CN108251442B - Flt3嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种编码嵌合抗原受体的核酸分子，所述嵌合抗原受体包含胞外区、跨膜区和胞内信号转导区，其编码的所述胞外区包含FLT3结合结构域，所述FLT3结合结构域为FLT3配体或与所述FLT3配体具有90‑99％同一性的氨基酸序列。通过流式细胞术、脱颗粒分析实验、以及ELISA检测T细胞分泌的细胞因子，证明该嵌合抗原受体修饰的T细胞对表达FLT3的白血病细胞有很强的杀伤作用，尤其是对携带有FLT3突变型的AML细胞具有特异杀伤作用，有效防止了脱靶效应。本发明嵌合抗原受体FLT3L‑CD8α‑4‑1BB‑CD3ζ可用于FLT3+白血病，尤其是携带有FLT3突变的白血病的治疗。

Description

FLT3嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及FLT3嵌合抗原受体及其应用。
背景技术
急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一类造血系统的恶性克隆性疾病，60岁以下患者的长期生存率不到40％，60岁以上患者的治愈率不到15％。FMS样酪氨酸激酶3(Fms-like tyrosine kinase 3,FLT3)是近年来发现的早期造血生长因子受体基因，在正常造血干/祖细胞(Haemopoietic Stem/progenitor Cells,HSPCs)中低表达。目前研究表明，超过90％的AML患者细胞表达FLT3，而且有约30％的AML患者存在FLT3突变。已知与AML发病相关的FLT3突变主要为内部串联重复(Internal tandem duplications,ITD)突变和酪氨酸激酶结构域(Tyrosine kinase domain,TKD)突变，其中FLT3-ITD突变可见于约24％的成年AML患者中，约7％的AML患者可发生FLT3-TKD突变。FLT3-ITD或TKD突变通常会引发下游信号通路Raf/MEK/ERK、JAK/STAT5或PI3K/Akt的激活，促进肿瘤的发生发展。核型正常的AML患者出现FLT3突变，提示其预后不良。尽管FLT3抑制剂可改善患者预后，但携带有FLT3突变的AML患者的有效治疗方案仍然是异基因造血干细胞移植。
肿瘤过继细胞免疫治疗近年来已逐步走向临床，国内外针对急性淋巴细胞白血病以CD19作为靶抗原的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)修饰的T细胞免疫治疗已获得突破性进展。已报道有超过350例的B-ALL患者参与临床试验。在不同诊疗中心，不同国家，使用不同结构CAR修饰的T细胞(CAR-T)、淋巴细胞清除方案、自体或异体T细胞以及不同的CAR-T回输数量治疗难治复发的B-ALL患者，有50％～90％的患者可达到完全缓解。目前已报道多种针对AML抗原的CAR-T细胞，如CD33、CD123、CD44v6、叶酸受体β(folatereceptor,FRβ)和Lewis-Y CAR-T等，但临床试验结果欠佳，尚未见CAR-T治疗AML最佳方案的报道。FLT3作为AML发生发展过程中的关键基因，具备良好的发展前途。
CAR是一种人工合成的跨膜蛋白，主要由胞外区、跨膜区和胞内信号转导区构成。胞外区包括信号肽、抗原识别区以及铰链区。常用于CAR结构的信号肽有CD8α和GM-CSF信号肽，可引导抗原识别区及铰链区转移到胞外。抗原识别区具有特异性识别并结合肿瘤细胞表面抗原的功能，通常由抗体的轻链和重链通过柔性连接肽(flexible linker)连接而成的单链抗体(single chain variable fragment,scFv)构成，也可使用抗原的配体或受体识别靶细胞。胞内信号转导区主要来源于T细胞受体的CD3ζ链，目前将仅包含CD3ζ的CAR称为一代CAR，将包含一个共刺激因子CD28或4-1BB等的胞内区与CD3ζ串联组成的CAR称为二代CAR，将包含两个共刺激因子的胞内区与CD3ζ串联组成的CAR称为三代CAR。由临床前及临床试验证实，二代CAR和三代CAR比一代CAR具有更强的杀伤肿瘤细胞的能力，但二代CAR和三代CAR相比，三代CAR并没有展现出明显的优势。
常用的CAR-T制备方法是从患者或供者外周血中分离出单个核细胞(PeripheralBlood Mononuclear Cell,PBMCs)或CD3+T细胞，使用包被抗CD3/CD28的磁珠或抗CD3抗体或滋养细胞以及细胞因子IL2，诱导T细胞快速增殖；再使用慢病毒或睡美人转座子系统(sleeping beauty transposon system)把CAR转入细胞中稳定表达，待CAR-T细胞扩增至足量后回输到患者体内。遇到肿瘤细胞的CAR-T细胞会分泌包括穿孔素、颗粒酶、IFN-γ、TNF-α等细胞因子发挥杀伤肿瘤细胞的作用。
目前CAR-T治疗的毒性作用除了会引发细胞因子释放综合症(cytokine releasesyndrome,CRS)外(可使用IL-6单抗——托珠单抗进行治疗)，还可能存在脱靶效应(offtarget/off tumor toxicity)，既对表达有CAR靶向的肿瘤抗原的正常细胞存在杀伤作用。Rosenberg研究组报道了1例晚期直肠癌患者在回输抗HER2/neu CAR-T细胞后发生了严重的脱靶效应，最终患者并发急性肺损伤而死亡。因此，防范CAR-T的脱靶效应是至关重要的。CD123在正常造血干祖细胞HSPCs中低表达，在白血病起始细胞中高表达，并在大多数AML细胞中表达，Mardiros等、Gill等构建了靶向CD123 CAR-T细胞，证实以CD123为靶点的CAR-T细胞可有效杀伤AML细胞。为了降低CAR-T对低表达CD123的正常HSPCs的脱靶效应，Arcangeli等将识别CD123的scFv突变，寻找仅识别高表达CD123抗原的scFv。已有研究者使用FLT3 scFv作为抗原识别区，制备CAR-T细胞，但FLT3scFv不能区分表达FLT3野生型(FLT3wild type,FLT3-wt)的正常细胞和FLT3突变型的白血病细胞。
因此，急需寻找一种对FLT3野生型和突变型白血病细胞均产生良好效果，同时又不产生脱靶效应的CAR-T细胞来弥补现有技术中的不足。
发明内容
本发明的一个方面，是针对现有技术中急性髓系白血病的CAR-T预期治疗效果差，且容易发生脱靶效应的问题，提供了一种FLT3嵌合抗原受体及其应用。
本发明提供的技术方案为：
编码嵌合抗原受体的核酸分子，所述嵌合抗原受体包含胞外区、跨膜区和胞内信号转导区，其编码的所述胞外区包含FLT3结合结构域，所述FLT3结合结构域为FLT3配体或与所述FLT3配体具有90-99％同一性的氨基酸序列。
在本发明中，FLT3-wt细胞在FLT3配体(FLT3 ligand,FLT3L)作用下可产生促进细胞存活信号；而FLT3突变型细胞经FLT3L的刺激不能产生应答。具体来说，使用FLT3L作为抗原识别区，CD3ζ串联4-1BB胞内区作为胞内信号激活区，制备识别FLT3的二代CAR-T(FLT3LCAR-T)，在遇到FLT3野生型细胞可能产生两种效应，既是FLT3L引发的促存活效应和CAR-T细胞引发的杀伤作用，两个作用相互抵消，从而对FLT3野生型细胞产生较弱的影响或没有影响。因此，以FLT3L为抗原识别区制备的CAR-T细胞有望在识别并杀伤FLT3突变型白血病细胞的同时，对FLT3野生型细胞产生较弱的或不产生脱靶效应。从而，本发明以配体FLT3L识别受体制备成特异性识别表达FLT3，尤其是FLT3突变型白血病细胞的CAR-T细胞。
在本发明中，可以对所述FLT3配体的氨基酸序列以合适的方式进行随机或者工程化的点突变，其目的可以为，例如，获得更好的亲和力和/或解离性质，而这些突变后的氨基酸序列均包含在本发明的保护范围之内。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，本发明核酸分子编码的所述胞外区包含如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。该氨基酸序列为FLT3配体的氨基酸序列。
在本发明中，所述核酸分子可编码信号肽。信号肽可引导抗原识别区及铰链区转移到胞外。任意合适的信号肽或信号肽的组合均可实现本发明的目的。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，本发明核酸分子编码的所述胞外区还包含构建在所述的嵌合抗原受体氨基末端的信号肽或与所述信号肽具有90-99％同一性的氨基酸序列，所述信号肽为CD8α中的信号肽序列或GM-CSF。
更优选地，所述信号肽为如SEQ ID NO.4所示的信号肽。
在本发明的一个实施方式中，本发明核酸分子编码的所述FLT3结合结构域通过铰链区与其编码的所述跨膜区连接。任意合适的铰链区序列均可实现本发明的目的。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述铰链区为CD8α。
在本发明中，所述核酸分子还编码跨膜结构域。任意合适的跨膜结构域均能实现本发明的目的。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述跨膜区为选自以下蛋白质的跨膜结构域或与所述蛋白质具有90-99％同一性的氨基酸序列：T细胞受体的α、β或ζ链、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154。
在本发明中，所述核酸分子编码的所述胞内信号转导区还包含共刺激因子。
作为优选，所述共刺激因子为通过选自以下蛋白质或与所述蛋白质具有90-99％同一性的氨基酸序列获得的功能性信号结构域的一种或几种：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、淋巴细胞活化信号分子、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1、4-1BB、B7-H3、CD278、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM、KIRDS2、SLAMF7、NKp80、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49α、IA4、CD49D、ITGA6、VLA6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11α、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、CD29、ITGB1、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、CD226、CD84、CD96、CEACAM1、CRTAM、CD229、CD160、PSGL1、CD100、CD69、SLAMF6、SLAM、BLAME、CD162、LTBR、LAT、GADS或SLP-76。
更优选地，在本发明的一个实施方式中，所述共刺激因子为CD28或4-1BB或与其具有90-99％同一性的氨基酸序列。
同时，本发明核酸分子还编码任意合适的胞内信号结构域。可以为CD3ζ胞内信号结构与其具有90-99％同一性的氨基酸序列。
作为优选，本发明核酸分子所编码的嵌合抗原受体是以FLT3配体FLT3L抗原识别区、CD8α铰链区和跨膜区、以及4-1BB和CD3ζ胞内信号结构域串联而成的结构为信号传导结构域，其序列如SEQ ID NO.2所示。
另外，在上述抗原识别区、铰链区、跨膜区以及胞内信号区之间合适的位置可插入任意肽链作为间隔区，所述肽链可以为寡肽或多肽。
对于上述核酸分子的制备方法，可基于上述抗原识别区、铰链区、跨膜区以及胞内信号区等结构域的碱基序列，通过化学合成或PCR扩增等已知技术制备。通常，可以对编码上述结构域的氨基酸的密码子进行优化，以优化其在宿主细胞中的表达。上述碱基序列的信息可通过检索已知文献或NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等数据库来获得。
在本发明的一个实施方式中，采用PCR扩增的方法获得FLT3配体FLT3L抗原识别区的碱基序列。具体为，提取患者骨髓单个核细胞的总RNA，逆转录合成cDNA第一链，PCR扩增。其引物为：
P1：5’CGCGGATCCACCCAGGACTGCTCCTTCCA3’
P2：5’CCGGAATTCCTGACACTGCAGCTCCAGGC3’
本发明的另一个方面，是提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体由上述核酸分子编码。
上述嵌合抗原受体的胞外区包含FLT3结合结构域，所述FLT3结合结构域为FLT3配体或与所述FLT3配体具有90-99％同一性的氨基酸序列。
作为优选，本发明嵌合抗原受体是以FLT3配体FLT3L抗原识别区、CD8α铰链区和跨膜区、以及4-1BB和CD3ζ胞内信号结构域串联而成的结构为信号传导结构域，氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
本发明的另一个方面，是提供了一种载体，所述载体包含上述核酸分子。
在本发明中，上述载体可以为直链载体，也可以为环状载体。可以为质粒等非病毒载体，也可以为病毒载体，还可以为利用转座子的载体。所述载体中可含有启动子、终止子等调控序列，以及耐药基因、报告基因等标记序列。另外，上述载体也可包含编码自杀基因的序列，可根据治疗过程，通过给予激活自杀基因的物质，从而控制体内CAR-T细胞的数目。
作为上述病毒载体，可以为逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等。在本发明的一个实施方式中，使用的是慢病毒表达载体。
本发明的另一个方面，是提供了一种细胞，所述细胞包含上述核酸分子、上述嵌合抗原受体或上述载体。
在本发明的一个实施方式中，上述细胞为人的T细胞。在本发明的另一个实施方式中，上述细胞为人的NK细胞。所述T细胞可以来自血液、骨髓等体液，也可以来自脾脏、胸腺、淋巴等组织，或者原发肿瘤、转移性肿瘤、癌性腹水等癌症组织，经分离、纯化后得到。同时，所述T细胞可以为CD4+T细胞、CD8+T细胞、αβT细胞、γδT细胞、NKT细胞等。
本发明的另一个方面，是提供了一种上述核酸分子在制备抗白血病药物中的应用。
本发明的另一个方面，是提供了一种上述嵌合抗原受体在制备抗白血病药物中的应用。
本发明的另一个方面，是提供了一种上述载体在制备抗白血病药物中的应用。
本发明的另一个方面，是提供了一种上述细胞在制备抗白血病药物中的应用。
作为优选，上述应用为在制备防止产生脱靶效应的抗白血病药物中的应用。
只要其在病理过程中表达FLT3，上述白血病包括但不限于急性髓系白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性B淋巴细胞白血病(BALL)、急性T淋巴细胞白血病(TALL)等。
在本发明中，使用FLT3 Ligand为抗原识别区，其识别的是FLT3的胞外配体识别区(extracellular ligand-binding domain)；而突变发生在近膜区(Juxtamembranedomain)和酪氨酸激酶区(Tyrosine kinase domain)；因此，本发明对野生型和突变型的胞外配体识别区为相同的，均具有杀伤作用。
但作为优选，上述白血病为产生基因突变的白血病。
更优选地，上述白血病为产生FLT3-ITD和/或FLT3-TKD突变的白血病。进一步优选地，上述白血病为产生FLT3-ITD和/或FLT3-TKD突变的急性髓系白血病。
本发明的另一个方面，是提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含上述核酸分子、上述嵌合抗原受体、上述载体或上述细胞。
本发明药物组合物除包含上述成分以外，还可包含任意药学上允许的添加剂，例如，生理盐水、细胞培养基、葡萄糖、注射用水、甘油、乙醇以及它们的组合物、稳定剂、表面活性剂、防腐剂、等渗剂等。
同样，本发明药物组合物也可以和其他合适的抗癌剂联合应用。例如，阿糖胞苷、柔红霉素、阿克拉霉素、伊马替尼、米托蒽醌等。
本发明的另一个方面，是提供了一种上述核酸分子在治疗白血病中的应用。
本发明的另一个方面，是提供了一种上述嵌合抗原受体在治疗白血病中的应用。
本发明的另一个方面，是提供了一种上述载体在治疗白血病中的应用。
本发明的另一个方面，是提供了一种上述细胞在治疗白血病中的应用。
本发明的另一个方面，是提供了一种上述药物组合物在治疗白血病中的应用。
作为优选，上述白血病为产生基因突变的白血病。
更优选地，上述白血病为产生FLT3-ITD和/或FLT3-TKD突变的白血病。进一步优选地，上述白血病为产生FLT3-ITD和/或FLT3-TKD突变的急性髓系白血病。
本发明的有益效果为：
本发明从患者骨髓单个核细胞中提取RNA，逆转成cDNA，经PCR技术将FLT3L克隆到含有信号肽和CD8α-4-1BB-CD3ζ的慢病毒表达载体中，包装成携带FLT3L-CD8α-4-1BB-CD3ζ编码基因的慢病毒载体。利用慢病毒感染T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体。通过流式细胞术、脱颗粒分析实验、以及ELISA检测T细胞分泌的细胞因子，证明该嵌合抗原受体修饰的T细胞对表达FLT3的白血病细胞有很强的杀伤作用，尤其是对携带有FLT3突变型的AML细胞具有特异杀伤作用，有效防止了脱靶效应。本发明嵌合抗原受体FLT3L-CD8α-4-1BB-CD3ζ可用于FLT3+白血病，尤其是携带有FLT3突变的白血病的治疗。
附图说明
图1为本发明实施例中FLT3配体FLT3L的PCR扩增电泳图，其中，1为2kb核酸分子量标准泳道，2为FLT3L泳道；
图2为本发明实施例中慢病毒表达载体FLT3L-CD8α-4-1BB-CD3ζ限制性内切酶酶切片段电泳鉴定图，其中，1为15kb核酸分子量标记泳道；2为用核酸内切酶NheⅠ和NotⅠ双酶切慢病毒表达质粒FLT3L-CD8α-4-1BB-CD3ζ所得到的编码FLT3L-CD8α-4-1BB-CD3ζ的DNA片段(1149bp)和载体片段(7241bp)泳道；
图3为本发明实施例中慢病毒表达载体示意图，其中，逆时针序列是正向基因片段，顺时针序列为反向基因片段；
图4为利用流式细胞术检测本发明实施例中构建的FLT3L-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞中CAR分子的表达结果图，其中，A为转染空载体的T细胞和转染CAR的T细胞的GFP感染效率，B为GFP阳性细胞上FLT3L的表达；
图5为利用流式细胞术检测本发明实施例中急性髓系白血病细胞系U937、THP-1(FLT3野生型)、REH(FLT3野生型)、MV4-11(FLT3-ITD纯合突变)和MOLM13(FLT3-ITD杂合突变)细胞中FLT3靶抗原分子的表达强度结果图，其中，A为FLT3靶抗原分子表达阳性率；B为FLT3靶抗原分子的表达强度(specific fluorescence intensity,SFI)；
图6为本发明实施例中FLT3L-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞与FLT3野生型的REH和THP-1、FLT3突变型的MV4-11和MOLM13以及FLT3阴性的U937细胞系按效靶比1:1、1:2、1:4、1:8共培养48小时后残留的急性髓系白血病细胞存活率结果图，其中，CAR-T为FLT3L-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞的实验组；VEC-T为转染空载体的T细胞的对照组；
图7为本发明实施例中FLT3L-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞对U937、MV4-11、MOLM13、REH和THP-1(效靶比1:1、1:2、1:4、1:8)杀伤作用的脱颗粒检测结果图，其中，CAR-T为FLT3L-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞的实验组；VEC-T为转染空载体的T细胞的对照组，其中，A为流式细胞结果，B为柱状结果图；
图8为本发明实施例中FLT3L-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞与U937、REH、THP-1、MV4-11和MOLM13细胞系按效靶比1:1共培养24小时后，T细胞释放的细胞因子IFN-γ、TNF-α水平结果图，其中，CAR-T为FLT3L-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞的实验组；VEC-T为转染空载体的T细胞的对照组；
图9为利用流式细胞术检测AML病人骨髓单个核细胞(BMMCs)FLT3靶抗原分子的表达强度(specific fluorescence intensity,SFI)结果图，其中，●表示的1-5号病人携带FLT3-ITD突变，■表示的6-10号病人FLT3为野生型，▲表示的11和12号病人携带FLT3-TKD突变；
图10为本发明实施例中FLT3L-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞与AML病人的BMMCs按效靶比1:4共培养48小时后流式检测残留的急性髓系白血病细胞存活率结果图，其中，CAR-T为FLT3L-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞的实验组；VEC-T为转染空载体的T细胞的对照组，其中，●表示CAR-T组，■表示VEC-T组；
图11为本发明实施例中FLT3L-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞对AML病人的BMMCs杀伤作用的脱颗粒检测结果图，其中，CAR-T为FLT3L-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞的实验组；VEC-T为转染空载体的T细胞的对照组，其中，●表示CAR-T组，■表示VEC-T组；
图12为本发明实施例中FLT3L-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞与AML病人的BMMCs按效靶比1:4共培养48小时后，T细胞释放的细胞因子IFN-γ水平结果图，其中，CAR-T为FLT3L-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞的实验组；VEC-T为转染空载体的T细胞的对照组；
图13为本发明实施例中FLT3L-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞在小鼠体内效果的评价结果图，选用6-8周的NOD/SCID雌性小鼠并随机分为两组，第0天经尾静脉注射5×106的MV4-11细胞，第7天和第14天分别经尾静脉注射1×107的VEC-T细胞或CAR-T细胞(如A所示)，注射T细胞后每周监测小鼠体重变化(如B所示)，小鼠生存曲线如C所示，用SPSS软件计算生存期，其中，CAR-T为FLT3L-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞的实验组；VEC-T为转染空载体的T细胞的对照组；
图14为本发明实施例中FLT3L-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞分别与三个不同来源的脐带血CD34+细胞按效靶比1:1共培养24h后，在半固体培养基中培养14天后观察形态并计数集落数目结果图，其中，CAR-T为FLT3L-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞的实验组，VEC-T为转染空载体的T细胞的对照组，未处理组为未与T细胞共培养的空白对照组。
序列说明
SEQ ID NO.1为本发明FLT3嵌合抗原受体的氨基酸序列；
SEQ ID NO.2为本发明FLT3嵌合抗原受体的核酸序列；
SEQ ID NO.3为本发明FLT3嵌合抗原受体中抗原识别区的氨基酸序列；
SEQ ID NO.4为本发明FLT3嵌合抗原受体中信号肽的氨基酸序列；
SEQ ID NO.5为本发明FLT3嵌合抗原受体中CD8α-4-1BB-CD3ζ的氨基酸序列。
具体实施方式
本发明公开了一种FLT3嵌合抗原受体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：嵌合抗原受体中抗原识别区FLT3配体(FLT3L)的克隆
1.提取患者骨髓单个核细胞的总RNA：在5×106细胞中加入RNA iso Plus(Takara)1ml，吹打混匀。加入200μl三氯甲烷，上下颠倒、涡旋振荡混匀。4℃，12000rpm，离心5分钟。吸取上清至1.5ml EP管，加入同体积异丙醇，轻轻上下颠倒混匀。4℃，12000rpm，离心15分钟。4℃预冷75％乙醇沉淀RNA，50μl DEPC水溶解总RNA。
2.逆转录合成cDNA第一链：配制PCR反应体系(20μl)如下：Oligo d(T)15Primers:2μl；M-MLV(200u/μl)：1μl；dNTP(each 2.5mM)：1μl；DTT(0.1M)：2μl；First strand buffer(5×)：4μl；CD20-RNA:2μg；DEPC水:补足至20μl。反应条件：37℃，60分钟，70℃10分钟。
3.PCR扩增FLT3L的基因片段：
P1：5’CGCGGATCCACCCAGGACTGCTCCTTCCA3’
P2：5’CCGGAATTCCTGACACTGCAGCTCCAGGC3’
配制PCR反应体系(20μl)如下：2×Taq PCR Master Mix(TianGen公司)：10μl；10μM P1+P2：1μl；10μM cDNA：1μl；ddH2O：补足至20μl。反应条件：94℃预变性5分钟；重复如下循环33次：94℃30秒，52℃30秒，72℃1分钟；最后，72℃延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳分离并回收FLT3L片段。结果如图1所示。
实施例2：嵌合抗原受体载体的构建
1.采用Nhe I、EcoR I核酸内切酶酶切含有CD8α-4-1BB-CD3ζ片段的质粒，获得CD8α-4-1BB-CD3ζ片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。所述含有CD8α-4-1BB-CD3ζ片段的质粒可通过现有技术中任意合适的方法制得。
2.将实施例1中得到的FLT3L片段与目的载体进行连接，将构建的FLT3L-CD8α-4-1BB-CD3ζCAR目的载体。用NheⅠ和NotⅠ进行酶切鉴定。结果如图2所示，酶切结果表明阳性克隆含有目的条带且测序鉴定正确。载体示意图如图3所示。
实施例3：嵌合抗原受体FLT3L-CD8α-4-1BB-CD3ζ慢病毒修饰T细胞的制备
1.采用EndoFree Plasmid Maxi质粒抽提试剂盒(QIAGEN公司)提取FLT3L-CD8α-4-1BB-CD3ζ表达质粒和包装质粒psPAX2、PMD.2G。三种质粒用4：3：1比例用Turbofect转染试剂(Thermo公司)进行转染(具体方法见Turbofect转染试剂说明书)。转染后24小时、48小时分别收取病毒上清，于4℃，3000rpm，离心10分钟，经0.45μm滤器过滤后，采用50000g，4℃，3小时超速离心后浓缩10倍，后转入-80℃保存。
2.T细胞的制备：取新鲜健康人外周血10ml，采用RosetteSep T cell enrichmentCocktail(Stemcell公司)和Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare公司)提取T细胞(具体步骤按照RosetteSep T cell enrichment Cocktail说明书)。按细胞：磁珠＝1：1比例加入抗CD3/CD28磁珠(Gibco公司)，培养24小时即为转染前的T细胞。
3.慢病毒感染T细胞及感染后T细胞的培养：从-80℃中取出病毒上清，室温下融化，按每1×106T细胞加入100μl病毒上清，加入Polybrene至终浓度为8μg/ml。32℃，1800rpm，离心1.5小时，转入5％CO2，37℃孵箱培养。
4.流式细胞术检测CAR修饰T细胞的阳性率：收集细胞，使用FITC通道分析GFP的表达。结果如图4所示，由图中可以看出，CAR-T的阳性率为54.6％。
实验例1：嵌合抗原受体FLT3L-CD8α-4-1BB-CD3ζ慢病毒修饰T细胞对白血病细胞的杀伤作用
1.白血病细胞系中FLT3的表达水平：
U937、MV4-11、MOLM13、REH和THP-1细胞系均购自美国ATCC。分别培养后，各吸取5×105细胞悬液，PBS洗2次后，标记APC抗人FLT3单抗(Biolegend公司)，以标记APC-isotype为对照组，冰上孵育30分钟。运用流式细胞术检测各种细胞系FLT3的表达水平，结果如图5所示。其中U937、MV4-11、MOLM13、REH和THP-1细胞系表达FLT3及对应的同型对照的直方图如图5的A所示，其特异荧光强度(specific fluorescence intensity,SFI)分别为1.08、1.45、1.77、2.49和1.88，结果如图5的B所示。
结果表明，本实验例中所使用的各种白血病细胞系除U937以外，均表达FLT3。
2.CAR修饰的T细胞与U937、MV4-11、MOLM13、REH和THP-1细胞系共培养后流式检测残留的白血病细胞：
将上述细胞按1×105细胞/孔接种24孔培养板，分别加入1×105(1:1)、5×104(1:2)、2.5×104(1:4)、1.25×104(1:8)浓度的CAR修饰的T细胞，并重复将转染不含CAR的空载体T细胞(VEC-T)设为对照组，于孵箱中共培养。因为在U937、MV4-11、MOLM13和THP-1细胞系中100％表达CD33，REH细胞系中100％表达CD19，而T细胞表面没有CD33或CD19的表达，因此将共培养后的细胞用APC抗人CD33单抗(Biolegend公司)标记U937、MV4-11、MOLM13和THP-1，用APC抗人CD19单抗(Biolegend公司)标记REH，用APC-Cy7抗人CD3单抗(Biolegend公司)标记T细胞，流式细胞术检测残留细胞。结果如图6所示，结果表明，CAR-T与表达FLT3-ITD的MV4-11共培养48小时后，MV4-11分别存留0.02％、0.032％、0.26％和1.46％，对照组存留MV4-11为79.6％、87.6％、90.5％、80.7％。CAR-T与MOLM13共培养48小时后，MOLM13分别存留12.4％、23％、57.9％和89.7％，对照组存留62.5％、81.1％、90.6％、95％。CAR-T与表达野生型FLT3的REH共培养48小时后，REH分别存留3.2％、2.4％、4.1％和38.1％，对照组存留61.3％、80.5％、92.9％、97.6％。CAR-T与表达野生型FLT3的THP-1共培养48小时后，THP-1分别存留6.36％、31％、63％和82.3％，对照组存留37.4％、60.9％、82.4％、88.6％。而CAR-T与FLT3阴性的U937共培养48小时后，U937分别存留62.4％、82.4％、88.4％和99.3％，对照组存留74.5％、86％、86％、94％。有上述结果可以看出，CAR-T对表达FLT3突变型和FLT3野生型的白血病细胞都有杀伤作用，同时，对FLT3突变型的杀伤作用强于FLT3野生型的白血病细胞。
3.脱颗粒实验分析CAR修饰的T细胞的激活：
将CAR-T及VEC-T细胞分别与U937、MV4-11、MOLM13、REH和THP-1细胞按照效靶比1:1进行共培养，并在共培养体系中加入anti-CD107a抗体和monensin；4h后应用流式细胞仪检测GFP+细胞表面CD107a的表达水平。结果如图7所示，结果表明，CAR-T与MV4-11、MOLM13、REH和THP-1共培养体系中，细胞激活百分率分别为18.6％、16.1％、21.4％、15.8％，VEC-T与MV4-11、MOLM13、REH和THP-1共培养体系中，细胞激活百分率分别为3.34％、1.43％、2.48％、3.33％。CAR-T与VEC-T的激活有显著差异(P<0.001)。而CAR-T与U937共培养体系中，细胞激活百分率为1.60％、VEC-T与U937共培养体系中，细胞激活百分率为1.89％，两者没有差异。
4.ELISA检测AML细胞系与CAR-T细胞共培养上清中细胞因子IFN-γ、TNF-α的水平：
分别将U937、MV4-11、MOLM13、REH和THP-1细胞系按照2×105细胞/孔接种24孔板。按每孔2×105细胞分别加入CAR-T、VEC-T细胞，补充培养液至1ml于孵箱中共培养24小时后。采用人IFN-γ、TNFα ELISA检测试剂盒(R&D公司)，对共培养上清进行检测(具体步骤见ELISA检测试剂盒说明书)。结果如图8所示，结果表明，表达FLT3的AML细胞系MV4-11、MOLM13、REH和THP-1与CAR-T共培养上清中IFN-γ、TNF-α细胞因子水平均较VEC-T组有显著性升高(P<0.001)，但在不表达FLT3的U937细胞的共培养上清中的IFN-γ、TNF-α细胞因子水平没有统计学差异(P>0.05)。结果表明，CAR-T在表达FLT3的AML细胞系刺激下，能够分泌Th1类细胞因子；而且与表达野生型AML细胞系相比，FLT3L CAR-T在与AML-ITD细胞共培养时可分泌更多的细胞因子。
5.AML病人的骨髓单个核细胞(BMMCs)中FLT3的表达水平：
病人标本均来自中国医学科学院血液病医院并征得患者的知情同意。1到5号病人携带FLT3-ITD突变，6-10号病人为FLT3-wt,11到12号病人携带FLT3-TKD突变。采用Ficoll梯度离心分离出BMMCs后，各吸取5×105细胞悬液，PBS洗2次后，标记APC抗人FLT3单抗(Biolegend公司)或APC-isotype(对照组)，冰上孵育30分钟。运用流式细胞术检测各患者BMMCs表达FLT3的特异荧光强度(specific fluorescence intensity,SFI)，统计如图9所示(SFI＞1.4为FLT3阳性)，其中，●表示1-5号病人，■表示6-10号病人，▲表示11和12号病人。
6.CAR修饰的T细胞与AML病人的BMMCs共培养后流式检测残留的白血病细胞：
将细胞按2×105细胞/孔接种24孔培养板，分别加入8×105(E:T＝1:4)的CAR修饰的T细胞，转染不含CAR的空载体T细胞(VEC-T)设为对照组，于孵箱中共培养48h。将共培养后的细胞用APC抗人CD33单抗(Biolegend公司)标记AML病人的白血病细胞，用APC-Cy7抗人CD3单抗(Biolegend公司)标记T细胞，流式细胞术检测残留细胞。结果如图10所示，结果显示，CAR-T与表达FLT3-ITD的1-5号病人共培养48小时后，CAR-T组分别存留CD33+细胞为42.36％、72.5％、31.38％、41.46％、20.0％，对照组存留为100％、99.74％、60.46％、86.74％、58.9％；CAR-T与表达FLT3-wt的6-10号BMMCs共培养48小时后，CAR-T组分别存留CD33+细胞为32.2％、9.9％、27.99％、25.5％、6.6％，对照组存留分别为69.7％、24.05％、42.77％、44.82％、27.45％；CAR-T与表达FLT3-TKD的11，12号的BMMCs共培养48小时后，CAR-T组分别存留CD33+细胞为24.7％、46.25％，对照组存留分别为36.9％、81.2％。由上述结果可以说明，CAR-T对表达FLT3突变型(ITD和TKD)和FLT3野生型的白血病原代BMMCs均有杀伤作用。图中，●表示CAR-T组，■表示VEC-T组。
7.CAR修饰的T细胞与AML病人的BMMCs共培养后脱颗粒实验分析CAR修饰的T细胞的激活：
将CAR-T及VEC-T细胞分别与1到12号病人的BMMCs按照效靶比1:1进行共培养，并在共培养体系中加入anti-CD107a抗体和monensin；4h后应用流式细胞仪检测CD3+细胞表面CD107a的表达水平。结果如图11所示，结果显示，CAR-T与表达FLT3-ITD的1-5号病人共培养体系中，细胞激活百分率分别为10.58％、8.74％、14.97％、11.9％，10.8％；VEC-T与表达FLT3-ITD的1-5号病人共培养体系中，细胞激活百分率分别为3.14％、3.2％、6.58％、2.52％，3.32％。CAR-T与FLT3-wt的6-10号病人共培养体系中，细胞激活百分率分别为16％、15.86％、11.9％、13.67％，11.2％。VEC-T与表达FLT3-WT的6-10号病人共培养体系中，细胞激活百分率分别为4.48％、9.95％、4.8％、3.08％，3.88％。CAR-T与表达FLT3-TKD的11、12号病人共培养体系中细胞激活百分率分别为12.1％、11％。VEC-T与表达FLT3-TKD的11、12号病人共培养体系中，细胞激活百分率分别为6.0％、3.2％。由上述结果可以说明，CAR-T与VEC-T的激活有显著差异。图中，●表示CAR-T组，■表示VEC-T组。
8.ELISA检测AML病人BMMCs与CAR-T细胞共培养上清中细胞因子IFN-γ的水平：
分别将AML病人的BMMCs按照2×105细胞/孔接种24孔板。按每孔8×105细胞分别加入CAR-T或VEC-T细胞(E:T＝1:4)，补充培养液至1ml于孵箱中共培养48小时后。采用人IFN-γELISA检测试剂盒(R&D公司)，对共培养上清进行检测(具体步骤见ELISA检测试剂盒说明书)。结果如图12所示。结果表明，表达FLT3-ITD、FLT3-wt和FLT3-TKD的AML病人BMMCs与CAR-T共培养上清中IFN-γ细胞因子水平均较VEC-T组有显著性升高。由上述结果可以说明，CAR-T在表达FLT3(FLT3-ITD、FLT3-wt和FLT3-TKD)的AML病人BMMCs刺激下，能够分泌Th1类细胞因子。
9.CAR修饰的T细胞在FLT3+AML白血病小鼠模型的作用：
选取6-8周的NOD/SCID雌性小鼠并随机分为两组，经过尾静脉注射MV4-11细胞5×106/只；移植后的第7天和第14天分别注射CAR-T细胞或VEC-T细胞1×107/只(见图13的A)，与对照组相比，小鼠体重并未因注射CAR-T发生明显下降，提示CAR-T的治疗对小鼠无明显的毒副作用。白血病细胞移植后第28天，VEC-T组开始小鼠开始出现明显的体重减轻，而CAR-T组无明显变化(如图13的B所示)。VEC-T组和CAR-T组生存期分别为86天及126天，生存曲线如图13的C所示，计算两组生存期差异发现，CAR-T组可以显著延长小鼠的生存期，有显著的统计学差异(p＝0.0039)。
实验例2：CAR修饰的T细胞对造血干祖细胞的脱靶作用
选取三份不同来源的脐带血，采用CD34+免疫磁珠分选出CD34+细胞，与CAR-T或VEC-T按效靶比1:1共培养24h后，共培养或未处理的CD34+细胞在半固体培养基中培养14天后，观察各组集落形态并计数集落数目。结果如图14所示，结果表明，CAR-T组与VEC-T组或未处理组相比，集落数目无明显减少；说明CAR-T细胞对CD34+细胞无明显的脱靶作用。
对比例1：
将anti-FLT3-scFv-CD28-CD3ζ修饰的T细胞，感染空载体的T细胞(EV)或未感染的T细胞(Unmodified)分别与MOLM13细胞按效靶比10:1共培养16小时后，采用4-hr 51Crrelease的方法检测CAR-T组特异性杀伤比例为40～50％；EV组和Unmodified组未见特异性杀伤作用。
将实施例1～3中制备的CAR-T细胞或感染空载体的T细胞(VECT)分别与MOLM13细胞以效靶比1:1共培养48小时后，流式细胞学检测残留的白血病细胞为0％当缩短共培养时间至24小时，流式细胞学检测FLT3L-CART组残留白血病细胞仅为7％，VECT组未见特异性杀伤作用。
结果表明，在共培养时间相近的前提下，实施例1～3中制备的CAR-T细胞与anti-FLT3-scFv-CAR T相比，能以更小的效靶比，特异性的杀伤更多的MOLM13白血病细胞。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国医学科学院血液病医院(血液学研究所)
<120> FLT3嵌合抗原受体及其应用
<130> 2018
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 381
<212> PRT
<213> Artificial
<400> 1
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gly Ser Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser
20 25 30
Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr
35 40 45
Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu
50 55 60
Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met
65 70 75 80
Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu
85 90 95
Arg Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln Pro
100 105 110
Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu
115 120 125
Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg
130 135 140
Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Leu Gln Cys Gln Glu Phe Thr Thr
145 150 155 160
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
165 170 175
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
180 185 190
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
195 200 205
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
210 215 220
Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
225 230 235 240
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
245 250 255
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
260 265 270
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
275 280 285
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
290 295 300
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
305 310 315 320
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
325 330 335
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
340 345 350
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
355 360 365
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
370 375 380
<210> 2
<211> 1149
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
gccaccatgg ccttaccagt gaccgccttg ctcctgccgc tggccttgct gctccacgcc 60
gccaggccgg gatccaccca ggactgctcc ttccaacaca gccccatctc ctccgacttc 120
gctgtcaaaa tccgtgagct gtctgactac ctgcttcaag attacccagt caccgtggcc 180
tccaacctgc aggacgagga gctctgcggg ggcctctggc ggctggtcct ggcacagcgc 240
tggatggagc ggctcaagac tgtcgctggg tccaagatgc aaggcttgct ggagcgcgtg 300
aacacggaga tacactttgt caccaaatgt gcctttcagc ccccccccag ctgtcttcgc 360
ttcgtccaga ccaacatctc ccgcctcctg caggagacct ccgagcagct ggtggcgctg 420
aagccctgga tcactcgcca gaacttctcc cggtgcctgg agctgcagtg tcaggaattc 480
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 540
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 600
gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 660
ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaaa cggggcagaa agaaactcct gtatatattc 720
aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact actcaagagg aagatggctg tagctgccga 780
tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac 840
gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 900
gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 960
agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 1020
gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 1080
taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 1140
ccccctcgc 1149
<210> 3
<211> 133
<212> PRT
<213> Human
<400> 3
Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala
1 5 10 15
Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val
20 25 30
Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp
35 40 45
Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala
50 55 60
Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His
65 70 75 80
Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe
85 90 95
Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu
100 105 110
Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu
115 120 125
Glu Leu Gln Cys Gln
130
<210> 4
<211> 23
<212> PRT
<213> Human
<400> 4
Ala Thr Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu
1 5 10 15
Leu Leu His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 5
<211> 223
<212> PRT
<213> Human
<400> 5
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
65 70 75 80
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
85 90 95
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
100 105 110
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
115 120 125
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
130 135 140
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
145 150 155 160
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
165 170 175
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
180 185 190
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
195 200 205
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
210 215 220

Claims (8)

1.嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码如权利要求1所述的嵌合抗原受体的核酸分子，其特征在于，所述所述核酸分子的序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种载体，其特征在于，所述载体包含如权利要求2所述的核酸分子。
4.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含如权利要求2所述的核酸分子或如权利要求3所述的载体。
5.如权利要求1所述的嵌合抗原受体、如权利要求2所述的核酸分子、如权利要求3所述的载体或如权利要求4所述的细胞在制备抗白血病药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述白血病为产生FLT3-ITD和/或FLT3-TKD突变的白血病。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述白血病为产生FLT3-ITD和/或FLT3-TKD突变的急性髓系白血病。
8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1所述的嵌合抗原受体、如权利要求2所述的核酸分子、如权利要求3所述的载体或如权利要求4所述的细胞。
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