CN112979820B

CN112979820B - 靶向cd123的嵌合抗原受体及含有靶向cd123嵌合抗原受体的双靶点嵌合抗原受体

Info

Publication number: CN112979820B
Application number: CN201911299888.2A
Authority: CN
Inventors: 王建祥; 王敏; 熊冬生; 王珍珍; 卢杨; 饶青; 徐颖茜; 邢海燕
Original assignee: Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital of CAMS and PUMC
Priority date: 2019-12-17
Filing date: 2019-12-17
Publication date: 2022-06-17
Anticipated expiration: 2039-12-17
Also published as: CN112979820A

Abstract

本发明公开了编码靶向CD123的嵌合抗原受体的核酸分子，所述嵌合抗原受体包含胞外区、跨膜区和胞内信号转导区，其编码的所述胞外区包含CD123结合结构域，所述CD123结合结构域为抗CD123的单链抗体可变区片段；所述抗CD123的单链抗体可变区片段为SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列或与其具有90％～99％同一性的序列、SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列或与其具有90％～99％同一性的序列，或SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列或与其具有90％～99％同一性的序列。本发明嵌合抗原受体可用于CD123⁺和/或CD33⁺血液肿瘤的治疗，有效防止脱靶效应，使治疗效果更好，不易发生逃逸。

Description

靶向CD123的嵌合抗原受体及含有靶向CD123嵌合抗原受体的双靶点嵌合抗原受体

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及靶向CD123的嵌合抗原受体及含有靶向CD123嵌合抗原受体的双靶点嵌合抗原受体。

背景技术

嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)修饰的T细胞作为一种免疫治疗策略，在肿瘤治疗中受到广泛的重视和应用。CAR的结构一般由胞外靶向连接区(常为具有抗原识别功能的单链抗体)，铰链区，跨膜区和胞内信号转导区四部分组成。目前根据胞内信号转导区加入共刺激分子的数量，将CAR分为一代(无共刺激分子)、二代(含一种共刺激分子)和三代(含两种共刺激分子)。目前应用最多的是二代CAR。

急性髓系白血病(AML)是髓系造血干祖细胞失控性扩增为特征的异质性肿瘤，是最常见的成人白血病，占白血病相关死亡人数的第一位。尽管化疗和造血干细胞移植对AML的治疗有一定效果，但多中心回顾性研究显示，60岁以下AML患者仅40％能够生存5年以上，复发患者和60岁以上患者预后更差。造血干细胞移植为难治复发AML患者治愈的唯一方式，但至少有一半的难治复发患者不适合做移植术，且难治复发AML患者移植后复发率和移植相关死亡率很高，因此需要更好的治疗方式改善AML预后。

CD123是AML相关抗原，高表达CD123是AML预后不良因素之一。CD123高表达于白血病干细胞，低表达或不表达于正常造血干细胞，成为治疗AML的理想治疗靶点。除了AML以外，CD123还会过表达于其他血液系统肿瘤，如急性B淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、浆细胞样树突细胞肿瘤和多毛细胞白血病等。

此外，CD33也在大量AML疾病中的特异性表达以及在正常细胞的最低限度表达，因此它也一直是AML治疗的重要靶点。

一项针对319例AML患者的研究发现95.7％的AML患者表达CD33或CD123中的一种或两种抗原，因此，同时靶向CD33和CD123可用于治疗大部分患者的AML，同时可以防止与复发相关的抗原逃逸，更好的提高AML的治疗效果。

由于市场上单一针对CD123或CD33的嵌合抗原受体治疗白血病过程中容易因白血病细胞的逃避机制导致复发和无效，因此需要寻找一种更加有效的嵌合抗原受体解决上述问题。

发明内容

本发明是针对现有技术中CD123的嵌合抗原受治疗白血病的疗效差，容易复发和无效的缺点，提供了一种靶向CD123的嵌合抗原受体及其应用。

本发明的一个方面，是提供了编码靶向CD123的嵌合抗原受体的核酸分子，所述嵌合抗原受体包含胞外区、跨膜区和胞内信号转导区，其编码的所述胞外区包含CD123结合结构域，所述CD123结合结构域为抗CD123的单链抗体可变区片段；

所述抗CD123的单链抗体可变区片段为SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列或与其具有90％～99％同一性的序列、SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列或与其具有90％～99％同一性的序列，或SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列或与其具有90％～99％同一性的序列。

在本发明中，CD123⁺肿瘤细胞与SEQ ID NO.1所示的6E11-123CAR、SEQ ID NO.2所示的12H7-123CAR、SEQ ID NO.3所示的13C3-123CAR结合后可以激活相应的CAR-T细胞，产生细胞毒效应；而CD123^-细胞不能激活CAR-T细胞产生应答。因此，以6E11-CD123scFv(SEQID NO.13所示)、12H7-CD123scFv(SEQ ID NO.14所示)、13C3-CD123scFv(SEQ ID NO.15所示)为抗原识别区制备的CAR-T细胞在识别并杀伤CD123⁺肿瘤细胞的同时，对CD123^-细胞不产生脱靶效应。

在本发明中，CD123⁺和/或CD33⁺肿瘤细胞均可与SEQ ID NO.6所示的CD123/CD33双靶点嵌合抗原受体结合并激活CAR-T细胞，产生细胞毒效应；而CD123和CD33都不表达的细胞不能激活CAR-T细胞产生应答。因此，CD123和CD33双靶点嵌合抗原受体T细胞可识别并杀伤CD123⁺和/或CD33⁺肿瘤细胞，同时对CD123-CD33-细胞不产生脱靶效应。

在本发明中，可以对所述CD123 scFv的氨基酸序列以合适的方式进行随机或者工程化的点突变，其目的可以为，例如，获得更好的亲和力和/或解离性质，而这些突变后的氨基酸序列均包含在本发明的保护范围之内。

在本发明中，所述核酸分子可编码信号肽。信号肽可引导抗原识别区及铰链区转移到胞外。任意合适的信号肽或信号肽的组合均可实现本发明的目的。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，本发明核酸分子编码的所述胞外区还包含构建在所述的嵌合抗原受体氨基末端的信号肽或与所述信号肽具有90-99％同一性的氨基酸序列，所述信号肽为CD8α中的信号肽序列或GM-CSF。

更优选地，所述信号肽为如SEQ ID NO.17所示的信号肽。

由图2-5可以看出，在本发明的一个实施方式中，所述信号肽(或引导肽，CD8αleader)构建在CD123结合结构域的氨基末端。

在本发明的一个实施方式中，本发明核酸分子编码的所述CD123结合结构域通过铰链区与其编码的所述跨膜区连接。任意合适的铰链区序列均可实现本发明的目的。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述铰链区为CD8α中的铰链区序列。

在本发明中，所述核酸分子还编码跨膜结构域。任意合适的跨膜结构域均能实现本发明的目的。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述跨膜区为选自以下蛋白质的跨膜结构域或与所述蛋白质具有90-99％同一性的氨基酸序列：T细胞受体的α、β或ζ链、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD123、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述跨膜区为CD8α跨膜结构域或与其具有90-99％同一性的氨基酸序列。

在本发明中，所述核酸分子编码的所述胞内信号转导区还包含共刺激因子。

作为优选，所述共刺激因子为通过选自以下蛋白质或与所述蛋白质具有90-99％同一性的氨基酸序列获得的功能性信号结构域的一种或几种：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、淋巴细胞活化信号分子、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1、4-1BB、B7-H3、CD278、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM、KIRDS2、SLAMF7、NKp80、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49α、IA4、CD49D、ITGA6、VLA6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11α、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、CD29、ITGB1、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、CD1236、CD84、CD96、CEACAM1、CRTAM、CD1239、CD160、PSGL1、CD100、CD69、SLAMF6、SLAM、BLAME、CD162、LTBR、LAT、GADS或SLP-76。

所述CD123嵌合抗原受体的共刺激因子为CD28或4-1BB或与其具有90-99％同一性的氨基酸序列，更优选地，在本发明的一个实施方式中，所述CD123嵌合抗原受体的共刺激因子为4-1BB或与其具有90-99％同一性的氨基酸序列。如图2-4所示。

同时，本发明核酸分子还编码任意合适的胞内信号结构域。可以为CD3ζ胞内信号结构与其具有90-99％同一性的氨基酸序列。所述胞内结构域可构建在所述共刺激因子的羧基末端。

作为优选，本发明靶向CD123的嵌合抗原受体核酸分子所编码的嵌合抗原受体是以6E11-CD123 scFv、12H7-CD123 scFv或13C3-CD123 scFv的抗原识别区和CD8α铰链区和跨膜区、以及4-1BB和CD3ζ胞内信号结构域串联而成的结构为信号传导结构域，从而形成6E11-CD123 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ、12H7-CD123 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ或13C3-CD123scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ，其核酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示。

另外，在上述抗原识别区、铰链区、跨膜区以及胞内信号区之间合适的位置可插入任意肽链作为间隔区，所述肽链可以为寡肽或多肽。

对于上述核酸分子的制备方法，可基于上述抗原识别区、铰链区、跨膜区以及胞内信号区等结构域的碱基序列，通过化学合成或PCR扩增等已知技术制备。通常，可以对编码上述结构域的氨基酸的密码子进行优化，以优化其在宿主细胞中的表达。上述碱基序列的信息可通过检索已知文献或NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等数据库来获得。

在本发明的一个实施方式中，发明人所用的小鼠抗人CD123单克隆抗体杂交瘤细胞株(专利申请号201911099300.9)来制备CD123结合结构域。该单克隆抗体是由申请人——中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所)研制的，三种杂交瘤生产的单克隆抗体已申请专利，可用于CD123阳性的血液肿瘤检测和诊断。

当然，在已知CD123结合结构域的序列的基础上，通过其他合适的方法，例如，化学合成的方法也可以制得该结合结构域的序列。

在本发明中，所述含有CD8α-4-1BB-CD3ζ片段的质粒可通过现有技术中任意合适的方法制得，例如，专利号为ZL201510233748.0的专利。

本发明的另一个方面，是提供了靶向CD123的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体由上述核酸分子编码。

上述CD123嵌合抗原受体的胞外区包含CD123结合结构域，所述CD123结合结构域为鼠抗人CD123抗体轻链和重链构成的scFv的氨基酸序列。

作为优选，本发明CD123嵌合抗原受体是以6E11-CD123 scFv、12H7-CD123 scFv或13C3-CD123 scFv抗原识别区、CD8α铰链区和跨膜区、以及4-1BB和CD3ζ胞内信号结构域串联而成的结构，即6E11-CD123 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ、12H7-CD123 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ或13C3-CD123 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ，氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1-3所示。

本发明的另一个方面，是提供了一种载体，所述载体包含上述核酸分子。

在本发明中，上述载体可以为直链载体，也可以为环状载体。可以为质粒等非病毒载体，也可以为病毒载体，还可以为利用转座子的载体。所述载体中可含有启动子、终止子等调控序列，以及耐药基因、报告基因等标记序列。另外，上述载体也可包含编码自杀基因的序列，可根据治疗过程，通过给予激活自杀基因的物质，从而控制体内CAR-T细胞的数目。

作为上述病毒载体，可以为逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等。在本发明的一个实施方式中，使用的是慢病毒表达载体。

本发明的另一个方面，是提供了一种细胞，所述细胞包含上述核酸分子、上述嵌合抗原受体或上述载体。

在本发明的一个实施方式中，上述细胞为人的T细胞。所述T细胞可以来自血液、骨髓等体液，也可以来自脾脏、胸腺、淋巴等组织，或者原发肿瘤、转移性肿瘤、癌性腹水等癌症组织，经分离、纯化后得到。同时，所述T细胞可以为CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、αβT细胞或γδT细胞。所述T细胞可以以合适的方式替换为NK细胞，其也视为包含在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个方面，是提供了上述核酸分子在制备治疗CD123阳性的血液肿瘤药物中的应用，所述血液肿瘤优选为急性髓系白血病。

本发明的另一个方面，是提供了上述嵌合抗原受体在制备治疗CD123阳性的血液肿瘤药物中的应用，所述血液肿瘤优选为急性髓系白血病。

本发明的另一个方面，是提供了上述载体在制备治疗CD123阳性的血液肿瘤药物中的应用，所述血液肿瘤优选为急性髓系白血病。

本发明的另一个方面，是提供了上述细胞在制备治疗CD123阳性的血液肿瘤药物中的应用，所述血液肿瘤优选为急性髓系白血病。

只要其在病理过程中表达CD123，上述血液肿瘤包括但不限于AML、慢性粒细胞自血病、骨髓增生异常综合症及肥大细胞增多症、B-细胞急性淋巴细胞血液肿瘤、T-细胞急性淋巴细胞血液肿瘤等。作为优选，上述血液肿瘤为AML。

本发明的另一个方面，是提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含上述核酸分子、上述嵌合抗原受体、上述载体或上述细胞，以及药学上接受的载体。

本发明药物组合物除包含上述成分以外，还可包含任意药学上允许的添加剂，例如，生理盐水、细胞培养基、葡萄糖、注射用水、甘油、乙醇以及它们的组合物、稳定剂、表面活性剂、防腐剂、等渗剂等。

同样，本发明药物组合物也可以和其他合适的抗癌剂联合应用。例如，阿糖胞苷、柔红霉素、去甲氧柔红霉素、米托蒽醌等。

本发明的另一个方面，是提供了上述药物组合物在制备治疗CD123阳性的血液肿瘤药物中的应用，所述血液肿瘤优选为急性髓系白血病。

本发明的另一个方面，是提供了一种治疗血液肿瘤的方法，在所述方法中使用上述核酸分子、上述嵌合抗原受体、上述载体、上述细胞或上述药物组合物。

为了进一步提高疗效，防止在治疗过程中发生逃逸，更好地治疗和缓解疾病，在本发明中，发明人还研究了双靶点嵌合抗原受体。进一步地，在上述靶向CD123嵌合抗原受体的基础上，本发明还提供了CD123/其他肿瘤细胞表面抗原的双靶点嵌合抗原受体。其技术方案为：

上述核酸分子，还同时包含编码靶向其他肿瘤细胞表面抗原的嵌合抗原受体的核酸分子；

所述靶向CD123的嵌合抗原受体和所述靶向其他肿瘤细胞表面抗原的嵌合抗原受体之间通过2A家族剪切肽连接。

在本发明中，包含所述其他肿瘤细胞表面抗原的结合结构域的嵌合抗原受体序列可以构建在包含所述CD123结合结构域的嵌合抗原受体序列的C末端方向，也可以构建在其N末端方向，只要其之间通过2A家族剪切肽连接即可。在本发明的一个实施方式中，包含所述其他肿瘤细胞表面抗原的结合结构域的嵌合抗原受体序列构建在包含所述CD123结合结构域的嵌合抗原受体序列的C末端方向，如图5所示。

作为优选，所述其他肿瘤细胞表面抗原可以为选自CD5,CD4,CD3,CD2,CD52,GD2,CD13,CD14,CD15,CD19,CD20,CD22,CD33,CD30,CD41,CD45,CD61,CD64,CD68,CD117,CD138,CD267,CD269,CD38,Flt3receptor,CLL-1and CS1(SLAME7),Fetoprotein(AFP),glypican-3(GPC3),BAFF-R,BAFF,APRIL,BCMA,TACL或Ley,更优选地，所述其他肿瘤细胞表面抗原为CD33；

所述靶向其他肿瘤细胞表面抗原的嵌合抗原受体包含胞外区、跨膜区和胞内信号转导区，所述胞外区包含所述其他肿瘤细胞表面抗原的结合结构域，所述其他肿瘤细胞表面抗原的结合结构域为抗该表面抗原的单链抗体可变区片段，优选为抗CD33的单链抗体可变区片段。

在本发明中，所述核酸分子编码的所述2A家族剪切肽可以为T2A、P2A或E2A。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述2A家族剪切肽为T2A。

在本发明中，靶向其他肿瘤细胞表面抗原的嵌合抗原受体包含独立构建的信号肽、抗原识别区、铰链区、跨膜区、共刺激因子以及胞内信号结构域，从而使靶向其他肿瘤细胞表面抗原的嵌合抗原受体与靶向CD123的嵌合抗原受体在细胞膜表面以类似“并联”的形式存在。如图5所示。

上述其他肿瘤细胞表面抗原的结合结构域可以为任意合适的能够与相应抗原结合的序列，例如，与相应抗原结合的抗体、抗体片段，如scFv、Fab等，或配体。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述其他肿瘤细胞表面抗原的结合结构域为来自ZL201510362934.4专利中的CD33的单链抗体的氨基酸序列，其序列如SEQ ID NO.16所示。

上述核酸分子编码的所述其他肿瘤细胞表面抗原的CD33结合结构域的氨基末端还包含信号肽或与所述信号肽具有90-99％同一性的氨基酸序列，所述信号肽为CD8α中的信号肽序列或GM-CSF，优选为如SEQ ID NO.17所示的信号肽。

由图5可以看出，在本发明的一个实施方式中，所述信号肽(或引导肽，CD8αleader)构建在CD33结合结构域的氨基末端。

在本发明的一个实施方式中，本发明核酸分子编码的所述其他肿瘤细胞表面抗原的结合结构域通过铰链区与其编码的所述跨膜区连接。任意合适的铰链区序列均可实现本发明的目的。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述铰链区为CD8α中的铰链区序列。

上述其他肿瘤细胞表面抗原的嵌合抗原受体的共刺激因子为CD28或4-1BB或与其具有90-99％同一性的氨基酸序列，更优选地，在本发明的一个实施方式中，CD123/其他肿瘤细胞表面抗原的双靶点嵌合抗原受体中的所述CD123结合结构域的共刺激因子优选为CD28或与其具有90-99％同一性的氨基酸序列，所述其他肿瘤细胞表面抗原的结合结构域的共刺激因子优选为4-1BB或与其具有90-99％同一性的氨基酸序列。如图5所示。

作为优选，在本发明的实施方式中，靶向CD123和CD33双靶点嵌合抗原受体核酸分子所编码的嵌合抗原受体是以CD123嵌合抗原受体和CD33嵌合抗原受体并联而成，即CD123scFv-CD8α-CD28-CD3ζ-T2A-CD33scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ，其核酸序列如SEQ IDNO.12所示。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述双靶点嵌合抗原受体中CD123嵌合抗原受体是以13C3-CD123 scFv抗原识别区、CD8α铰链区和跨膜区、以及CD28和CD3ζ胞内信号结构域串联而成的结构，如序列SEQ ID NO.10所示。所述双靶点嵌合抗原受体中CD33嵌合抗原受体是以CD33 scFv抗原识别区、CD8α铰链区和跨膜区、以及4-1BB和CD3ζ胞内信号结构域并联而成的结构，其序列如SEQ ID NO.11所示。

本发明的另一个方面，是提供了一种靶向CD123和其他肿瘤细胞表面抗原的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体由上述核酸分子编码。

作为优选，在本发明的实施方式中，所述其他肿瘤细胞表面抗原为CD33。

作为优选，本发明CD123和CD33双靶点嵌合抗原受体核酸分子所编码的双靶点嵌合抗原受体是以CD123嵌合抗原受体和CD33嵌合抗原受体通过2A家族剪切肽串联而成，其中CD123嵌合抗原受体是以13C3-CD123 scFv抗原识别区、CD8α铰链区和跨膜区、以及CD28共刺激因子和CD3ζ胞内信号结构域串联而成的结构，CD33嵌合抗原受体是以CD33 scFv抗原识别区、CD8α铰链区和跨膜区、以及4-1BB共刺激因子和CD3ζ胞内信号结构域串联而成的结构，其氨基酸序列SEQ ID NO.6所示。

本发明的另一个方面，是提供了一种载体，所述载体包含编码CD123和其他肿瘤细胞表面抗原的双靶点嵌合抗原受体的核酸分子。

本发明的另一个方面，是提供了一种细胞，所述细胞包含上述编码CD123和其他肿瘤细胞表面抗原的双靶点嵌合抗原受体的核酸分子、上述CD123和其他肿瘤细胞表面抗原的双靶点嵌合抗原受体或上述载体。

本发明的另一个方面，是提供了上述核酸分子在制备治疗CD123阳性和/或其他肿瘤细胞表面抗原阳性的血液肿瘤药物中的应用，所述血液肿瘤优选为急性髓系白血病，更优选为患者经常规化疗后复发或无效的急性髓系白血病，

本发明的另一个方面，是提供了上述嵌合抗原受体在制备治疗CD123阳性和/或其他肿瘤细胞表面抗原阳性的血液肿瘤药物中的应用，所述血液肿瘤优选为急性髓系白血病，更优选为患者经常规化疗后复发或无效的急性髓系白血病。

本发明的另一个方面，是提供了上述载体在制备治疗CD123阳性和/或其他肿瘤细胞表面抗原阳性的血液肿瘤药物中的应用，所述血液肿瘤优选为急性髓系白血病，更优选为患者经常规化疗后复发或无效的急性髓系白血病。

本发明的另一个方面，是提供了上述细胞在制备治疗CD123阳性和/或其他肿瘤细胞表面抗原阳性的血液肿瘤药物中的应用，所述血液肿瘤优选为急性髓系白血病，更优选为患者经常规化疗后复发或无效的急性髓系白血病。

只要其在病理过程中表达CD123和/或其他肿瘤细胞表面抗原，上述血液肿瘤包括但不限于AML、慢性粒细胞自血病、骨髓增生异常综合症及肥大细胞增多症、B-细胞急性淋巴细胞白血病、T-细胞急性淋巴细胞白血病等。作为优选，上述血液肿瘤为AML。

本发明的另一个方面，是提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含上述编码CD123和其他肿瘤细胞表面抗原的双靶点嵌合抗原受体的核酸分子、上述CD123和其他肿瘤细胞表面抗原的双靶点嵌合抗原受体、上述载体或上述细胞，以及药学上接受的载体。

本发明的另一个方面，是提供了上述药物组合物在制备治疗CD123阳性和/或其他肿瘤细胞表面抗原阳性的血液肿瘤药物中的应用，所述血液肿瘤优选为急性髓系白血病，更优选为患者经常规化疗后复发或无效的急性髓系白血病。

本发明的另一个方面，是提供了一种治疗血液肿瘤的方法，在所述方法中使用上述编码CD123和其他肿瘤细胞表面抗原的双靶点嵌合抗原受体的核酸分子、上述CD123和其他肿瘤细胞表面抗原的双靶点嵌合抗原受体、上述载体或上述细胞或上述药物组合物。

本发明的有益效果为：

本发明人通过核酸分子化学合成或PCR技术，得到三种新的CD123 scFv并克隆到含有信号肽和CD8α-4-1BB-CD3ζ的慢病毒表达载体中，包装成携带CD123 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ编码基因的慢病毒载体。利用慢病毒感染T细胞，使T细胞表达CD123嵌合抗原受体(CAR-T)。通过流式细胞术、脱颗粒分析实验、以及ELISA检测T细胞分泌的细胞因子，证明上述三种嵌合抗原受体修饰的T细胞对表达CD123的AML细胞有很强的体外杀伤作用，对不表达CD123的细胞几乎没有杀伤作用，有效防止了脱靶效应。其中两种嵌合抗原受体修饰的T细胞同时具有良好的体外和体内抗白血病作用。本发明的三种嵌合抗原受体CD123 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ可用于CD123⁺血液肿瘤的治疗。

发明人还将CD123嵌合抗原受体和CD33嵌合抗原受体同时克隆到慢病毒表达载体中，包装成同时携带CD123 scFv-CD8α-CD28-CD3ζ编码基因和CD33 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ编码基因的慢病毒载体。利用慢病毒感染T细胞，使T细胞同时表达CD123嵌合抗原受体和CD33嵌合抗原受体。通过流式细胞术、脱颗粒分析实验，证明上述双靶点嵌合抗原受体修饰的T细胞对表达CD123和/或CD33的AML细胞有很强的体外杀伤作用，对CD123和CD33都不表达细胞几乎没有杀伤作用，有效防止了脱靶效应。本发明的双靶点嵌合抗原受体CD123scFv-CD8α-CD28-CD3ζ-T2A-CD33 scFv-CD8α-CD28-CD3ζ可用于CD123⁺和/或CD33⁺血液肿瘤的治疗，靶向两种抗原可以使得治疗效果更好，不易发生逃逸，更容易缓解疾病。

附图说明

图1为本发明实施例中慢病毒表达载体限制性内切酶酶切片段电泳鉴定图，其中，A为CD123 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ限制性内切酶酶切片段电泳鉴定图，其中，1为15kb核酸分子量标记泳道；2为用核酸内切酶Nhe I和Not I双酶切慢病毒表达质粒6E11-CD123scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ所得到的编码6E11-CD123 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ的DNA片段(1419bp)和载体片段(7310bp)泳道；3为用核酸内切酶Nhe I和Not I双酶切慢病毒表达质粒12H7-CD123scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ所得到的编码12H7-CD123 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ的DNA片段(1419bp)和载体片段(7310bp)泳道；4为用核酸内切酶Nhe I和Not I双酶切慢病毒表达质粒13C3-CD123 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ所得到的编码13C3-CD123 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ的DNA片段(1493bp)和载体片段(7310bp)泳道；

B为CD123 scFv-CD8α-CD28-CD3ζ-T2A-CD33 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ限制性内切酶酶切片段电泳鉴定图，其中，1为15kb核酸分子量标记泳道；2为用核酸内切酶Nhe I和SalI双酶切慢病毒表达质粒CD123 scFv-CD8α-CD28-CD3ζ-T2A-CD33 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ所得到的编码CD123 scFv-CD8α-CD28-CD3ζ-T2A-CD33 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ的DNA片段(3052bp)和载体片段(6464bp)泳道；

图2为本发明实施例中6E11-CD123 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ慢病毒表达载体示意图，其中，逆时针序列是正向基因片段，顺时针序列为反向基因片段；

图3为本发明实施例中12H7-CD123 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ慢病毒表达载体示意图，其中，逆时针序列是正向基因片段，顺时针序列为反向基因片段；

图4为本发明实施例中13C3-CD123 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ慢病毒表达载体示意图，其中，逆时针序列是正向基因片段，顺时针序列为反向基因片段；

图5为本发明实施例中CD123 scFv-CD8α-CD28-CD3ζ-T2A-CD33 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ慢病毒表达载体示意图，其中，逆时针序列是正向基因片段，顺时针序列为反向基因片段；

图6为利用流式细胞术检测本发明实施例中构建的6E11-CD123 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ(6E11 CAR-T)、12H7-CD123 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ(12H7 CAR-T)、13C3-CD123scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ(13C3 CAR-T)修饰T细胞中CAR分子的表达结果图，其中，GFP为载体携带的标志蛋白的表达，F(ab')₂为兔抗鼠IgG标记CD123 scFv在T细胞表面的表达；CD123scFv为重组人CD123-Fc融合蛋白标记T细胞后用鼠抗人IgG Fc抗体标记的CD123 scFv在T细胞表面的表达；

图7为利用流式细胞术检测本发明实施例中所应用的靶细胞：AML细胞系MV4-11(A)和慢性粒细胞白血病细胞系K562(B)细胞中CD123靶抗原分子的表达强度结果图；

图8为利用流式细胞术检测本发明实施例中T细胞与靶细胞共培养后残留的肿瘤细胞存活率结果图，其中，Vector-T、6E11 CAR-T、12H7 CAR-T、13C3 CAR-T与CD123阳性的MV4-11细胞系的效靶比为1:8、1:4、1:2、1:1，共培养24(A)及48(B)小时；6E11 CAR-T为6E11-CD123 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞的实验组,12H7 CAR-T为12H7-CD123 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞的实验组，13C3 CAR-T为13C3-CD123 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞的实验组；Vector-T为转染空载体的T细胞的对照组；

图9为利用流式细胞术检测本发明实施例中T细胞与靶细胞共培养后残留的肿瘤细胞存活率结果图，其中，Vector-T、6E11 CAR-T、12H7 CAR-T、13C3 CAR-T与CD123阳性的MV4-11细胞系系按效靶比1:1共培养48小时；6E11CAR-T为6E11-CD123 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞的实验组,12H7 CAR-T为12H7-CD123 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞的实验组，13C3 CAR-T为13C3-CD123 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞的实验组；Vector-T为转染空载体的T细胞的对照组；

图10为利用流式细胞术检测本发明实施例中T细胞与靶细胞共培养后残留的肿瘤细胞存活率结果图，其中，Vector-T、6E11 CAR-T、12H7 CAR-T、13C3 CAR-T与CD123阴性的K562细胞系按效靶比1:8、1:4、1:2、1:1共培养24(A)及48(B)小时；6E11 CAR-T为6E11-CD123 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞的实验组,12H7 CAR-T为12H7-CD123 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞的实验组，13C3 CAR-T为13C3-CD123 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞的实验组；Vector-T为转染空载体的T细胞的对照组；

图11为利用流式细胞术检测本发明实施例中T细胞与靶细胞共培养后残留的肿瘤细胞存活率结果图，其中，Vector-T、6E11 CAR-T、12H7 CAR-T、13C3 CAR-T与CD123阴性的K562细胞系按效靶比2:1共培养48小时；6E11 CAR-T为6E11-CD123 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞的实验组,12H7 CAR-T为12H7-CD123 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞的实验组，13C3 CAR-T为13C3-CD123 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰T细胞的实验组；Vector-T为转染空载体的T细胞的对照组；

图12为本发明实施例中Vector-T和CAR-T细胞对MV4-11、K562(效靶比1:1)杀伤作用的脱颗粒检测结果图，其中，CAR-T分别为6E11 CAR-T、12H7CAR-T、13C3 CAR-T，Vector-T为转染空载体的T细胞的对照组；

图13为本发明实施例中Vector-T、CAR-T细胞与MV4-11细胞系按效靶比1:1共培养48小时后，T细胞释放的细胞因子TNF-α(A)、IL-2(B)、IFN-γ(C)水平结果图，其中，CAR-T分别为6E11 CAR-T、12H7 CAR-T、13C3 CAR-T，Vector-T为转染空载体的T细胞的对照组；

图14为本发明实施例中Vector-T、CAR-T细胞与K562细胞系按效靶比1:1共培养48小时后，T细胞释放的细胞因子TNF-α(A)、IL-2(B)、IFN-γ(C)水平结果图，其中，CAR-T分别为6E11 CAR-T、12H7 CAR-T、13C3 CAR-T，Vector-T为转染空载体的T细胞的对照组；

图15为利用流式细胞术检测AML患者骨髓单个核细胞(BMMCs)CD123靶抗原分子的表达结果图，其中P1～P5表示患者编号；

图16为本发明实施例中Vector-T、CAR-T细胞与AML患者的BMMCs按效靶比1:1共培养24小时后流式检测残留的肿瘤细胞细胞存活率结果图，其中，CAR-T分别为6E11 CAR-T、12H7 CAR-T、13C3 CAR-T，Vector-T为转染空载体的T细胞的对照组；

图17为本发明实施例中6E11 CAR-T、12H7 CAR-T、13C3 CAR-T、Vector-T细胞对AML患者的BMMCs杀伤作用的脱颗粒检测结果图；

图18为本发明实施例中6E11 CAR-T、12H7 CAR-T、13C3 CAR-T，Vector-T细胞在白血病小鼠体内效果的评价结果图，选用6-8周的NOD/SCID雌性小鼠28只，并随机分为4组，每组7只，第0天经尾静脉注射5×10⁶的MV4-11细胞，第7天、第14天分别经尾静脉注射1×10⁷的Vector-T细胞或6E11 CAR-T、12H7 CAR-T、13C3 CAR-T细胞(如图18的A所示)，MV4-11细胞移植后第10周(Vector组已有3只小鼠发病死亡)肿瘤负荷图，如图18的B所示，12H7 CAR-T组、13C3 CAR-T组肿瘤负荷明显低于Vector-T组，小鼠生存曲线如图18的C所示，用SPSS软件计算生存期，Vector-T组、6E11 CAR-T组、12H7 CAR-T组、13C3 CAR-T组中位生存期分别为79天、80天、137天和169天，12H7 CAR-T组、13C3 CAR-T组均可以显著延长小鼠的生存期，与对照组相比有显著的统计学差异(p<0.001)；

图19为利用流式细胞术检测本发明实施例中构建的CD123scFv-CD8α-CD28-CD3ζ-T2A-CD33 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ(双CAR)修饰T细胞中CAR分子的表达结果图，其中，F(ab)'₂为兔抗鼠IgG标记CD123 scFv在T细胞表面的表达，CD123Pro-hFc为重组人CD123和人IgG Fc融合蛋白标记T细胞后用鼠抗人IgG Fc抗体标记的CD123 scFv在T细胞表面的表达,CD33Pro-mFc为重组人CD33和鼠IgG Fc融合蛋白标记T细胞后用山羊抗鼠IgG Fc抗体标记的CD33 scFv在T细胞表面的表达；

图20为利用流式细胞术检测本发明实施例中所应用的靶细胞CD123及CD33的表达，其中AML细胞系Molm13为CD123和CD33双阳性靶细胞(图20的A)，慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞为CD123和CD33双阴性靶细胞(图20的B)，急性淋巴细胞白血病细胞系Jurkat细胞为CD123和CD33双阴性靶细胞(图20的C)，发明人还构建了过表达CD33的Jurkat细胞系(Jurkat xp33，图20的D中的左图)和过表达CD123的Jurkat细胞系(Jurkat xp123，图20的D中的右图)；

图21为利用流式细胞术检测本发明实施例中T细胞与靶细胞共培养后残留的肿瘤细胞存活率结果图及流式图，其中，A为Vector-T、123 CAR-T、33 CAR-T、123-33双CAR-T与CD123阳性的Molm13细胞系按效靶比1:8、1:2、1:1共培养48小时后残留的肿瘤细胞存活率结果图；B为Vector-T、123 CAR-T、33 CAR-T、123-33双CAR-T与CD123阴性的K562细胞系按效靶比1:2共培养48小时后残留的肿瘤细胞存活率流式图；C为Vector-T、123 CAR-T、33CAR-T、123-33双CAR-T与Jurkat xp33细胞系按效靶比1:3共培养48小时后残留的肿瘤细胞存活率流式图；D为Vector-T、123 CAR-T、33 CAR-T、123-33双CAR-T与Jurkat xp123细胞系按效靶比1:2共培养48小时后残留的肿瘤细胞存活率流式图；

图22为本发明实施例中Vector-T、123 CAR-T、33 CAR-T、123-33双CAR-T细胞对Molm13、K562(效靶比1:1)杀伤作用的脱颗粒检测结果图；

结果表明，对于CD123、CD33均表达的Molm13细胞系，123 CAR-T、33 CAR-T、123-33双靶点CAR-T均有明显的杀伤作用，对于CD123、CD33均不表达的K562细胞系，123 CAR-T、33CAR-T、123-33双靶点CAR-T均无明显的杀伤作用，此外，对于只表达CD123或只表达CD33的Jurkat细胞系，双靶点CAR-T均能明显杀伤，且杀伤效果不亚于相应的单靶点CAR-T，说明双靶点CAR-T在CD123或CD33抗原单独存在或同时存在的情况下均能发挥作用，且作用明显，无明显脱靶现象；

图23为本发明实施例中Vector-T、123 CAR-T、33 CAR-T、123-33双靶点CAR-T细胞在小鼠体内效果的评价结果图，选用6-8周的NSG雌性小鼠32只并随机分为4组，每组8只，第0天经尾静脉注射1×10⁶的过表达CD123的Jurkat细胞和1×10⁶的过表达CD33的Jurkat细胞的混合细胞悬液，第3天经尾静脉注射3×10⁶的Vector-T细胞或123 CAR-T、33 CAR-T、123-33双CAR-T细胞，第7天经尾静脉注射1×10⁶的Vector-T细胞或123 CAR-T、33 CAR-T、123-33双CAR-T细胞(如A所示)，小鼠生存曲线B所示，用SPSS软件计算生存期，Vector-T、123CAR-T、33 CAR-T、123-33双CAR-T细胞中位生存期分别为30.5天、41.5天、42天和51天，123CAR-T、33 CAR-T、123-33双CAR-T均可以显著延长小鼠的生存期，与对照组相比有显著的统计学差异(p<0.05)。

序列说明

SEQ ID NO.1为本发明6E11 CD123scFv-CD8-4-1BB-CD3ζ的氨基酸序列；

SEQ ID NO.2为本发明12H7 CD123scFv-CD8-4-1BB-CD3ζ的氨基酸序列；

SEQ ID NO.3为本发明13C3 CD123scFv-CD8-4-1BB-CD3ζ的氨基酸序列；

SEQ ID NO.4为本发明13C3 CD123scFv-CD8-CD28-CD3ζ的氨基酸序列；

SEQ ID NO.5为本发明CD33scFv-CD8-4-1BB-CD3ζ的氨基酸序列；

SEQ ID NO.6为本发明CD123scFv-CD8-CD28-CD3ζ-T2A-CD33scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ的氨基酸序列；

SEQ ID NO.7为本发明6E11 CD123scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ的核酸序列；

SEQ ID NO.8为本发明12H7 CD123scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ的核酸序列；

SEQ ID NO.9为本发明13C3 CD123scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ的核酸序列；

SEQ ID NO.10为本发明13C3 CD123scFv-CD8α-CD28-CD3ζ的核酸序列；

SEQ ID NO.11为本发明CD33scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ的核酸序列；

SEQ ID NO.12为本发明CD123scFv-CD8α-CD28-CD3ζ-T2A-CD33scFv-CD8α-4-1BB-CD3的核酸序列；

SEQ ID NO.13为本发明6E11 CD123scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ抗原识别区的氨基酸序列；

SEQ ID NO.14为本发明12H7 CD123scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ抗原识别区的氨基酸序列；

SEQ ID NO.15为本发明13C3 CD123scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ抗原识别区的氨基酸序列；

SEQ ID NO.16为本发明CD33scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ抗原识别区的氨基酸序列；

SEQ ID NO.17为本发明靶向CD123的嵌合抗原受体及靶向CD123和CD33的双靶点嵌合抗原受体中信号肽的氨基酸序列；

SEQ ID NO.18为本发明靶向CD123的嵌合抗原受体中CD8α-4-1BB-CD3ζ的氨基酸序列；

SEQ ID NO.19为本发明靶向CD123的嵌合抗原受体中CD8α-CD28-CD3ζ的氨基酸序列；

SEQ ID NO.20为本发明中靶向CD123和CD33的双靶点嵌合抗原受体中T2A的氨基酸序列。

具体实施方式

本发明公开了一种靶向CD123的嵌合抗原受体及含有靶向CD123嵌合抗原受体的双靶点嵌合抗原受体，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：嵌合抗原受体CD123 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ载体的构建1.采用Nhe I、Bstb I核酸内切酶酶切发明人前期构建的含有CD8α-4-1BB-CD3ζ片段的质粒，获得CD8α-4-1BB-CD3ζ片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。所述含有CD8α-4-1BB-CD3ζ片段的质粒可通过现有技术中任意合适的方法制得，例如，专利号为ZL201510233748.0的专利中的方法。

2.将全基因合成得到的6E11 CD123 scFv、12H7 CD123 scFv、13C3 CD123scFv片段与目的载体进行连接，将构建的6E11-CD123 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζCAR(6E11 123CAR)、12H7-CD123 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζCAR(12H7 123CAR)、13C3-CD123 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζCAR(13C3 123CAR)目的载体用核酸内切酶Nhe I和Not I进行酶切鉴定，结果如图1的A所示，酶切结果表明阳性克隆含有目的条带且测序鉴定正确。载体示意图如图2-4所示。

实施例2：嵌合抗原受体CD123 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ慢病毒修饰T细胞的制备

1.采用EndoFree Plasmid Maxi质粒抽提试剂盒(QIAGEN公司)提取CD123 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ表达质粒和包装质粒psPAX2、pMD.2G。三种质粒用4：3：1比例用PEI转染试剂(polyscience公司)进行转染(具体方法见PEI转染试剂说明书)。转染后12小时更换新鲜培养液，之后24小时、48小时分别收取病毒上清，于4℃，3000rpm，离心15分钟，经0.45μm滤器过滤后，采用50000g，4℃，1.5小时超速离心后浓缩10倍，后转入-80℃保存。

2.T细胞的制备：取新鲜健康人外周血10ml，采用RosetteSep T cell enrichmentCocktail(Stemcell公司)和Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare公司)提取T细胞(具体步骤按照RosetteSep T cell enrichment Cocktail说明书)。按细胞：磁珠＝1：1比例加入抗CD3/CD28磁珠(Gibco公司)，培养24小时即为转染前的T细胞。

3.慢病毒感染T细胞及感染后T细胞的培养：从-80℃中取出病毒上清，室温下融化，按每1×10⁶T细胞加入100μl病毒上清，加入Polybrene至终浓度为8μg/ml。32℃，1800rpm，离心1.5小时，转入5％CO₂，37℃孵箱培养。

4.流式细胞术检测CAR修饰T细胞的阳性率：收集细胞，每种分两管标记，一管标记兔抗鼠IgG F(ab)'₂抗体，一管用重组人CD123-Fc融合蛋白标记T细胞后用鼠抗人IgG Fc抗体进行标记，流式细胞术分析T细胞F(ab)'₂和GFP的表达以及CD123-Fc融合蛋白的阳性率。结果如图6所示，由图中可以看出，CAR-T的阳性率均为60％以上。

实施例3：嵌合抗原受体CD123 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ慢病毒修饰T细胞对白血病细胞的杀伤作用

1.血液肿瘤细胞系中CD123的表达水平：

MV4-11和K562细胞系均购自美国ATCC。分别培养后，各吸取5×10⁵细胞悬液，PBS洗2次后，标记APC抗人CD123单抗(Biolegend公司)，以标记APC-isotype为对照组，冰上孵育30分钟。运用流式细胞术检测各种细胞系CD123的表达水平，结果如图7所示，MV4-11为CD123阳性细胞，K562细胞为CD123阴性细胞。

2.CAR修饰的T细胞与MV4-11和K562细胞系共培养后流式检测残留的肿瘤细胞：

将上述细胞按2×10⁵细胞/孔接种24孔培养板，分别加入2.5×10⁴(E:T＝1:8)、5×10⁴(E:T＝1:4)、1×10⁵(E:T＝1:2)、2×10⁵(E:T＝1:1)CAR修饰的T细胞，将转染不含CAR的空载体T细胞(Vector-T)设为对照组，于孵箱中共培养。将共培养后24或48小时的细胞用APC抗人CD123单抗(Biolegend公司)标记MV411细胞系，用PE抗人CD3单抗(Biolegend公司)标记T细胞，流式细胞术检测残留细胞。结果如图8-11所示，1)与Vecor-T相比，6E11 CAR-T、12H7 CAR-T、13C3 CAR-T均能明显杀伤CD123+靶细胞MV4-11(图8、9)；2)与Vecor-T相比，6E11 CAR-T、12H7 CAR-T、13C3 CAR-T对CD123-靶细胞K562没有杀伤作用(图10、11)。结果证实6E11 CAR-T、12H7 CAR-T、13C3 CAR-T对CD123+靶细胞有高效的特异性杀伤作用，同时，对不表达CD123的靶细胞没有表现出脱靶效应。

3.脱颗粒实验分析CAR修饰的T细胞的激活：MV4-11和K562细胞按照效靶比1:1进行共培养，并在共培养体系中加入anti-CD107a抗体和莫能霉素；4h后应用流式细胞仪检测GFP⁺细胞表面CD107a的表达水平。结果如图12所示，结果表明，6E11 CAR-T、12H7 CAR-T、13C3 CAR-T与MV4-11共培养体系中，细胞激活百分率均在25％以上，Vecor-T与MV4-11共培养体系中，细胞激活百分率<5％，CAR-T与Vecor-T的激活有显著差异(P<0.0001)；且CAR-T与K562细胞共培养的激活水平显著低于与MV4-11共培养的激活水平。

4.ELISA检测白血病细胞系与CAR-T细胞共培养上清中细胞因子IFN-γ、TNF-α的水平：

分别将MV4-11和K562细胞系按照2×10⁵细胞/孔接种24孔板。按每孔2×10⁵细胞分别加入CAR-T、vec-T细胞，补充培养液至1ml。于孵箱中共培养48小时后，采用人IFN-γ、TNFα、IL-2ELISA检测试剂盒(R&D公司)，对共培养上清进行检测(具体步骤见ELISA检测试剂盒说明书)。结果如图13-14所示，表达CD123的MV4-11细胞系与CAR-T共培养上清中IFN-γ、TNF-α、IL-2细胞因子水平均较Vecor-T组有显著性升高(P<0.0001)(图13)，而在不表达CD123的K562细胞的共培养上清中的水平很低(图14)。结果表明，CAR-T在表达CD123的肿瘤细胞刺激下，能够分泌Th1类细胞因子。

5.AML患者的骨髓单个核细胞(BMMCs)中CD123的表达水平：

病人标本均来自中国医学科学院血液病医院，并征得患者的知情同意。采用Ficoll梯度离心分离出BMMCs后，各吸取5×10⁵细胞悬液，PBS洗2次后，标记APC抗人CD123单抗(Biolegend公司)或APC-isotype(对照组)，冰上孵育30分钟。运用流式细胞术检测各患者BMMCs表达CD123的比例和强度，如图15所示，其中P1～P5代表1～5号患者。

6.CAR修饰的T细胞与AML患者的BMMCs共培养后流式检测残留的白血病细胞：

将细胞按2.5×10⁵细胞/孔接种24孔培养板，分别加入2.5×10⁵(E:T＝1:1)的CAR修饰的T细胞，转染不含CAR的空载体T细胞(Vecor-T)设为对照组，于孵箱中共培养24h。将共培养后的细胞用APC抗人CD123单抗(Biolegend公司)标记AML患者的白血病细胞，用APC-Cy7抗人CD3单抗(Biolegend公司)标记T细胞，流式细胞术检测残留细胞。结果如图16所示，结果显示，三组CAR-T与表达CD123的1～5号患者BMMCs共培养24小时后，残留靶细胞比例均明显低于对照组(P<0.01)。上述结果可以说明，CAR-T对表达CD123的白血病原代BMMCs具有细胞毒作用。

7.CAR修饰的T细胞与AML患者的BMMCs共培养后脱颗粒实验分析CAR修饰的T细胞的激活：

将CAR-T及Vector-T细胞分别与1～4号患者的BMMCs按照效靶比1:1进行共培养，并在共培养体系中加入anti-CD107a抗体和莫能霉素；4h后应用流式细胞仪检测CD3⁺细胞表面CD107a的表达水平。结果如图17所示，结果显示，三组CAR-T与1～4号患者共培养体系中，细胞激活百分率均明显高于对照组(P<0.01)。由上述结果可以说明，CAR-T与Vector-T的激活有显著差异。

8.CAR修饰的T细胞在CD123⁺白血病小鼠模型的作用：

选用28只6-8周的NOD/SCID雌性小鼠给予200cGY照射并随机分为4组，每组7只。第0天经尾静脉注射5×10⁶的CD123⁺的MV4-11细胞，第7天和第14天分别经尾静脉注射1×10⁷的Vector-T细胞或6E11 CAR-T、12H7 CAR-T、13C3 CAR-T细胞(如图18的A所示)，小鼠肿瘤负荷如图18的B所示，生存曲线如图18的C所示，用SPSS软件计算生存期。Vector-T、6E11CAR-T、12H7 CAR-T、13C3 CAR-T细胞中位生存期分别为79天、80天、137天和169天，12H7CAR-T组、13C3 CAR-T组均可以显著延长小鼠的生存期，与对照组相比有显著的统计学差异(p<0.01)。

实施例4：双靶点嵌合抗原受体载体的构建

1.利用全基因合成技术于擎科生物公司合成CD8α-CD28-CD3ζ片段，氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示，5‘端酶切位点为BstbI，3‘端酶切位点为NotI，采用Bstb I、Not I核酸内切酶酶切含有13C3 CD123 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ嵌合抗原受体的表达载体质粒，并与合成的CD8α-CD28-CD3ζ片段连接，得到含有13C3 CD123 scFv-CD8α-CD28-CD3ζ嵌合抗原受体的载体。

2.设计并于擎科生物公司合成如下引物，

Sense:5’TAGATCCGGAGCCACCATGGCCTTACC3’

Anti-sense:5’CAGAGGTTGATTGTCGACCGGAAGG 3’

利用上述引物以专利号为ZL201510362934.4的专利中的CD33 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ嵌合抗原受体的载体为模版，利用PCR技术从上述载体中获得CD8α-CD33 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ片段，5’端酶切位点为BspE I，3’端酶切位点为Sal I。

3.采用BspE I、Sal I核酸内切酶酶切含有13C3 CD123 scFv-CD8α-CD28-CD3ζ嵌合抗原受体的载体质粒，并与PCR得到的CD8α-CD33 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ片段进行连接，得到CD123 scFv-CD8α-CD28-CD3ζCAR-T2A-CD33 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζCAR表达载体。

4.将构建的CD123 scFv-CD8α-CD28-CD3ζCAR-T2A-CD33 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζCAR(123-33双CAR)目的载体用核酸内切酶Nhe I和Sal I进行酶切鉴定，结果如图1的B所示，酶切结果表明阳性克隆含有目的条带且测序鉴定正确。载体示意图如图5所示。

实施例5：双靶点嵌合抗原受体CD123 scFv-CD8α-CD28-CD3ζ-T2A-CD33 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ(双CAR)慢病毒修饰T细胞的制备

1.采用EndoFree Plasmid Maxi质粒抽提试剂盒(QIAGEN公司)提取CD123 scFv-CD8α-CD28-CD3ζ-T2A-CD33 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ双CAR表达质粒和包装质粒psPAX2、pMD.2G。三种质粒用4：3：1比例用PEI转染试剂(polyscience公司)进行转染(具体方法见PEI转染试剂说明书)。转染后12小时更换新鲜培养液，之后24小时、48小时分别收取病毒上清，于4℃，3000rpm，离心15分钟，经0.45μm滤器过滤后，采用50000g，4℃，1.5小时超速离心后浓缩10倍，后转入-80℃保存。

4.流式细胞术检测CAR修饰T细胞的阳性率：收集细胞分为三管，一管标记兔抗鼠IgG F(ab)'₂抗体，一管标记hCD123-hFc融合蛋白，PBS洗2遍后用鼠抗人IgG Fc抗体，一管标记hCD33-mFc融合蛋白，PBS洗2遍后用山羊抗鼠IgG Fc抗体。

流式细胞术分析T细胞F(ab)'₂的表达、CD123-hFc及CD33-mFc结合率，结果如图19所示，由图中可以看出，双CAR-T的F(ab)'₂阳性率为40％以上，且CD123 CAR、CD33 CAR阳性率均为40％以上。

实验例6：双靶点嵌合抗原受体CD123 scFv-CD8α-CD28-CD3ζ-T2A-CD33 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ慢病毒修饰T细胞对白血病细胞的杀伤作用

1.血液肿瘤细胞系中CD123的表达水平：

Molm13、K562、Jurkat细胞系均购自美国ATCC。分别培养后，各吸取5×10⁵细胞悬液，PBS洗2次后，标记APC抗人CD123单抗(Biolegend公司)，以标记APC-isotype为对照组，冰上孵育30分钟。运用流式细胞术检测各种细胞系CD123的表达水平，Molm13、K562、Jurkat细胞系表达CD123的阳性率分别为98.8％、0.94％和0.21％；Molm13、K562、Jurkat细胞系表达CD33的阳性率分别为99.9％、2.93％和0.025％；Jurkat xp33或Jurkat xp123分选之后几乎百分之百表达CD33或CD123(如图20所示)。

2.双CAR修饰的T细胞与MV4-11和K562细胞系共培养后流式检测残留的肿瘤细胞：

将上述细胞按2×10⁵细胞/孔接种24孔培养板，分别加入2.5×10⁴(E:T＝1:8)、1×10⁵(E:T＝1:2)、2×10⁵(E:T＝1:1)CAR修饰的T细胞，并将转染不含CAR的空载体T细胞(Vector-T)设为对照组，于孵箱中共培养。将共培养后24小时的细胞用APC抗人CD33单抗(Biolegend公司)标记Molm13细胞系，用PE抗人CD3单抗(Biolegend公司)标记T细胞，流式细胞术检测残留细胞。结果如图21所示，1)与Vecor-T相比，123 CAR-T、33 CAR-T、123-33双CAR-T均能明显杀伤靶细胞Molm13(图21的A)；2)与Vecor-T相比，123 CAR-T、33 CAR-T、123-33双CAR-T对双阴性靶细胞K562没有杀伤作用(图21的B)；3)123-33双CAR-T对于Jurkat xp123和Jurkat xp33均能明显杀伤，但是单靶点的CAR-T仅能杀伤表达相应抗原的Jurkat细胞(图21的C、D)。结果证实CD123和CD33双靶点CAR-T对于CD123和CD33单阳和双阳的靶细胞均有明显的杀伤作用，对不表达CD123和CD23的靶细胞没有脱靶效应。

3.脱颗粒实验分析CAR修饰的T细胞的激活：Molm13和K562细胞按照效靶比1:1进行共培养，并在共培养体系中加入anti-CD107a抗体和莫能霉素；4h后应用流式细胞仪检测GFP⁺细胞表面CD107a的表达水平。结果如图22所示，123 CAR-T、33 CAR-T、123-33双靶点CAR-T与Molm13共培养体系中，细胞激活率均在20％以上，且123-33双靶点CAR-T激活水平明显高于单靶点CAR-T(P＝0.0002)，而Vector-T与Molm13共培养体系中，细胞激活率低于5％，CAR-T与Vecor-T的激活有显著差异(P<0.0001)；但123 CAR-T、33 CAR-T、123-33双靶点CAR-T与CD123-CD33-的K562细胞共培养后激活水平与Vecor-T无明显差异。

4.CD123 scFv-CD8α-CD28-CD3ζ-T2A-CD33 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ双CAR修饰的T细胞在CD123⁺白血病小鼠模型的作用：

选用32只6-8周的NSG雌性小鼠并随机分为4组，每组8只。第0天经尾静脉注射1×10⁶的Jurkat xp123细胞和1×10⁶的Jurkat xp33细胞的混合细胞悬液，第3天经尾静脉注射3×10⁶的Vector-T细胞或123 CAR-T、33 CAR-T、123-33双CAR-T细胞，第7天经尾静脉注射1×10⁶的Vector-T细胞或123 CAR-T、33CAR-T、123-33双CAR-T细胞(如图23的A所示)，小鼠生存曲线如图23的B所示，用SPSS软件计算生存期。Vector-T、123 CAR-T、33 CAR-T、123-33双CAR-T细胞中位生存期分别为30.5天、40.5天、42天和51天，123 CAR-T、33 CAR-T、123-33双CAR-T均可以显著延长小鼠的生存期，与对照组相比有显著的统计学差异(p<0.05),其中123-33双CAR-T组在接种肿瘤细胞后的3周左右出现了3只小鼠死亡，病理结果显示未见肿瘤细胞浸润，推测其死于感染或CRS，但大部分小鼠出现了长生存，且生存期均显著优于123CAR-T、33 CAR-T组，证明123-33双CAR-T相较于123 CAR-T、33 CAR-T有更明显的杀伤肿瘤细胞的优势。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所）

<120> 靶向CD123的嵌合抗原受体及含有靶向CD123嵌合抗原受体的双靶点嵌合抗原受体

<130> None

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 473

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 1

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1 5 10 15

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20 25 30

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50 55 60

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130 135 140

Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Asn

145 150 155 160

Asp Phe Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu

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210 215 220

Cys Ala Arg Gly Gly Met Ile Thr Pro Tyr Phe Ser Tyr Trp Gly Gln

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420 425 430

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435 440 445

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<210> 2

<211> 473

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 2

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Asp Gln Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ala Asn Ser

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<212> PRT

<213> Artificial

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<212> PRT

<213> Artificial

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100 105 110

Lys Arg Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro

130 135 140

Ser Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser

145 150 155 160

Thr Ser Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly

165 170 175

Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Lys

180 185 190

Pro Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn

195 200 205

Gln Val Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Ala Ala Thr

210 215 220

Tyr Tyr Cys Ala Arg Met Gly Gly Gly Asn Tyr Leu Phe Leu Tyr Ala

225 230 235 240

Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ala Phe Glu

245 250 255

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

260 265 270

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

275 280 285

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile

290 295 300

Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val

305 310 315 320

Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp

325 330 335

Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr

340 345 350

Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val

355 360 365

Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn

370 375 380

Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val

385 390 395 400

Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg

405 410 415

Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys

420 425 430

Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg

435 440 445

Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys

450 455 460

Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Ala Ala

465 470 475 480

Ala Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn

485 490 495

Pro Gly Pro Ser Gly Ala Thr Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu

500 505 510

Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Gly Ser Asp Ile

515 520 525

Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Gly Lys

530 535 540

Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile Ala

545 550 555 560

Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile His Tyr

565 570 575

Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly

580 585 590

Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro Glu Asp

595 600 605

Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Thr Phe Gly

610 615 620

Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

625 630 635 640

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly

645 650 655

Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala

660 665 670

Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Asn Met Tyr Trp Val Lys Gln Ser

675 680 685

His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Lys Gly

690 695 700

Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val

705 710 715 720

Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser

725 730 735

Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Met Ile Thr Ala Tyr

740 745 750

Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Glu

755 760 765

Phe Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile

770 775 780

Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala

785 790 795 800

Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr

805 810 815

Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu

820 825 830

Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile

835 840 845

Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp

850 855 860

Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

865 870 875 880

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

885 890 895

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

900 905 910

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

915 920 925

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

930 935 940

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

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Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

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Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

980 985 990

<210> 7

<211> 1419

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 7

gatgttgtgg tgactcaaac tccactctcc ctgcctgtca gctttggaga ttcagtttct 60

atctcttgca ggtctagtca gagtcttgca aacagttatg ggaacacctt tttgtcttgg 120

tacctgcaca ggcctggcca gtctccacag ctcctcatct atgggatttc caacagattt 180

tctggggtgc cagacaggtt cagtggcagt ggttcaggga cagatttcac actcaagatc 240

agctcaataa agcctgagga cttgggagtg tattactgct tacaaggtac acatcagccg 300

tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaacggg ctggtggtgg tggttctggc 360

ggcggcggct ccggtggtgg tggttctcag gtgcagcttc aggagtctgg acctggcctg 420

gtgaaacctt ctcagtctct gtccctcacc tgcactgtca ctggctactc aatcaccaat 480

gattttgcct ggaactggat ccggcagttt ccaggaaaca aactggagtg gatgggctac 540

ataagtttca gtggtagcac ttcctacaac ccatctctca aaggtcgaat ctctatcact 600

cgagacacat ccaagaacca gttcttcctg cagttgaatt ctgtgactac tgaggacaca 660

gccacatatt cctgtgcaag aggagggatg attacgccct acttttctta ctggggccaa 720

gggactctgg tcactgtctc cgcattcgaa accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 780

ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 840

gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg 900

cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaaa 960

cggggcagaa agaaactcct gtatatattc aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact 1020

actcaagagg aagatggctg tagctgccga tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa 1080

ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 1140

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ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1260

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acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 1419

<210> 8

<211> 1419

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 8

gatgttgtgg tgactcaaac tccactctcc ctgcctgtca gctttggaga tcaagtttct 60

atctcttgca ggtctagtca gagtcttgca aacagttatg ggaacacctt tttgtcttgg 120

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tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaacggg ctggtggtgg tggttctggc 360

ggcggcggct ccggtggtgg tggttctcag gtgaagcttc aggagtctgg acctggcctg 420

gtgaaacctt ctcagtctct gtccctcacc tgcactgtca ctggctactc aatcaccagt 480

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gccacgtatt actgtgcaag aggagggatg attacgccct actttgccta ctggggccaa 720

gggactctgg tcactgtctc cgcagaattc accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 780

ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 840

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cggggcagaa agaaactcct gtatatattc aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact 1020

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acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 1419

<210> 9

<211> 1437

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 9

gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctggctatgt cagtaggaca gaaggtcact 60

atgaactgca agtccagtca gagcctttta aatagtggca atcaaaagaa ctatttggcc 120

tggtaccagc agaaaccagg acaatctcct aaacttctga tatattttgc atccactagg 180

gaatctgggg tccctgatcg cttcataggc agtggatctg ggacagattt cactcttacc 240

atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gattacttct gtcagcaaca ttatggcact 300

ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaac gggctggtgg tggtggttct 360

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gcacacattt ggtgggatga tgacaagcgc tacaagccag ccctgaagag ccgattgaca 600

atctccaagg atacctccag caaccaggta ttcctcaaga tcgccagtgt ggacactgca 660

gatgctgcca catactactg tgctcgaatg ggaggtggta actacttatt tctctatgct 720

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atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa 1080

gaagaaggag gatgtgaact gagagtgaag ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac 1140

cagcagggcc agaaccagct ctataacgag ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat 1200

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cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag 1320

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<210> 10

<211> 1434

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 10

gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctggctatgt cagtaggaca gaaggtcact 60

atgaactgca agtccagtca gagcctttta aatagtggca atcaaaagaa ctatttggcc 120

tggtaccagc agaaaccagg acaatctcct aaacttctga tatattttgc atccactagg 180

gaatctgggg tccctgatcg cttcataggc agtggatctg ggacagattt cactcttacc 240

atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gattacttct gtcagcaaca ttatggcact 300

ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaac gggctggtgg tggtggttct 360

ggcggcggcg gctccggtgg tggtggttct caggtgcagc tgcaggagtc aggccctggg 420

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gcacacattt ggtgggatga tgacaagcgc tacaagccag ccctgaagag ccgattgaca 600

atctccaagg atacctccag caaccaggta ttcctcaaga tcgccagtgt ggacactgca 660

gatgctgcca catactactg tgctcgaatg ggaggtggta actacttatt tctctatgct 720

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caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt 1320

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<210> 11

<211> 1467

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 11

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccgggatccg acattgtgat gacccagtct ccatcctcac tgtctgcatc tctgggaggc 120

aaagtcacca tcacttgcaa ggcaagccaa gacattaaca agtatatagc ttggtaccaa 180

cacaagcctg gaaaaggtcc taggctgctc atacattaca catctacatt acagccaggc 240

atcccatcaa ggttcagtgg aagtgggtct gggagagatt attccttcag catcagcaac 300

ctggagcctg aagatattgc aacttattat tgtctacagt atgataatct tctcacgttc 360

ggtgctggca ccaaattgga gctcaaacgg ggtggcggtg gctcgggtgg aggtggatct 420

ggtggtggcg gttcggaggt caagctgcag cagtctggac ctgagctggt gaagcctggg 480

acttcagtga aggtatcctg caaggcttct ggttactcat tcactgacta caacatgtac 540

tgggtgaagc agagccatgg aaagagcctt gagtggattg gatatattga tccttacaaa 600

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tccagcacag ccttcatgca tctcaacagc ctgacatctg aggactctgc agtctattac 720

tgtgcaagag agatgattac ggcgtactac tttgactact ggggccaagg gaccacggtc 780

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acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt atcacccttt actgcaaacg gggcagaaag 1020

aaactcctgt atatattcaa acaaccattt atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa 1080

gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa gaagaaggag gatgtgaact gagagtgaag 1140

ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag 1200

ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 1260

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aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc 1380

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<210> 12

<211> 2976

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 12

gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctggctatgt cagtaggaca gaaggtcact 60

atgaactgca agtccagtca gagcctttta aatagtggca atcaaaagaa ctatttggcc 120

tggtaccagc agaaaccagg acaatctcct aaacttctga tatattttgc atccactagg 180

gaatctgggg tccctgatcg cttcataggc agtggatctg ggacagattt cactcttacc 240

atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gattacttct gtcagcaaca ttatggcact 300

ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaac gggctggtgg tggtggttct 360

ggcggcggcg gctccggtgg tggtggttct caggtgcagc tgcaggagtc aggccctggg 420

atattgcagc cctcccagac cctcactctg acttgttcct tctctggatt ttcactgagc 480

acttctggta tgggtgtagg ctggattcgt cagccttcag ggaagggtct ggaatggctg 540

gcacacattt ggtgggatga tgacaagcgc tacaagccag ccctgaagag ccgattgaca 600

atctccaagg atacctccag caaccaggta ttcctcaaga tcgccagtgt ggacactgca 660

gatgctgcca catactactg tgctcgaatg ggaggtggta actacttatt tctctatgct 720

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atcagcaacc tggagcctga agatattgca acttattatt gtctacagta tgataatctt 1860

ctcacgttcg gtgctggcac caaattggag ctcaaacggg gtggcggtgg ctcgggtgga 1920

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aagcctggga cttcagtgaa ggtatcctgc aaggcttctg gttactcatt cactgactac 2040

aacatgtact gggtgaagca gagccatgga aagagccttg agtggattgg atatattgat 2100

ccttacaaag gtggtactat ttacaaccag aagtttaagg gcaaggccac attgactgtt 2160

gacaagtcct ccagcacagc cttcatgcat ctcaacagcc tgacatctga ggactctgca 2220

gtctattact gtgcaagaga gatgattacg gcgtactact ttgactactg gggccaaggg 2280

accacggtca ccgtctcctc agaattcacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg 2340

gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg 2400

gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc 2460

ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcaaacgg 2520

ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa caaccattta tgagaccagt acaaactact 2580

caagaggaag atggctgtag ctgccgattt ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg 2640

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 2700

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 2760

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 2820

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 2880

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 2940

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 2976

<210> 13

<211> 248

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 13

Asp Val Val Val Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Phe Gly

1 5 10 15

Asp Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ala Asn Ser

20 25 30

Tyr Gly Asn Thr Phe Leu Ser Trp Tyr Leu His Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Ser Ile Lys Pro Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly

85 90 95

Thr His Gln Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser

130 135 140

Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Asn

145 150 155 160

Asp Phe Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu

165 170 175

Trp Met Gly Tyr Ile Ser Phe Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser

180 185 190

Leu Lys Gly Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

195 200 205

Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Ser

210 215 220

Cys Ala Arg Gly Gly Met Ile Thr Pro Tyr Phe Ser Tyr Trp Gly Gln

225 230 235 240

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

245

<210> 14

<211> 248

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 14

Asp Val Val Val Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Phe Gly

1 5 10 15

Asp Gln Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ala Asn Ser

20 25 30

Tyr Gly Asn Thr Phe Leu Ser Trp Tyr Leu His Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Thr Ile Lys Pro Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly

85 90 95

Thr His Gln Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser

130 135 140

Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser

145 150 155 160

Asp Phe Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Phe Pro Gly Asp Lys Leu Glu

165 170 175

Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Gly Thr Asn Tyr His Pro Ser

180 185 190

Leu Lys Asp Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

195 200 205

Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

210 215 220

Cys Ala Arg Gly Gly Met Ile Thr Pro Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

225 230 235 240

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

245

<210> 15

<211> 254

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 15

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly

1 5 10 15

Gln Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln

85 90 95

His Tyr Gly Thr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

100 105 110

Lys Arg Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro

130 135 140

Ser Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser

145 150 155 160

Thr Ser Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly

165 170 175

Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Lys

180 185 190

Pro Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn

195 200 205

Gln Val Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Ala Ala Thr

210 215 220

Tyr Tyr Cys Ala Arg Met Gly Gly Gly Asn Tyr Leu Phe Leu Tyr Ala

225 230 235 240

Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ala

245 250

<210> 16

<211> 241

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 16

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr

20 25 30

Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Gln

115 120 125

Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr Ser Val Lys Val Ser Cys

130 135 140

Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Asn Met Tyr Trp Val Lys

145 150 155 160

Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr

165 170 175

Lys Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe Met His Leu Asn Ser Leu

195 200 205

Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Met Ile Thr

210 215 220

Ala Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

225 230 235 240

Ser

<210> 17

<211> 21

<212> PRT

<213> Human

<400> 17

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 18

<211> 223

<212> PRT

<213> Human

<400> 18

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile

35 40 45

Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val

50 55 60

Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

65 70 75 80

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

85 90 95

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg

100 105 110

Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln

115 120 125

Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

130 135 140

Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro

145 150 155 160

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

165 170 175

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

180 185 190

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

195 200 205

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

210 215 220

<210> 19

<211> 222

<212> PRT

<213> Human

<400> 19

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile

35 40 45

Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val

50 55 60

Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp

65 70 75 80

Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr

85 90 95

Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val

100 105 110

Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn

115 120 125

Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val

130 135 140

Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg

145 150 155 160

Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys

165 170 175

Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg

180 185 190

Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys

195 200 205

Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

210 215 220

<210> 20

<211> 18

<212> PRT

<213> insect virus

<400> 20

Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

1 5 10 15

Gly Pro

Claims

1.编码靶向CD123的嵌合抗原受体的核酸分子，所述嵌合抗原受体包含胞外区、跨膜区和胞内信号转导区，其特征在于，其编码的所述胞外区包含CD123结合结构域，所述CD123结合结构域为抗CD123的单链抗体可变区片段；

所述抗CD123的单链抗体可变区片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.15所示。

2.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，其编码的所述胞外区还包含构建在所述的嵌合抗原受体氨基末端的信号肽，所述信号肽为CD8α中的信号肽序列。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述信号肽的序列如SEQ ID NO.17所示。

4.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，其编码的所述CD123结合结构域通过铰链区与其编码的所述跨膜区连接；所述跨膜区为选自以下蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD123、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、4-1BB或CD154。

5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述铰链区为CD8α中的铰链区序列。

6.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，其编码的所述胞内信号转导区还包含共刺激因子。

7.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述共刺激因子为通过选自以下蛋白质获得的功能性信号结构域的一种或几种：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、淋巴细胞活化信号分子、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1、4-1BB、B7-H3、CD278、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM、KIRDS2、SLAMF7、NKp80、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49α、IA4、CD49D、ITGA6、VLA6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11α、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、CD29、ITGB1、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、CD1236、CD84、CD96、CEACAM1、CRTAM、CD1239、CD160、PSGL1、CD100、CD69、SLAMF6、SLAM、BLAME、CD162、LTBR、LAT、GADS或SLP-76。

8.根据权利要求7所述的核酸分子，其特征在于，所述共刺激因子为CD28或4-1BB。

9.根据权利要求8所述的核酸分子，其特征在于，所述共刺激因子为4-1BB。

10.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的序列如SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示。

11.靶向CD123的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由权利要求1～10中任意一项所述的核酸分子编码。

12.根据权利要求11所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。

13.一种载体，其特征在于，所述载体包含如权利要求1～10中任意一项所述的核酸分子。

14.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含如权利要求1～10中任意一项所述的核酸分子、如权利要求11或12所述的嵌合抗原受体或如权利要求13所述的载体。

15.如权利要求1～10中任意一项所述的核酸分子、如权利要求11或12所述的嵌合抗原受体、如权利要求13所述的载体或如权利要求14所述的细胞在制备治疗CD123阳性的血液肿瘤药物中的应用。

16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述血液肿瘤为急性髓系白血病。

17.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1～10中任意一项所述的核酸分子、如权利要求11或12所述的嵌合抗原受体、如权利要求13所述的载体或如权利要求14所述的细胞，以及药学上接受的载体。

18.如权利要求17所述的药物组合物在制备治疗CD123阳性的血液肿瘤药物中的应用。

19.根据权利要求18所述的应用，其特征在于，所述血液肿瘤为急性髓系白血病。

20.根据权利要求1～9中任意一项所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子还同时包含编码靶向其他肿瘤细胞表面抗原的嵌合抗原受体的核酸分子；

21.根据权利要求20所述的核酸分子，其特征在于，所述其他肿瘤细胞表面抗原为选自CD5、CD4、CD3、CD2、CD52、GD2、CD13、CD14、CD15、CD19、CD20、CD22、CD33、CD30、CD41、CD45、CD61、CD64、CD68、CD117、CD138、CD267、CD269、CD38、Flt3受体、CLL-1/CS1(SLAME7)、Fetoprotein(AFP)、glypican-3(GPC3)、BAFF-R、BAFF、APRIL、BCMA、TACL或Ley；

所述靶向其他肿瘤细胞表面抗原的嵌合抗原受体包含胞外区、跨膜区和胞内信号转导区，所述胞外区包含所述其他肿瘤细胞表面抗原的结合结构域，所述其他肿瘤细胞表面抗原的结合结构域为抗该表面抗原的单链抗体可变区片段。

22.根据权利要求21所述的核酸分子，其特征在于，所述其他肿瘤细胞表面抗原为CD33；所述单链抗体可变区片段为抗CD33的单链抗体可变区片段。

23.根据权利要求20所述的核酸分子，其特征在于，其编码的所述2A家族剪切肽为T2A、P2A或E2A。

24.根据权利要求23所述的核酸分子，其特征在于，其编码的所述2A家族剪切肽为T2A。

25.根据权利要求20所述的核酸分子，其特征在于，其编码的所述靶向其他肿瘤细胞表面抗原的嵌合抗原受体的结合结构域的氨基末端还包含信号肽，所述信号肽为CD8α中的信号肽序列。

26.根据权利要求25所述的核酸分子，其特征在于，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.17所示。

27.根据权利要求20所述的核酸分子，其特征在于，其编码的所述靶向其他肿瘤细胞表面抗原的嵌合抗原受体的结合结构域通过铰链区与其编码的所述跨膜区连接；所述跨膜区为选自以下蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD123、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、4-1BB或CD154。

28.根据权利要求27所述的核酸分子，其特征在于，所述铰链区为CD8α中的铰链区序列。

29.根据权利要求20所述的核酸分子，其特征在于，其编码的所述靶向其他肿瘤细胞表面抗原的嵌合抗原受体的胞内信号转导区还包含共刺激因子。

30.根据权利要求29所述的核酸分子，其特征在于，所述共刺激因子为通过选自以下蛋白质获得的功能性信号结构域的一种或几种：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、淋巴细胞活化信号分子、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1、4-1BB、B7-H3、CD278、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM、KIRDS2、SLAMF7、NKp80、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49α、IA4、CD49D、ITGA6、VLA6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11α、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、CD29、ITGB1、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、CD1236、CD84、CD96、CEACAM1、CRTAM、CD1239、CD160、PSGL1、CD100、CD69、SLAMF6、SLAM、BLAME、CD162、LTBR、LAT、GADS或SLP-76。

31.根据权利要求30所述的核酸分子，其特征在于，所述共刺激因子为CD28或4-1BB。

32.根据权利要求31所述的核酸分子，其特征在于，当所述核酸分子同时编码靶向CD123的嵌合抗原受体和靶向其他肿瘤细胞表面抗原的嵌合抗原受体时，所述靶向CD123的嵌合抗原受体的共刺激因子为CD28，所述靶向其他肿瘤细胞表面抗原的嵌合抗原受体的共刺激因子为4-1BB。

33.根据权利要求20所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的序列如SEQ IDNO.12所示。

34.靶向CD123和其他肿瘤细胞表面抗原的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由权利要求20～33中任意一项所述的核酸分子编码。

35.根据权利要求34所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

36.一种载体，其特征在于，所述载体包含如权利要求20～33中任意一项所述的核酸分子。

37.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含如权利要求20～33中任意一项所述的核酸分子、如权利要求34或35所述的嵌合抗原受体或如权利要求36所述的载体。

38.如权利要求20～33中任意一项所述的核酸分子、如权利要求34或35所述的嵌合抗原受体、如权利要求36所述的载体或如权利要求37所述的细胞在制备治疗血液肿瘤药物中的应用。

39.根据权利要求38所述的应用，其特征在于，所述血液肿瘤为急性髓系白血病。

40.根据权利要求39所述的应用，其特征在于，所述血液肿瘤为患者经常规化疗后复发或无效的急性髓系白血病。

41.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求20～33中任意一项所述的核酸分子、如权利要求34或35所述的嵌合抗原受体、如权利要求36所述的载体或如权利要求37所述的细胞，以及药学上接受的载体。

42.如权利要求41所述的药物组合物在制备治疗CD123阳性和/或其他肿瘤细胞表面抗原阳性的血液肿瘤药物中的应用。

43.根据权利要求42所述的应用，其特征在于，所述血液肿瘤为急性髓系白血病。

44.根据权利要求43所述的应用，其特征在于，所述血液肿瘤为患者经常规化疗后复发或无效的急性髓系白血病。

45.根据权利要求42、43或44所述的应用，其特征在于，所述其他肿瘤细胞表面抗原为CD33。