CN104119444B - 抗肿瘤融合蛋白及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了双功能抗肿瘤融合蛋白及其制备方法和用途。具体地，本发明公开了包含力达霉素辅基蛋白与内皮抑素的融合蛋白，所述融合蛋白可以用力达霉素发色团进行强化。还公开了重组产生所述融合蛋白的方法以及所述融合蛋白在治疗肿瘤中的用途。

Description

抗肿瘤融合蛋白及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及内皮抑素与力达霉素辅基蛋白的融合蛋白及其制备方法和用途。

背景技术

1971年Folkman教授(Folkman J.N Engl J Med.1971;285:1182-1186)提出肿瘤的生长依赖于血管新生。肿瘤组织中的新生血管为肿瘤生长提供营养和氧气，也是肿瘤侵袭和转移的主要途径。通常，良性肿瘤血管生成稀少，血管生长缓慢；而大多数恶性肿瘤的血管生成密集且生长迅速。因此，抑制血管新生能明显阻止肿瘤生长和扩散转移。近年来，针对肿瘤新生血管靶点的新抗癌药物(如贝伐单抗、索拉非尼、舒尼替尼)已经进入临床应用，并取得了良好的疗效。除此之外，作为内源性血管生长广谱抑制剂，内皮抑素(Endostatin)在小鼠体内可达到93％～97％的肿瘤抑制率，成为最引人注目的抗血管生成药物之一。内皮抑素是胶原蛋白XVIII羧基末端的水解片段，分子量约为20KD，含有184个氨基酸(O’Reilly,etal.(1997);Cell88(2):277-285)。世界上首例血管内皮抑制素抗癌新药，新型重组人血管内皮抑素——恩度(Recombinant human endostatin，rh-Endosmtin，Endostar)是在天然Endostatin的N-末端引入附加氨基酸序列MGGSHHHHH组成的，于2006年7月在中国上市开始临床使用，并且对晚期肺癌显示出较好的疗效。内皮抑素能特异性地作用于旺盛增殖的血管内皮细胞，并在肿瘤部位选择性地富集，这表明其具有靶向治疗肿瘤的潜力。

力达霉素(Lidamycin，LDM)，又被称作C1027，是大分子肽类抗肿瘤抗生素家族的成员之一，分离自球链霉菌(Streptomyces globisporus)(Hu et al.,J Antibiot1988;41:1575-1579)。力达霉素分子由烯二炔类发色团和110个氨基酸的力达霉素辅基蛋白(Lidamycin apoprotein,LDP)非共价结合形成。其中发色团和辅基蛋白可以被拆分和重建，重建的分子保留与原始分子相似的、强烈的抗肿瘤生物学活性。LDP特异性结合很多肿瘤组织，其本身也具有抗肿瘤作用。

尽管血管抑制剂类药物如恩度和化疗药物联合使用是本领域常用的治疗方案，但本领域并没有关于内皮抑素和力达霉素联合使用的报道。

发明概述

在第一方面，本发明提供了一种分离的融合蛋白，其包含力达霉素辅基蛋白和内皮抑素。在一些实施方式中，所述力达霉素辅基蛋白包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述内皮抑素包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述内皮抑素包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。

本发明的融合蛋白中的所述力达霉素辅基蛋白和内皮抑素可以通过连接肽连接。在一些实施方式中，所述连接肽包含SEQ ID NO:3所示的序列。

在一具体实施方式中，本发明的融合蛋白包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

本发明的所述融合蛋白可以用聚乙二醇修饰。在一实施方式中，所述聚乙二醇的分子量为20-40kD。在一具体实施方式中，所述聚乙二醇的分子量为20kD。本发明的所述融合蛋白可以用单甲氧基聚乙二醇进行修饰。在一具体实施方式中，所述融合蛋白用单甲氧基聚乙二醇丙醛进行修饰。

在一些实施方式中，本发明所述融合蛋白还与力达霉素发色团结合。

在第二方面，本发明还提供了多核苷酸，其包含编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列。在一些具体实施方式中，本发明的多核苷酸包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。

在第三方面，本发明还提供了表达构建体，其包含本发明的多核苷酸。

在第四方面，本发明还提供了宿主细胞，其包含本发明的多核苷酸或以本发明的表达构建体转化，其中所述宿主细胞能够表达本发明所述的融合蛋白。

在第五方面，本发明还提供了产生本发明的融合蛋白的方法，包括：在适合融合蛋白表达的条件下培养本发明的宿主细胞；和回收所表达的融合蛋白。

在第六方面，本发明还提供了本发明的融合蛋白在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。由此，本发明最后一个方面是提供用于治疗肿瘤的药物组合物，其含有本发明的融合蛋白及药物学上可接受的载体。

附图说明

图1显示融合蛋白的构建与表达。A：融合蛋白ES-LDP和LDP-ES构建示意图；B：融合蛋白ES-LDP和LDP-ES的初步诱导表达；C：融合蛋白ES-LDP和LDP-ES的蛋白质印迹分析。

图2重组表达的融合蛋白的鉴定。A：复性后融合蛋白ES-LDP经纯化后SDS-PAGE结果，其中左侧为还原电泳结果，右侧为非还原电泳结果；B：复性后融合蛋白LDP-ES经纯化后SDS-PAGE图谱，其中左侧为还原电泳，右侧为非还原电泳；C：复性后融合蛋白ES-LDP的RP-HPLC分析；D：复性后融合蛋白LDP-ES的RP-HPLC分析；E：融合蛋白ES-LDP结合发色团后的特征性吸收峰；F：融合蛋白LDP-ES结合发色团后的特征性吸收峰；G：融合蛋白ES、ES-LDP和LDP-ES荧光发射光谱对比检测；H：融合蛋白MES、ES-LDP和LDP-ES圆二色性对比检测。

图3融合蛋白对细胞迁移的影响。A：ES-LDP和LDP-ES对人微血管内皮细胞HMEC迁移的抑制作用；B：ES-LDP和LDP-ES对乳腺癌细胞4T1细胞迁移的抑制作用。

图4融合蛋白抑制HMEC体外血管生成。A：ES-LDP和LDP-ES对HMEC体外血管生成分支点数量的影响；B：ES-LDP和LDP-ES对HMEC体外血管生成长度的影响。

图5表示ES-LDP和LDP-ES对ERK1/2信号通路和细胞周期蛋白Cyclin D1的影响。

图6表示ES-LDP和LDP-ES对人肺癌细胞裸鼠移植瘤模型PG-BE1的生长抑制作用。其中A(实验1)和B(实验2)为对肿瘤体积的影响。A：(●)对照组；(■)ES组(12mg/kg)；(▲)ES-LDP组(18mg/kg)；(▼)LDP-ES组(18mg/kg)；B：(●)对照组；(■)LDM组(0.05mg/kg)；(▲)LDP-ES-AE组(0.15mg/kg)；(▼)LDP-ES-AE组(0.30mg/kg)；(◆)LDP-ES-AE组(0.60mg/kg)；(○)ES-LDP-AE组(0.15mg/kg)；(□)ES-LDP-AE组(0.30mg/kg)。C(实验1)和D(实验2)为对动物体重的影响。C：(●)对照组；(■)ES组(12mg/kg)；(▲)ES-LDP组(18mg/kg)；(▼)LDP-ES组(18mg/kg)；D：(●)对照组；(■)LDM组(0.05mg/kg)；(▲)LDP-ES-AE组(0.15mg/kg)；(▼)LDP-ES-AE组(0.30mg/kg)；(◆)LDP-ES-AE组(0.60mg/kg)；(○)ES-LDP-AE组(0.15mg/kg)；(□)ES-LDP-AE组(0.30mg/kg)。

图7PG-BE1肿瘤血管生成和增殖的免疫组化分析结果。

图8ES-LDP对4T1-luc实验性肺转移的影响。A：小动物活体成像检测；B：肺部表面转移灶统计；C：增加的肺重。

图9表示FITC标记的LDP、ES-LDP和LDP-ES在荷瘤小鼠体内分布情况的活体成像。

图10表示PEG化修饰的融合蛋白的细胞学活性测定

发明详述

本发明提供了一种分离的融合蛋白，其包括力达霉素辅基蛋白(LDP)和内皮抑素。该融合蛋白具有内皮抑素和LDP的靶向性，还具有内皮抑素的抗血管生成活性和LDP的抗肿瘤活性，并且能够在与力达霉素发色团结合后产生强烈的杀伤肿瘤细胞的作用，是一种既靶向血管又具有细胞毒作用的双功能融合蛋白，可用于肿瘤治疗。

在一些实施方式中，所述力达霉素辅基蛋白包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

在另一些实施方式中，所述力达霉素辅基蛋白包含与SEQ ID NO:1具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列相同性并具有力达霉素辅基蛋白生物学活性的氨基酸序列。

在另一些实施方式中，所述力达霉素辅基蛋白包含SEQ ID NO:1经过取代、缺失或添加一或多个氨基酸残基所获得的保留力达霉素辅基蛋白生物学活性的氨基酸序列。

如本文所用，“力达霉素辅基蛋白生物学活性”包括靶向肿瘤组织，与力达霉素发色团非共价结合，杀伤肿瘤细胞等等。

在一些实施方式中，所述内皮抑素包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

在另一些实施方式中，所述内皮抑素包含与SEQ ID NO:2具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列相同性，并具有内皮抑素生物学活性的氨基酸序列，如SEQ ID NO:11所示的序列。

在另一些实施方式中，所述内皮抑素包含SEQ ID NO:2经过取代、缺失或添加一或多个氨基酸残基所获得的具有内皮抑素生物学活性的氨基酸序列。

如本文所用，“内皮抑素生物学活性”包括特异性地与新生血管内皮细胞结合并抑制血管生成，选择性地在肿瘤部位积聚，抑制肿瘤生长或迁移等等。

如本文所用，“包含”一词在描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。例如，本领域已知，当在大肠杆菌表达系统中表达时，一定比例的所表达的重组蛋白会保留起始密码子“ATG”编码的起始甲硫氨酸残基。因此，本发明的融合蛋白也可以包含额外的起始甲硫氨酸残基。此外，为了增加可溶性表达及方便纯化，还可以在靶氨基酸序列末端添加本领域熟知的表达标签，添加这样的标签不会从实质上改变蛋白质的功能，如MGGSHHHHH。带有该附加氨基酸序列的蛋白即恩度(Endostar)(SEQID NO:11)，系统比对试验证明，其理化性质及生物学活性与天然内皮抑制素(Endostatin)相比没有本质差异，但部分性能有所提高(Biochemistry,2010,49:6420-6429,IUBMBLife,2009,61(6):613-626)。经PEG修饰后，恩度与天然内皮抑制素的各项性能即不再有显著性差异（ZL200610011247.9）。因此，将融合蛋白中的内皮抑制素序列换成恩度的效果将是本领域技术人员可以预期的。

本领域已知可以对蛋白或多肽的氨基酸序列进行一或多个氨基酸残基的“取代、缺失或添加”，使得保留、基本上保留或增强其生物学活性。进行“取代、缺失或添加”的方法为本领域技术人员所熟知。例如，对蛋白或多肽可进行保守性氨基酸取代。即一种氨基酸残基被另一种具有类似化学性质，例如电荷或疏水性的侧链R基团的氨基酸残基所取代。一般而言，保守性氨基酸取代不会在实质上改变蛋白质的功能性质。

如本文所用，术语“序列相同性”是指氨基酸或核苷酸序列不变的程度。用于评价氨基酸或核苷酸之间的序列相同性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，氨基酸序列相同性通常使用序列分析软件来测量。例如，可使用NCBI数据库的BLAST程序来确定相同性。对于序列相同性的确定，可以参见例如：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics andGenome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysisof Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,NewJersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,AcademicPress,1987和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,MStockton Press,New York,1991。

融合蛋白中不同部分的相互协同与各部分的正确的空间构象密切相关。在本领域中，在融合蛋白的构建中可以用“连接肽”来连接融合蛋白的不同部分，使各部分充分展开，互不干扰地充分折叠成各自天然构象。所述连接肽通常是由低疏水性和低电荷效应的氨基酸组成的柔性多肽。本领域常用的连接肽富含Gly、Ser、Pro、Ala、Thr等氨基酸，尤其是Gly和Ser。

因此，本发明的融合蛋白中的力达霉素辅基蛋白和内皮抑素可以通过连接肽连接。在一具体实施方式中，本发明的融合蛋白中使用的连接肽是由Gly和Ser组成的多肽Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO:3)。在一具体实施方式中，本发明的融合蛋白包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

本发明的融合蛋白还可以包括额外的修饰，例如与生物相容性大分子聚合物共价连接，从而延长融合蛋白在体内的半衰期，降低免疫原性，避免蛋白酶的降解或增加可溶性。在一些实施方式中，用聚乙二醇(PEG)修饰本发明的融合蛋白。使用的聚乙二醇可以具有例如约5kD-约50kD、约20kD-约40kD或约20kD的分子量。在一具体的实施方式中，用来修饰融合蛋白的聚乙二醇是单甲氧基聚乙二醇。在一更具体的实施方式中，使用单甲氧基聚乙二醇丙醛修饰本发明的融合蛋白。用PEG修饰蛋白质的方法为本领域技术人员所熟知。

“力达霉素发色团”是指完整的力达霉素分子(LDM)中包含的活性烯二炔类发色团(active enediyne chromophore,AE)。LDM由力达霉素辅基蛋白(LDP)和活性烯二炔类发色团(AE)非共价结合形成。力达霉素发色团是力达霉素的活性部分，在抗肿瘤中发挥主要作用，而LDP保护发色团并将发色团携带至肿瘤部位。LDP与力达霉素发色团结合后具有强烈的肿瘤细胞杀伤作用。因此，本发明的融合蛋白可以与力达霉素发色团结合，从而强化其肿瘤细胞杀伤作用。本发明中使用的力达霉素发色团可以通过层析方法由LDM分离获得(GuoXF,et al.Clin Cancer Res.2010,16:2085-94；Zhong G,et al.Cancer Lett.2010,295:124-33；中国专利公开号CN101475643和CN101497666)。

本发明还提供了包含编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列的多核苷酸。根据密码子表，本领域技术人员可以容易地从本发明的融合蛋白的氨基酸序列推导出相应的核苷酸序列。编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列还可以针对不同的宿主细胞(如大肠杆菌)进行密码子优化，从而改善融合蛋白的表达。进行密码子优化的方法为本领域技术人员所熟知。在一些具体实施方式中，本发明的多核苷酸包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。

本发明也涉及包含本发明上述的多核苷酸的表达构建体。在本发明的表达构建体中，编码所述融合蛋白的多核苷酸的序列与表达控制序列可操纵地连接以进行希望的转录及最终在宿主细胞中产生所述融合蛋白。合适的表达控制序列包括但不限于启动子、增强子、核糖体作用位点如核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、转录终止序列和稳定mRNA的序列等等。

用于本发明的表达构建体的载体包括那些在宿主细胞中自主复制的载体，如质粒载体；还包括能够整合到宿主细胞DNA中并和宿主细胞DNA一起复制的载体。可商购获得许多适于本发明的载体。在一个具体实施方式中，本发明的表达构建体衍生自Novagen公司的pET30a。

本发明还提供一种宿主细胞，其含有本发明的多核苷酸或以本发明的表达构建体转化，其中所述宿主细胞能够表达本发明的融合蛋白。用于表达本发明融合蛋白的宿主细胞包括原核生物、酵母和高等真核细胞。示例性的原核宿主包括埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙门氏菌属(Salmonella)以及假单胞菌属(Pseudomonas)和链霉菌属(Streptomyces)的细菌。在一些实施方式中，所述宿主细胞是埃希氏菌属细胞，例如大肠杆菌。在本发明的一个具体实施方式中，所使用的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)菌株细胞(Novagen)。

可以通过许多本领域已熟知的技术之一将本发明的重组表达构建体导入宿主细胞，这样的技术包括但不限于：热激转化，电穿孔，DEAE-葡聚糖转染，显微注射，脂质体接介导的转染，磷酸钙沉淀，原生质融合，微粒轰击，病毒转化及类似技术。

由此，还提供了产生本发明的融合蛋白的方法，包括：在适合融合蛋白表达的条件下培养本发明的宿主细胞；和回收所表达的融合蛋白。

在另一个方面，本发明还提供了包含本发明的融合蛋白的药物组合物，其用于治疗肿瘤。所述肿瘤包括但不限于肺癌、乳腺癌等。适当地，所述药物组合物进一步包含药物学上可接受的载体。

如本文所用，“药物学上可接受的载体”是指可以安全地进行施用的固体或液体填充物、用于稀释的物质等。依照施用时的特殊途径，可以使用本领域中所熟知的各种不同的载体。这些载体可包括糖类，淀粉，纤维素及其衍生物，麦芽糖，明胶，滑石，硫酸钙，植物油，合成油，多元醇，藻酸，磷酸缓冲液，乳化剂，等张盐水，以及无热原水等等。

可用任何安全途径为患者提供本发明的药物组合物。可使用例如经口，直肠，肠外注射，舌下，口腔，静脉内，关节内，肌肉内，真皮内与皮下的注射，或经吸入，眼球内，腹膜内，脑室内或经透皮肤等及其类似途径。

可以药物有效量施用本发明的药物组合物。对患者施用的剂量应当足以在一段适当时间后在患者身上产生有利的应答。施用剂量应由医师判断，视施用对象的各种因素而定，如年龄、性别、体重及其一般健康状况等。

实施例

下面将通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所描述的实施例范围中。

实施例1、制备重组表达构建体

LDP和内皮抑素构成的融合蛋白的DNA编码框通过PCR和分子克隆技术制备获得。融合蛋白的全长编码序列包含编码LDP的核苷酸序列(SEQ ID NO:8)和编码内皮抑素的核苷酸序列(SEQ ID NO:9)，中间由编码连接肽GGGSGGSG的序列(SEQ ID NO:10)隔开。所获得的全长编码序列插入到pET30a的表达载体中得到表达构建体。如图1A所示，构建了两种分别被命名为ES-LDP(SEQ ID NO:4)和LDP-ES(SEQ ID NO:5)的融合蛋白。编码这两种融合蛋白的多核苷酸片段(SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7)分别插入到pET30a表达载体中，然后转化到BL21(DE3)感受态细胞中。

实施例2、融合蛋白的表达、纯化、复性和鉴定

利用实施例1中获得的转化的细胞大规模表达所述融合蛋白。通过SDS-PAGE(图1B)和蛋白质印迹(图1C)的方法检测融合蛋白的表达情况。所表达的融合蛋白纯化并复性后分别进行SDS-PAGE、HPLC分析。结果如图2所示：图2A表示复性后的融合蛋白ES-LDP纯化之后SDS-PAGE图谱，其中：左侧为还原电泳；右侧为非还原电泳；图2B表示复性后融合蛋LDP-ES在纯化后SDS-PAGE图谱，其中：左侧为还原电泳；右侧为非还原电泳；图2C表示复性后融合蛋白ES-LDP的RP-HPLC分析，图2D表示复性后融合蛋白LDP-ES的RP-HPLC分析；图2G表示ES和融合蛋白ES-LDP和LDP-ES荧光发射光谱对比检测；图2H表示ES和融合蛋白ES-LDP和LDP-ES圆二色性对比检测。结果发现ES、ES-LDP和LDP-ES具有相似的吸收峰，表明ES蛋白复性形成了正确的空间结构。

实施例3、融合蛋白ES-LDP和LDP-ES与力达霉素发色团的结合

取高活性的力达霉素纯品(由中国医学科学院医药生物技术研究所制备和保存)，经C4柱分离活性发色团，流动相为水：乙腈：三氟乙酸(78%：22%：0.05%)，监测350nm处的吸光值，收集力达霉素发色团。将实施例2获得的融合蛋白与力达霉素发色团按照1:4的摩尔比混合，置于摇床上缓慢晃动，4℃避光反应16小时。将混合液经Sephadex G-25柱除去未结合上的力达霉素发色团，用HPLC(C4300A柱)检测340nm处的吸光值(图2E和F)。根据峰面积和相同条件下建立的力达霉素发色团吸光值标准曲线计算两种融合蛋白各自结合效率，结果如表1所示，表明了ES-LDP对力达霉素发色团的结合效率高于LDP-ES。下文中用ES-LDP-AE和LDP-ES-AE分别表示用力达霉素发色团强化的ES-LDP和LDP-ES融合蛋白。力达霉素发色团的结合表明两种融合蛋白中的LDP均具有正确的空间构象。

表1ES-LDP和LDP-ES的发色团结合效率比较

实施例4、经力达霉素发色团强化的ES-LDP和LDP-ES对内皮细胞和和肿瘤细胞的细胞毒作用

取对数生长期的人微血管内皮细胞HMEC（由中国科学院药物研究所惠赠）、小鼠乳腺癌细胞4T1（购自中国医学科学院药物研究所）和人肺巨细胞癌PG-BE1细胞（购自中国医学科学院基础医学研究所），用胰酶消化后计数，以4000个细胞/孔接种于96孔板中，37℃培养24小时后吸弃培养液，加入以培养液稀释的不同浓度的力达霉素或强化的融合蛋白LDP-ES-AE和ES-LDP-AE各100μl/孔，每个药物浓度设三个平行孔。继续培养48小时后，每孔加入10μl CCK-8（同仁化学，Lot.DL765），37℃继续培养1小时后，酶标仪上测定490nm处的吸光值。每次实验均设无药对照孔和无细胞对照孔各3孔，按下面公式计算细胞的存活率及强化融合蛋白的IC50值：细胞存活率=(A_加药组-A_空白组)/(A_对照组-A_空白组)×100%。结果如表2所示，表明强化融合蛋白与LDM具有相似的IC50，在10^-9和10^-10M之间，因ES-LDP结合效率较高，故对HMEC和肿瘤细胞保持了较高的细胞毒性，与LDM的IC50值更为接近，而LDP-ES结合效率较低，有一部分蛋白没有完全被强化。

表2对HMEC和不同肿瘤细胞IC50的测定

实施例5、ES-LDP和LDP-ES对HMEC和4T1迁移的影响：

细胞迁移采用伤口愈合测定(wound-healing assay)进行评价。将HMEC或4T1细胞以5x10⁵个细胞/孔接种入24孔板(CytoSelect^TM24-Well Wound Healing Assay Kit)，37℃培养过夜。待细胞贴壁后取下中间的塞子，用PBS冲洗两次洗去未贴壁和死亡的细胞，底部形成规则的缺损。加入含不同浓度ES、ES-LDP或LDP-ES的培养基继续培养至对照组（各组培养液中均含有VEGF）缺损完全闭合。然后吸弃培养基依次加入固定液和染色液（CELLBIOLABS,INC CBA120），室温晾干在显微镜下拍照，采用Image-Pro Plus6.0软件测量剩余缺损的面积，计算细胞迁移百分率=(1-剩余缺损面积)/缺损总面积×100%。结果示于图3。图3A表示ES-LDP和LDP-ES对人微血管内皮细胞HMEC迁移的抑制作用；图3B表示ES-LDP和LDP-ES对乳腺癌细胞4T1细胞迁移的抑制作用。结果表明ES-LDP和LDP-ES能抑制HMEC和4T1细胞的迁移，效果与ES相似；其中ES-LDP与ES比较有显著的统计学差异。

实施例6、ES-LDP和LDP-ES抑制HMEC体外血管生成

体外抑制HMEC血管生成的实验采用基于基质胶的测定进行评价。实验步骤如下：在96孔板每孔包被60μl基质胶，37°C培养1h，随后每孔用100μl含有1.5×10⁴HMEC的培养基接种。培养基中分别含有不同浓度的ES、ES-LDP或LDP-ES，每组3个复孔。37°C培养24h后在显微镜下照相，然后利用Image-Pro Plus6.0软件测量HMEC形成的分支点数目和血管长度。结果如图4所示。图4A表示ES-LDP和LDP-ES对HMEC体外管腔生成分支点数量的影响；图4B表示ES-LDP和LDP-ES对HMEC体外管腔生成长度的影响。实验结果表明ES-LDP或LDP-ES均能显著抑制管腔生成，其中从抑制管腔新生长度来看，高浓度时ES-LDP与ES相比具有显著统计学意义。

实施例7、ES-LDP和LDP-ES减少ERK1/2的磷酸化并降低Cyclin D1的表达

将HMEC细胞以1×10⁶/孔接种入6孔板，37℃孵育24h使之贴壁。然后分别加入终浓度10μM的ES、ES-LDP或LDP-ES处理。24h后收集细胞用冰预冷的PBS洗2次，离心弃上清液，加入100μl细胞裂解液(2%SDS,10%甘油,625mM Tris-HCl,pH6.8)冰上裂解15min。随后于4℃，12000rpm离心20分钟，收集上清液。用BCA试剂盒（Lot#171928）进行蛋白定量，取50μg蛋白与适量5×上样缓冲液混合，沸水浴中变性5分钟。配制12%的分离胶和5%的浓缩胶进行SDS-PAGE电泳分析。电泳完毕后进行转膜，将蛋白转移至PVDF膜上。5%脱脂奶室温封闭2h。所用的一抗为β-actin(中杉金桥，ZB-2301),ERK（#5013）,pERK（#4307）,和cyclin D1（#2978）(Cell Signalling,MA,USA,稀释1:1,000)，室温孵育2h，TBST洗膜3次。然后加入羊抗鼠/兔HRP标记的二抗(中衫金桥，稀释1:5,000)，室温孵育2h，TBST洗膜3次。将Millipore公司的检测液A和B（Lot No.1118802）以1：1混合，对PVDF膜进行显色，凝胶成像系统拍照保存结果(图5)。结果表明ES-LDP和LDP-ES减少ERK1/2的磷酸化并降低CyclinD1的表达。

实施例8、ES-LDP和LDP-ES以及用发色团强化的融合蛋白对裸鼠移植瘤PG-BE1生长的抑制作用

首先取体重为18-22g的雌性BALB/c裸鼠2只以建立移植瘤传代模型，将人肺巨细胞癌PG-BE1细胞接种于裸鼠腋窝皮下，每只接种1×10⁷个细胞。待瘤块长至足够大小时，将其在无菌生理盐水中剪成2×2×2mm³的小块，用套管针将瘤块分别移植到另外60只裸鼠右腋窝皮下，用火胶棉将切口粘住。待瘤块长至100mm³大小时，将裸鼠按照瘤块大小和体重进行分组，使每组瘤块大小平均值为100mm³，且各组体重平均值接近，每组6只裸鼠。当肿瘤体积为100mm³时给药。实验1：ES、ES-LDP和LDP-ES腹腔注射，每周三次，连续给药两周，对照组不做任何处理。实验2：将不同浓度的LDM和强化的融合蛋白通过尾静脉给药，每只裸鼠注射200μl，对照组给等体积生理盐水。第一次给药后的第7天，按照相同的剂量再次给药一次。实验期间每3天测量一次肿瘤直径和体重，根据公式V=ab²/2计算肿瘤体积(a：肿瘤长径，b：肿瘤短径)，绘制肿瘤生长曲线，观察体重变化(图6)。实验第30天处死动物，分离肿瘤并称重，计算抑瘤率(表3)。结果表明与对照组相比，ES、LDM、LDP-ES-AE和ES-LDP-AE均有极显著抗肿瘤活性；与LDM相比，ES-LDP-AE有显著抗肿瘤活性。

表3：ES-LDP和LDP-ES以及强化融合蛋白对裸鼠移植瘤PG-BE1生长的抑制作用

*与对照组相比P＜0.05，**与对照组相比P＜0.01，#与LDM组相比P＜0.05。

实施例9、免疫组化分析融合蛋白对PG-BE1血管生成和细胞增殖的影响

PG-BE1荷瘤裸鼠处死后，取肿瘤组织固定、脱水、包埋；制成石蜡切片。石蜡切片脱蜡入水，热修复，用5%BSA封闭，分别采用抗-CD31（Santa，sc1506-R）和抗Ki-67的单抗（中杉金桥，ZM-0166）4℃孵育过夜。采用中衫金桥PV-9004通用免疫组化试剂继续孵育，DAB显色。苏木素复染，酒精分化，氨水泛蓝，二甲苯透明后中性树胶封片。显微镜下照相(图7)，并用Leica图像分析系统分析。结果表明融合蛋白引起的血管生成减少主要是由于LDM由ES靶向导致的；而由ES靶向的融合蛋白能显著导致肿瘤组织坏死增加，细胞增殖减弱。

实施例10、ES-LDP对4T1-luc实验性肺转移的抑制作用：

我们用静脉注射肿瘤细胞的实验性肺转移模型研究了ES-LDP对4T1-luc实验性肺转移的抑制作用。取体重为18-22g的雌性BALB/c鼠，每只尾静脉注射2×10⁵鼠4T1-luc乳腺癌细胞。3天以后将小鼠随机分为3组，每组10只。分别静脉注射ES或ES-LDP，对照组不做任何处理。7天后再给药1次。17天后，将小鼠采用异氟醚麻醉并且腹腔注射荧光素酶底物D-luciferin(150mg/kg)（Xenogen，Cat.No.P-1041）。采用XENGOEN的小动物活体成像仪器拍照(图8A)。然后将动物处死，取肺组织称重(图8C)并用10%中性福尔马林固定，在解剖显微镜下计数肺表面瘤结数(附图8B)。可以发现经ES和ES-LDP处理后，肺部转移的瘤结数明显减少。ES-LDP具有更强的抗转移作用，使肺部表面瘤结数减少51.4%，使增加的肺重减少56.7%；而ES分别使肺部表面瘤结数减少35.2%，使增加的肺重减少34.2%。实施例11、ES-LDP和LDP-ES荷瘤小鼠活体成像研究

用FITC分别标记10mg LDP、ES-LDP和LDP-ES，取体重18-22g雌性BALB/c裸鼠9只，接种PG-BE1瘤块，待肿瘤生长至体积约为200mm³，分为3组，每组分别静脉注射标记后的蛋白300μg。在1h、2h、4h、6h、12h将动物麻醉后，采用XENGOEN的小动物活体成像仪器拍照。研究发现ES-LDP在给药2h后开始在肿瘤部位聚集，大约6h后逐渐代谢消除。而LDP和LDP-ES处理组肿瘤部位几乎没有明显的药物富集现象。说明ES-LDP具有靶向体内肿瘤的活性，而这种活性主要由位于融合蛋白N端的内皮抑素来介导(图9)。

实施例12、PEG-ES-LDP和PEG-LDP-ES蛋白活性的测定

复苏一支人血管内皮细胞（HMEC），接入DMEM培养基，另加10%FBS和1%双抗，CO₂培养箱37℃培养。待细胞铺满约90%平皿面积时，直接吹打收获，计数后离心重悬为2×10⁵个/ml。取6个EP管，每管加入吹打均匀的细胞悬液400μl，分别加入ES，ES-LDP和PEG-ES-LDP（N-末端20kD单甲氧基聚乙二醇丙醛修饰的ES-LDP），LDP-ES和PEG-LDP-ES（N-末端20kD单甲氧基聚乙二醇丙醛修饰的ES-LDP）至终浓度1μM，对照孔加入等体积PBS。混匀后取200μl加入24孔板中的Transwell小篮中，平行复孔，37℃孵育30min，将孵育好的Transwell小篮转移至24孔板800μl含有1%FBS的DMEM培养基里，迁移6小时。迁移结束后，每孔用1ml4%的多聚甲醛固定1h，PBS清洗之后用结晶紫染色30min，然后用PBS清洗，使用棉签擦去小篮上层细胞再去拍照，每孔取上下左右共4个视野，将每种药物的8个视野计数，分别去掉一个最高值和一个最低值，计算平均迁移细胞数。如图10所示，PEG-ES-LDP和PEG-LDP-ES抑制内皮细胞迁移的活性和修饰前相比均有显著升高（P<0.05），说明PEG修饰对这两种融合蛋白的活性均有明显的改善。

Claims (21)

1.分离的融合蛋白，其包含力达霉素辅基蛋白和内皮抑素。

2.权利要求1的融合蛋白，其中所述力达霉素辅基蛋白由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成。

3.权利要求1的融合蛋白，其中所述内皮抑素由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成。

4.权利要求1的融合蛋白，其中所述内皮抑素由SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列组成。

5.权利要求1的融合蛋白，其中所述力达霉素辅基蛋白和内皮抑素通过连接肽连接。

6.权利要求5的融合蛋白，其中所述连接肽由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成。

7.权利要求6的融合蛋白，其由SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列组成。

8.权利要求1-7任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白以聚乙二醇修饰。

9.权利要求8的融合蛋白，其中所述聚乙二醇的分子量为20kD-40kD。

10.权利要求9的融合蛋白，其中所述聚乙二醇的分子量为20kD。

11.权利要求8的融合蛋白，其中所述聚乙二醇是单甲氧基聚乙二醇。

12.权利要求11的融合蛋白，其中所述聚乙二醇是单甲氧基聚乙二醇丙醛。

13.权利要求1-7、9-12中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白与力达霉素发色团结合。

14.权利要求8的融合蛋白，其中所述融合蛋白与力达霉素发色团结合。

15.多核苷酸，其由编码权利要求1-7中任一项的融合蛋白的核苷酸序列组成。

16.权利要求15的多核苷酸，其由SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列组成。

17.表达构建体，其包含权利要求15或16的多核苷酸。

18.宿主细胞，其包含权利要求15或16的多核苷酸或以权利要求17的表达构建体转化，其中所述宿主细胞能够表达所述融合蛋白。

19.产生融合蛋白的方法，包括：

在适合融合蛋白表达的条件下培养权利要求18的宿主细胞；和

回收所表达的融合蛋白。

20.权利要求1-14中任一项的融合蛋白在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。

21.用于治疗肿瘤的药物组合物，其包含权利要求1-14中任一项的融合蛋白及药物学上可接受的载体。

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