CN102391377A

CN102391377A - 一种可诱导和激活癌靶向t细胞的融合蛋白及制备方法及用途

Info

Publication number: CN102391377A
Application number: CN2011103388867A
Authority: CN
Inventors: 孙嘉琳
Original assignee: 孙嘉琳
Current assignee: Nanjing double bond targeted drug Technology Co., Ltd
Priority date: 2011-11-01
Filing date: 2011-11-01
Publication date: 2012-03-28
Anticipated expiration: 2031-11-01
Also published as: CN102391377B

Abstract

本发明公开了一种可诱导和激活癌靶向T细胞的融合蛋白及制备方法及用途，该蛋白包括与癌细胞作用的肽和共刺激分子B7.1，所述与癌细胞作用的肽选自转化生长因子-α、表皮生长因子、血管内皮细胞生长因子、促性腺激素释放激素或促胃液素释放肽，本发明的融合蛋白具有癌靶向作用，一方面可分别与VEGFR、EGFR、GnRH-R、或GRP-R作用，另一方面又与T细胞上表达的相应受体CD28和CTLA-4相互作用，这样就将T细胞靶向性定位到大量表达VEGFR、EGFR、GnRH-R、或GRP-R的癌细胞周围，实验证明，本发明的融合蛋白能够抑制肿瘤生长和引起癌细胞的凋亡。

Description

一种可诱导和激活癌靶向T细胞的融合蛋白及制备方法及用途

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白及制备方法及用途，属于生物医药领域。

背景技术

表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)、血管内皮细胞生长因子(Vascularendothelial cell growth factor，VEGF)、促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasinghormone，GnRH)和促胃液素释放肽(gastrin-releasing peptide，GRP)等的受体在各种肿瘤组织中大量表达，例如在肠黏膜肿瘤中的EGF受体比正常组织高出300倍(Gastroenterology，98，961-967，1990)。所以，异常高表达的EGF受体、VEGF受体、GnRH受体、GRP受体等成为引人注目的癌治疗靶点。转化生长因子-α(Transforming growth factor-α，TGF-α)的受体与EGF的受体相同。

上面这些细胞因子以及激素和多肽等可以与癌细胞上的相对应的受体(Receptor)相互作用。所以在它们的后面连接一个效应物例如毒素蛋白而形成融合蛋白，就可以靶向性攻击癌细胞(J Biol Chem，267，24034-24040，1992；Proc Natl Acad Sci USA，99，7866-7871，2002；Cancer Res，54，5154-5159，1994；J Biol Chem，272，11597-11603，1997；Cancer Res，57，290-294，1997)。

T细胞的有效活化需要两个信号的参与，即需要抗原肽-MHC复合物与T细胞上的TCR-CD3结合提供第1信号，以及共刺激分子(Costimulatory molecules)B7介导的第2信号。最基本的共刺激信号由抗原递呈细胞表达的B7.1(CD80)、B7.2(CD86)分子与T细胞上表达的相应受体(CD28和CTLA-4)提供(Amj Respir Crit Care Med，162，5164-5168，2000；Immunol CellBiol，77，304-311，1999；Clin Cancer Res，13，5271-5279，2007；Trends Immunol，24，313-318，2003)。

研究发现，转导B7.1基因使头颈部鳞状上皮细胞癌细胞表面表达B7.1蛋白能诱导淋巴细胞更好的增殖，在淋巴细胞-肿瘤细胞混合培养时能更有效地产生抗肿瘤效应细胞(CellImmunol，201，132-143，2000)。转导B7分子的肿瘤细胞不仅能激活未致敏T细胞，还能增强树突状细胞的抗原递呈能力并活化肿瘤特异性T细胞，提示使肿瘤细胞表达B7分子能增强T细胞应答。

作为药物的应用，B7.1-Fc和B7.2-Fc可以诱导和激活抗癌的T细胞，显示出抗肿瘤的生物活性(Cancer Res，59，4964-4972，1999；Clin Cancer Res，11，8492-8502，2005；JImmunol，172，1347-1354，2004；Cancer Res，62，5727-5735，2002)。

在抗癌的靶向性药物中，抗体是很流行的手段，但是抗体只是封闭癌细胞，与T淋巴细胞无关。肿瘤组织富含大血管和毛细血管，这些血管不仅给肿瘤输送营养，而且血管中有大量的淋巴细胞，其中70-80％是T淋巴细胞，但是这些T细胞是没有癌细胞特异性，是不会攻击肿瘤的。利用这些没有癌细胞特异性的T细胞来靶向性攻击癌细胞，是一种抗癌领域中的新的强有力的手段，这样的药物是不同于抗体的，现在没有报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种可诱导和激活癌靶向T细胞的融合蛋白。

本发明的第二个目的是提供一种含有可诱导和激活癌靶向T细胞的编码融合蛋白的核苷酸序列的重组载体。

本发明的第三个目的是提供一种可诱导和激活癌靶向T细胞的融合蛋白的制备方法。

本发明的第四个目的是提供一种可诱导和激活癌靶向T细胞的用途。

本发明的技术方案概述如下：

一种可诱导和激活癌靶向T细胞的融合蛋白，包括与癌细胞作用的肽和共刺激分子B7.1(又名CD80)，所述与癌细胞作用的肽选自缩写为TGF-α的转化生长因子-α、缩写为EGF的表皮生长因子、缩写为VEGF的血管内皮细胞生长因子、缩写为GnRH的促性腺激素释放激素或缩写为GRP的促胃液素释放肽，TGF-α-B7.1由SEQ ID No4所示；EGF-B7.1由SEQ ID No6所示；VEGF-B7.1由SEQ ID No8所示；GnRH-B7.1由SEQ ID No10所示；GRP-B7.1由SEQ IDNo12所示。

一种重组载体，含有编码上面所述融合蛋白的核苷酸序列，编码SEQ ID No4的核苷酸序列为SEQ ID No3所示；编码SEQ ID No6的核苷酸序列为SEQ ID No5所示；编码SEQ ID No8的核苷酸序列为SEQ ID No7所示；编码SEQ ID No10的核苷酸序列为SEQ ID No9所示；编码SEQ ID No12的核苷酸序列为SEQ ID No11所示。

一种可诱导和激活癌靶向T细胞的融合蛋白的变异体或人为改造的突变序列。

一种宿主细胞，该宿主细胞含有上面所述的重组载体。

可诱导和激活癌靶向T细胞的融合蛋白的制备方法，培养上面所述宿主细胞，收集表达的相应的融合蛋白TGF-α-B7.1；EGF-B7.1；VEGF-B7.1；GnRH-B7.1；GRP-B7.1。

上面所述可诱导和激活癌靶向T细胞的融合蛋白与癌症有关。

上面所述可诱导和激活癌靶向T细胞的融合蛋白能够诱导和激活T细胞。

上面所述可诱导和激活癌靶向T细胞的融合蛋白在制备治疗癌症和抗实体肿瘤的药物的应用。

本发明的优点：

本发明的融合蛋白具有癌靶向作用，一方面可分别与VEGF的受体VEGFR、EGF和TGF-α的受体EGFR、GnRH的受体GnRH-R、或GRP的受体GRP-R作用，另一方面又与T细胞上表达的相应受体CD28和CTLA-4相互作用，这样就将T细胞靶向性定位到大量表达VEGFR、EGFR、GnRH-R、或GRP-R的癌细胞周围，从而诱导T细胞攻击癌细胞。T细胞可分泌的细胞因子例如干扰素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)、穿孔素和颗粒酶并诱导靶细胞产生Fas等导致癌细胞凋亡，所以上面的融合蛋白对于实体肿瘤有着很明显的杀伤作用。

实验证明，本发明的融合蛋白能够抑制肿瘤生长和引起癌细胞的凋亡。

附图说明

图1表示三种本发明的融合蛋白抑制肉瘤肿瘤Sarcoma(S180)生长，图中表示的是小鼠的肿瘤重量。

图2利用常规免疫组化检测到的T细胞，棕色小点是T细胞。(图中：2-1为对照；2-2为B7.1；2-3为TGF-α-B7.1；2-4为EGF-B7.1；2-5为VEGF-B7.1)

图3利用常规免疫组化检查3种本发明的融合蛋白与肿瘤的结合能力。(图中：3-1为TGF-α-B7.1；3-2为EGF-B7.1；3-3为VEGF-B7.1)

图4利用常规免疫组化检测干扰素-γ(IFN-γ)，棕色部分就是T细胞分泌的IFN-γ。(图中：4-1为对照；4-2为B7.1；4-3为TGF-α-B7.1；4-4为EGF-B7.1；4-5为VEGF-B7.1)

图5显示的是被T细胞攻击的癌细胞，大细胞是癌细胞，小细胞是T细胞。(图中：5-1肝癌细胞；5-2肺癌细胞)

图6显示的是凋亡的癌细胞，大细胞是癌细胞，小细胞是T细胞，颜色深的大细胞即癌细胞正在凋亡。(图中：6-1肝癌细胞；6-2肺癌细胞)

具体实施方式

小鼠肿瘤中的一种S180癌细胞上表达大量的EGFR和VEGFR(Clin Cancer Res 13，2998-3005，2007；PLoS One 5，e15368，2010)，所以这里采用小鼠肿瘤S180用于小鼠荷瘤模型实验。人和小鼠的细胞因子例如VEGF、EGF和TGF-α在结构上有很大的相似性，可以发生交叉反应(Biochemistry 40，8930-8939，2001；J Control Release，82，71-82，2002；J Biol Chem 270，4334-4340，1995；J Biol Chem 276，19166-19171，2001；Dev Dyn 204，228-239，1995)。同样，人来源的B7.1(CD80)和B7.2(CD86)也可以在小鼠中发挥作用(ClinCancer Res，11，8492-8502，2005)。所以这里可以在小鼠荷瘤模型中分析融合蛋白的生物活性，下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1 B7.1(CD80)表达载体的构建

根据GenBank数据库的人来源的B7.1基因(又名CD80)的信息(NM_005191)，委托TAKARA公司合成一个核酸序列片段包括一个连接肽和一个B7.1基因(编码细胞外部分的208个氨基酸)和在整个片断的前面HindIII及后面XhoI限制酶切点的几个碱基，将这个合成好的核酸片段插入T载体并进行DNA测序鉴定，然后再用双酶切方法即用HindIII和XhoI处理后，把这片段插入pET22b质粒上，这样就产生了表达载体pET22b-B7.1，可表达B7.1蛋白。序列表(SEQ ID NO.2)仅仅是B7.1蛋白，前面的连接肽可见另一个序列表(SEQ ID NO.14)。

实施例2TGF-α-B7.1表达载体的构建

根据GenBank数据库的人来源的TGF-α基因的信息(NM_003236)，委托TAKARA公司合成一个核酸序列片段包括TGF-α基因及在TGF-α前面再增加限制内切酶位点BamHI和EcoRI的几个碱基，在片断的后面包含了SalI和HindIII的限制内切酶位点。将这个合成好的核酸片段插入T载体并进行DNA测序鉴定，然后再用双酶切方法即用BamHI和HindIII处理后，把这个片段插入pET22b-B7.1质粒上，这样就产生了表达载体pET22b-TGF-α-B7.1，可表达TGF-α-B7.1融合蛋白(见序列表SEQ ID NO.4)。

实施例3EGF-B7.1表达载体的构建

根据GenBank数据库的人来源的EGF基因的信息(NM_001963和NM_001178130)，委托TAKARA公司合成一个核酸序列片段包括EGF基因及在EGF前面再增加限制内切酶位点BamHI和EcoRI的几个碱基，在片断的后面包含了SalI和HindIII的限制内切酶位点。将这个合成好的核酸片段插入T载体并进行DNA测序鉴定，然后再用双酶切方法即用BamHI和HindIII处理后，把这个片段插入pET22b-B7.1质粒上，这样就产生了表达载体pET22b-EGF-B7.1，可表达EGF-B7.1融合蛋白(见序列表SEQ ID NO.6)。

实施例4VEGF-B7.1表达载体的构建

根据GenBank数据库的人来源的VEGF基因的信息(NM_003376)以及参考论文(J.Biol.Chem.，266，11947-11954，1991)，委托TAKARA公司合成一个核酸序列片段包括VEGF基因(121个氨基酸)及在VEGF前面再增加限制内切酶位点BamHI和EcoRI的几个碱基，在片断的后面包含了SalI和HindIII的限制内切酶位点。将这个合成好的核酸片段插入T载体并进行DNA测序鉴定，然后再用双酶切方法即用BamHI和HindIII处理后，把这个片段插入pET22b-B7.1质粒上，这样就产生了表达载体pET22b-VEGF-B7.1，可表达VEGF-B7.1融合蛋白(见序列表SEQ ID NO.8)。

实施例5GnRH-B7.1表达载体的构建

根据GenBank数据库的人来源的GnRH基因的信息(NM_021081和NM_000825等)，委托TAKARA公司合成一个核酸序列片段包括GnRH基因及在GnRH前面再增加限制内切酶位点BamHI和EcoRI的几个碱基，在片断的后面包含了SalI和HindIII的限制内切酶位点。将这个合成好的核酸片段插入T载体并进行DNA测序鉴定，然后再用双酶切方法即用BamHI和HindIII处理后，把这个片段插入pET22b-B7.1质粒上，这样就产生了表达载体pET22b-GnRH-B7.1，可表达GnRH-B7.1融合蛋白(见序列表SEQ ID NO.10)。

实施例6GRP-B7.1表达载体的构建

根据GenBank数据库的人来源的GRP基因的信息(NM_002091、NM_001012512和NM_001012513等)，委托TAKARA公司合成一个核酸序列片段包括GnRH基因及在GnRH前面再增加限制内切酶位点BamHI和EcoRI的几个碱基，在片断的后面包含了SalI和HindIII的限制内切酶位点。将这个合成好的核酸片段插入T载体并进行DNA测序鉴定，然后再用双酶切方法即用BamHI和HindIII处理后，把这个片段插入pET22b-B7.1质粒上，这样就产生了表达载体pET22b-GRP-B7.1，可表达GRP-B7.1融合蛋白(见序列表SEQ ID NO.12)。

实施例7各种蛋白的表达、变性和复性以及纯化

将各种表达质粒pET22b-B7.1、pET22b-TGF-α-B7.1、pET22b-EGF-B7.1、pET22b-VEGF-B7.1、pET22b-GnRH-B7.1和pET22b-GRP-B7.1分别用电穿孔法转入大肠杆菌BL21(DE3)，利用抗生素Amp(Ampicillin)筛选阳性菌。接下来各种蛋白的表达、变性和复性以及纯化的过程大致相同，操作如下：

含有表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)先进行大规模37℃培养，然后加入IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside)使之浓度达到1mM并过夜30℃培养，从而诱导表达蛋白。第2天离心培养液和收集菌体，用超声波法破细胞壁，离心收集包含体沉淀，这里的蛋白是以包含体形式存在。包含体蛋白用6M尿素变性溶解，然后进行多阶段透析，透析溶液是逐步稀释的尿素例如3M、2M和1M，接下来是0.5M尿素，0.4M L-精氨酸，375μM氧化型谷胱甘肽GSSG，1.875mM还原型谷胱甘肽GSH，透析后进行离心，所得上清液就是蛋白的复性溶液。用His·Bind Purification Kit试剂盒(Novagen公司)对于蛋白进行纯化，先用Binding Buffer冲洗凝胶柱，同时也在蛋白溶液里加入Binding Buffer，将蛋白样品上柱，用Wash Buffer漂洗，然后用Elute Buffer洗脱，用蛋白质电泳进行鉴定，将纯度为一条带的蛋白用于以后的实验。这样得到6种高纯度蛋白B7.1、TGF-α-B7.1、EGF-B7.1、VEGF-B7.1、GnRH-B7.1和GRP-B7.1，其中B7.1是用于对照实验的。

实施例8抑制肿瘤实验

首先选择雄性ICR小鼠，4-5周，18-22g，分成5组，每组30只小鼠。小鼠肉瘤细胞S180是从ATCC购买，先进行体外培养，再注射到ICR小鼠腹腔，进行体内大规模培养，最后，取出腹腔内的S180细胞，将2x10⁶小鼠肉瘤细胞S180接种于另外五组的ICR小鼠的右侧腋下，然后隔天往腹腔内分别注射B7.1、TGF-α-B7.1、EGF-B7.1和VEGF-B7.1蛋白溶液0.2ml(250pmol)/只，而对照组注射等量生理盐水(0.9％NaCl)，9天后处死小鼠。观察小鼠肿瘤生长情况以及处死后肿瘤的重量。图1表示各组小鼠解剖后的肿瘤的重量，结果表明TGF-α-B7.1、EGF-B7.1和VEGF-B7.1融合蛋白很有效地抑制肿瘤生长，而注射B7.1的效果不太好。

实施例9肿瘤组织内T淋巴细胞的检测

TGF-α-B7.1、EGF-B7.1和VEGF-B7.1融合蛋白和B7.1蛋白处理以及对照组生理盐水的小鼠S180肿瘤组织切成小块，用石蜡包埋制成石蜡切片，然后进行免疫组织化学实验。为了检测肿瘤组织内的T细胞，使用Santa Cruz Biotechnolog公司的抗CD3抗体，然后用二抗以及avidin-biotin-perxidase complex(Zymed公司)，最后用Diaminobenzidine(DAB)显色。经TGF-α-B7.1、EGF-B7.1和VEGF-B7.1注射的小鼠肿瘤组织内发现有大量的T细胞(图2显示的棕色小点为T细胞)，这说明在TGF-α-B7.1、EGF-B7.1和VEGF-B7.1诱导下，肿瘤组织内充满了浸润性(Infiltrating)T细胞。而B7.1处理小组的肿瘤内只有少量的T细胞，而生理盐水处理的对照组几乎没有什么T细胞。这里的结果表明融合蛋白能够靶向性的将T细胞富集到实体肿瘤的组织内部。

实施例10三种融合蛋白对于癌细胞的结合能力的检查

由于pET22b载体上有6个组氨酸的标签，所以本发明的融合蛋白的C末端都带有这个标签，所以可用抗6个组氨酸抗体(Santa Cruz Biotechnolog公司)来检测融合蛋白的存在。用TGF-α-B7.1、EGF-B7.1和VEGF-B7.1融合蛋白溶液孵育肿瘤组织石蜡切片，然后用抗6个组氨酸抗体进行检测。发现TGF-α-B7.1、EGF-B7.1和VEGF-B7.1融合蛋白都可以与S180癌细胞结合(图3中的棕色部分)，表明融合蛋白中的人来源的TGF-α、EGF和VEGF可与小鼠癌细胞上的EGFR和VEGFR先后作用。

实施例11肿瘤组织内干扰素-γ(IFN-γ)的检测

用免疫组织化学方法检测肿瘤组织内由T细胞分泌的细胞因子IFN-γ，抗体是SantaCruz Biotechnolog公司的抗IFN-γ抗体。图4是测定的结果，表明在TGF-α-B7.1、EGF-B7.1和VEGF-B7.1诱导下，肿瘤组织内的T细胞分泌了大量的IFN-γ(图4中：4-3、4-4和4-5中的棕色部分)，而B7.1组只有很少的阳性反应(图4-2)，生理盐水组(图4-1)没有什么IFN-γ分泌。

实施例12GnRH-B7.1和GRP-B7.1诱导T淋巴细胞活性

外周血细胞购自天津血液中心，用Ficoll密度离心和尼龙毛柱方法取得T淋巴细胞(JClin Invest，91，1490-1498，1993)，这些T细胞用DMEM培养基培养。然后分别加入B7.1、GnRH-B7.1和GRP-B7.1。

在6孔板上用DMEM培养基培养T细胞，然后加入5pmol量的3种蛋白，然后用enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)的IFN-γ试剂盒(R&D Systems公司)来检测培养基中的IFN-γ的含量。

表1为分析B7.1、GnRH-B7.1和GRP-B7.1蛋白刺激T细胞的能力，检测的是细胞因子IFN-γ。

表1IFN-γ(pg/ml)

结果表明GnRH-B7.1和GRP-B7.1融合蛋白与B7.1一样可以激活T细胞，使得T细胞分泌细胞因子IFN-γ。

同时，在不加蛋白的对照组(只有癌细胞和T细胞)中，则没有检测到IFN-γ。

实施例13GnRH-B7.1和GRP-B7.1融合蛋白杀伤癌细胞

在6孔板上用DMEM培养基培养人癌细胞来源的肝癌细胞Hep G2和肺癌细胞A549，浓度为2x10⁵个/孔，然后加入T细胞，再分别加入B7.1、GnRH-B7.1或GRP-B7.1，蛋白的量都是5pmol。

细胞毒作用或癌细胞杀伤效果采用MTT(Methabenzthiazuron)法测定(Immunology，82，117-125，1994)，细胞生长抑制用100-[(A_test-A_b)/(A_c-A_b)]x 100公式计算，A_test指的是有T细胞加入下的癌细胞生长，A_b指的是孔中只有培养基，A_c指的是癌细胞生长。以后每种癌细胞杀伤实验的次数都在20以上。

效靶比是指T细胞与肿瘤细胞数量之比，在5∶1、15∶1的情况下，分别加入5pmol量的B7.1、GnRH-B7.1或GRP-B7.1，结果在表2(下面)，随着T细胞数量的增加，肿瘤细胞杀伤效果也增加，在T细胞与肿瘤细胞15∶1的条件下，经70小时培养后测定，GnRH-B7.1和GRP-B7.1杀伤率或细胞毒作用达到60(％)以上(表2)，而B7.1的效果要比GnRH-B7.1和GRP-B7.1低。另外在不加蛋白仅加T细胞的情况下，细胞毒作用发现在1-4(％)以下。

表2为T细胞与癌细胞不同数量之比的共培养，在B7.1、GnRH-B7.1或GRP-B7.1诱导下，T细胞针对肿瘤细胞的细胞毒作用即杀伤作用。

图5和图6是显微镜观察癌细胞被经过GnRH-B7.1或GRP-B7.1诱导的T细胞的杀伤的效果。

图5显示的是被T细胞攻击的癌细胞(图中：5-1肝癌细胞；5-2肺癌细胞)，大的细胞是癌细胞，周围的小细胞是T细胞，表明T细胞正在攻击癌细胞。

图6显示的是凋亡的癌细胞(图中：6-1肝癌细胞；6-2肺癌细胞)，大的细胞是癌细胞，周围的小细胞是T细胞，这些T细胞正在攻击癌细胞，颜色深的大细胞即癌细胞正在凋亡。

这里的实验表明GnRH-B7.1和GRP-B7.1可以分别杀伤肝癌细胞Hep G2和肺癌细胞A549，杀伤作用要比B7.1大得多。

本发明选择了一个崭新的战略，将T细胞的共刺激分子B7.1(CD80)连接到细胞因子、激素和多肽(例如：促胃液素释放肽)上，这样产生了新型的细胞因子-共刺激分子融合蛋白质、激素-共刺激分子融合蛋白质和多肽-共刺激分子融合蛋白质。

这里的细胞因子、激素和多肽可以采用个别氨基酸的点突变而不影响生物活性，例如GnRH的第一个氨基酸即基因序列(NM_021081和NM_000825)上的氨基酸可以是Gln(FEBS Lett，472，241-246，2000；Cancer Res，64，2090-2095，2004)，与这里的GnRH-B7.1融合蛋白中的GnRH的第一个氨基酸同为Gln(见序列表SEQID NO.10)；也可以是Glu(J Biol Chem，272，11597-11603，1997；Cancer Res，60，3701-3705，2000)。

作为一个模型，在此虽然只选择共刺激分子B7.1(CD80)，共刺激分子还可以选自其它B7家族成员例如B7.2(CD86)、B7-H1(PD-L1)、B7-H2(B7RP-1或ICOS-L或B7h或GL-50)、B7-H3(B7RP-2)、B7-H4(B7x或B7S1)、B7-DC(PD-L2)等，以及这些蛋白的氨基酸序列有70％以上的相同性的自然和人为的变异体等，也能够说明本发明的思想。共刺激分子B7.1(CD80)或其它共刺激分子的作用是激发机体内的免疫反应。更进一步的，除了B7家族成员外，其它的能够刺激T细胞的分子都可以作为本发明方案中的融合蛋白中的一个组成部分。

同样，作为实验材料的TGF-α-B7.1、EGF-B7.1、VEGF-B7.1、GnRH-B7.1和GRP-B7.1融合蛋白中的TGF-α、EGF、VEGF、GnRH和GRP，只是利用它们肿瘤细胞的定位作用，如果采用与肿瘤细胞紧密相关的其它细胞因子、激素、酶或多肽等也能够说明本发明的思想，因为与这些细胞因子、激素、酶或多肽相对应的癌细胞表面有大量的受体。

这样物质有碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)及FGF家族、白细胞介素家族(Interleukin)例如白细胞介素-2、白细胞介素-3、白细胞介素-4、白细胞介素-6、白细胞介素-8、白细胞介素-11、白细胞介素-13、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulat ing factor，GM-CSF)、肝素结合EGF样生长因子(Heparin-binding EGF-like growth factor，HB-EGF)、胰岛素样生长因子(Insulin-likegrowth factor，IGF)、肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor，HGF)、血小板衍生生长因子(Platelet-derived growth factor，PDGF)、神经生长因子(Nerve growth factor，NGF)、胎盘生长因子(Placental growth factor，PGF)、干细胞因子(Stem cell factor，SCF)、Heregulin、erbB配体、各种趋化因子(Chemokine)及其家族、Ephrin家族、血管生成素(Angiopoietin)、血小板生成素(Thrombopoietin)和血浆第VII因子(Factor VII)、尿激酶型纤溶酶原激活物(Urokinase-type plasminogen activator)、生长激素释放激素(Growthhormone releasing hormone)、促黑激素-MSH、催乳激素(Prolactin)、催乳激素释放激素(Prolactin releasing hormone)、生长激素(Growth hormone)、促卵泡激素(Folliclestimulating hormone)、胎盘泌乳激素(Placental lactogen)、绒毛膜促性腺激素(Chorionicgonadotropin)和促肾上腺皮质激素释放激素(Corticotropin releasing hormone)、生长抑素(Somatostatin)、去唾液酸糖蛋白(Asialoglycoprotein)、低密度脂蛋白(Low densitylipoprotein)和转铁蛋白(Transferrin)等，以及这些蛋白的氨基酸序列有70％以上的相同性的自然和人为的变异体等。许多肿瘤组织都过量表达这些物质受体，从而趋化因子、酶、激素及其它蛋白等多肽分子配体就可以像细胞因子那样与共刺激分子连接形成融合蛋白质，将共刺激分子定位到肿瘤组织内。

这些融合蛋白质还可以通过化学交联反应等手段分别将细胞因子、激素或多肽等与共刺激分子的蛋白质片段进行连接，例如共价键连接来构建。对于融合蛋白质可以进行化学修饰、缺损融合蛋白质的一部分多肽片段以及将其它多肽连接在这些蛋白质上等一系列的改造。纯化后的融合蛋白质可通过一系列蛋白质的变性和复性过程来完善其包括二硫键在内的空间结构，提高其生物活性。

为了更好地说明本发明中的融合蛋白的结构与功能，在这里以EGF-B7.1为例，融合蛋白中的连接肽可以采用各种长度和组份，虽然连接肽有各种变化，其作用是与这里实施例中所描述的一样，是将EGF的癌细胞靶向作用与B7.1的T细胞的激活作用结合在一起，即同时及同地(在一个地方)发挥作用。甚至还可以构建包含抗体的Fc片断，例如EGF-B7.1-Fc，从而形成融合蛋白的二聚体，这实际上是双分子的融合蛋白，其本质是与这里实施例中所描述的方案是一样的。

从更大的范围来看，这里实验中所采用的细胞因子、激素或多肽与其相对应的癌细胞表面上过度表达的受体实际上是一种配体(Ligand)和受体之间相互作用的关系，利用这种配体和受体的亲和力，将共刺激分子定位到肿瘤组织。除了细胞因子、激素或多肽外，其它凡是能与癌细胞过度表达的受体相对应的蛋白质或多肽分子即配体也可用于癌细胞的特异性定位。除了上面所说的与癌细胞上的受体对应的配体外，从噬菌体展示(Phage display)等方法筛选到的与癌细胞上受体有亲和力并有拮抗作用的人工筛选的蛋白质或多肽及用其它方法筛选到的能够直接与癌细胞表面相互作用的蛋白质或多肽分子都可以和共刺激分子形成融合蛋白质。

作为药物其剂型可以是乳化剂、脂质体、分散剂、稳定剂等一起制成各种注射、口服、敷贴以及手术处理等药物的给药形式。除了融合蛋白质本身可以作为药物外，编码融合蛋白质的核苷酸片段或载体还可以作为基因治疗形式来应用。

本发明的具体实施例中，所述细胞因子-共刺激分子融合蛋白是TGF-α-B7.1、EGF-B7.1和VEGF-B7.1，激素-共刺激分子融合蛋白是GnRH-B7.1，多肽-共刺激分子融合蛋白是GRP-B7.1，它们能够诱导和刺激T淋巴细胞来分别抗肉瘤S180、Hep G2肝癌和A549肺癌，但是，只要其它种类的癌细胞(各种脏器、血液中的细胞、骨骼、脑、肠和皮肤等)上表达TGF-α、EGF、VEGF、GnRH和GRP的受体，都可以采用这里的融合蛋白来杀伤肿瘤，从而应用于各种癌症或恶性肿瘤的治疗。

以上实施例和优选实施方式的描述属于对权利要求限定的本发明的示意性说明，而不是限制本发明。需要特别指出的是，只要不脱离本发明的宗旨，所有显而易见的改变以及具有等价代换的相似发明，均包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种可诱导和激活癌靶向T细胞的融合蛋白，其特征是包括与癌细胞作用的肽和共刺激分子B7.1，所述与癌细胞作用的肽选自缩写为TGF-α的转化生长因子-α、缩写为EGF的表皮生长因子、缩写为VEGF的血管内皮细胞生长因子、缩写为GnRH的促性腺激素释放激素或缩写为GRP的促胃液素释放肽，TGF-α-B7.1由SEQ ID No4所示；EGF-B7.1由SEQ ID No6所示；VEGF-B7.1由SEQID No8所示；GnRH-B7.1由SEQ ID No10所示；GRP-B7.1由SEQ ID No12所示。

2.一种重组载体，其特征在于含有编码权利要求1所述融合蛋白的核苷酸序列，编码SEQIDNo4的核苷酸序列为SEQ ID No3所示；编码SEQ ID No6的核苷酸序列为SEQ ID No5所示；编码SEQ ID No8的核苷酸序列为SEQ ID No7所示；编码SEQ ID No10的核苷酸序列为SEQ IDNo9所示；编码SEQID No12的核苷酸序列为SEQ ID No11所示。

3.权利要求1所述一种可诱导和激活癌靶向T细胞的融合蛋白的变异体或人为改造的突变序列。

4.一种宿主细胞，其特征在于该宿主细胞含有权利要求2所述的重组载体。

5.权利要求1所述可诱导和激活癌靶向T细胞的融合蛋白的制备方法，其特征在于培养权利要求4所述的宿主细胞，收集表达的权利要求1所述的融合蛋白。

6.权利要求1所述的融合蛋白与癌症有关。

7.权利要求1所述的融合蛋白能够诱导和激活T细胞。

8.权利要求1所述的融合蛋白在制备治疗癌症和抗实体肿瘤的药物的应用。