CN110078830A - 一种在共刺激结构域上携带重复活化基序的嵌合抗原受体t细胞 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种嵌合抗原受体融合蛋白，其从N端到C端包含：(i)具有抗肿瘤抗原活性的单链可变区片段(scFv)，(ii)跨膜结构域，(iii)至少一个共刺激结构域，其具有一个或多个连续重复至少一次的结合基序，和(iv)激活域。优选的共刺激结构域是CD28、4‑1BB、ICOS‑1、CD27、OX‑40、GITR或DAP10。

Description

一种在共刺激结构域上携带重复活化基序的嵌合抗原受体T 细胞

技术领域

本发明涉及肿瘤的过继免疫基因治疗领域，具体地涉及一种编码嵌合抗原受体的核酸以及表达嵌合抗原受体的细胞。本发明特别涉及在共刺激结构域上携带重复活化基序的嵌合抗原受体T细胞。

背景技术

免疫治疗是一种非常有前途的治疗癌症的方法。T细胞或T淋巴细胞是免疫系统有效的武器，它们能够持续性地帮我们区分正常细胞和外来抗原或非正常细胞，如癌症或被感染的细胞。基因修饰的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)是设计肿瘤特异性T细胞的常见方案。将靶向肿瘤相关抗原(TAA)的CAR-T细胞输入患者(称为过继细胞转移或ACT)，这代表了一种有效的免疫治疗方法。与化疗或抗体技术相比，CAR-T技术的优点在于重编程的T细胞可以增殖并在患者体内持续存在(“活的药物”)。

CAR(嵌合抗原受体)通常是由一个单克隆抗体衍生的单链可变区片段 (scFv)通过铰链和跨膜结构域连接到可变数目的胞内信号结构域：单个细胞活化的CD3-ζ结构域；以及和CD3-ζ结构域相连的CD28，CD137(4-1BB)或其他共刺激域(也可用CD27信号结构域代替CD28或CD137结构域，图1)。

CAR的发展从第一代(没有共刺激域)到第二代(具有一个共刺激域)到第三代CAR(具有多个共刺激域)。生成的具有多个共刺激域的CAR(即所谓的第三代CAR)会产生增加的细胞溶解活性，并显着改善CAR-T细胞的持续性，表现出增强的抗肿瘤活性。

然而，目前嵌合抗原受体的研究还有很多不足，还存在复发率高、安全性低等问题。因此，本领域迫切需要开发特异性好、疗效稳定、副作用小的嵌合抗原受体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在共刺激结构域上携带重复活化基序的嵌合抗原受体T细胞。

在本发明的第一方面，提供了一种嵌合抗原受体融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白从N-末端到C-末端包含：

(i)具有抗肿瘤抗原活性的单链可变片段(scFv)

(ii)跨膜结构域，

(iii)至少一个共刺激结构域，其具有一个或多个连续重复至少一次的结合基序，和

(iv)激活域。

在另一优选例中，所述的肿瘤抗原选自下组：间皮素、VEGFR-2、CD19、CD20、 CD30、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD52、CD56、CD80、CD81、CD86、CD123、 CD171、CD276、B7H4、CD133、EGFR、GPC3、PMSA、CD3、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、 ErbB2/HER-2、ErbB3/HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-acetyl GD2、 O-acetyl GD3、GHRHR、GHR、FLT1、KDR、FLT4、CD44v6、CD151、CA125、CEA、CTLA-4、 GITR、BTLA、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gpl30、LewisA、Lewis Y、TNFR1、TNFR2、 PD1、PD-L1、PD-L2、HVEM、MAGE-A、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、CD40、 CD137、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、TCRa、TCRp、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol,a、Frizzled、OX40、CD79b、和Notch-1-4。

在另一优选例中，所述的肿瘤抗原是间皮素。

在另一优选例中，所述的共刺激结构域选自下组：CD28、4-1BB、ICOS-1、CD27、 OX-40、GITR和DAP10。

在另一优选例中，所述的共刺激结构域是CD28。

在另一优选例中，所述的融合蛋白包含连续重复1、2、3或4次的结合基序YMNM。

在另一优选例中，所述的融合蛋白包含连续重复1、2、3或4次的结合基序PYAP。

在另一优选例中，在最后一个YMNM之后立即包含从T到P的突变。

在另一优选例中，所述的共刺激结构域的序列如SEQ ID NO.:14所示。

在另一优选例中，所述的结合基序位于共刺激结构域，较佳地位于共刺激结构域CD28。

在另一优选例中，所述的scFv包含VH和VL，并且，所述融合蛋白还包含一Beacon标签，所述Beacon标签连接至VH的N端、或位于VH和VL之间、或位于VL和跨膜结构域之间。

在另一优选例中，所述的CAR具有下式I结构：

L-scFv-H-TM-C-CD3ζ(I)

式中，

各“-”独立地为连接肽或肽键；

L为任选的信号肽序列；

scFv为权利要求3所述的单链抗体；

H为任选的铰链区；

TM为跨膜结构域；

C为共刺激结构域；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。

在另一优选例中，所述的L为选自下组的蛋白的信号肽：CD8、GM-CSF、CD4、 CD137、或其组合。

在另一优选例中，所述的L为CD8来源的信号肽。

在另一优选例中，所述的H为选自下组的蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137、或其组合。

在另一优选例中，所述的H为CD8来源的铰链区。

在另一优选例中，所述的TM为选自下组的蛋白的跨膜区：CD28、CD3 epsi lon、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、 CD86、CD134、CD137、CD154、或其组合。

在另一优选例中，TM包括CD8来源的跨膜区，和/或CD28来源的跨膜区。

在另一优选例中，所述的嵌合抗原受体融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.: 4所示。

在另一优选例中，所述的融合蛋白具有间皮素ScFv-Beacon-CD28 TM-CD28 DD-CD3ζ的氨基酸序列，或者在每个片段中具有至少95％的同一性。

在另一优选例中，所述的融合蛋白具有间皮素ScFv-Beacon-CD28 TM-CD28DD,T195P-CD3 zetaζ的氨基酸序列，或者在每个片段中具有至少95％的同一性。

在本发明的第二方面，提供了一种核酸分子，所述的核酸分子编码本发明第一方面所述的融合蛋白。

在另一优选例中，所述核酸分子的序列如SEQ ID NO.:3所示。

在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第二方面所述的核酸分子。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。

在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。

在另一优选例中，所述核酸分子位于慢病毒载体的Xba I和EcoR I慢病毒位点中。

在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体或染色体中整合有外源的本发明第二方面所述的核酸分子或表达本发明第一方面所述的CAR。

在另一优选例中，所述细胞为分离的细胞，和/或所述细胞为基因工程化的细胞。

在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞。

在另一优选例中，所述细胞为T细胞。

在本发明的第五方面，提供了一种制备工程化免疫细胞的方法，所述的工程化免疫细胞表达本发明第一方面所述的CAR，包括以下步骤：将本发明第二方面所述的核酸分子或本发明第三方面所述的载体转导入T细胞或NK细胞内，从而获得所述工程化免疫细胞。

在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测的步骤。

在本发明的第六方面，提供了一种制剂，所述制剂含有本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面所述的细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在另一优选例中，所述制剂为液态制剂。

在另一优选例中，所述制剂的剂型为注射剂。

在另一优选例中，所述制剂中所述CAR-T细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/ml，较佳地1×10⁴-1×10⁷个细胞/ml。

在本发明的第七方面，提供了一种本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面所述的细胞的用途，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。

在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合。

在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、或其组合。

在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、睾丸癌、结直肠癌、尿路肿瘤、甲状腺癌、或其组合。

在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：卵巢癌、间皮瘤、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、子宫内膜癌、或其组合。

在本发明的第八方面，提供了一种用于制备本发明第四方面所述细胞的试剂盒，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的本发明第二方面所述的核酸分子、或本发明第三方面所述的载体。

在本发明的第九方面，提供了一种本发明第四方面所述细胞、或本发明第六方面所述的制剂的用途，用于预防和/或治疗癌症或肿瘤。

在本发明的第十方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明第四方面所述的细胞、或本发明第六方面所述的制剂。

在另一优选例中，所述疾病为癌症或肿瘤。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了CAR的结构。左边是第一代CAR(没有共刺激域)，中间是第二代CAR(一个共刺激结构域CD28或者4-BB)，右边是第三代CAR(两个或多个共刺激结构域)。

图2显示了CD28蛋白的结构及其调控基序。

图3显示了具有不同结构的共激活结构域的靶向间皮素的CAR的结构。 CD3ζ(CD3zeta)标记为Z。No Meso TM28-Z(Mock Control)靶向胞内蛋白，用作模拟无间皮素的对照；Meso TM28 28WT-Z、Meso TM28 4-1BB-Z，Meso TM8 4-1BB-Z和Meso TM28 28DD Z具有重复的YMNM和PYAP结构域；Meso TM28 28DDT195P-Z具有上述重复结构域和T195P突变。铰链结构域中的C表示CD8铰链中的两个丝氨酸突变为半胱氨酸。-Q表示CD3ζ结构域中缺少Gln。构建体还包含GM-CSF、前导序列或人CD8前导序列。

图4用Fab抗体进行的流式细胞术显示慢病毒有效转导T细胞和间皮素scFv 有效表达。

图5用Beacon抗体进行的流式细胞术显示慢病毒有效转导T细胞和Beacon 标记的间皮素scFv有效表达。

图6显示了IL-2存在下CAR-T细胞的生长和扩增。

图7显示了Meso-CAR对间皮素阳性的卵巢癌细胞的细胞毒性测定。施用 10:1稀释的效应物与靶细胞。

图8显示了Meso-CAR对间皮素阴性的卵巢癌细胞的细胞毒性测定。

注：附图中的flag与本发明所述的Beacon具有相同含义。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现一种在共刺激结构域上携带重复活化基序的嵌合抗原受体T细胞。具体地，本发明提供的嵌合抗原受体融合蛋白包含连续重复1、2、3或4次的结合基序YMNM(191-194)、或连续重复1、2、3或4次的结合基序PYAP。优选地，所述的融合蛋白在最后一个YMNM重复之后还紧接着包含从T到P的突变。本发明增强了嵌合抗原受体(CAR)T细胞的功能活性，使其能够更有效地攻击肿瘤细胞。

术语

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。

术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。

术语“给予”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将本发明的产品物理引入受试者，包括静脉内，肌内，皮下，腹膜内，脊髓或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。

术语“抗体”(Ab)应包括但不限于免疫球蛋白，其特异性结合抗原并包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链，或其抗原结合部分。每条 H链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个恒定结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个恒定结构域CL。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其散布有更保守的称为框架区(FR)的区域。每个VH和 VL包含三个CDR和四个FR，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1， CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。

如本文所用，“嵌合抗原受体(CAR)”是一种融合蛋白，其包含能够结合抗原的胞外结构域，与胞外结构域衍生自不同多肽的跨膜结构域，以及至少一个胞内结构域。“嵌合抗原受体(CAR)”也称为“嵌合受体”、“T-body”或“嵌合免疫受体(CIR)”。所述的“能够结合抗原的胞外结构域”是指能够结合某一抗原的任何寡肽或多肽。“胞内结构域”是指已知的作为传递信号以激活或抑制细胞内生物过程的结构域的任何寡肽或多肽。

如本文所用，“域”或“结构域”是指多肽中独立于其它区域且折叠成特异结构的区域。

如本文所用，Beacon标签、FLAG标签、Flag、或FLAG表位是指利用重组DNA 技术添加到某一蛋白中的多肽蛋白标签，具有序列为DYKDDDD的基序。其可以融合到蛋白的C端或N端，或插入蛋白内。

如本文所用，“单链可变区片段(scFv)”是指源自抗体的单链多肽，其保留了结合抗原的能力。scFv的实例包括通过重组DNA技术形成的抗体多肽，其中免疫球蛋白重链(H链)和轻链(L链)片段的Fv区经由间隔序列连接。制备scFv的各种方法是本领域技术人员所熟知的。

如本文所用，“肿瘤抗原”是指具有抗原性的生物分子，其表达导致癌症。

嵌合抗原受体

本发明涉及一种嵌合抗原受体融合蛋白，其从N端到C端包含：(i)具有抗肿瘤抗原活性的单链可变区片段(scFv)，(ii)跨膜结构域，(iii)至少一个共刺激结构域，其具有一个或多个连续重复至少一次的结合基序，和 (iv)激活域。

在另一优选例中，所述的激活结构域是CD3zeta(CD3Z或CD3)。

在另一优选例中，所述的共刺激结构域选自下组：CD28、4-1BB(CD137)、 ICOS-1、CD27、OX 40(CD137)、DAP10、和GITR(AITR)。表1显示了上述共刺激蛋白的胞浆结构域、蛋白结合位点和活化位点(结合基序)。

表1

在另一优选例中，所述的共刺激结构域是CD28。所述的融合蛋白包含连续重复1、2、3或4次的结合基序YMNM(191-194)。在另一优选例中，所述的融合蛋白包含连续重复1、2、3或4次的结合基序PYAP。所述的“连续重复”、“立即重复”是指在YMNM和YMNM之间，或在PYAP和PYAP之间不存在其它氨基酸。在另一优选例中，所述的融合蛋白在最后一个YMNM重复之后还紧接着包含从T到P 的突变。

在另一优选例中，所述的共刺激结构域选自下组：4-1BB(CD137)、ICOS-1、 CD27、OX40(CD137)、DAP10、和GITR(AITR)，并且其结合基序可以连续重复1、 2、3或4次，如上面针对CD28所述，以增加其活性。此外，可以在这些共刺激结构域中产生突变位点以增加活性。

在另一优选例中，所述的融合蛋白还包含一Beacon标签，所述Beacon标签连接至VH的N端、或位于VH和VL之间、或位于VL和跨膜结构域之间。

所述的跨膜结构域可以来源于天然多肽，也可以是人工设计的。来源于天然多肽的跨膜结构域可以从任何膜结合蛋白或跨膜蛋白中获得。例如，T细胞受体α或β链以及CD3zeta链的跨膜结构域选自下组：CD28、CD3.epsilon.、 CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、 CD134、CD137、ICOS、CD154、和GITR。人工设计的跨膜结构域是主要包含疏水残基如亮氨酸和缬氨酸的多肽。优选地，在合成跨膜结构域的各末端包含苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，在如上(b)中所述的跨膜结构域和胞内结构域之间设置短的寡肽接头或多肽接头，例如长度为2-10个氨基酸的接头。优选地，可以使用具有甘氨酸-丝氨酸连续序列的接头序列。

本发明的目的在于增加嵌合抗原受体(CAR)T细胞的功能活性，从而更有效地攻击肿瘤细胞。

在另一优选例中，CAR的共刺激结构域CD28的遗传修饰通过重复活化CD28 区域和插入T195P点突变来进行，显示可增强CD28配体的结合活性：GRB2和GADS/GRAP2。CD28蛋白包含两个基序：YMNM和PYAP，负责其配体结合和下游活性(图2)。首先，抗原呈递细胞(APC)上的CD80和CD86与CD28胞外结构域结合，随后该相互作用从CD28的胞质尾部开始启动信号转导级联。Src激酶使得 YMNM基序中的酪氨酸磷酸化，导致Grb2和PI3K结合，激活下游信号传导(图2)。 CD28的第二结合基序PYAP与不同组的配体结合：Lck，Grb-2和Filamin A。敲入小鼠的实验表明PYAP基序对于CD28依赖性的IL-2产生是关键的。

本发明的CAR构建体显示在图3底部两幅图中。Meso TM28-28DD Z具有重复的YMNM和PYAP结构域；Meso TM28-28DD T195P具有重复的YMNM和PYAP结构域以及T195P点突变(紧接在第二个YMNM之后)。图2中的Beacon标签显示在Meso scFv 的C末端；然而，Beacon标签也可以位于信号肽的N端或C端，或位于VH和VL之间。Beacon标签需要位于胞外域，而不位于胞内域。

由于CD28基序(YMNM和PYAP)对其下游信号传导至关重要，因此本发明重复了各个负责其配体结合和IL-2产生的CD28基序，并将其引入抗间皮素CAR构建体的内部。在另一优选例中，本发明引入了负责Grb2配体结合和CD28激活的 T195P突变。本发明人提供了具有重复基序YMNM-YMNM和PYAP-PYAP的CD28突变体(图3，第5幅图)，并且还在具有双基序的CD28突变体的第二个YMNM之后紧接着产生了额外的T195P点突变(图3，最后一幅图)。本发明人比较了这些CAR 构建体和靶向间皮素的野生型CD28CAR以及野生型4-1BB-Z CAR的活性(图3)。本发明在间皮素scFv之后引入了Beacon标签。本发明人还制备了间皮素scFv的 C末端结构域上没有Beacon标签的相同突变构建体。

核酸分子

本发明提供了编码上述CAR的核酸。通过常规方法，利用特定CAR的氨基酸序列，可以很容易地制备编码CAR的核酸。利用前述各结构域的氨基酸序列的 NCBI RefSeq ID或GenBenk登录号，可以获得编码氨基酸序列的核苷酸序列。本发明的核酸可以使用标准分子生物学和/或化学方法制备。例如，可以基于碱基序列合成核酸，并且可以通过使用聚合酶链反应(PCR)将从cDNA文库获得的DNA片段融合来制备本发明的核酸。

包含本发明的核酸作为活性成分的组合物可以用于治疗癌症,例如血癌 (白血病)，实体肿瘤等。包含本发明的核酸作为活性成分的组合物，可以通过肠胃外给药，例如通过注射或输注，经皮内、肌内、皮下、腹膜内、鼻内、动脉内、静脉内、肿瘤内或传入淋巴管内给药，给药途径没有特别限制。

编码本发明的CAR的核酸可以插入载体中，并且可以将载体导入细胞。例如，可以使用病毒载体如逆转录病毒载体(包括致癌反转录病毒载体、慢病毒载体和假型载体)、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、猿病毒载体、牛痘病毒载体或仙台病毒载体、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)载体和HSV载体。作为病毒载体，优选使用缺乏复制能力的病毒载体，以免在感染细胞中自复制。作为病毒载体，优选使用缺乏复制能力的病毒载体，以免在感染细胞中自复制。

例如，当使用逆转录病毒载体时，本发明的方法可以是通过基于载体所具有的LTR序列和包装信号序列，选择合适的包装细胞，并使用包装细胞制备逆转录病毒颗粒。包装细胞的实例包括PG13(ATCC CRL-10686)、PA317(ATCC CRL-9078)、GP+E-86、GP+envAm-12和Psi-Crip。还可以使用具有高转染效率的293细胞或293T细胞来制备逆转录病毒颗粒。基于逆转录病毒和包装细胞产生的多种逆转录病毒载体可广泛地从许多公司获得。

本发明的细胞通过CAR与特异性抗原结合，从而将信号传递到细胞中，进而活化细胞。表达CAR的细胞的活化，可以根据宿主细胞的种类和CAR的胞内结构域而变化，并且可以基于例如细胞因子的释放，细胞增殖率的提高，细胞表面分子的改变等作为指标。例如，从活化细胞释放细胞毒性因子(肿瘤坏死因子，淋巴毒素等)，从而破坏表达抗原的靶细胞。此外，细胞因子的释放或细胞表面分子的变化还可以激活其他免疫细胞，例如B细胞、树突状细胞、NK细胞和巨噬细胞。表达CAR的细胞可以用作疾病的治疗剂。该治疗剂包含表达CAR的细胞作为活性成分，并且还可以包含合适的赋形剂。赋形剂的实例包括上述的药学上可接受的赋形剂(用于包含本发明的核酸作为活性成分的组合物的赋形剂)、各种细胞培养基和等渗氯化钠。

本发明提供了基因修饰的CD28共刺激结构域，其具有重复的CD28活化基序 (负责结合CD28共刺激配体，如PI3K和其它活化T细胞、调节IL-2分泌的配体)。在另一构建物中，发明人增加了额外的点突变：T195P，其也可以增强CD28配体GRB-2和GADS/GRAP2与其胞质尾部的结合。发明人提供了Beacon标记的靶向间皮素的构建物和无Beacon标记的靶向间皮素的构建物。数据表明，转导这些突变构建物的T细胞有效生长。此外，用过表达间皮素的卵巢癌细胞系A1847进行实时细胞毒性测定，结果显示，具有T195P突变的双突变体具有更高的活性，单独的双突变体活性次之，然后是野生型间皮素CAR-T细胞。

与野生型间皮素CAR-T细胞相比，含有本发明的突变型CD28共激活结构域的基因修饰和工程改造的CAR-T细胞的优点在于，增加了CAR-T细胞的功能活性，例如细胞毒性。这种改进的方法可以用于靶向其他肿瘤抗原的CAR-T细胞。利用本发明的CD28修饰方法优化CAR-T的功能，具有很高的商业化潜力，可以用于基础医学和临床试验。

可以对使用天然杀伤细胞(NK-92和原代人类自然杀伤细胞)的CAR构建体利用相同策略进行改进，

除了Beacon标签之外，也可以在构建中使用其他标签，包括用于多种生物学应用(毒素偶联抗体、体内细胞成像、用于细胞扩增的含磁珠标记的细胞的分选等)的标签，具体地，所述标签可选自下组：Strep标签、His标签、Xpress 标签、Avi标签、钙调素标签、聚谷氨酸标签、HA标签、Myc标签、Nus标签、S 标签、X标签、SBP标签、Sof标签、V5标签、CBP、GST、MBP、GFP、硫氧还蛋白标签、或其组合。

可与多种CAR突变体、肿瘤微环境和免疫检查点抑制剂组合进行治疗，以便增强单个CAR的活性。

基于本发明的突变，CAR-T细胞在动物体内的活性可以增强。

载体

编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。

本发明也提供了其中插入本发明的表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。

简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。

本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、 5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。

该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。

进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。

已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。

额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。

合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子 -1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔 (Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。

报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白的基因(例如，Ui-Tei等， 2000FEBS Letters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。

将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。

将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。

将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。

将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。

在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为慢病毒载体。

制剂

本发明提供了一种含有本发明第一方面所述的CAR-T细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述CAR-T细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/ml，更优地1×10⁴-1×10⁷个细胞/ml。

在一个实施方式中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。

治疗性应用

本发明包括用编码本发明表达盒的慢病毒载体(LV)转导的细胞(例如，T细胞)进行的治疗性应用。转导的T细胞可靶向肿瘤细胞的标志物，如间皮素，协同激活T细胞，引起T细胞免疫应答，从而显著提高其对肿瘤细胞的杀伤效率。

因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：给哺乳动物施用本发明的CAR-T细胞。

在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，分离病人自体T细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR-T细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被T细胞以无MHC限制方式识别。此外，一种CAR-T就可以治疗表达该抗原的所有癌症。不像抗体疗法，CAR-T 细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。

在一个实施方式中，本发明的CAR-T细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰T细胞诱导对CAR中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如，抗间皮素的CAR-T细胞引起抗表达间皮素的细胞的特异性免疫应答。

尽管本文公开的数据具体公开了包括抗-间皮素scFv、铰链和跨膜区、和 4-1BB和CD3ζ信号传导结构域的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化。

可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。

血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。

实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌卵巢癌、。

本发明的CAR-修饰T细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。

对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。

离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的CAR的载体进行基因修饰 (即，体外转导或转染)。CAR-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和CAR-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。

除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。

本发明提供了治疗肿瘤的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR-修饰的T细胞。

本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/ 或与其他组分诸如IL-2、IL-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA 或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。

本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。

当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者 (对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重的剂量，优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。

对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。

在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将 T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。

施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×10⁶个至1×10¹⁰个本发明经修饰的T细胞(如，CAR-T20细胞)，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

在本发明的实施例中，发明人示例性地将不同的CAR构建体克隆至慢病毒载体(Lenti CMV-MCS-EF1a-puro)的Xba I和EcoR I位点，从而在慢病毒载体内产生各CAR构建体。对于一些构建体，在CD8铰链上进行修饰，产生两个甘氨酸到半胱氨酸的突变，以增加CAR的稳定性，并且在scFv片段之后引入Beacon标签，作为CAR的检测标记。利用293T细胞生产慢病毒，通过RT-PCR建立效价。随后，利用相同剂量的慢病毒转导T细胞，如方法部分所述。使用包含6种不同 CAR(图3)的慢病毒转导T细胞，并且还利用未转导的T细胞来检测CAR-T细胞的功能活性。

实施例1CAR慢病毒的生产

慢病毒通过以下步骤制备：

第1天：

1.将5×10⁶HEK293FT细胞接种到100毫米直径的培养皿；

第2天：

2.检查以确保细胞70％-90％的汇合度；

3.为每个100毫米直径的培养皿准备转染复合物，流程如下：

a.在1.5ml管A中：将2.5μg CAR(嵌合抗原受体)DNA质粒(plasmid)和 20μL慢病毒包装组合(ALSTEM,产品目录号VP100；见Appendix B3)稀释到0.5ml DMEM或Opti-MEM无血清培养基中，轻轻混合；

b.在1.5ml管B中：将30μL Nanofect转染试剂(ALSTEM,产品目录号NF100) 稀释到0.5ml DMEM或Opti-MEM无血清培养基中，轻轻混合；

c.将管B中的NanoFect/DMEM加入到DNA/DMEM溶液(管A)中，涡旋5-10秒，将DMEM-plasmid-NanoFect混合物在室温下孵育15分钟；

4.将步骤3获得的全部转染复合物逐滴滴加到细胞板上，将板来回旋转使得转染复合物均匀地分散在板上；

5.37℃加湿5％CO₂培养箱中过夜培养该细胞；

第3天：

6.用10mL新鲜培养基替换上述转染复合物的上清液，并补充20μL ViralBoost(500X,ALSTEM,产品目录号VB100)；

7.37℃培育24小时；

第4天：

8.将含有慢病毒的培养液上清收集到50mL无菌有盖锥形离心管中，并放置于冰上；

9.上清液在4℃3000转条件下离心15分钟，以沉淀细胞碎片；

10.利用0.45μm的低蛋白结合无菌过滤器过滤澄清后的上清液；

11.通过定量RT-PCR测定慢病毒的浓度/滴度，利用Lenti-X qRT-PCR滴定试剂盒(Clontech；产品目录号631235)，测定上清液中HEK293的病毒浓度(通过DNaseI预处理去除任何可能残留的质粒DNA)；

12.上述病毒可以用于感染、纯化，或作为病毒原液存储于‐80℃备用，优选为小份单独存储，以减少反复冻融带来的病毒滴度损失。

实施例2慢病毒包装系统

产品说明

产品名称：SuperLenti^TM Lentivirus Packaging System

说明书：

对于慢病毒颗粒的生产，通常需要三种成分：1)含有目标外源基因的慢病毒载体，2)包含所有必需的病毒结构蛋白的包装载体，3)表达水泡性口炎病毒 (VSV)糖蛋白(G)的包膜载体。第三代慢病毒包装系统提供了最大的生物安全性，因为慢病毒Rev基因是作为相对其他结构基因的独立载体提供，进一步消除了将载体逆向重组到有复制能力的病毒颗粒中的可能性。第三代慢病毒包装混合物仅支持嵌合5’LTR的慢病毒表达载体，其中HIV启动子被CMV或RSV替代，因此使其独立于TAT。

SuperLenti慢病毒包装混合物是一种基于HIV的即用型第三代慢病毒包装系统，其中质粒表达慢病毒生产所需的元件，其允许创建基于HIV-1的复制无效的慢病毒，在分裂或非分裂哺乳动物细胞中递送并表达目标外源基因。

产品目录号：VP 100；

规格：200μL；

运输：室温；

储存和安全性：-20℃储存，该产品可以在-20℃稳定储存6个月。应该分装成一次使用的剂量，以便尽量避免反复冻融。使用前-20℃冰箱小份储存。

使用方法：

对于100mm培养皿的慢病毒包装，用20μl慢病毒包装混合物混合2.5μg 慢病毒表达载体。

对于150mm培养皿的慢病毒包装，用40μL慢病毒包装混合物混合5μg慢病毒表达载体。

质量控制：在转染实验条件下，通过使用人类胚胎肾293细胞对每批次的慢病毒包装混合物进行测试。

仅供研究使用。不用于诊断或治疗过程。

实施例3全血中外周血单核细胞(PBMC)的分离

全血(斯坦福大学医院血液中心，斯坦福，加州)采集自单个个体或多个个体(取决于所需血的量)，并置于10mL的Heparin vacutainers(Becton Dickinson公司)中。

注：应该在采血后的两小时内处理血液，以确保细胞产量最大。血液可以在室温下(室内)储存过夜，用于第二天的处理；然而，细胞产量会有一些损失。血液不应在4℃下储存在空管中。在50ml锥形离心管中，将约10ml抗凝全血与无菌磷酸盐缓冲液(PBS)混合，总体积为20ml(PBS，pH7/4，不含Ca²⁺/Mg²⁺)。在另一单独的，无菌50mL锥形离心管中，移液管移入15mL Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare，17-1440-03)。非常轻柔地将20ml的血液/PBS层压到Ficoll的表面，并在室温下以400xg离心样品30-40min，无需制动。小心吸取稀释血浆和 Ficoll分界处的包含外周血单核细胞(PBMC)的细胞层，避免吸入Ficoll。为了确保完全去除Ficoll，血小板和血浆蛋白，用总体积为40ml的PBS洗涤PBMC两次，并在室温下以200xg离心10分钟。然后用血细胞计数器计数细胞。如果洗涤的PBMC立即使用，则用CAR-T培养基(AIM V-AlbuMAX(BSA)(生命科技)洗涤一次，含有5％AB血清和1.25μg/mL两性霉素B(Gemini Bioproducts，伍德兰，CA)， 100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)。如果要将PBMC冷冻，则在转移绝缘小瓶中重悬洗涤细胞，-80℃，保持24小时，然后储存在液氮中。

实施例4外周血单核细胞T细胞活化

如果使用新鲜分离的PBMC，分离的细胞(用1xPBS(pH7.4)洗涤，无Ca²⁺/Mg²⁺)用CAR-T培养基(AIM V-AlbuMAX(BSA)(生命科技，含有5％AB血清和1.25μg/mL 两性霉素B(Gemini Bioproducts，伍德兰，CA)，100U/mL青霉素和100μg/mL 链霉素)洗涤一次，不使用人白细胞介素-2(huIL-2)(Invitrogen)，浓度为 5×10⁵个细胞/mL。在不含huIL-2的CAR-T培养基中洗涤一次，最后用含300U/mL huIL2(1000×stock；Invitrogen)的CAR-T培养基重悬浮至终浓度为5×10⁵个细胞/mL。

如果使用冷冻的PBMC，在9mL预热(37℃)的DMEM培养基(生命科技)中，在 10％FBS，100u/mL青霉素和100μg/mL链霉素存在下，以5×10⁵个细胞/mL的浓度，解冻并重悬细胞(1×10⁷细胞/mL)。300xg离心细胞5分钟，然后用不含 huIL-2的CAR-T培养基洗涤一次，最后用含30U/mL huIL2的CAR-T培养基重悬浮至终浓度为5×10⁵个细胞/mL。

在活化之前，将缀合抗人CD28和CD3抗体的磁珠(Invitrogen)用1mL无菌 1xPBS(pH7.4)(使用磁性架从溶液中分离珠子)洗涤三次，然后重悬于CAR-T培养基中(300U.mLhuIL-2)，终浓度为2×10⁷珠/mL。

然后将25uL的磁珠添加到1mL的PBMC中，以1:1的磁珠细胞比混合PBMC和磁珠。

将所需数量的等分试样加到12孔低附着或未处理细胞培养板的各个孔中，并在37℃下CO₂存在下培养24小时，然后进行病毒转导。

实施例5T细胞转导和扩增

PBMC活化后，将细胞在37℃，5％CO₂下培养24小时。

冰上解冻慢病毒。每孔1x10⁶个细胞并添加5×10⁶个慢病毒和2μL/mL Transplus培养基(Alstem，Richmond，CA)(最终稀释1:500)。细胞额外培养24 小时后重复添加病毒。

然后将细胞在持续存在300U/ml IL-2的新鲜培养基中培养12-14天(总培养时间取决于所需CAR-T细胞的最终数量)。

每隔2-3天分析细胞浓度，分析时添加培养基稀释细胞悬浮液至1×10⁶细胞/mL。

实施例6转导验证-细胞染色

在FACS缓冲液(磷酸盐缓冲液(PBS)，缓冲液中加0.1％叠氮钠和0.4％牛血清白蛋白)中洗涤并悬浮细胞。然后细胞按等分为1×10⁶的小份。

用正常山羊IgG(生命科技)阻断Fc受体，添加100μl 1:1000稀释的正常山羊IgG到各管，冰上孵育10分钟。

每管中加入1.0ml FACS缓冲液，300g旋转沉淀5分钟。

加入生物素标记的多克隆山羊抗鼠F(ab)2抗体(生命科技)检测CD24scFv；加入生物素标记的正常多克隆山羊IgG抗体(生命科技)作为同种型对照。 (1:200稀释，反应体积为100μl)。

将细胞在4℃孵育25分钟，并用FACS缓冲液洗涤一次。

在FACS缓冲液中悬浮细胞并通过向每个管中加入100μl 1:1000稀释的正常小鼠IgG来阻断细胞。在冰中孵育10分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞并重悬于 100μl FAC缓冲液中。

随后用藻红蛋白(PE)标记的链霉亲和素(BD Pharmingen，San Diego，CA) 和别藻蓝蛋白(APC)标记的CD3(eBiocience，San Diego，CA)对细胞进行染色。将1.0μl PE和APC分别加入管2和3。

利用流式细胞仪BD FacsCalibur(BD Biosciences)进行细胞采集，并用 FlowJo软件(Treestar，Inc.Amland，OR)进行分析。

实施例7细胞毒性试验(实时ACEA)和IL-2细胞因子试验

根据下述制造商的方案使用ACEA仪器进行细胞毒性试验。

实时细胞试验(RTCA)方案

第1天：

A.制备(贴壁)靶细胞：

1.从培养瓶中吸去旧的培养基。

2.加入5-10mL常规培养基(无血清)到培养瓶中，冲洗掉血清残留物。然后，吸入培养基。

3.向培养瓶中加入0.5mL-1mL的0.05％胰蛋白酶-EDTA以分离细胞。

4.将4.5mL-9.5mL培养基(含FBS)加入培养瓶中，上下吸取培养基至烧瓶底部，将细胞分散成单细胞溶液。

5.将悬浮的细胞悬液转移到15mL管中。

6.取出10μL细胞悬液并用血细胞计数器计数，测定细胞浓度。

7.在25℃下以1000rpm(或300xg)离心细胞悬液5分钟。

8.离心后，吸去上清液，将细胞沉淀重新悬浮于含有FBS的培养基中，直到浓度达到1×10⁵个细胞/mL。

B.制备RTCA板：

1.只将50uL培养基(与用于细胞悬液的培养基相同)加入到待检测的孔中。

2.将E-板(ACEA生物科学，Inc，产品编号：JL-10-156010-1A)放回台上。

3.启动RTCA 2.0软件

a.输入版面信息：

i.至少，选择所有的孔，然后点击“应用”。这激活了孔。

b.输入计划：

i.步骤1＝背景测量。不要改变。

ii.步骤2＝监测细胞

iii.步骤3＝短期细胞毒性

iv.步骤4＝长期细胞毒性(点击“自动”框)

^**可以更改每个步骤的循环次数和每个循环之间的间隔^**

4.单击“步骤1”，然后按开始命名实验，并测量培养基的背景。

5.“步骤1”完成后，从台上取下E-板。

6.将A部分的100μL细胞悬液加入孔中(不要移除先前的培养基，每个孔中最终总计150uL)。

7.让细胞在通风橱中静置5分钟。

8.将E-板放回台上。

9.点击“步骤2”，然后按开始恢复记录。

第2天-处理：

A.制备CAR-T效应细胞：

1.从6孔板中取出所有悬浮的CAR-T细胞并充分混合。

2.取10μL细胞悬液，用血细胞计数器测定细胞浓度。

3.在25℃下以1000rpm(或300xg)离心细胞悬液5分钟。

4.吸出上清液，并将细胞沉淀重悬于2mL细胞毒性缓冲液(RPMI 1640无苯酚(Invitrogen)+1％P/S(Invitrogen)+5％人AB血清(Gemini Bioproducts； 100-318)。

5.重复步骤3。

6.吸出上清液并将细胞沉淀重悬于细胞毒性培养基(无酚红 RPMI 1640(Invitrogen)加5％AB血清(Gemini Bioproducts；100-318))中以获得 1×10⁶细胞/mL的终浓度。

B.制备RTCA板：

1.A部分完成后，按快进至步骤3。

2.从台上取下E-板。

3.从每个孔小心地吸去上清液。

4.向每个孔中加入100μL的细胞毒性培养基。

5.重复步骤3。

6.向每个孔中加入50μL的细胞毒性培养基。

7.将100μl来自A部分的CAR-T细胞悬液(1×10⁵个细胞)分配至每个设计的所需孔中。

8.将E-板放回到台上。

9.点击“步骤3”，然后按开始恢复记录。

实施例8.IL-2分泌的测定

利用人IL-2ELISA试剂盒(产品目录号EH2IL2，Thermo Scientific)进行测定，方法如下：

1.每孔重复添加50μL的重组标准品或样品。注意：如果任何测试样品中的人IL-2浓度可能超过标准曲线上的最高点，1500pg/mL，请参阅样品制备-样品稀释部分。

2.每孔加入50μL生物素标记的抗体试剂。轻轻敲打板几次以便混合均匀。

3.将50μL标准稀释液加入到所有不含标准品或样品的孔中。

4.小心地用胶板盖板盖住。通过用拇指在边缘和每个板条上按压，确保所有的边缘和板条被严密地密封。在20-25℃的室温下孵育3小时。

5.小心取下胶板盖。在清洗之前，轻轻挤压板框的长边，确保所有的板条都牢固地留在框架中。清空板上的内容物。利用喷射瓶，使用漂洗缓冲液充分充满每个孔，然后清空板上的内容物。重复两次，共进行三次洗涤。将板在纸巾或其他吸水材料上吸干。注意：为了自动清洗，吸取所有孔并用漂洗缓冲液清洗三次，用漂洗缓冲液充满孔。将板在纸巾或其他吸水材料上吸干。

6.向每个孔加入100μL预备好的链霉亲和素-HRP溶液。

7.小心地连接一个新的胶板盖，确保所有的边缘和板条被严密密封。将板在20-25℃的室温下孵育30分钟。

8.小心地取下盖板并弃去板中的内容物。如板洗涤部分所述，对板进行洗涤。

9.向每个孔中移取100μLTMB底物溶液。

10.在室温下避光显色反应30分钟。不要用铝箔或板密封机对板进行覆盖。底物反应产生蓝色溶液，当加入终止液时变成黄色。

11.30分钟后，每孔加入100μL终止液，停止反应。

12.在停止反应的30分钟内对板进行评估。在设置为450nm和550nm的ELISA 读板仪上测量吸光度。从450nm值中减去550nm的值，以校正微孔板中的光学缺陷。如果550nm不可用，则仅在450nm处测量吸光度。注意：省略550nm的测量将导致更高的吸光度值。

13.使用标准曲线，确定未知样品中的IL-2量。

实施例9.IFN-γ分泌的测定

利用人IFN-γELISA试剂盒(目录号KHC4012，Invitrogen)进行测定，具体方法如下：

1.确定测定所需的8孔板条的数量。将这些板条插入框架以供当前使用。 (重新包装额外的板条和框架。将它们存放在冰箱内备用。)

2.向所有孔中加入50μL的孵育缓冲液。预留为色原体空白的孔应当留空。

3.向零孔中加入50μL的标准稀释缓冲液。预留为色原体空白的孔应当留空。

4.向适当的微量滴定孔中加入50μL的标准品，样品或对照。

5.移取50μL生物素化的HuIFNγ生物素偶联物溶液到除色原体空白之外的每个孔中。温柔轻敲板的侧面以便混合。

6.用盖板盖住板，在室温下孵育1小时30分钟。

7.彻底吸取或倾倒孔中溶液并弃去液体。将孔洗涤4次。

8.除色原体空白外，每孔加入100μL链霉亲和素-HRP工作液。

9.用盖板盖住板，在室温下孵育45分钟。

10.彻底吸取或倾倒孔中溶液并弃去液体。将孔洗涤4次。

11.向每个孔中加入100μL稳定的色原体。孔中的液体将开始变蓝。

12.在室温和黑暗中孵育30分钟。请注意：不要用铝箔覆盖板。色原体底物的孵育时间通常由所用的微量滴定板读数器确定。许多板读取器能够记录 2.0的最大光密度(O.D.)。应当监控O.D.值，并且在阳性孔的O.D值超过仪器极限之前停止底物反应。只有向每个孔添加终止液后，450nm处的O.D.值才能被读取。如果使用只记录到2.0O.D.的读数器，建议在20到25分钟后停止测定。

13.每孔加入100μL终止液。温柔轻敲板的侧面以便混合。孔中的溶液应该从蓝色变为黄色。

14.基于由100μL各种稳定的色原体和终止溶液组成的色原体空白，将读板器调至空白，读取各孔在450nm处的吸光度。添加终止液后2小时内读板。

15.在方格纸上绘制标准品吸光度与标准品浓度。(在绘图之前，最好从包括标准，未知和对照在内的所有数据点中减去背景吸光度。)通过这些点画出最佳的平滑曲线来构建标准曲线。如果使用曲线拟合软件，则四参数算法提供最佳曲线拟合。

16.从步骤15绘制的标准曲线中读取未知样品和对照的Hu IFN-γ浓度。 (产生的信号大于最高标准(1000pg/mL)的样品应在标准稀释缓冲液中稀释并重新分析，乘以适当稀释因子得到的浓度)。

实施例10.CAR的构建

CAR构建的方案如图3所示。

CAR序列如下所示：

1.pMeso-BBz(Mes0TM28-4-1BB-Z)

(抗间皮素scFV-Beacon-CD8(铰链)-CD28(TM)-CD137-CD3zeta)

其中，<sec.signal hCD8>的编码序列如下所示(SEQ ID NO.：7)：

<anti-mesothelin(抗间皮素p4)>的编码序列如下所示(SEQ ID NO.：8)：

CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTCGTGACGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTACTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAACGACTATGCAGTATCTGTGAAAAGTCGAATGAGCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGGAATGATGACTTACTATTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGCATTCTAGGATCCGGTGGCGGTGGCAGCGGCGGTGGTGGTTCCGGAGGCGGCGGTTCTCAGCCTGTGCTGACTCAGTCGTCTTCCCTCTCTGCATCTCCTGGAGCATCAGCCAGTCTCACCTGCACCTTGCGCAGTGGCATCAATGTTGGTCCCTACAGGATATACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAGTCCTCCCCAGTATCTCCTGAACTACAAATCAGACTCAGATAAGCAGCAGGGCTCTGGAGTCCCCAGCCGCTTCTCTGGATCCAAAGATGCTTCGGCCAATGCAGGGGTTTTACTCATCTCTGGGCTCCGGTCTGAGGATGAGGCTGACTATTACTGTATGATTTGGCACAGCAGCGCTGCTGTGTTCGGAGGAGGCACCCAACTGACCGTCCTCTCC

<Beacon>的编码序列如下所示(SEQ ID NO.：9)：

GACTACAAAGACGATGACGACAAG

<CD8hinge>的编码序列如下所示(SEQ ID NO.：10)：

aagcccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgat

<CD28TM>的编码序列如下所示(SEQ ID NO.：11)：

AAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCC TTTATTATTTTCTGGGTG

<CD137>的编码序列如下所示(SEQ ID NO.：12)：

aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg

<CD3zeta>的编码序列如下所示(SEQ ID NO.：13)：

agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgcccc ctcgctaa

完整的pMeso-BBz的编码序列如下所示(SEQ ID NO.：1)：

GACTACAAAGACGATGACGACAAGaagcccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCT ATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaatgagaattc

完整的pMeso-BBz的氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO.：2)：

MALPVTALLLPLALLLHAARPASQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLSLEDYKDDDDKKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR--

2.具有DD突变的Meso-28DDz(CD28中的两个重复基序YMNM和PYAP以粗体显示)

(抗间皮素scFV-Beacon-CD8(铰链)-CD28(TM和激活域，具有插入的突变) -CD3zeta)

其中，<sec.信号肽,hu CD8>的编码序列如SEQ ID NO.：7所示；

<抗间皮素(p4)>的编码序列如SEQ ID NO.：8所示；

<Beacon>的编码序列如SEQ ID NO.：9所示；

<cd8铰链>的编码序列如SEQ ID NO.：10所示；

<CD28TM和具有两个串联突变的激活域>的编码序列下所示(SEQ ID NO.： 14)；

<cd3zeta>的编码序列如SEQ ID NO.：13所示；

铰链区有两个丝氨酸被半胱氨酸取代(与sequence#3相比)

构建的克隆于慢病毒载体的pMeso-28z的编码序列如下所示(SEQ ID NO.： 3)：

agggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaatgagaattc

完整的pMeso-28z的氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO.：4)：

3.Meso 28WTZ的序列

除了CD28内的突变和无Beacon标签外，Meso 28WTZ(anti-mesothelin scFV-CD8(hinge)-CD28(TM and激活域)-CD3zeta的序列与Meso 28DDZ相同。

其中，<huCD8信号肽>的编码序列如SEQ ID NO.：7所示；

<抗间皮素(p4)>的编码序列如SEQ ID NO.：8所示；

<cd8铰链>的编码序列如SEQ ID NO.：10所示；

<CD28TM/CD28激活域>的编码序列如下所示(SEQ ID NO.：15)：

TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTA TCGCTCC

<CD3zeta>的编码序列如SEQ ID NO.：13所示；

完整的Meso 28WTZ的编码序列如下所示(SEQ ID NO.：5)：

tctagagccgccaccATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGgctagcCAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTCGTGACGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTACTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAACGACTATGCAGTATCTGTGAAAAGTCGAATGAGCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGGAATGATGACTTACTATTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGCATTCTAGGATCCGGTGGCGGTGGCAGCGGCGGTGGTGGTTCCGGAGGCGGCGGTTCTCAGCCTGTGCTGACTCAGTCGTCTTCCCTCTCTGCATCTCCTGGAGCATCAGCCAGTCTCACCTGCACCTTGCGCAGTGGCATCAATGTTGGTCCCTACAGGATATACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAGTCCTCCCCAGTATCTCCTGAACTACAAATCAGACTCAGATAAGCAGCAGGGCTCTGGAGTCCCCAGCCGCTTCTCTGGATCCAAAGATGCTTCGGCCAATGCAGGGGTTTTACTCATCTCTGGGCTCCGGTCTGAGGATGAGGCTGACTATTACTGTATGATTTGGCACAGCAGCGCTGCTGTGTTCGGAGGAGGCACCCAACTGACCGTCCTCTCCctcgagAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGAGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCAGTGATaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAAtaggaattc

人CD8前导序列MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO.：6)

4.除了TM8结构域被TM28取代外，Meso TM8-4-1BB-Z的序列与 Meso-TM28-4-1BB-Z相同。

5.Meso 28DDT195PZ的序列与在重复的PYAP基序之后添加额外的T195P的 Meso28DD-Z相同。

所有上述构建体在铰链前具有Beacon标签作为scFv胞外结构域的检测标记。

6.阴性对照No Meso TM28-28-Z CAR构建体没有misothelin，但具有GM-CSF 前导序列MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP(SEQ ID NO.：16)。无Beacon标记

实施例11.用CAR慢病毒构建体转导T细胞

所有构建体同样方法转导T细胞，转导效率达到>40％。利用C3-APC以及 IgG-PE对照和Fab-PE Ab进行的流式细胞术如图4所示。另外，我们使用 Beacon-PE检查了Beacon-标记的构建体的表达，检测到约40％的T细胞转导并表达scFv-Beacon标记的抗体片段(图5)。

实施例12CAR-T细胞表现出体外的有效生长

培养几周后分析细胞的体外生长。在培养12-16天期间，在添加IL-2条件下，所有的CAR-T细胞都有效的加速生长(方法)(图6)。CAR-T细胞生长之间没有显着差异。

实施例13实时细胞毒性测定

间皮素阳性细胞的实时细胞毒性测定显示，与间皮素野生型28Z CAR-T细胞相比，间皮素-DTT195P28-z和间皮素DD28Z CAR-T细胞的细胞毒性增加。

实时高灵敏度细胞毒性测定显示，与Meso-28Z CAR-T细胞和Meso-4-1BBZ CAR-T细胞相比，Meso-DDT195P28Z和Meso DD28Z CAR-T细胞对卵巢靶细胞系 A1847具有更高的活性(图7)。该差异是显着的，细胞之间p<0.05。使用10： 1效应物与目标比例。与CD28跨膜结构域相同，使用CD8跨膜结构域的Meso 4-11 BB Z CAR-T细胞没有细胞毒性，部分可以通过Beacon-标记的Meso构建体表达较少来解释(图5)。Meso 28WT Z CAR-T细胞比具有CD28TM结构域的4-1BBZ 细胞更具细胞毒性。两种间皮素突变体对A1847细胞均具有较高的细胞毒性。具有重复结构域和T195P突变的突变体具有最高的细胞毒性。

无Beacon标记的间皮素突变体获得的数据相同。

与间皮素阳性A1847细胞系相比，用间皮素-CD28-Z构建体和间皮素阴性 C30细胞系进行的测定显示更低的细胞毒性(图8)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 曹卫

<120> 一种在共刺激结构域上携带重复活化基序的嵌合抗原受体T细胞

<130> P2017-1229

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1593

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tctagagccg ccaccatggc cttaccagtg accgccttgc tcctgccgct ggccttgctg 60

ctccacgccg ccaggccggc tagccaggta cagctgcagc agtcaggtcc aggactcgtg 120

acgccctcgc agaccctctc actcacctgt gccatctccg gggacagtgt ctctagcaac 180

agtgctactt ggaactggat caggcagtcc ccatcgagag gccttgagtg gctgggaagg 240

acatactaca ggtccaagtg gtataacgac tatgcagtat ctgtgaaaag tcgaatgagc 300

atcaacccag acacatccaa gaaccagttc tccctgcagc tgaactctgt gactcccgag 360

gacacggctg tgtattactg tgcaagagga atgatgactt actattacgg tatggacgtc 420

tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc tcaggcattc taggatccgg tggcggtggc 480

agcggcggtg gtggttccgg aggcggcggt tctcagcctg tgctgactca gtcgtcttcc 540

ctctctgcat ctcctggagc atcagccagt ctcacctgca ccttgcgcag tggcatcaat 600

gttggtccct acaggatata ctggtaccag cagaagccag ggagtcctcc ccagtatctc 660

ctgaactaca aatcagactc agataagcag cagggctctg gagtccccag ccgcttctct 720

ggatccaaag atgcttcggc caatgcaggg gttttactca tctctgggct ccggtctgag 780

gatgaggctg actattactg tatgatttgg cacagcagcg ctgctgtgtt cggaggaggc 840

acccaactga ccgtcctctc cctcgaggac tacaaagacg atgacgacaa gaagcccacc 900

acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc 960

ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac 1020

ttcgcctgtg ataagccctt ttgggtgctg gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat 1080

agcttgctag taacagtggc ctttattatt ttctgggtga aacggggcag aaagaaactc 1140

ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 1200

tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc 1260

aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 1320

ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 1380

gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 1440

aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 1500

cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 1560

atgcaggccc tgccccctcg ctaatgagaa ttc 1593

<210> 2

<211> 522

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Ala Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro

20 25 30

Gly Leu Val Thr Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser

35 40 45

Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Thr Trp Asn Trp Ile Arg Gln

50 55 60

Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser

65 70 75 80

Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val Lys Ser Arg Met Ser Ile

85 90 95

Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val

100 105 110

Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Met Met Thr

115 120 125

Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val

130 135 140

Ser Ser Gly Ile Leu Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

145 150 155 160

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Pro Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Leu

165 170 175

Ser Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Ser

180 185 190

Gly Ile Asn Val Gly Pro Tyr Arg Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

195 200 205

Gly Ser Pro Pro Gln Tyr Leu Leu Asn Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys

210 215 220

Gln Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Ala

225 230 235 240

Ser Ala Asn Ala Gly Val Leu Leu Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp

245 250 255

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Ile Trp His Ser Ser Ala Ala Val Phe

260 265 270

Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Ser Leu Glu Asp Tyr Lys Asp

275 280 285

Asp Asp Asp Lys Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr

290 295 300

Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala

305 310 315 320

Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe

325 330 335

Ala Cys Asp Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu

340 345 350

Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

355 360 365

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

370 375 380

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

385 390 395 400

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

405 410 415

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

420 425 430

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

435 440 445

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

450 455 460

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

465 470 475 480

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

485 490 495

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

500 505 510

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

515 520

<210> 3

<211> 1614

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tctagagccg ccaccatggc cttaccagtg accgccttgc tcctgccgct ggccttgctg 60

ctccacgccg ccaggccggc tagccaggta cagctgcagc agtcaggtcc aggactcgtg 120

acgccctcgc agaccctctc actcacctgt gccatctccg gggacagtgt ctctagcaac 180

agtgctactt ggaactggat caggcagtcc ccatcgagag gccttgagtg gctgggaagg 240

acatactaca ggtccaagtg gtataacgac tatgcagtat ctgtgaaaag tcgaatgagc 300

atcaacccag acacatccaa gaaccagttc tccctgcagc tgaactctgt gactcccgag 360

gacacggctg tgtattactg tgcaagagga atgatgactt actattacgg tatggacgtc 420

tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc tcaggcattc taggatccgg tggcggtggc 480

agcggcggtg gtggttccgg aggcggcggt tctcagcctg tgctgactca gtcgtcttcc 540

ctctctgcat ctcctggagc atcagccagt ctcacctgca ccttgcgcag tggcatcaat 600

gttggtccct acaggatata ctggtaccag cagaagccag ggagtcctcc ccagtatctc 660

ctgaactaca aatcagactc agataagcag cagggctctg gagtccccag ccgcttctct 720

ggatccaaag atgcttcggc caatgcaggg gttttactca tctctgggct ccggtctgag 780

gatgaggctg actattactg tatgatttgg cacagcagcg ctgctgtgtt cggaggaggc 840

acccaactga ccgtcctctc cctcgaggac tacaaagacg atgacgacaa gaagcccacc 900

acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc 960

ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac 1020

ttcgcctgtg ataagccctt ttgggtgctg gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat 1080

agcttgctag taacagtggc ctttattatt ttctgggtga ggagtaagag gagcaggctc 1140

ctgcacagtg actacatgaa catgtacatg aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc 1200

cgcaagcatt accagcccta tgccccaccc tatgccccac cacgcgactt cgcagcctat 1260

cgctccagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 1320

cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 1380

cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg 1440

tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 1500

gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag 1560

gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gctaatgaga attc 1614

<210> 4

<211> 529

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Ala Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro

20 25 30

Gly Leu Val Thr Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser

35 40 45

Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Thr Trp Asn Trp Ile Arg Gln

50 55 60

Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser

65 70 75 80

Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val Lys Ser Arg Met Ser Ile

85 90 95

Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val

100 105 110

Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Met Met Thr

115 120 125

Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val

130 135 140

Ser Ser Gly Ile Leu Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

145 150 155 160

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Pro Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Leu

165 170 175

Ser Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Ser

180 185 190

Gly Ile Asn Val Gly Pro Tyr Arg Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

195 200 205

Gly Ser Pro Pro Gln Tyr Leu Leu Asn Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys

210 215 220

Gln Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Ala

225 230 235 240

Ser Ala Asn Ala Gly Val Leu Leu Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp

245 250 255

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Ile Trp His Ser Ser Ala Ala Val Phe

260 265 270

Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Ser Leu Glu Asp Tyr Lys Asp

275 280 285

Asp Asp Asp Lys Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr

290 295 300

Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala

305 310 315 320

Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe

325 330 335

Ala Cys Asp Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu

340 345 350

Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

355 360 365

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Tyr

370 375 380

Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln

385 390 395 400

Pro Tyr Ala Pro Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg

405 410 415

Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

420 425 430

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

435 440 445

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

450 455 460

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

465 470 475 480

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

485 490 495

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

500 505 510

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

515 520 525

Arg

<210> 5

<211> 1569

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tctagagccg ccaccatggc cttaccagtg accgccttgc tcctgccgct ggccttgctg 60

ctccacgccg ccaggccggc tagccaggta cagctgcagc agtcaggtcc aggactcgtg 120

acgccctcgc agaccctctc actcacctgt gccatctccg gggacagtgt ctctagcaac 180

agtgctactt ggaactggat caggcagtcc ccatcgagag gccttgagtg gctgggaagg 240

acatactaca ggtccaagtg gtataacgac tatgcagtat ctgtgaaaag tcgaatgagc 300

atcaacccag acacatccaa gaaccagttc tccctgcagc tgaactctgt gactcccgag 360

gacacggctg tgtattactg tgcaagagga atgatgactt actattacgg tatggacgtc 420

tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc tcaggcattc taggatccgg tggcggtggc 480

agcggcggtg gtggttccgg aggcggcggt tctcagcctg tgctgactca gtcgtcttcc 540

ctctctgcat ctcctggagc atcagccagt ctcacctgca ccttgcgcag tggcatcaat 600

gttggtccct acaggatata ctggtaccag cagaagccag ggagtcctcc ccagtatctc 660

ctgaactaca aatcagactc agataagcag cagggctctg gagtccccag ccgcttctct 720

ggatccaaag atgcttcggc caatgcaggg gttttactca tctctgggct ccggtctgag 780

gatgaggctg actattactg tatgatttgg cacagcagcg ctgctgtgtt cggaggaggc 840

acccaactga ccgtcctctc cctcgagaag cccaccacga cgccagcgcc gcgaccacca 900

acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc ctgtccctgc gcccagaggc gagccggcca 960

gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg ccagtgataa gcccttttgg 1020

gtgctggtgg tggttggtgg agtcctggct tgctatagct tgctagtaac agtggccttt 1080

attattttct gggtgaggag taagaggagc aggctcctgc acagtgacta catgaacatg 1140

actccccgcc gccccgggcc cacccgcaag cattaccagc cctatgcccc accacgcgac 1200

ttcgcagcct atcgctccag agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag 1260

cagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt 1320

ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa agccgcagag aaggaagaac 1380

cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag 1440

attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc aaggggcacg atggccttta ccagggtctc 1500

agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc cttcacatgc aggccctgcc ccctcgctaa 1560

taggaattc 1569

<210> 6

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 7

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

<210> 8

<211> 777

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctcgtgacgc cctcgcagac cctctcactc 60

acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagtg ctacttggaa ctggatcagg 120

cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggtat 180

aacgactatg cagtatctgt gaaaagtcga atgagcatca acccagacac atccaagaac 240

cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300

agaggaatga tgacttacta ttacggtatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc 360

gtctcctcag gcattctagg atccggtggc ggtggcagcg gcggtggtgg ttccggaggc 420

ggcggttctc agcctgtgct gactcagtcg tcttccctct ctgcatctcc tggagcatca 480

gccagtctca cctgcacctt gcgcagtggc atcaatgttg gtccctacag gatatactgg 540

taccagcaga agccagggag tcctccccag tatctcctga actacaaatc agactcagat 600

aagcagcagg gctctggagt ccccagccgc ttctctggat ccaaagatgc ttcggccaat 660

gcaggggttt tactcatctc tgggctccgg tctgaggatg aggctgacta ttactgtatg 720

atttggcaca gcagcgctgc tgtgttcgga ggaggcaccc aactgaccgt cctctcc 777

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gactacaaag acgatgacga caag 24

<210> 10

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aagcccacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 60

cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 120

gggctggact tcgcctgtga t 141

<210> 11

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aagccctttt gggtgctggt ggtggttggt ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta 60

acagtggcct ttattatttt ctgggtg 87

<210> 12

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 13

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 339

<210> 14

<211> 234

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aagccctttt gggtgctggt ggtggttggt ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta 60

acagtggcct ttattatttt ctgggtgagg agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac 120

tacatgaaca tgtacatgaa catgactccc cgccgccccg ggcccacccg caagcattac 180

cagccctatg ccccacccta tgccccacca cgcgacttcg cagcctatcg ctcc 234

<210> 15

<211> 204

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60

gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg 120

aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca 180

cgcgacttcg cagcctatcg ctcc 204

<210> 16

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro

20

Claims (10)

1.一种嵌合抗原受体融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白从N-末端到C-末端包含：

(i)具有抗肿瘤抗原活性的单链可变片段(scFv)

(ii)跨膜结构域，

(iii)至少一个共刺激结构域，其具有一个或多个连续重复至少一次的结合基序，和

(iv)激活域。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的肿瘤抗原选自下组：间皮素、VEGFR-2、CD19、CD20、CD30、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD52、CD56、CD80、CD81、CD86、CD123、CD171、CD276、B7H4、CD133、EGFR、GPC3、PMSA、CD3、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER-2、ErbB3/HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-acetyl GD2、O-acetyl GD3、GHRHR、GHR、FLT1、KDR、FLT4、CD44v6、CD151、CA125、CEA、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gpl30、Lewis A、Lewis Y、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、HVEM、MAGE-A、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、CD40、CD137、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、TCRa、TCRp、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol,a、Frizzled、OX40、CD79b、和Notch-1-4。

3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白包含重复1、2、3或4次的结合基序YMNM。

4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白包含重复1、2、3或4次的结合基序PYAP。

5.如权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，在最后一个YMNM之后包含从T到P的突变。

6.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的scFv包含VH和VL，并且，所述融合蛋白还包含一Beacon标签，所述Beacon标签连接至VH的N端、或位于VH和VL之间、或位于VL和跨膜结构域之间。

7.一种核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子编码权利要求1所述的融合蛋白。

8.一种蛋白，其特征在于，所述的蛋白具有间皮素ScFv-Beacon-CD28 TM-CD28 DD-CD3ζ的氨基酸序列，或者在每个片段中具有至少95％的同一性。

9.一种蛋白，其特征在于，所述的蛋白具有间皮素ScFv-Beacon-CD28 TM-CD28 DD,T195P-CD3 zetaζ的氨基酸序列，或者在每个片段中具有至少95％的同一性。

10.一种核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子编码权利要求8或9所述的蛋白。