CN115087666B - 嵌合抗原受体的优化 - Google Patents
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Abstract
一种嵌合抗原受体的优化，特别是胞内共刺激域的改造。
Description
发明领域
本发明涉及嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)的优化，特别是胞内共刺激域的改造。
发明背景
CAR-T技术结合了抗体的特异性及T细胞的杀伤效应，从而形成了一种过继性免疫的有效途径(Benmebarek et al.，Int.J.Mol.Sci.20：1283，2019)。最初的CAR通常由胞外抗原结合域、铰链区、跨膜区和胞内信号域构成(Gross et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：10024-10028，1989；Eshhar et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：720-724，1993)。第二代CAR增加了胞内共刺激域，通常位于跨膜区与胞内信号域之间(Imai et al.，Leukemia18：676-684，2004；Zhao et al.，Cancer Cell 28：415-428，2015)。第三代CAR增加两个共刺激域(Zhong et al.，Mol.Ther.18：413-420，2010)。虽然CAR-T技术在血液瘤治疗方面取得了巨大成功，但是仍有一些患者无响应或响应后复发，而且在疗效持久性及毒副反应上仍有不足。另外，CAR-T在实体瘤的治疗中更是面临疗效有限和脱靶效应等多重障碍。CAR-T疗效和安全性的两个重要问题是：1)CAR-T在体内的扩增和持续不足；2)CAR-T会引起细胞因子风暴、神经毒性和脱靶效应等毒副反应。
造成上述现象的原因在于目前的CAR分子采用的各元件基本上是野生型的，导致抗原识别域在与靶分子结合时可能并未达到免疫突触形成的最佳结合状态，或者免疫突触形成后向胞内的信号传递过强或过弱，从而影响CAR-T细胞在体内的存活、扩增及对肿瘤细胞杀伤性能的持续性及整个免疫系统功能的调节，最终体现为临床疗效和安全性的差异。
本发明通过对CAR分子，特别是胞内共刺激域的优化，提高CAR-T细胞在体内的扩增效率和持续时间，提高杀伤肿瘤的效能，并降低毒副作用，最终达到提高临床疗效、减少疾病复发和降低副作用的目的。
发明概述
在一个方面，本发明涉及一种改造来自肿瘤坏死因子受体超家族成员的共刺激域的方法。在一个实施方案中，该方法包括替代共刺激域中一个或多个与下游信号分子相互作用的基序内的一个或多个氨基酸残基。任选地，该方法还可以包括替代共刺激域中一个或多个与下游信号分子相互作用的基序N端和/或C端的一个或多个氨基酸残基。在另一个实施方案中，该方法包括添加或删除共刺激域中一个或多个与下游信号分子相互作用的基序。任选地，该方法还可以包括添加或删除共刺激域中与下游信号分子相互作用的基序N端和/或C端的一个或多个氨基酸残基。在又一个实施方案中，该方法包括对共刺激域添加一个或多个下游信号分子中与多聚化(例如三聚化)有关的序列。本发明还涉及通过所述方法获得的改造的共刺激域。
在一个方面，本发明涉及一种改造的来自肿瘤坏死因子受体超家族成员的共刺激域。在一个实施方案中，改造后的共刺激域包含一个或多个与下游信号分子相互作用的基序内的一个或多个氨基酸残基的替代。任选地，改造后的共刺激域还可以包含一个或多个与下游信号分子相互作用的基序N端和/或C端的一个或多个氨基酸残基的替代。在另一个实施方案中，改造后的共刺激域添加或删除一个或多个与下游信号分子相互作用的基序。任选地，改造后的共刺激域还可以添加或删除一个或多个与下游信号分子相互作用的基序N端和/或C端的一个或多个氨基酸残基。在又一个实施方案中，改造后的共刺激域添加一个或多个下游信号分子中与多聚化(例如三聚化)有关的序列。
在一个方面，本发明涉及一种优化嵌合抗原受体的方法，其包括上文改造来自肿瘤坏死因子受体超家族成员的共刺激域的方法作为一个步骤。本发明优化嵌合抗原受体的方法(具体是改造来自肿瘤坏死因子受体超家族成员的共刺激域的方法)可以单独使用，也可以与其它优化嵌合抗原受体的方法(例如改造信号域的方法)组合使用。本发明还涉及通过所述方法获得的优化的嵌合抗原受体。
在一个方面，本发明涉及一种优化的嵌合抗原受体，其包含上文改造的来自肿瘤坏死因子受体超家族成员的共刺激域作为一个构件。本发明的优化的嵌合抗原受体不仅可以包含改造的来自肿瘤坏死因子受体超家族成员的共刺激域，而且可以包含改造的其它构件，例如改造的信号域。
在一个方面，本发明涉及一种嵌合抗原受体，其包含本发明的改造的共刺激域。在一个方面，本发明涉及一种动物细胞，其包含本发明的嵌合抗原受体。在一个实施方案中，所述动物是哺乳动物(例如犬、猫、猪、牛、绵羊、山羊和马)。在一个实施方案中，所述动物是啮齿动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠和家兔)或非人灵长动物(例如猴、猿和黑猩猩)。在一个实施方案中，所述动物是人。在一个实施方案中，所述细胞是淋巴细胞，例如T细胞、B细胞或NK细胞。
例如，所述肿瘤坏死因子受体超家族成员是4-1BB。例如，所述下游信号分子是TRAF2。
附图简述
图1显示CAR分子元件及其对CAR-T功能的影响。
图2显示载体pLenti-CAR结构示意图。
图3显示4-1BB共刺激信号域改造的BCMA CAR-T细胞增殖速度的比较。
图4显示4-1BB共刺激信号域改造的BCMA CAR-T细胞中CD4+和CD8+细胞比例的比较。
图5显示4-1BB共刺激信号域改造的BCMA CAR-T细胞中CCR7+CD62+细胞比例的比较。
图6显示4-1BB共刺激信号域改造的BCMA CAR-T细胞中处于耗竭状态的细胞比例的比较。
图7显示4-1BB共刺激信号域改造的BCMA CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤效率的比较。
发明详述
除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。这些技术在文献中有充分解释。
除非另有定义，本文中所使用的技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常的理解具有相同的含义。
1.共刺激域
嵌合抗原受体中采用的胞内共刺激域通常来自两大家族，以4-1BB为代表的肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)和以CD28为代表的CD28家族。肿瘤坏死因子受体超家族的成员包含4-1BB、ATAR、CD27、CD30、CD40、Ox40、LMP1、LTβR等共刺激分子。它们与下游信号分子(例如TRAF家族成员)结合的位点具有序列保守性，包括主要共有基序(P/S/A/T)X(Q/E)E和次要共有基序PXQXXD，其中X为任意氨基酸。举例而言，在人序列中，4-1BB(NP_001552.2)包含TTQE和PEEE；ATRR包含AVEE；CD27包含PIQE；CD30包含PEQE和SVEE；CD40包含PVQE；LMP1包含PQQATD；LTβR包含PHQE；OX40包含PIQE；TANK包含PIQCTD；TNF-R2包含SKEE。各种共刺激分子均与TRAF家族的TRAF2结合，但是对TRAF家族的其他成员(例如TRAF1、TRAF3、TRAF5、TRAF6)的结合有所不同。参见Hong et al.，Molecular Cell 4：321-330，1999。
在本发明中，通过对来自肿瘤坏死因子受体超家族成员的共刺激域中与下游信号分子结合的基序进行改造，提高CAR-T细胞在体内的增殖效率，延长CAR-T细胞在体内的持续时间，增强CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤效能，减轻细胞因子释放综合征和神经毒性，最终达到改善临床疗效、减轻毒副作用的目的。
另外，还在来自肿瘤坏死因子受体超家族成员的共刺激域中添加使其多聚化(例如三聚化)的序列，调整向下游传递信号的强度。参见Wu et al.，Structural Studies ofHuman TRAF2，Cold Spring Harb Symp Quant Biol 64：541-550，1999。
在本发明中，4-1BB可以包含例如NP_001552.2中所列氨基酸序列，其中共刺激域对应于第214-255位氨基酸残基(SEQ ID NO：2)。或者，4-1BB可以是其它天然存在同源氨基酸序列，例如等位基因产物、同等型、同系物、旁系同源物、等等。如此，来自4-1BB的共刺激域是其它天然存在同源氨基酸序列中与NP_0015522中所列氨基酸序列第214-255位氨基酸残基对应的部分。
2.改造共刺激域的方法
在一个方面，本发明涉及一种改造来自肿瘤坏死因子受体超家族成员的共刺激域的方法，该方法包括替代共刺激域中一个或多个与下游信号分子相互作用的基序内的一个或多个氨基酸残基。任选地，该方法还可以包括替代共刺激域中一个或多个与下游信号分子相互作用的基序N端和/或C端的一个或多个氨基酸残基。
在一个方面，本发明涉及一种改造来自肿瘤坏死因子受体超家族成员的共刺激域的方法，该方法包括添加或删除共刺激域中一个或多个与下游信号分子相互作用的基序。任选地，该方法还可以包括添加或删除共刺激域中与下游信号分子相互作用的基序N端和/或C端的一个或多个氨基酸残基。
在一个方面，本发明涉及一种改造来自肿瘤坏死因子受体超家族成员的共刺激域的方法，该方法包括对共刺激域添加一个或多个下游信号分子中与多聚化(例如三聚化)有关的序列。
在一个实施方案中，所述肿瘤坏死因子受体超家族成员选自CD30、CD40、CD27、OX40、4-1BB、ATAR、LTβR和LMP1。在一个实施方案中，所述肿瘤坏死因子受体超家族成员是4-1BB。在一个实施方案中，所述下游信号分子选自TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF5和TRAF6。在一个实施方案中，所述下游信号分子是TRAF2。在一个实施方案中，所述肿瘤坏死因子受体超家族成员是4-1BB且所述下游信号分子是TRAF2。
在一个实施方案中，来自肿瘤坏死因子受体超家族成员的共刺激域中与下游信号分子相互作用的基序选自(P/S/A/T)X(Q/E)E和PXQXXD，其中X是任何天然发生氨基酸。在一个实施方案中，来自肿瘤坏死因子受体超家族成员的共刺激域中与下游信号分子相互作用的基序是(P/S/A/T)X(Q/E)E，其中X是任何天然发生氨基酸。在一个实施方案中，所述替代产生非天然存在的基序。在一个实施方案中，“非天然存在的基序”指在所有肿瘤坏死因子受体超家族成员中非天然存在的基序。在一个实施方案中，“非天然存在的基序”指在所改造的肿瘤坏死因子受体超家族成员中非天然存在的基序。在一个实施方案中，“非天然存在的基序”指在所改造的肿瘤坏死因子受体超家族成员中在所改造的位置处非天然存在的基序。
在一个实施方案中，所述方法包括替代共刺激域中两个不同的与下游分子信号相互作用的基序内的一个或多个氨基酸残基，并且导致两个不同基序互换位置。在一个实施方案中，所述方法进一步包括替代共刺激域中两个不同基序N端和/或C端的一个或多个氨基酸残基，并且导致两个不同基序N端和/或C端的一个或多个氨基酸残基连同基序一起互换位置。
在一个实施方案中，将4-1BB共刺激域(例如SEQ ID NO：2，对应于NP_001552.2中所列氨基酸序列第214-255位)中的TTQE基序(对应于NP_0015522中所列氨基酸序列第234-237位)替代成PTEE或PEEE基序。在一个实施方案中，将4-1BB共刺激域(例如SEQ ID NO：2，对应于NP_001552.2中所列氨基酸序列第214-255位)中的PEEE基序(对应于NP_001552.2第246-249位)替代成PEQE、TEQE或TTQE基序。在一个实施方案中，将4-1BB共刺激域中的PEEE基序替代成PEQE基序。在一个实施方案中，将4-1BB共刺激域中的TTQE基序替代成PTEE基序并将PEEE基序替代成TEQE基序。在一个实施方案中，将4-1BB共刺激域中的TTQE基序替代成PEEE基序并将PEEE基序替代成TTQE基序，即将TTQE基序和PEEE基序互换位置。在一个实施方案中，将4-1BB共刺激域中的QTTQE序列替代成FPEEE序列并将FPEEE序列替代成QTTQE序列，即将TTQE基序连同N端的Q残基和PEEE基序连同N端的F残基互换位置。
在一个实施方案中，对4-1BB共刺激域(例如SEQ ID NO：2)添加TTQE和/或PEEE基序。在一个实施方案中，在4-1BB共刺激域的N端或C端，特别是C端添加TTQE和/或PEEE基序。在一个实施方案中，对4-1BB共刺激域添加VQTTQEEDGCS和/或RFPEEEEGGCE序列。在一个实施方案中，在4-1BB共刺激域的N端或C端，特别是C端添加VQTTQEEDGCS和/或RFPEEEEGGCE序列。
在一个实施方案中，对4-1BB共刺激域(例如SEQ ID NO：2)添加来自TRAF2的DLAMADLEQKV三聚化序列。在一个实施方案中，在4-1BB共刺激域的N端或C端，特别是C端添加DLAMADLEQKV三聚化序列。
本发明还涉及通过所述方法获得的改造的共刺激域。
3.改造的共刺激域
在一个方面，本发明涉及一种改造的来自肿瘤坏死因子受体超家族成员的共刺激域，与该共刺激域的天然序列相比，改造后的共刺激域包含一个或多个与下游信号分子相互作用的基序内的一个或多个氨基酸残基的替代。任选地，改造后的共刺激域还可以包含一个或多个与下游信号分子相互作用的基序N端和/或C端的一个或多个氨基酸残基的替代。
在一个方面，本发明涉及一种改造的来自肿瘤坏死因子受体超家族成员的共刺激域，与该共刺激域的天然序列相比，改造后的共刺激域添加或删除一个或多个与下游信号分子相互作用的基序。任选地，改造后的共刺激域还可以添加或删除一个或多个与下游信号分子相互作用的基序N端和/或C端的一个或多个氨基酸残基。
在一个方面，本发明涉及一种改造的来自肿瘤坏死因子受体超家族成员的共刺激域，与该共刺激域的天然序列相比，改造后的共刺激域添加一个或多个下游信号分子中与多聚化(例如三聚化)有关的序列。
在一个实施方案中，所述肿瘤坏死因子受体超家族成员选自CD30、CD40、CD27、OX40、4-1BB、ATAR、LTβR和LMP1。在一个实施方案中，所述肿瘤坏死因子受体超家族成员是4-1BB。在一个实施方案中，所述下游信号分子选自TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF5和TRAF6。在一个实施方案中，所述下游信号分子是TRAF2。在一个实施方案中，所述肿瘤坏死因子受体超家族成员是4-1BB且所述下游信号分子是TRAF2。
在一个实施方案中，来自肿瘤坏死因子受体超家族成员的共刺激域中与下游信号分子相互作用的基序选自(P/S/A/T)X(Q/E)E和PXQXXD，其中X是任何天然发生氨基酸。在一个实施方案中，来自肿瘤坏死因子受体超家族成员的共刺激域中与下游信号分子相互作用的基序是(P/S/A/T)X(Q/E)E，其中X是任何天然发生氨基酸。在一个实施方案中，所述替代产生非天然存在的基序。在一个实施方案中，“非天然存在的基序”指在所有肿瘤坏死因子受体超家族成员中非天然存在的基序。在一个实施方案中，“非天然存在的基序”指在所改造的肿瘤坏死因子受体超家族成员中非天然存在的基序。在一个实施方案中，“非天然存在的基序”指在所改造的肿瘤坏死因子受体超家族成员中在所改造的位置处非天然存在的基序。
在一个实施方案中，改造后的共刺激域中两个不同基序互换位置。在一个实施方案中，改造后的共刺激域中两个不同基序互换位置，而且进一步地，两个不同基序N端和/或C端的一个或多个氨基酸残基连同基序一起互换位置。
在一个实施方案中，与天然序列4-1BB共刺激域(例如SEQ ID NO：2，对应于NP_001552.2第214-255位)相比，改造后的4-1BB共刺激域包含自TTQE基序(对应于NP_001552.2第234-237位)替代而成的PTEE或PEEE基序。在一个实施方案中，与天然序列4-1BB共刺激域(例如SEQ ID NO：2，对应于NP_001552.2第214-255位)相比，改造后的4-1BB共刺激域包含自PEEE基序(对应于NP_001552.2第246-249位)替代而成的PEQE、TEQE或TTQE基序。在一个实施方案中，改造后的4-1BB共刺激域包含自PEEE基序替代而成的PEQE基序。在一个实施方案中，改造后的4-1BB共刺激域包含自TTQE基序替代而成的PTEE基序和自PEEE基序替代而成的TEQE基序。在一个实施方案中，改造后的4-1BB共刺激域包含自TTQE基序替代而成的PEEE基序和自PEEE基序替代而成的TTQE基序。在一个实施方案中，改造后的4-1BB共刺激域包含自QTTQE序列替代而成的FPEEE序列和自FPEEE序列替代而成的QTTQE序列。在一个实施方案中，改造后的4-1BB共刺激域包含SEQ ID NO：4、6或8所示氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。
在一个实施方案中，与天然序列4-1BB共刺激域(例如SEQ ID NO：2)相比，改造后的4-1BB共刺激域包含额外的TTQE和/或PEEE基序。在一个实施方案中，额外的TTQE和/或PEEE基序添加在4-1BB共刺激域的N端或C端，特别是C端。在一个实施方案中，改造后的4-1BB共刺激域包含额外的VQTTQEEDGCS和/或RFPEEEEGGCE序列。在一个实施方案中，额外的VQTTQEEDGCS和/或RFPEEEEGGCE序列添加在4-1BB共刺激域的N端或C端，特别是C端。在一个实施方案中，改造后的4-1BB共刺激域包含SEQ ID NO：10或12所示氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。
在一个实施方案中，与天然序列4-1BB共刺激域(例如SEQ ID NO：2)相比，改造后的4-1BB共刺激域包含来自TRAF2的DLAMADLEQKV三聚化序列。在一个实施方案中，DLAMADLEQKV三聚化序列添加在4-1BB共刺激域的N端或C端，特别是C端。在一个实施方案中，改造后的4-1BB共刺激域包含SEQ ID NO：14所示氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。
4.优化嵌合抗原受体的方法
在一个方面，本发明涉及一种优化嵌合抗原受体的方法，其包括上文改造来自肿瘤坏死因子受体超家族成员(特别是4-1BB)的共刺激域的方法作为一个步骤。
本发明优化嵌合抗原受体的方法(具体是改造来自肿瘤坏死因子受体超家族成员(特别是4-1BB)的共刺激域的方法)可以单独使用，也可以与其它优化嵌合抗原受体的方法(例如改造信号域的方法)组合使用。
本发明还涉及通过所述方法获得的优化的嵌合抗原受体。
5.优化的嵌合抗原受体
在一个方面，本发明涉及一种优化的嵌合抗原受体，其包含上文改造的来自肿瘤坏死因子受体超家族成员(特别是4-1BB)的共刺激域作为一个构件。
本发明的优化的嵌合抗原受体不仅可以包含改造的来自肿瘤坏死因子受体超家族成员(特别是4-1BB)的共刺激域，而且可以包含改造的其它构件，例如改造的信号域。
在一个实施方案中，本发明提供一种经过优化的针对BCMA的嵌合抗原受体，其包含：
(1)针对BCMA的抗原结合域，特别是SEQ ID NO：16第23至268位氨基酸；
(2)铰链区，特别是SEQ ID NO：16第269至313位氨基酸；
(3)跨膜区，特别是SEQ ID NO：16第314至337位氨基酸；
(4)共刺激域，特别是选自SEQ ID NO：4、6、8、10、12和14的氨基酸序列；和
(5)信号域，特别是SEQ ID NO：16第380至491位氨基酸。
除非特别指明，本文所述技术方案可以任意组合。
序列说明
实施例
实施例1：共刺激信号域改造优化
本实施例以Bluebird专利(US20180085444A1)中单链抗体构建靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的CAR(BCMA CAR)分子的4-1BB共刺激域改造优化为例。改造原则：在不改变4-1BB共刺激域性质和功能的同时，降低CAR-T细胞自激活的可能性，增加4-1BB向胞内传递信号的效率，促使CAR-T细胞形成更多中心记忆T细胞(CAR-Tcm)、初始T细胞(CAR-Tnaive)、干细胞样记忆T细胞(CAR-Tscm)亚群(统称为Tcns)，延长CAR-T细胞在体内的存活时间，增加CAR-T细胞抗瘤性能。
初始BCMA CAR分子核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。
对于未经改造的4-1BB共刺激信号域，BCMA CAR的4-1BB共刺激信号域核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
对于经过改造的4-1BB共刺激信号域，BCMA CAR-B5共刺激信号域核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；BCMA CAR-B6共刺激信号域核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；BCMA CAR-B7共刺激信号域核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；BCMACAR-B8共刺激信号域核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示；BCMA CAR-B9共刺激信号域核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示；BCMACAR-B11共刺激信号域核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。
上述各方案核苷酸序列通过基因合成的方法合成，然后与其他序列搭桥连接，最终形成CAR编码分子。将CAR编码分子插入慢病毒载体pLenti6.3/V5(Thermo Fisher，Waltham，MA，USA)(图2)。
从健康志愿者的外周血单个核细胞(妙通(上海)生物科技有限公司，中国)中分离T细胞。将分离纯化后的T细胞以1.0×106个细胞/ml接种培养至X-VIVO 15培养基(Lonza，Switzerland)中，按T细胞数与CD3/CD28Dynabeads(Thermo Fisher)比例为1∶1加入Dynabeads于培养体系中，并加入IL-2(山东金泰生物工程有限公司，中国)(500IU/ml)培养48小时后，将含有未改造或改造后4-1BB的CAR通过慢病毒转导至T细胞中。病毒感染细胞24小时后，细胞离心换液，并加入含IL-2(500IU/ml)的新鲜X-VIVO 15继续培养。细胞培养4天后，收集培养体系中的所有细胞，并用磁力架去除培养体系中的Dynabeads，T细胞离心并计数，用流式细胞仪(NovoCyte2060R，ACEABiosciences，San Diego，CA 92121，USA)检测各组细胞CAR含量后按CAR-T与NCI H929细胞(国家实验细胞资源共享平台，中国)比例为5∶1加入NCI H929进行共培养。CAR-T细胞继续培养至第16天，留取相应细胞样品进行流式检测分析CAR表达率，CAR-T细胞中CD4+细胞、CD8+细胞、CCR7+CD62L+细胞比例及CAR-T细胞免疫耗竭分子PD1、LAG3表达情况，并进行肿瘤细胞杀伤实验，基本如先期所述进行(Sallusto etal.，Nature 401(6754)：708，1999)。
结果如图3至图7所示。图3显示，4-1BB共刺激信号域改造后BCMA CAR-T-B11可以促使CAR-T细胞增殖加快约三分之二。由此，在体内可以增加肿瘤的杀伤速度，在体外可以缩短细胞临床细胞所需剂量的时间，减少患者等待时间，增加治愈疾病的机会，减少患者治疗成本。图4显示，4-1BB共刺激信号域改造后BCMA CAR-T-B6、BCMA CAR-T-B7可以促使CAR-T细胞中CD8+CAR-T细胞比例增加约一倍，从而提升了相应CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤效能。图5显示，4-1BB共刺激信号域改造后BCMA CAR-T-B5、BCMA CAR-T-B7、BCMA CAR-T-B8、BCMA CAR-T-B9、BCMA CAR-T-B11可以促使CAR-T细胞中CAR-Tcns比例增加约30％，这可以增加相应CAR-T细胞在体内生存周期，降低疾病复发风险。图6显示，改造后的4-1BB共刺激域对相应CAR-T细胞的耗竭状态无明显影响。显示了改造后的4-1BB在提升相应CAR-T细胞的杀伤效能及体内存活周期的同时，对细胞的耗竭状态并无影响。图7显示，改造后的4-1BB共刺激域对应的BCMA CAR-T-B6、BCMA CAR-T-B7可以提升约10％的杀伤效应，这对于帮助患者实现完全缓解、降低疾病复发具有显著意义。
综上所述，可见4-1BB共刺激信号域改造后CAR-T在体外细胞增殖、亚群分布、细胞耗竭及肿瘤细胞杀伤方面均有显著改善。
本说明书足以使本领域技术人员能够实施本发明。提供实施例仅出于例示目的，并非意图以任何方式限制本发明的范围。实际上，根据上面的描述，在本文所显示和描述之外，本发明的多种修饰对于本领域技术人员是显而易见的，而且在所附权利要求的范围内。
Claims (13)
1.一种改造的来自肿瘤坏死因子受体超家族成员的共刺激域，其特征在于，与天然序列相比，改造后的共刺激域包含一个或多个与下游信号分子相互作用的基序内的一个或多个氨基酸残基的替代；其中所述肿瘤坏死因子受体超家族成员是4-1BB且所述下游信号分子是TRAF2；改造后的4-1BB共刺激域包含自TTQE基序替代而成的PTEE或PEEE基序和/或自PEEE基序替代而成的PEQE、TEQE或TTQE基序。
2.权利要求1的改造的共刺激域，其中改造后的4-1BB共刺激域包含自QTTQE序列替代而成的FPEEE序列和/或自FPEEE序列替代而成的QTTQE序列。
3.权利要求1的改造的共刺激域，其中改造后的4-1BB共刺激域由SEQ ID NO：4、6或8所示氨基酸序列组成。
4.一种改造的来自肿瘤坏死因子受体超家族成员的共刺激域，其特征在于，与天然序列相比，改造后的共刺激域添加一个或多个与下游信号分子相互作用的基序；其中所述肿瘤坏死因子受体超家族成员是4-1BB且所述下游信号分子是TRAF2；改造后的4-1BB共刺激域包含额外的VQTTQEEDGCS和/或RFPEEEEGGCE序列。
5.权利要求4的改造的共刺激域，其中改造后的4-1BB共刺激域由SEQ ID NO：10或12所示氨基酸序列组成。
6.一种改造的来自肿瘤坏死因子受体超家族成员的共刺激域，其特征在于，与天然序列相比，改造后的共刺激域添加一个或多个下游信号分子中与多聚化有关的序列；其中所述肿瘤坏死因子受体超家族成员是4-1BB且所述下游信号分子是TRAF2；改造后的4-1BB共刺激域包含来自TRAF2的DLAMADLEQKV三聚化序列。
7.权利要求6的改造的共刺激域，其中改造后的4-1BB共刺激域由SEQ ID NO：14所示氨基酸序列组成。
8.一种改造来自肿瘤坏死因子受体超家族成员的共刺激域的方法，其包括：替代共刺激域中一个或多个与下游信号分子相互作用的基序内的一个或多个氨基酸残基；
其中所述肿瘤坏死因子受体超家族成员是4-1BB且所述下游信号分子是TRAF2；
所述替代是将4-1BB共刺激域中的TTQE基序替代成PTEE或PEEE基序和/或将PEEE基序替代成PEQE、TEQE或TTQE基序。
9.权利要求8的方法，其中所述替代是将4-1BB共刺激域中的QTTQE序列替代成FPEEE序列和/或将FPEEE序列替代成QTTQE序列。
10.一种改造来自肿瘤坏死因子受体超家族成员的共刺激域的方法，其包括：添加共刺激域中一个或多个与下游信号分子相互作用的序列；
其中所述肿瘤坏死因子受体超家族成员是4-1BB且所述下游信号分子是TRAF2；
所添加的序列是VQTTQEEDGCS和/或RFPEEEEGGCE序列。
11.一种改造来自肿瘤坏死因子受体超家族成员的共刺激域的方法，其包括：对共刺激域添加一个或多个下游信号分子中与多聚化有关的序列；
其中所述肿瘤坏死因子受体超家族成员是4-1BB且所述下游信号分子是TRAF2；
所添加的序列是来自TRAF2的DLAMADLEQKV三聚化序列。
12.一种嵌合抗原受体，其包含权利要求1至7任一项的改造的共刺激域或通过权利要求8至11任一项获得的改造的共刺激域。
13.一种动物细胞，其包含权利要求12的嵌合抗原受体。
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