10                  15

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Leu Gln Phe Leu Gly Asp

            20                  25                  30

Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val

        35                  40                  45

Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val

    50                  55                  60

Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val

65                  70                  75                  80

Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg

                85                  90                  95

Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln

            100                 105                 110

Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu

        115                 120                 125

Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser

    130                 135                 140

Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile

145                 150                 155                 160

Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu

                165                 170                 175

Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg

            180                 185                 190

Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly

        195                 200                 205

Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser

    210                 215                 220

Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp

225                 230                 235                 240

Leu Lys

<210>2

<211>729

<212>DNA

<213>编码TAT-PEIII的DNA序列

<400>2

atgagaggat ctcaccatca ccatcaccat acggatcctg gctatggcag gaagaagcgt    60

agacagagac gtagaggcct gcagttcctc ggcgacggcg gcgacgtcag cttcagcacc    120

cgcggcacgc agaactggac ggtggagcgg ctgctccagg cgcaccgcca actggaggag    180

cgcggctatg tgttcgtcgg ctaccacggc accttcctcg aagcggcgca aagcatcgtc    240

ttcggcgggg tgcgcgcgcg cagccaggac ctcgacgcga tctggcgcgg tttctatatc    300

gccggcgatc cggcgctggc ctacggctac gcccaggacc aggaacccga cgcacgcggc    360

cggatccgca acggtgccct gctgcgggtc tatgtgccgc gctcgagcct gccgggcttc    420

taccgcacca gcctgaccct ggccgcgccg gaggcggcgg gcgaggtcga acggctgatc    480

ggccatccgc tgccgctgcg cctggacgcc atcaccggcc ccgaggagga aggcgggcgc    540

ctggagacca ttctcggctg gccgctggcc gagcgcaccg tggtgattcc ctcggcgatc    600

cccaccgacc cgcgcaacgt cggcggcgac ctcgacccgt ccagcatccc cgacaaggaa    660

caggcgatca gcgccctgcc ggactacgcc agccagcccg gcaaaccgcc gcgcgaggac    720

ctgaagtaa                                                            729

Claims (10)

1.一种用于肿瘤局部介入治疗的TAT-PEIII融合蛋白，其特征在于，含有人类免疫缺陷病毒的TAT PTD和铜绿假单胞菌外毒素A的III区。

2.根据权利要求1所述的用于肿瘤局部介入治疗的TAT-PEIII融合蛋白，其特征在于，组成TAT-PEIII融合蛋白的TAT PTD不含有大肠埃希菌E.Coli的稀有密码子。

3.根据权利要求2所述的用于肿瘤局部介入治疗的TAT-PEIII融合蛋白，其特征在于，该TAT-PEIII融合蛋白具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

4.一种编码权利要求3所述的用于肿瘤局部介入治疗的TAT-PEIII融合蛋白的DNA序列，其特征在于其具有SEQ ID NO：2所示的序列或者编码相同蛋白质的与其具有遗传密码简并性的序列。

5.一种权利要求1所述的用于肿瘤局部介入治疗的TAT-PEIII融合蛋白的制备方法，其特征在于，将Tat PTD与PEIII融合制得，包含下列步骤：

确定人类免疫缺陷病毒的Tat PTD氨基酸所对应的核苷酸序列；

选择加在Tat PTD两侧的甘氨酸的密码子；

扩增同时含有Tat PTD和PEIII片断的目的基因。

6.根据权利要求5所述的TAT-PEIII融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述用于构建pQE-TAT-PEIII重组质粒的HIV Tat PTD的核苷酸序列为：tat ggc aggaag aag cgt aga cag aga cgt aga。

7.根据权利要求5所述的TAT-PEIII融合蛋白的制备方法，其特征在于，所选择的甘氨酸的密码子为ggc。

8.根据权利要求5所述的TAT-PEIII融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述目的基因长度为729bp。

9.一种表达权利要求5、6、7、8中任一项所述的目的基因的重组质粒，其特征在于，所述质粒载体为pQE-TAT-PEIII。

10.根据权利要求9所述的重组质粒，其特征在于，利用PvuII、HindIII酶切位点，将目的基因克隆于原核表达载体pQE-31中制得。

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