CN108484776B - 一种融合蛋白、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于免疫治疗领域，公开了一种融合蛋白、制备方法及应用。本发明的融合蛋白包括HSP70蛋白和FPR1胞外段蛋白融合后的蛋白。所述的FPR1胞外段蛋白包括多段氨基酸序列，不同段的FPR1胞外段蛋白的氨基酸序列之间由柔性连接肽连接。本发明的融合蛋白制备简单，特异性强，持续时间长，能够显著增强免疫治疗效果。

Description

一种融合蛋白、制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种融合蛋白、制备方法及应用，尤其是在肿瘤免疫治疗领域中的应用。
背景技术
宫颈癌是指发生在宫颈阴道部或移行带的鳞状上皮细胞及宫颈管内膜的柱状上皮细胞交界处的恶性肿瘤。子宫颈癌是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤，宫颈癌的发生率仅次于乳腺癌。目前，子宫颈癌的主要治疗方法为手术疗法，同时对中高危患者采取辅助化疗，对于宫颈癌晚期患者主要采用单独或者联合放疗，但效果并没有显著提升患者预后情况。因此，寻找有效的治疗靶点及治疗方法仍是宫颈癌治疗的难点。
有鉴于此特提出本发明。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种融合蛋白、制备方法及其应用。本发明的融合蛋白制备简单，特异性强，持续时间长，能够显著增强免疫治疗效果。
为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：
本发明的第一目的是提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包括HSP70蛋白和FPR1胞外段蛋白融合后的蛋白。
由于HPV病毒的发现，为子宫颈癌的防治提供了有效的靶点，现已有针对HPV病毒疫苗成功研发并开始推广使用。但由于接种人群的局限，取得效果并不确切，最重要的是目前已经推广使用的HPV疫苗只能起到预防作用，而且接种年龄及适用人群有限。
本申请通过免疫治疗的手段进行宫颈癌的治疗，国内对免疫治疗DC疫苗的研究还处于初始阶段，本申请的研究走在国内同行业之首。目前，将整个肿瘤细胞作为抗原冲击致敏DC 的方法来制备疫苗是一种简单有效的方法，有动物实验及临床试验证实应用肿瘤裂解物冲击 DC细胞可诱导出明显的特异性HPV的CTL抗肿瘤反应。而且肿瘤裂解物中含有大量热休克蛋白可以促进DC细胞成熟，诱导DC细胞成熟标志物的上调，增强其对T细胞的激活能力。但是使用的DC激励物为肿瘤细胞粗提取物，肿瘤细胞粗提取物作为DC激励底物激励DC 细胞所诱发的抗肿瘤效应强度低，特异性差，尤其是还有可能诱发自体免疫性疾病，由于其安全问题，目前无法应用于临床。因此制备DC疫苗的关键技术是寻找和制备肿瘤的特异性抗原肽。而免疫治疗的重难点在于宫颈癌特异性靶点的筛选，本申请中将筛选得到的宫颈癌高表达细胞膜抗原应用于免疫治疗中，克服了特异性差及靶向性低的缺点。
本申请组前期用蛋白质谱技术对宫颈癌及癌旁组织进行了差异蛋白筛查，FPR1即为差异蛋白之一，其在肿瘤组织呈显著高表达。
FRP1是一个七次跨膜的G蛋白偶联受体，是炎症细胞趋化的主要功能受体，广泛参与人体生理及病理进程。FPR1在炎症、创伤修复、抗病原微生物感染中发挥重要作用。细菌甲酰化趋化性多肽(fMLF)作为FPR1经典的激活剂可以与FPR1结合，并发生一系列的信号转导作用，主要激活PI3K，PKC，MAPK，NF-κB信号通路。基于FPR1可以识别细菌多肽并激活H2O2的产生，所以FPR1在宿主抗微生物感染过程中发挥了重要作用。而FPR1缺失的小鼠更容易发生微生物感染。FPR1在多种肿瘤中的表达水平是升高的，并且参与肿瘤的发生过程。以恶性胶质瘤为例，FPR1在肿瘤部位呈现明显的高表达，位于恶性胶质瘤细胞表面的FPR1可以被肿瘤细胞及正常细胞所分泌的Anx-A1等激动剂激活。激活后的FPR1进而作用于一系列调节性分子，p38，MAPK，ERK1/2，以及转录因子NF-κB，STAT3，HIF-1α等促进肿瘤细胞增殖，侵润及迁移，并通过EGFR等促进了血管的生成。这证明肿瘤细胞可以利用肿瘤细胞微环境中的FPR1激动剂实现多条重要信号通路的激活，这些信号通路的激活最终促进了肿瘤的发生。
而MHCⅠ类抗原加工递呈过程是一个依赖HSPs的转接过程。因此热休克蛋白将肿瘤抗原和机体免疫系统联系了起来。HSP与多肽结合是CTL活化的关键之一。一些来自肿瘤细胞表面的抗原肽只能产生有限的细胞免疫应答，而当与HSP(主要为Hsp70、Hsp60、Hsp90等)结合形成Hsp抗原肽复合物后，活化CTL的能力是单纯抗原肽的几百倍，显著增强了免疫治疗的效果。
热休克蛋白70(Heat Shock Protein 70,HSP70)可作为分子伴侣，将携带的抗原肽递呈给 DCs，且能增强抗原肽的抗原性，并最终激活T淋巴细胞，发挥特异性的细胞毒性作用，产生抗肿瘤免疫效应。热休克蛋白是生物细胞收到各种理化因子刺激产生的一类高度保守的蛋白质，具有分子伴侣的性质，即其可以与不同功能的多种蛋白质在细胞中形成复合体，参与蛋白的折叠、亚基的组成、蛋白的运输及降解过程，从而调节靶蛋白的活性和功能，但不参与靶蛋白的组成。
热休克蛋白70(heat shock protein 70)是结核分支杆菌中重要抗原成分，能通过类似MHCⅠ类分子肽结合区结构与多肽结合，向免疫细胞提呈抗原。分枝杆菌Hsp70免疫原性非常强，具有免疫优势抗原的特点，能诱导出特异性Th1型细胞反应，对结核分支杆菌的攻击可产生较强的保护性免疫效应。结核分支杆菌的hsp70能诱导小鼠巨噬细胞分泌白细胞介素 1α、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子等多种细胞因子，在调节机体的免疫反应中有特殊作用。有实验证实将分支杆菌hsp70抗原基因克隆到巨细胞病毒启动子下游构成DNA疫苗，发现其免疫效果与BCG的相近，说明hsp70是保护性免疫原。
因此，本申请选取了Hsp70蛋白，将其与宫颈癌细胞膜抗原FPR1进行融合表达，将表达纯化的Hsp70-FPR1融合蛋白作为抗原致敏DC，发现其对子宫颈癌的免疫治疗效果非常显著，且持续时间大大延长，可以为子宫颈癌的治疗提供更为有效的方法。
进一步的方案，FPR1蛋白包括多段胞外段氨基酸序列，不同段的FPR1胞外段蛋白的氨基酸序列之间由柔性连接肽连接。
本申请选定FPR1作为宫颈癌治疗的靶点，为了增强其免疫治疗效果，我们将FPR1及热休克蛋白Hsp70进行融合表达。由于FPR1为一个七次跨膜蛋白，蛋白跨膜区及胞内段区域并不参与到免疫识别中，即真正发挥抗原作用的是FPR1蛋白的胞外段，若利用FPR1蛋白应用到免疫治疗中会造成无关抗原表位增多，影响免疫治疗特异性。因此本申请仅选取FPR1 蛋白胞外段与HSP70进行融合。将FPR1蛋白的多个胞外段扩增、连接。为了不破坏各胞外段的结构，不同段的FPR1胞外段蛋白的氨基酸序列之间由柔性连接肽连接。
具体的，利用了柔性linker蛋白作为蛋白的纽带将其串联，实验中选取GGGGGGS作为柔性linker，甘氨酸为最小且无手性的氨基酸，其作为linker不会破坏蛋白的空间结构，完整的保留各蛋白的抗原表位。且选用柔性linker分子量很小，并不会增加蛋白抗原表位。
进一步的方案，所述的FPR1胞外段蛋白包括如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。作为优选的实施例，FPR1胞外段蛋白采用如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，能够减少无关抗原表位，增强免疫治疗的特异性。
进一步的方案，所述的FPR1胞外段蛋白和HSP70蛋白之间由柔性连接肽连接。
本申请将FPR1蛋白的多个胞外段扩增、连接，并与HSP70蛋白融合表达。同样的，为了不破坏各胞外段及Hsp70的结构，我们利用了柔性linker蛋白(实验中选取GGGGGGS作为柔性linker，甘氨酸为最小且无手性的氨基酸，其作为linker不会破坏蛋白的空间结构，完整的保留各蛋白的抗原表位。且选用柔性linker分子量很小，并不会增加蛋白抗原表位)作为蛋白的纽带将其串联融合表达，得到Hsp70-FPR1胞外段融合蛋白。
进一步的方案，所述融合蛋白包括SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。作为优选的实施例，融合蛋白采用如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，能够减少无关抗原表位，增强免疫治疗的特异性，延长持续时间，显著增强免疫治疗效果。
本发明的第二目的是提供一种编码如上所述的融合蛋白的核苷酸序列。
本发明的第三目的是提供一种包括如上所述的融合蛋白或者所述的核苷酸序列的载体、重组菌或重组细胞。
本发明的第四目的是提供一种融合蛋白的制备方法，包括：构建含有如上所述的融合蛋白的表达系统，表达FPR1胞外段蛋白和HSP70蛋白的融合蛋白；然后将融合蛋白进行纯化。
优选的方案，将表达SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的核苷酸序列克隆到proEM系统中，并转染到大肠杆菌中制备转染级质粒，之后将质粒通过转染试剂转染到哺乳动物细胞 HEK293中进行瞬时表达，再通过亲和层析纯化蛋白。
更具体的，将Hsp70和FPR1胞外段基因通过双酶切法插入到表达载体proEM中，并通过酶切法和测序确认最终表达载体的准确性，最终转到DH5a克隆菌株中，通过质粒大抽试剂盒提取转染级质粒，之后将质粒通过转染试剂转染到哺乳动物细胞HEK293中进行瞬时表达，再通过亲和层析纯化蛋白，获得融合蛋白。
本发明的第五目的是提供所述的融合蛋白在制备治疗和/或预防宫颈癌的药物中的应用。
本发明的第六目的是提供一种疫苗，包括如上所述的一种融合蛋白和药学上可接受的载体。
采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
1、本申请的融合蛋白成分单一，结构明确，制备简单，不仅能够降低成本，还能够解决现有肿瘤细胞裂解物成分复杂，无法保证所诱发抗瘤免疫的强度和特异性的缺点。
2、本申请仅采用FPR1胞外段蛋白，与HSP70蛋白形成的融合蛋白，去除了无关抗原表位，增强了免疫治疗的特异性，制备的DC疫苗持续时间长，并且能够显著增强免疫治疗效果。
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。
附图说明
附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：
图1为FPR1蛋白的胞内和胞外结构序列分析结果示意图；
图2为本申请的技术路线图；
图3为FRP1胞外段、HSP70及HSP70-FPR1胞外段融合蛋白纯化蛋白的SDS-PAGE电泳图；
其中，LaneM1、M2、M3为SDS-PAGE蛋白Marker；Lane1，3，5为阳性对照，BSA (1μg)；Lane2，4，6为目的蛋白，箭头所指为纯化后的蛋白；
图4示经不同蛋白致敏后的树突状细胞的形态；
图5为流式细胞仪检测的不同蛋白致敏树突状细胞表面标志物；
图6为取材过程中不同组别的小鼠，可明显观察到肿瘤位置；
图7为将各组肿瘤解剖后的图示，蛋白致敏组的肿瘤均明显小于PBS对照组；
图8为肿瘤生长曲线图。
需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
各实施例中采用的主要实验材料及仪器如下：
质粒抽提试剂盒、DNA回收试剂盒、T4连接酶、Taq DNA聚合酶、电泳相关试剂(Tris，Acr，Bis，AP，TEMED等)，蛋白浓度测定试剂盒，超声波破碎仪，高速冷冻离心机，质谱仪。
实施例一构建并表达纯化融合蛋白
1、Hsp70、FPR1序列确认及克隆
在Gene Bank中检索Hsp70及FPR1基因序列并分析，获得Hsp70及FPR1基因的核苷酸序列及氨基酸序列。其中，Hsp70的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。FPR1的完整氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
由于FPR1为七次跨膜蛋白，本申请通过分析获得FPR1的四段胞外段，其分析结果如图 1所示。FPR1蛋白的具体序列如下，其中，带有外框的部分即为FPR1的胞外段。
为了减小无关抗原表位，本申请将FPR1蛋白胞外段与Hsp70蛋白进行融合表达。首先，利用真核表达纯化系统分别获取FPR1胞外段蛋白的四段胞外蛋白序列，为了不改变蛋白结构，利用柔性连接肽，也就是柔性linker(GGGGGS)将蛋白序列进行串联表达，形成完整的FPR1胞外段蛋白，也就是exFPR1。以下将FPR1胞外段蛋白的集合称为exFPR1，FPR1 胞外段蛋白(exFPR1)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
其中，本申请的融合蛋白，也就是Hsp70-exFPR1胞外段融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
利用模板扩增或者人工合成的方式，分别获得FPR1胞外段蛋白(exFPR1)，Hsp70蛋白以及Hsp70-exFPR1胞外段融合蛋白的核苷酸序列。
本申请的实验技术路线如图2所示。
2、蛋白表达及纯化
将exFPR1、HSP70及Hsp70-exFPR1基因通过双酶切法插入到表达载体proEM中，并通过酶切法和测序确认最终表达载体的准确性，最终转到DH5a克隆菌株中，通过质粒大抽试剂盒提取转染级质粒，之后将质粒通过转染试剂转染到哺乳动物细胞HEK293中进行瞬时表达，再通过亲和层析纯化蛋白。
纯化后的蛋白利用SDS-PAGE进行鉴定，结果如图3所示。图3中，LaneM1,M2,M3 为SDS-PAGE蛋白Marker；Lane1，3，5为阳性对照，BSA(1μg)；Lane2，4，6为目的蛋白，箭头所指为纯化后的蛋白。由此可知，获得的exFPR1、HSP70及Hsp70-exFPR1蛋白均正确。
3、DC细胞的获取及T细胞的激活
1)脐带血单核细胞分离
取肝素抗凝静脉血与等量Hank’s液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于等量淋巴细胞分离液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm×20分钟。离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank’s液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入5倍以上体积的Hank’s液或RPMI1640，1500rpm离心10分钟，洗涤细胞两次。即得较纯得单核细胞。
然后将获得单核细胞用含有10％胎牛血清IMDM培养基进行培养，4小时后贴壁细胞用于诱导分化为DC细胞，悬浮细胞主要为T细胞。
2)DC细胞培养及鉴定
贴壁细胞(主要是CD14+的单核细胞)，加入含重组人GM-CSF 500-1,000U/ml和重组人 IL-4 500U/ml的无血清培养液，37℃，5％CO2培养箱中培养，诱导单核细胞向DC细胞分化；每3d半量换液一次，并补足细胞因子；在培养的第5d加入肿瘤抗原50ng/ml，对DC进行抗原负载。
本实验根据抗原不同，共分为5组：PBS组、exFPR1蛋白组、Hsp70蛋白组、exFPR1 蛋白+Hsp70蛋白组及Hsp70-exFPR1融合蛋白组。其中，exFPR1蛋白+Hsp70蛋白组为两个蛋白的混合物，Hsp70-exFPR1为融合蛋白。
在培养的第6d，加入重组人TNF-α(500U/ml)，诱导DC细胞成熟；在培养的第7d或第8d，收获DC细胞，其数量应达到1×106个以上。然后对DC细胞进行质检。
质检方法：
(1)利用台盼蓝染色法检测细胞活力，观察细胞形态。检测结果如图4所示。其中，活细胞的数量在80％以上。图4为经不同蛋白致敏后的树突状细胞的形态。与PBS组对照组相比，exFPR1蛋白组、Hsp70蛋白组、Hsp70+exFPR1蛋白组及Hsp70-exFPR1融合蛋白组树突状细胞明显成熟，呈散在分布状，细胞体积明显增大，细胞出现明显的树枝状突起。
(2)流式细胞仪检测DC细胞表面HLA-DR、CD83和CD86等分子的表达，以确定 DC是否成熟，检测结果如图5所示。其中，H-F为Hsp70-exFPR1融合蛋白，H+F为Hsp70 和exFPR1混合蛋白。
经HLA-DR、CD83、CD1a和CD11C染色证实，与PBS组相比，exFPR1蛋白组、Hsp70 蛋白组、Hsp70+exFPR1蛋白组及Hsp70-exFPR1融合蛋白组树突状细胞明显成熟。另外，由结果中还可以看出，Hsp70-exFPR1融合蛋白组的DC成熟率高于其他组，说明Hsp70-exFPR1 融合蛋白组可有效促进DC成熟。
3)DC激活T细胞的制备
收集步骤1)和步骤2)所获得的DC细胞和T细胞，按1∶10(数目比)的比例共培养，无血清培养液中添加重组人IL-2(300U/ml)；每3天半量换液一次，并补加重组人IL-2 (300U/ml)。在第7d收集细胞备用。
4.DC-T细胞过继输入预先成瘤的NOG免疫缺陷小鼠体内，评估免疫治疗效果。
在第0天，向4周龄雌性NOG小鼠的右侧皮下注射200μL肿瘤细胞(1×107)。在第14天，在第15和21天，通过尾静脉注射用不同蛋白质刺激的3×106人淋巴细胞，免疫两次。每3天用滑动卡尺以二维长宽方式测量肿瘤直径。小鼠在第36天在CO2室中被处死，并且解剖肿瘤以评估它们的体积和重量。然后通过下式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝肿瘤长度×肿瘤宽度×肿瘤宽度×0.5。
结果：肿瘤取材如图6、图7所示，生长曲线如图8所示。
图6为取材中对不同组别小鼠进行拍照，可明显观察到肿瘤位置。图7为将各组肿瘤解剖进行拍照，蛋白致敏组的肿瘤均明显小于PBS对照组。图8为绘制的肿瘤生长曲线。
由肿瘤生长曲线可以看出，NOG小鼠成瘤模型中两次注射肿瘤疫苗后，各组DC疫苗均产生较好免疫效果。Hsp70-exFPR1融合蛋白组和Hsp70+exFPR1组NOG小鼠肿瘤生长速度明显抑制，治疗效果优于Hsp70以及FPR1蛋白组，尤其在第21天第二次进行免疫治疗后。Hsp70-exFPR1融合蛋白组效果持续性最好，说明融合蛋白在免疫治疗中优势巨大，比不同蛋白混合添加效果更好。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。
序列表
<110> 首都医科大学附属北京朝阳医院
<120> 一种融合蛋白、制备方法及其应用
<130> 2018.3.10
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 634
<212> PRT
<213> 人工合成(Artificial sequence)
<400> 1
Met Ala Arg Ala Val Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Asn Ser Val Val
1 5 10 15
Ser Val Leu Glu Gly Gly Asp Pro Val Val Val Ala Asn Ser Glu Gly
20 25 30
Ser Arg Thr Thr Pro Ser Ile Val Ala Phe Ala Arg Asn Gly Glu Val
35 40 45
Leu Val Gly Gln Pro Ala Lys Asn Gln Ala Val Thr Asn Val Asp Arg
50 55 60
Thr Val Arg Ser Val Lys Arg His Met Gly Ser Asp Trp Ser Ile Glu
65 70 75 80
Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Thr Ala Pro Glu Ile Ser Ala Arg Ile Leu
85 90 95
Met Lys Leu Lys Arg Asp Ala Glu Ala Tyr Leu Gly Glu Asp Ile Thr
100 105 110
Asp Ala Val Ile Thr Thr Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ala Gln Arg Gln
115 120 125
Ala Thr Lys Asp Ala Gly Gln Ile Ala Gly Leu Asn Val Leu Arg Ile
130 135 140
Val Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala Tyr Gly Leu Asp Lys Gly
145 150 155 160
Glu Lys Glu Gln Arg Ile Leu Val Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe
165 170 175
Asp Val Ser Leu Leu Glu Ile Gly Glu Gly Val Val Glu Val Arg Ala
180 185 190
Thr Ser Gly Asp Asn His Leu Gly Gly Asp Asp Trp Asp Gln Arg Val
195 200 205
Val Asp Trp Leu Val Asp Lys Phe Lys Gly Thr Ser Gly Ile Asp Leu
210 215 220
Thr Lys Asp Lys Met Ala Met Gln Arg Leu Arg Glu Ala Ala Glu Lys
225 230 235 240
Ala Lys Ile Glu Leu Ser Ser Ser Gln Ser Thr Ser Ile Asn Leu Pro
245 250 255
Tyr Ile Thr Val Asp Ala Asp Lys Asn Pro Leu Phe Leu Asp Glu Gln
260 265 270
Leu Thr Arg Ala Glu Phe Gln Arg Ile Thr Gln Asp Leu Leu Asp Arg
275 280 285
Thr Arg Lys Pro Phe Gln Ser Val Ile Ala Asp Thr Gly Ile Ser Val
290 295 300
Ser Glu Ile Asp His Val Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Met Pro
305 310 315 320
Ala Val Thr Asp Leu Val Lys Glu Leu Thr Gly Gly Lys Glu Pro Asn
325 330 335
Lys Gly Val Asn Pro Asp Glu Val Val Ala Val Gly Ala Ala Leu Gln
340 345 350
Ala Gly Val Leu Lys Gly Glu Val Lys Asp Val Leu Leu Leu Asp Val
355 360 365
Thr Pro Leu Ser Leu Gly Ile Glu Thr Lys Gly Gly Val Met Thr Arg
370 375 380
Leu Ile Glu Arg Asn Thr Thr Ile Pro Thr Lys Arg Ser Glu Thr Phe
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Thr Thr Ala Asp Asp Asn Gln Pro Ser Val Gln Ile Gln Val Tyr Gln
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Leu Thr Gly Ile Pro Pro Ala Pro Arg Gly Ile Pro Gln Ile Glu Val
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Lys Gly Thr Gly Lys Glu Asn Thr Ile Arg Ile Gln Glu Gly Ser Gly
465 470 475 480
Leu Ser Lys Glu Asp Ile Asp Arg Met Ile Lys Asp Ala Glu Ala His
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Asp Ala Ala Val Ala Glu Ala Lys Ala Ala Leu Gly Gly Ser Asp Ile
545 550 555 560
Ser Ala Ile Lys Ser Ala Met Glu Lys Leu Gly Gln Glu Ser Gln Ala
565 570 575
Leu Gly Gln Ala Ile Tyr Glu Ala Ala Gln Ala Ala Ser Gln Ala Thr
580 585 590
Gly Ala Ala His Pro Gly Gly Glu Pro Gly Gly Ala His Pro Gly Ser
595 600 605
Ala Asp Asp Val Val Asp Ala Glu Val Val Asp Asp Gly Arg Glu Ala
610 615 620
Lys Val His His His His His His His His
625 630
<210> 2
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工合成(Artificial sequence)
<400> 2
Met Glu Thr Asn Ser Ser Leu Pro Thr Asn Ile Ser Gly Gly Thr Pro
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Ala Val Ser Ala Gly Tyr Leu Phe Leu Asp Ile Ile Thr Tyr Leu Val
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Phe Ala Val Thr Phe Val Leu Gly Val Leu Gly Asn Gly Leu Val Ile
35 40 45
Trp Val Ala Gly Phe Arg Met Thr His Thr Val Thr Thr Ile Ser Tyr
50 55 60
Leu Asn Leu Ala Val Ala Asp Phe Cys Phe Thr Ser Thr Leu Pro Phe
65 70 75 80
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Leu Cys Lys Phe Val Phe Thr Ile Val Asp Ile Asn Leu Phe Gly Ser
100 105 110
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115 120 125
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Val Ile Ile Gly Pro Trp Val Met Ala Leu Leu Leu Thr Leu Pro Val
145 150 155 160
Ile Ile Arg Val Thr Thr Val Pro Gly Lys Thr Gly Thr Val Ala Cys
165 170 175
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Gly Phe Ser Ala Pro Met Ser Ile Val Ala Val Ser Tyr Gly Leu Ile
210 215 220
Ala Thr Lys Ile His Lys Gln Gly Leu Ile Lys Ser Ser Arg Pro Leu
225 230 235 240
Arg Val Leu Ser Phe Val Ala Ala Ala Phe Phe Leu Cys Trp Ser Pro
245 250 255
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260 265 270
Gln Gly Met Tyr Lys Glu Ile Gly Ile Ala Val Asp Val Thr Ser Ala
275 280 285
Leu Ala Phe Phe Asn Ser Cys Leu Asn Pro Met Leu Tyr Val Phe Met
290 295 300
Gly Gln Asp Phe Arg Glu Arg Leu Ile His Ala Leu Pro Ala Ser Leu
305 310 315 320
Glu Arg Ala Leu Thr Glu Asp Ser Thr Gln Thr Ser Asp Thr Ala Thr
325 330 335
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340 345 350
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<211> 130
<212> PRT
<213> 人工合成(Artificial sequence)
<400> 3
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1 5 10 15
Ala Val Ser Ala Gly Tyr Leu Phe Leu Asp Ile Gly Gly Gly Gly Ser
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Arg Lys Ala Met Gly Gly His Trp Pro Phe Gly Trp Phe Leu Cys Lys
35 40 45
Phe Gly Gly Gly Gly Ser Arg Val Thr Thr Val Pro Gly Lys Thr Gly
50 55 60
Thr Val Ala Cys Thr Phe Asn Phe Ser Pro Trp Thr Asn Asp Pro Lys
65 70 75 80
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Arg Gly Gly Gly Gly Ser Arg Ile Arg Glu Leu Leu Gln Gly Met Tyr
100 105 110
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115 120 125
His His
130
<210> 4
<211> 764
<212> PRT
<213> 人工合成(Artificial sequence)
<400> 4
Met Ala Arg Ala Val Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Asn Ser Val Val
1 5 10 15
Ser Val Leu Glu Gly Gly Asp Pro Val Val Val Ala Asn Ser Glu Gly
20 25 30
Ser Arg Thr Thr Pro Ser Ile Val Ala Phe Ala Arg Asn Gly Glu Val
35 40 45
Leu Val Gly Gln Pro Ala Lys Asn Gln Ala Val Thr Asn Val Asp Arg
50 55 60
Thr Val Arg Ser Val Lys Arg His Met Gly Ser Asp Trp Ser Ile Glu
65 70 75 80
Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Thr Ala Pro Glu Ile Ser Ala Arg Ile Leu
85 90 95
Met Lys Leu Lys Arg Asp Ala Glu Ala Tyr Leu Gly Glu Asp Ile Thr
100 105 110
Asp Ala Val Ile Thr Thr Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ala Gln Arg Gln
115 120 125
Ala Thr Lys Asp Ala Gly Gln Ile Ala Gly Leu Asn Val Leu Arg Ile
130 135 140
Val Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala Tyr Gly Leu Asp Lys Gly
145 150 155 160
Glu Lys Glu Gln Arg Ile Leu Val Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe
165 170 175
Asp Val Ser Leu Leu Glu Ile Gly Glu Gly Val Val Glu Val Arg Ala
180 185 190
Thr Ser Gly Asp Asn His Leu Gly Gly Asp Asp Trp Asp Gln Arg Val
195 200 205
Val Asp Trp Leu Val Asp Lys Phe Lys Gly Thr Ser Gly Ile Asp Leu
210 215 220
Thr Lys Asp Lys Met Ala Met Gln Arg Leu Arg Glu Ala Ala Glu Lys
225 230 235 240
Ala Lys Ile Glu Leu Ser Ser Ser Gln Ser Thr Ser Ile Asn Leu Pro
245 250 255
Tyr Ile Thr Val Asp Ala Asp Lys Asn Pro Leu Phe Leu Asp Glu Gln
260 265 270
Leu Thr Arg Ala Glu Phe Gln Arg Ile Thr Gln Asp Leu Leu Asp Arg
275 280 285
Thr Arg Lys Pro Phe Gln Ser Val Ile Ala Asp Thr Gly Ile Ser Val
290 295 300
Ser Glu Ile Asp His Val Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Met Pro
305 310 315 320
Ala Val Thr Asp Leu Val Lys Glu Leu Thr Gly Gly Lys Glu Pro Asn
325 330 335
Lys Gly Val Asn Pro Asp Glu Val Val Ala Val Gly Ala Ala Leu Gln
340 345 350
Ala Gly Val Leu Lys Gly Glu Val Lys Asp Val Leu Leu Leu Asp Val
355 360 365
Thr Pro Leu Ser Leu Gly Ile Glu Thr Lys Gly Gly Val Met Thr Arg
370 375 380
Leu Ile Glu Arg Asn Thr Thr Ile Pro Thr Lys Arg Ser Glu Thr Phe
385 390 395 400
Thr Thr Ala Asp Asp Asn Gln Pro Ser Val Gln Ile Gln Val Tyr Gln
405 410 415
Gly Glu Arg Glu Ile Ala Ala His Asn Lys Leu Leu Gly Ser Phe Glu
420 425 430
Leu Thr Gly Ile Pro Pro Ala Pro Arg Gly Ile Pro Gln Ile Glu Val
435 440 445
Thr Phe Asp Ile Asp Ala Asn Gly Ile Val His Val Thr Ala Lys Asp
450 455 460
Lys Gly Thr Gly Lys Glu Asn Thr Ile Arg Ile Gln Glu Gly Ser Gly
465 470 475 480
Leu Ser Lys Glu Asp Ile Asp Arg Met Ile Lys Asp Ala Glu Ala His
485 490 495
Ala Glu Glu Asp Arg Lys Arg Arg Glu Glu Ala Asp Val Arg Asn Gln
500 505 510
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Asp Ala Ala Val Ala Glu Ala Lys Ala Ala Leu Gly Gly Ser Asp Ile
545 550 555 560
Ser Ala Ile Lys Ser Ala Met Glu Lys Leu Gly Gln Glu Ser Gln Ala
565 570 575
Leu Gly Gln Ala Ile Tyr Glu Ala Ala Gln Ala Ala Ser Gln Ala Thr
580 585 590
Gly Ala Ala His Pro Gly Gly Glu Pro Gly Gly Ala His Pro Gly Ser
595 600 605
Ala Asp Asp Val Val Asp Ala Glu Val Val Asp Asp Gly Arg Glu Ala
610 615 620
Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Glu Thr Asn Ser Ser
625 630 635 640
Leu Pro Thr Asn Ile Ser Gly Gly Thr Pro Ala Val Ser Ala Gly Tyr
645 650 655
Leu Phe Leu Asp Ile Gly Gly Gly Gly Ser Arg Lys Ala Met Gly Gly
660 665 670
His Trp Pro Phe Gly Trp Phe Leu Cys Lys Phe Gly Gly Gly Gly Ser
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705 710 715 720
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725 730 735
Arg Ile Arg Glu Leu Leu Gln Gly Met Tyr Lys Glu Ile Gly Ile Ala
740 745 750
Val Asp Val Val His His His His His His His His
755 760

Claims (11)

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为HSP70蛋白和FPR1胞外段蛋白融合后的蛋白，所述的FPR1胞外段蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的一种融合蛋白，其特征在于，所述的FPR1胞外段蛋白的氨基酸序列由四段氨基酸序列组成，不同段的FPR1胞外段蛋白的氨基酸序列之间由柔性连接肽连接；所述柔性连接肽为GGGGS。
3.根据权利要求1所述的一种融合蛋白，其特征在于，所述的FPR1胞外段蛋白和HSP70蛋白之间由柔性连接肽连接。
4.根据权利要求1所述的一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
5.一种编码权利要求1-4任意一项所述的融合蛋白的核苷酸序列。
6.一种包括权利要求1-4任意一项所述的融合蛋白或者权利要求5所述的核苷酸序列的重组菌或重组细胞，或者包括权利要求5所述的核苷酸序列的载体。
7.一种融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括：构建含有编码权利要求1-4任意一项所述的融合蛋白的核苷酸序列的表达系统，表达FPR1胞外段蛋白和HSP70蛋白的融合蛋白；然后将融合蛋白进行纯化。
8.根据权利要求7所述的一种融合蛋白的制备方法，其特征在于，将编码SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的核苷酸序列克隆到proEM系统中，并转染到大肠杆菌中制备转染级质粒，之后将质粒通过转染试剂转染到哺乳动物细胞HEK293中进行瞬时表达，再通过亲和层析纯化蛋白。
9.权利要求1-4任意一项所述的融合蛋白在制备治疗和/或预防宫颈癌的药物中的应用。
10.一种疫苗，其特征在于，包括权利要求1-4任意一项所述的一种融合蛋白和药学上可接受的载体。
11.根据权利要求10所述的一种疫苗，其特征在于，所述的疫苗为治疗和/或预防宫颈癌的DC疫苗。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109627295B (zh) * 2018-12-29 2020-08-04 四川大学 一种通用型狂犬病相关病毒g蛋白胞外段的制备方法
CN111533812B (zh) * 2020-06-22 2020-10-27 艾立克(北京)生物科技有限公司 针对sars-cov-2病毒的dna疫苗及其用途
CN114539429B (zh) * 2022-03-24 2022-07-29 上海普铭生物科技有限公司 融合蛋白组合物及其应用
CN115010806B (zh) * 2022-06-29 2023-06-23 任殿明 抑制剂联合骨髓间充质干细胞在治疗癌症中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002034777A1 (en) * 2000-10-24 2002-05-02 Chiesi Farmaceutici S.P.A. Fusion proteins as immunization treatments of alzheimer's disease
CN1680451A (zh) * 1997-08-05 2005-10-12 斯特思吉生物技术公司 包含hpv抗原和应激蛋白或者其表达载体的组合物激发的抗hpv抗原免疫应答
CN1824325A (zh) * 2005-12-16 2006-08-30 武汉大学 人乳头病毒dna嵌合疫苗及制备方法和应用
CN103772508A (zh) * 2014-01-15 2014-05-07 南京勉益生物药业有限公司 免疫增强的人乳头瘤病毒感染及相关疾病的治疗性疫苗

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1749276A (zh) * 2004-09-14 2006-03-22 北京迪威华宇生物技术有限公司 热休克蛋白65人上皮细胞生长因子受体2融合蛋白(hsp65－her2)
CN107281475B (zh) * 2017-06-15 2020-12-25 杭州贝罗康生物技术有限公司 一种预防及治疗肿瘤的基因疫苗及其制备方法和用途

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1680451A (zh) * 1997-08-05 2005-10-12 斯特思吉生物技术公司 包含hpv抗原和应激蛋白或者其表达载体的组合物激发的抗hpv抗原免疫应答
WO2002034777A1 (en) * 2000-10-24 2002-05-02 Chiesi Farmaceutici S.P.A. Fusion proteins as immunization treatments of alzheimer's disease
CN1824325A (zh) * 2005-12-16 2006-08-30 武汉大学 人乳头病毒dna嵌合疫苗及制备方法和应用
CN103772508A (zh) * 2014-01-15 2014-05-07 南京勉益生物药业有限公司 免疫增强的人乳头瘤病毒感染及相关疾病的治疗性疫苗

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANXA1与FPR1在胃癌组织中的表达及意义;杨华等;《宁夏医学杂志》;20150228;第37卷(第2期);第111-113页，参见全文 *
化学研究最新进展药物研究发展报告;朱海峰等;《科学观察》;20121231;第7卷(第3期);第11-23页，参见第16、21页 *

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