KR20210139312A - Il-10 변이체 분자, 및 염증 질환 및 종양학의 치료 방법 - Google Patents

Il-10 변이체 분자, 및 염증 질환 및 종양학의 치료 방법 Download PDF

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Abstract

본 출원은 암, 염증 질환 또는 장애, 및 자가면역 질환 또는 장애의 치료에 유용한 변이체 IL-10 분자, 그의 융합 단백질 및 키메라 단백질을 포함하는 조성물 또는 제형에 관한 것이다.

Description

IL-10 변이체 분자, 및 염증 질환 및 종양학의 치료 방법
관련 출원의 상호 참고
본 출원은 2019년 3월 6일에 출원한 미국 가특허 출원 번호 62/814,669, 2019년 9월 12일에 출원한 미국 가특허 출원 번호 62/899,504, 및 2020년 1월 17일에 출원한 미국 가특허 출원 번호 62/962,332를 우선권으로 주장하며, 각각의 개시내용은 그들의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
서론
본 출원은 IL-10 수용체 결합 영역 및/또는 IL-10 분자에 존재하는 도메인간 각도를 담당하는 도메인에 대한 변형을 포함하는 인터류킨 10 (IL-10)의 변이체 형태에 관한 것이다. IL-10에서 이들 도메인 중 하나 또는 둘 다를 변형시킴으로써, 본 발명자들은 놀랍게도 IL-10 수용체의 생성된 생물학적 기능이 특이적인 생물학적 반응을 유도하기 위해 조정되거나 또는 조절될 수 있음을 발견하였다. 본 출원은 또한 비-단백질 기반 혈청 연장 모이어티 뿐만 아니라 단백질 기반 연장 양식을 포함하는 반감기 연장된 IL-10 또는 IL-10 변이체 분자에 관한 것이다. 본 출원은 또한 IL-10 변이체 분자를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.
IL-10은 (i) 지다당류에 대한 반응으로 단핵구/대식세포에 의한 염증유발 시토카인 분비, 및 (ii) CD4+ T 세포의 인터류킨 2 (IL-2) 분비 및 증식 둘 다를 억제하는 그의 능력으로 인해 시토카인 합성 억제 인자로서 기재되었다. IL-10의 바이러스 유사체가 발견되었고 인간 IL-10과 유사한 또는 동일한 기능을 공유하는 것으로 보고되었을 때, 이들 IL-10 바이러스 유사체가 인간 게놈에서 발견된 억제성 시토카인의 기능을 채택함으로써 바이러스 병독성을 증강시킨 것으로 추정되었다.
IL-10의 억제 효과에 대한 추가의 연구는 만성 전장염을 발달시킨 IL-10 녹아웃 마우스의 생성에 의해 가능하게 되었다. 이들 마우스로부터 생성된 데이터는 IL-10 녹아웃 마우스가 주로 단핵구/대식세포 및 CD4+ T 세포에 의한 만성 염증유발 시토카인 분비를 통해 위장관 전체에 걸쳐 중증 염증을 발달시킴을 명백히 보여주었으며, 이는 초기 시험관내 관찰과 일치한다.
종합적으로, 데이터는 IL-10이 염증을 억제하는데 지배적인 역할을 발휘하였음을 암시하였다. 특히, 기능적 IL-10 수용체 또는 IL-10 생성 능력이 결여된 환자는 위장관의 염증 연관된 질환이 발생할 소인이 증가되었다.
건선, 류마티스성 관절염, 및 크론 질환의 맥락에서 IL-10의 항염증 기능을 평가하기 위해 여러 임상 시험이 수행되었다. 일반적으로, 재조합 인간 IL-10 (rHuIL-10) 치료는 안전하지만 효능이 부족한 것으로 발견되었다. 특히, rHuIL-10에 의한 크론 환자의 치료는 역의 용량 반응을 유도하였으며, 저용량은 염증을 중간 정도로 억제하는 것으로 나타났고, 억제 효과는 고용량에서 소실되었다. 최종 크론 연구의 엄격한 분석을 통해 10 및 20 μg/kg rHuIL-10을 투여한 환자가 인터페론 감마 (IFNγ) 및 네오프테린의 증가된 혈청 농도를 나타낸 것으로 드러났다. IFNγ는 염증성 장 질환 및 크론 질환의 발병기전을 악화시키는 것으로 공지되어 있다. 데이터는 고용량에서 IL-10에 의한 처리가 IFNγ를 유도하고, 이는 염증 질환을 악화시킬 것임을 시사한다.
건강한 인간에서 IL-10 효과의 추가의 분석은 염증전 인자 지다당류 (LPS)에 대한 노출 전에 IL-10의 투여가 염증유발 시토카인의 생성을 억제한다는 것을 시사한다. 그러나, LPS에 대한 노출 후에 rHuIL-10의 투여는 염증유발 시토카인의 분비를 증강시켰다. LPS가 염증성 장 질환 (IBD)을 가진 환자에서 정상 및 외래 장 박테리아 둘 다의 생성물이기 때문에, 이들 환자는 LPS가 결코 "없지"않을 것이며, 따라서 IL-10 처리가 LPS 전에 적용될 수 있는 상태가 절대 아닐 것이다. 따라서, 이들 데이터는 크론 및 다른 염증 질환을 가진 환자가 IL-10 처리의 치료 이익을 결코 보지 못할 것임을 시사한다.
IL-10의 역할에 혼란을 더하는 것은, IL-10이 항-종양 반응을 유도하기 위해 면역계를 활성화시킴을 나타내는 누적 데이터이다. 초기 데이터는 IL-10이 NK 세포를 활성화시켰음을 시사하였지만, 추가의 조사는 IL-10 처리가 CD8+ T 세포 및 IFNγ 의존성 방식으로 종양 성장을 억제한다는 것을 밝혀내었다. 계속된 조사에서 IL-10 처리가 FoxP3+CD4+ T 조절 세포 증식을 억제하고, 쿠퍼(Kupffer) 세포 스케빈징을 증강시켰음이 밝혀졌고, 이들은 IL-10이 억제제가 아니라 강력한 면역 자극제임을 시사하는 모든 기능이다. 마지막으로, 이들 자극 활성은 PEG화 IL-10으로 처리된 종양학 환자의 임상 연구에서 확인되었다.
종합적으로, 이들 데이터는 자가면역 연관된 염증을 앓고 있는 환자의 IL-10 처리가 치료 이익을 유도하는데 실패하였음을 나타내고, 이는 IL-10이 범면역 억제제가 아님을 시사한다. 이에 따라, (PEG) IL-10에 의한 암 환자의 치료는 강력하고 치료적으로 유용한 면역 활성화를 유도하고, 구체적으로 IL-10에 의해 처리된 크론 환자와 유사하게 용량 의존성 혈청 IFNγ를 유도하며, 이는 IL-10이 강력한 면역 자극제임을 시사한다.
바이러스가 IL-10 서열을 획득하는 이유는 해결되지 않았다. 엡스타인 바르 바이러스 (EBV-IL10) 및 시토메갈로바이러스 (CMV-IL10) 상동체 둘 다에 대한 추가의 분석은 이들 바이러스가 2가지 주요 방식으로 본래의 IL-10 서열을 변경시켰음을 시시한다. EBV-IL10은 IL-10 수용체에 대한 그의 친화도를 실질적으로 감소시키면서 리간드 수용체 상호작용의 특이적인 각도를 유도하는 동종이량체 상호작용의 유사한 삼차 각도를 유지하는 것으로 보인다. CMV-IL10은 IL-10 수용체와의 상호작용 각도를 실질적으로 변경시키면서 IL-10 수용체에 대한 증가된 친화도를 나타낸다. EBV-IL10 및 CMV-IL10 서열 각각이 본래의 IL-10에 대해 대략 80% 및 27% 상동성을 유지하고, 각각의 바이러스 상동체가 완전히 상이한 IL-10 수용체 친화도, 상이한 수용체 결속 각도를 갖지만, 각각의 바이러스 상동체가 본래의 IL-10과 매우 유사한 항염증 기능을 발휘하는 것으로 보인다. 따라서, IL-10 수용체에 대한 친화도 및/또는 수용체 상호작용의 각도가 IL-10 신호의 후속적인 하류 전달에 어떻게 영향을 미치는지는 불명확하다.
본 출원은 일반적으로 IL-10 수용체 신호 전달을 조절하는 신규한 IL-10 변이체 분자에 관한 것이다. 따라서, 본 출원은 IL-10 분자의 구조에 변형을 도입하여, 변경된 IL-10 수용체 결합 친화도 및/또는 변경된 IL-10 도메인간 각도를 갖는 신규한 IL-10 변이체 분자를 생성하는 IL-10 변이체 분자에 관한 것이다. 본 발명자들은 놀랍게도 IL-10 수용체 친화도 및/또는 IL-10 도메인간 각도에 영향을 미치는 주요 도메인에서 IL-10의 변형이 면역 질환, 염증 질환 또는 상태를 치료할 뿐만 아니라, 암을 치료하는데 사용될 수 있는 IL-10 수용체 효능제를 생성하였음을 발견하였다. 더욱이, IL-10 변이체 분자는 또한 IL-10 또는 IL-10 변이체의 단량체가 IL-10 동종이량체를 형성하는 것을 방해하지 않으면서, 융합 단백질의 일부로서 변이체 IL-10 분자, 예컨대 다양한 항체 도메인 (Fc 또는 가변 도메인)을 도입시킴으로써 증가된 혈청 반감기를 가질 수 있다.
특정한 실시양태에서, IL-10 변이체 분자는 변형된 인간 IL-10이다. 다른 실시양태에서, IL-10 변이체 분자는 변형된 마우스 IL-10이다. 바람직한 실시양태에서, IL-10 변이체 분자는 IL-10의 변형된 바이러스 상동체이다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 바이러스 IL-10 상동체는 CMV-IL10이다. 가장 바람직한 실시양태에서, 바이러스 IL-10 상동체는 EBV-IL10이다.
추가의 실시양태에서, IL-10 변이체 분자는 수용체 결합 영역 내에 적어도 1개 또는 그 초과의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 포함한다. 여전히 다른 실시양태에서, IL-10 변이체 분자는 IL-10의 도메인간 각도의 형성을 담당하는 영역에서 적어도 1개 또는 그 초과의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, IL-10 변이체 분자는 수용체 결합 도메인 및/또는 도메인간 각도를 담당하는 영역에 대한 변형 중 하나 또는 둘 다를 포함한다. 가장 바람직한 실시양태에서, IL-10 변이체 분자는 EBV-IL10 단백질 분자에서 하나의 또는 둘 다의 변형을 포함한다.
다양한 실시양태에서, IL-10 변이체 분자는 야생형 IL-10과 비교할 때 IL-10 수용체 또는 수용체 복합체에 대해 증강된 친화도를 갖는다. 다른 실시양태에서, IL-10 변이체 분자는 야생형 IL-10과 비교할 때 IL-10 수용체 또는 수용체 복합체에 대해 감소된 친화도를 갖는다. 다른 실시양태에서, IL-10 변이체 분자는 야생형 IL-10, 더욱 바람직하게는 EBV-IL10과 비교할 때 더 좁거나 또는 제한된 도메인간 각도를 형성한다. 또 다른 실시양태에서, IL-10 변이체 분자는 야생형 IL-10, 더욱 바람직하게는 EBV IL-10과 비교할 때 더 넓거나 또는 이완된 도메인간 각도를 형성한다.
여전히 추가의 실시양태에서, EBV IL-10 변이체 분자는 EBV IL-10의 나선 A, AB 루프 및/또는 나선 F ("부위 1")에 위치한 수용체 결합 영역 내에 적어도 1개 또는 그 초과의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 수용체 결합 도메인 영역에 대한 변형은 IL-10 수용체 또는 수용체 복합체에 대한 친화도를 증가시키거나 또는 증강시킬 수 있다. 특정한 다른 실시양태에서, 수용체 결합 영역에 대한 변형은 IL-10 수용체 또는 수용체 복합체에 대한 친화도를 약화시키거나 또는 감소시킬 수 있다
추가의 실시양태에서, EBV IL-10 변이체 분자는 도메인간 각도 형성을 담당하는 EBV IL-10 영역 내에 적어도 1개 또는 그 초과의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 변형은 EBV IL-10의 DE 루프에서 발생할 수 있다. DE 루프에서의 변형은 제한된 도메인간 각도 또는 이완된 도메인간 각도를 갖는 EBV IL-10 변이체 분자를 생성한다.
다른 측면에서, IL-10 변이체 분자는 키메라 또는 융합 분자이다. 한 실시양태에서, 키메라 또는 융합 단백질은 상이한 단백질로부터의 1개 이상의 도메인 또는 단일 단백질 내의 돌연변이를 포함하여 또 다른 단백질의 특징을 제공할 것이다. 바람직한 실시양태에서, 키메라 또는 융합된 단백질은 알부민, 효소, 글리코실트랜스퍼라제, 갈락토실트랜스퍼라제, IgG 힌지 영역 (예컨대 Fc 영역), 1개 이상의 항체의 1개 이상의 가변 도메인 (예컨대 비제한적으로 가변 중쇄 또는 가변 경쇄), 시토카인 (예컨대 IL-6, IL-4, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-12, IL-15, GM-CSF, G-CSF, 인터페론 -α, -β, -γ, TGF-β, 및 종양 괴사 인자 -α, -β), 표지, 작용제, 화학요법제, 방사성 동위원소, 및 반감기 연장제 (예컨대 히드록실 에틸 전분 (HES화), 폴리시알산, 헤파로산 중합체, 엘라스틴-유사 폴리펩티드 및 히알루론산)을 비롯하여 이로 제한되지 않는 또 다른 분자에 융합된 본원에 기재된 IL-10 변이체 분자를 포함하는 제1 부분을 포함할 것이다. 또 다른 실시양태에서, IL-10 변이체 분자는 1개 이상의 항체 중쇄 또는 경쇄 가변 영역에 융합된다. 융합 단백질은 융합 단백질의 상이한 부분에 공유적으로 연결된 1개 이상의 링커를 포함할 수 있다. 융합 단백질은 동일한 유형의 또 다른 융합 단백질과 비공유적으로 결합된 복합체를 형성할 수 있다. 이러한 융합 단백질은 IL-10의 단량체 또는 변이체 IL-10 분자의 단량체가 IL-10 또는 변이체 IL-10의 기능적 동종이량체와 함께 회합하는 것을 가능하게 할 것이다.
다른 실시양태에서, 변이체 IL-10 분자는 조작된 융합 단백질의 일부이다. 융합 단백질은 융합 단백질의 제1 말단에서 링커 또는 스페이서에 접합된 IL-10 또는 IL-10 변이체 분자의 적어도 1개의 단량체를 포함할 것이고, 1개 이상의 스페이서를 사용하여 융합 단백질의 다양한 부분에 연결되고, 이는 이어서 다른 말단에서 접합된 적어도 1개의 다른 분자에 접합되고, 분자는 적어도 1개의 시토카인 또는 그의 단량체, 치료제, 표지, 혈청 반감기 연장 분자, 또는 단백질 (예컨대 비제한적으로 수용체, 리간드, 또는 항체의 다양한 부분)로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 융합 단백질은 링커 또는 스페이서를 통해 적어도 1개의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역에 접합된 IL-10의 단량체 또는 IL-10 변이체 분자의 단량체를 포함한다. 가장 바람직한 실시양태에서, 융합 단백질은 링커 또는 스페이서를 통해 적어도 1개의 중쇄 및/또는 경쇄 영역에 접합된 EBV IL-10의 단량체 또는 EBV IL-10 변이체 분자의 단량체를 포함한다. 가장 바람직한 실시양태에서, EBV IL-10 또는 그의 EBV IL-10 변이체 분자의 단량체는 1개의 중쇄 가변 영역 및 1개의 경쇄 가변 영역에 접합되고, 단량체는 함께 이량체 복합체를 형성한다. EBV IL-10의 단량체 또는 EBV IL-10 변이체 분자의 단량체는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에 접합될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 본 출원의 IL-10 변이체 분자, 그의 융합 단백질 또는 키메라 단백질의 치료량을 염증 질환 또는 상태, 예컨대 비제한적으로 염증성 장 질환 (IBD), 크론 질환, 궤양성 대장염, 비알콜성 지방간염 (NASH), 및 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD)을 앓고 있는 대상체에게 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 본 출원의 IL-10 변이체 분자, 그의 융합 단백질 또는 키메라 단백질의 치료량은 암을 앓고 있는 대상체에게 투여된다. 1가지가 넘는 병리학적 상태를 가진 대상체의 치료가 또한 구상된다. 더욱 바람직한 실시양태에서, IL-10 변이체 분자는 EBV-IL10 변이체, 그의 융합 단백질 또는 키메라 단백질이다. 또 다른 실시양태에서, IL-10 변이체 분자, 그의 융합 단백질 또는 키메라 단백질은 조합 요법으로 사용된다. 예를 들어, IL-10 변이체 분자, 그의 융합 단백질 또는 키메라 단백질은 다른 요법 또는 치료와 병용으로 대상체에게 투여될 수 있다. 여전히 다른 실시양태에서, 본 출원의 IL-10 변이체 분자, 그의 융합 단백질 또는 키메라 단백질의 치료량은 지질 기반 질환, 예컨대 비제한적으로 상승된 수준의 콜레스테롤을 앓고 있는 대상체에게 투여된다.
다양한 실시양태에서, 본 출원의 IL-10 변이체 분자 또는 그의 융합 단백질은 단리되고 정제된 단백질로서 전달된다. 전달은 피부 및 피하 조직으로 피하 볼루스 주사의 형태 또는 다중 미량주사의 형태일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, IL-10 변이체 분자는 IL-10 변이체, 그의 융합 단백질 또는 키메라 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 벡터로서 전달될 수 있다. 핵산 벡터는 바이러스 벡터를 보유하는 플라스미드 또는 바이러스 입자일 수 있다. 한 실시양태에서, IL-10 변이체 분자는 관련 기술분야의 기술자에게 일반적으로 공지된 유전자 의약 기술에 의해 대상체에게 전달될 수 있다.
다른 실시양태에서, IL-10 변이체 분자는 또한 조합 요법 레지멘의 일부로서 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, IL-10 변이체 분자는 예를 들어 암, IBD, 크론 질환, NAFLD, NASH, 및 자가면역 질환의 치료를 위해 현재 이용되는 면역요법인 이중특이적 T-세포 인게이저 (BITES)와 조합되어 투여될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 핵산 벡터는 표적 세포에서 IL-10 변이체 분자를 코딩하는 서열의 직접적인 발현을 위해 1개 이상의 AAV 역 말단 반복부 (ITR) 서열 요소 및 제어 요소를 갖는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터이며, AAV 벡터는 플라스미드 ("네이키드" DNA)로서 또는 AAV 입자에 포장되어 투여될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 핵산 벡터는 우두 바이러스 벡터이다. 상이한 균주로부터 유래된 다양한 우두 바이러스 벡터, 예컨대 WR 균주 (ATCC VR-119), 와이어쓰(Wyeth) 균주 (ATCC VR-325), 리들-코리오알란토익(Lederle-Chorioallantoic) 균주 (ATCC VR-325), CL 균주 (ATCC VR-117) 등을 사용하여 본 출원의 변이체 IL-10 분자를 도입시킬 수 있으며; 이들 모든 균주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection, 버지니아주 마나사스)으로부터 입수가능하다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 IL-10 변이체 분자는 PEG화 IL-10 변이체 분자를 포함하거나 이로 제한되지 않고, 본원에 기재되거나 또는 관련 기술분야에 일반적으로 공지된 임의의 방법에 의해 대상체에게 전달될 수 있다.
본 출원의 이들 및 다른 실시양태는 본원의 개시내용에 비추어 관련 기술분야의 기술자에게 용이하게 일어날 것이다.
도 1은 단량체 IL-10 분자의 리본 다이어그램 (Josephson et al, Immunity, 15, p. 35-46)을 도시한다. 적색으로 강조한 부분은 부위 I 수용체 접촉 계면을 나타내고, 녹색은 부위 II 수용체 접촉 계면을 나타낸다.
도 2a-2c는 공여자 1에서 IL-10 및 EBV IL-10이 IL-1β (도 2a) 및 TNFα (도 2b) 시토카인 생성을 실험함으로써 단핵구/대식세포 (Mθ)를 활성화시키는 능력 및 IFNγ (도 2c) 생성을 실험함으로써 T-세포 자극을 활성화시키는 능력을 비교한다.
도 3a-3c는 공여자 1에서 IL-10 및 EBV IL-10이 IL-1β (도 3a) 및 TNFα (도 3b) 시토카인 생성을 실험함으로써 단핵구/대식세포 (Mθ)를 활성화시키는 능력 및 IFNγ (도 3c) 생성을 실험함으로써 T-세포 자극을 활성화시키는 능력을 비교한다.
도 4a-b는 IL-10 또는 EBV IL-10에 의한 자극 후에 T 세포로부터 IFNγ 유도의 양을 도시한다.
도 5a-5c는 MC/9 세포 증식 (도 5a), LPS에 대한 반응으로 단핵구/대식세포 (Mθ)에 의한 TNFα 분비 (도 5b), 및 T 세포 수용체 자극에 대한 반응으로 T 세포에 의한 IFNγ 분비 (도 5c)에 대한 N-말단 5 kDa 모노 및 디-PEG화 EBV-IL-10의 효과를 도시한다.
도 6a-6e는 다양한 IL-10 변이체 분자, 및 EBV-IL-10을 포함하는 융합 단백질에 대한 구체적인 아미노산 서열을 도시한다.
도 7은 링커 또는 스페이서에 접합된 IL-10 또는 IL-10 변이체 분자를 포함하는 융합 단백질의 도식 표현을 도시한다 (이 경우에는 scFv). 이 대표적인 예는 N-말단 및 C-말단 둘 다에 대해 접합된 IL-10 또는 IL-10 변이체 분자를 도시한다.
도 8a-8c는 다양한 IL-10 변이체, 예컨대 EBV IL-10에서 제조된 변이체의 도식 표현이다. 도 8a (DV05)는 서열식별번호(SEQ ID No.) 3의 아미노산 위치 31에서 단일 점 돌연변이 (V31L V31L)를 포함하는 IL-10 변이체이다. 도 8b (DV06)는 서열식별번호 3의 아미노산 위치 75에서 단일 점 돌연변이 (A75I A75I)를 포함하는 IL-10 변이체이다. 도 8c (DV07)는 서열식별번호 3의 아미노산 위치 31 및 75에서 2개의 점 돌연변이 (V31L 및 A75I)를 포함하는 IL-10 변이체이다.
도 8d는 야생형 인간 IL-10, EBV-IL-10, DV05, DV06, 및 DV07을 비롯한 IL-10의 다양한 형태에 대한 단핵구/대식세포 반응을 검정한다. IL-10 변이체 (DV05, DV06, DV07)를 비롯한 모든 형태는 LPS에 대한 반응으로 TNFα 분비를 억제한다.
도 8e는 IL-10의 다양한 형태 (야생형 인간 IL-10, EBV IL-10, DV05, DV06 및 DV07)에 대한 T-세포 반응을 검정하며, 모든 형태가 IFN-감마를 유도하지는 않는다.
도 9a-9f는 IL-10 융합 단백질/면역접합체/디아바디 구축물의 다양한 배치의 도식 표현이다. 도 9(a)-(c)는 융합 단백질 복합체 (즉, 디아바디)를 나타내며, 각각의 융합 단백질은 카르복시 말단 링커 또는 아미노 말단 링커를 통해 IL-10의 단량체 (이는 또한 IL-10 변이체 분자로 치환될 수 있음)에 연결된 2가지 상이한 항체로부터 수득된 VH 및 VL 영역을 포함하고, (a) IL-10 수용체 결합에 영향을 미치는 단일 돌연변이 - 예를 들어, 아미노산 위치 31; (b) IL-10 수용체 결합에 영향을 미치는 단일 돌연변이 - 예를 들어 아미노산 위치 75; 및 (c) IL-10 수용체 결합에 영향을 미치는 2개의 돌연변이 - 예를 들어 아미노산 위치 31 및 75를 갖는다. 도 9(d)-(f)는 융합 단백질 복합체 (즉, 미니바디)를 나타내며, 각각의 융합 단백질은 카르복시 말단 링커 또는 아미노 말단 링커를 통해 IL-10의 단량체 (이는 또한 IL-10 변이체 분자로 치환될 수 있음)에 연결된 하나의 항체로부터 수득된 단일 VH 또는 VL 영역을 포함하고, (d) IL-10 수용체 결합에 영향을 미치는 단일 돌연변이 - 예를 들어, 아미노산 위치 31; (e) IL-10 수용체 결합에 영향을 미치는 단일 돌연변이 - 예를 들어 아미노산 위치 75; 및 (f) IL-10 수용체 결합에 영향을 미치는 2개의 돌연변이 - 예를 들어 아미노산 위치 31 및 75를 갖는다.
도 10(a)-10(f)는 IL-10 융합 단백질/면역접합체/디아바디 구축물의 다양한 배치의 도식 표현이다. 도 10(a)-(c)는 단일 융합 단백질 (즉, 미니바디)을 나타내고, IL-10의 단량체 (이는 또한 IL-10 변이체 분자로 치환될 수 있음) 각각은 카르복시 말단 링커 또는 아미노 말단 링커를 통해 동일한 항체로부터의 VH 또는 VL에 연결되고, VH 및 VL은 함께 연결된다. IL-10의 단량체는 (a) IL-10 수용체 결합에 영향을 미치는 단일 돌연변이 - 예를 들어, 아미노산 위치 31; (b) IL-10 수용체 결합에 영향을 미치는 단일 돌연변이 - 예를 들어 아미노산 위치 75; 및 (c) IL-10 수용체 결합에 영향을 미치는 2개의 돌연변이 - 예를 들어 아미노산 위치 31 및 75를 포함한다. 도 10(d)-(f)는 단일 융합 단백질을 나타내고, IL-10의 단량체 (이는 또한 IL-10 변이체 분자로 치환될 수 있음)는 함께 연결되고, 각각의 IL-10의 단량체는 카르복시 말단 링커 또는 아미노 말단 링커를 통해 하나의 항체로부터 수득된 단일 VH 또는 VL 영역에 추가로 연결된다. IL-10 단량체는 (d) IL-10 수용체 결합에 영향을 미치는 단일 돌연변이 - 예를 들어, 아미노산 위치 31; (e) IL-10 수용체 결합에 영향을 미치는 단일 돌연변이 - 예를 들어 아미노산 위치 75; 및 (f) IL-10 수용체 결합에 영향을 미치는 2개의 돌연변이 - 예를 들어, 아미노산 위치 31 및 75를 포함한다.
도 11은 DV07 돌연변이를 포함하는 디아바디를 사용하여 종양 부피의 생체내 감소를 도시한다. 제형 완충제 (1X 인산염 완충된 식염수; "대조군") 및 DV07 디아바디 (성숙한 단백질의 V31L V31L 및 A75I A75I를 갖는 EBV IL-10 변이체, 및 항-CD3α 및 항-EGFR으로부터의 가변 도메인 (이들 VH/VL 쌍은 마우스 표적에 결합하지 않음)을 포함하는 융합 단백질 복합체)의 단일 용량을 3 일째에 투여하였다. DV07 디아바디에 대해 1 mg/kg 및 0.4 mg/kg의 투여 농도를 시험하였다.
도 12는 IL-10의 공개된 변이체 (다이아몬드), 야생형 IL-10 (원) 및 DHivDEbo:DV07로 명명되는 DV07 디아바디의 대안적인 형태 (다이아몬드; V31L 및 A75I 돌연변이를 갖는 EBV IL-10 변이체 및 항-HIV 및 항-에볼라로부터의 가변 도메인 (이들 VH/VL 쌍은 마우스 단백질에 결합하지 않음)을 포함하는 융합 단백질 복합체, 디아바디는 도 9(c)에 개략적으로 나타낸 구조를 가짐)에 대한 시험관내 T-세포 반응을 도시한다.
도 13a는 디아바디 형태에서 V31L 및 A75I 돌연변이를 갖는 다양한 형태의 EBV IL-10 변이체 분자를 이용하여 단핵구/ 대식세포에 대한 LPS 노출에 의해 유도된 TNFα의 억제를 비교한다. "wt"는 인간 IL-10을 나타내고; "EBV"는 EBV IL-10을 나타내고; "DCd3DEgfr:DV05"는 V31L 돌연변이를 포함하는 EBV IL-10 변이체에 연결된 항-CD3 항체 및 항-EGFR 항체로부터의 VH 및 VL 영역을 포함하는 디아바디이고; "DCd3DEgfr:DV07"은 V31L 및 A75I 돌연변이 둘 다를 포함하는 EBV IL-10 변이체에 연결된 항-CD3 항체 및 항-EGFR 항체로부터의 VH 및 VL 영역을 포함하는 디아바디이고; "DHivDEbo:DV07"은 V31L 및 A75I 돌연변이 둘 다를 포함하는 EBV IL-10 변이체에 연결된 항-HIV 항체 및 항-에볼라 항체로부터의 VH 및 VL 영역을 포함하는 디아바디이다.
도 13b는 V31L 및 A75I 돌연변이를 갖는 EBV IL-10 변이체 분자 및 상이한 항체로부터의 VH 및 VL 영역을 포함하는 다양한 디아바디 형태에 대해 인간 IL-10 ("wt") EBV IL-10 ("EBV")을 이용하여 반응 검정에서 T-세포의 IFNγ 분비를 비교한다. 형태 DHivDEgfr:DV07은 항-HIV 및 항-EGFR로부터의 가변 영역을 포함하는 V31L 및 A75I 치환을 갖는 EBV IL-10 변이체 디아바디이다. 형태 DHivDEbo:DV07은 항-HIV 및 항-에볼라로부터의 가변 영역을 포함하는 V31L 및 A75I 돌연변이 둘 다를 갖는 EBV IL-10 변이체 디아바디이다.
도 14a-14b는 2가지 공여자로부터 단리된 단핵구/대식세포 (도 14a) 및 T-세포 (도 14b)에 대한 2가지 형태의 EBV IL-10 변이체 디아바디, DH:DV07 및 DHDE:DV07을 비교한다. 형태 DHDV07은 항-HIV 및 항-EGFR로부터의 가변 영역을 포함하고 V31L 및 A75I 치환을 갖는 EBV IL-10 변이체 디아바디이다. 형태 DHDE:DV07은 항-HIV 및 항-에볼라로부터의 가변 영역을 포함하고 V31L 및 A75I 치환을 갖는 EBV IL-10 변이체 디아바디이다. 도 14a는 인간 IL-10 ("wt"), DH:DV07 및 DHDE:DV07을 이용하여 단리된 단핵구/대식세포에서 LPS에 의해 유도된 TNFα의 억제를 비교한다. 도 14b는 인간 IL-10 ("wt"), EBV IL-10, DH:DV07 및 DHDE:DV07에 대한 반응으로 단리된 T-세포에서 IFNγ의 분비를 비교한다.
도 15는 MC/9 비만 세포에 대한 다양한 형태의 EBV-10 변이체 디아바디 형태의 직접적인 비교이다. 이 검정은 인간 IL-10, EBV IL-10, D:DV05 (항-CD3α 및 항-EGFR로부터의 가변 영역을 포함하고 V31L 돌연변이를 가진 EBV IL-10), D:DV06 (항-CD3α 및 항-EGFR로부터의 가변 영역을 포함하고 A75I 돌연변이를 가진 EBV IL-10), D:DV07 (항-CD3α 및 항-EGFR로부터의 가변 영역을 포함하고 V31L 및 A75I 돌연변이를 가짐), 및 DhivDEbo:DV07 (항-HIV 및 항-에볼라로부터의 가변 영역을 포함하고 V31L 및 A75I 치환을 가진 EBV IL-10 변이체 디아바디)을 비교한다.
도 16a-16c는 D:DV07 (항-CD3α 및 항-EGFR로부터의 가변 영역을 포함하는 V31L 및 A75I 돌연변이를 가짐)을 이용하는 생체내 종양 연구로부터의 결과이다. 생체내 종양 부피는 투여 제형 완충제 ("대조군"), 0.4 mg/kg 주 3회 (q3w), 0.2 mg/kg 주 3회 (q3w), 0.2 mg/kg 2 일 중단 (qd), 0.1 mg/kg 2 일 중단 (qd)의 투여 후에 평가하였다.
도 17a-17b는 각각 도 9c 및 9f의 개략적인 다이어그램에 상응하는 2가지 IL-10 변이체 융합 단백질 포맷, 고분자량 (대형) 및 소분자량 (소형)의 생체내 연구로부터의 결과이다. IL-10 변이체는 V31L 및 A75I 돌연변이를 포함한다. 이들 결과는 종양 크기를 감소시키기 위해 표적화 능력이 없는 IL-10 융합 단백질의 영향을 시험하였다. 융합 단백질로부터의 VH 및 VL 영역은 항-HIV 및 항-에볼라 (대형) 또는 항-에볼라 (소형)로부터의 비표적화 서열이다. 도 17a는 PEG화 IL-10 (0.75 mg/kg 매일)과 비교하여 5 일 투여하고 2 일 중단하는 비표적화 소형 포맷의 투여 연구이다. 도 17b는 PEG화 재조합 인간 IL-10 (0.75 mg/kg 매일)과 비교하여 주 3회 투여하는 비표적화 소형 (1 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.25 mg/kg) 및 대형 (0.2 mg/kg) 포맷의 투여 연구이다.
도 18a-18c는 각각 도 9c 및 9f의 개략적 다이어그램에 상응하는 대형 및 소형의 2가지 IL-10 변이체 융합 단백질 포맷의 생체내 연구로부터의 결과이다. 이들 결과는 종양 크기를 감소시키기 위해 표적화 능력을 갖는 IL-10 융합 단백질의 결과를 시험하였다. IL-10 변이체는 V31L 및 A75I 돌연변이를 포함한다. 대형 포맷에서, 융합 단백질로부터 VH 및 VL 영역의 한 집합은 항-EGFR 항체로부터의 것인 반면에, VH 및 VL의 다른 집합은 항-에볼라 항체로부터의 것이다. 소형 포맷은 항-EGFR 항체로부터의 VH 및 VL만을 포함한다. 도 18a는 PEG화 재조합 인간 IL-10 (0.75 mg/kg)과 비교하여 표적화된 IL-10 융합 단백질, 대형 포맷 (0.25 mg/kg), 소형 포맷 (0.25 mg/kg), 및 비표적화 IL-10 융합 단백질 소형 포맷 (0.25 mg/kg)의 매일 투여 연구로부터의 결과이다. 도 18b는 대형 포맷 비표적화 IL-10 융합 단백질 (0.2 mg/kg의 DhDe:DV07) 및 PEG화 IL-10 (0.75 mg/kg 매일)과 비교하여 대형 포맷 표적화된 IL-10 융합 단백질 (1 mg/kg, 0.25 mg/kg, 및 0.25 mg/kg 매일)의 주 3회 투여 연구로부터의 결과이다. 도 18c는 소형 포맷 비표적화 IL-10 융합 단백질 (1 mg/kg의 Debo:DV07) 및 PEG화 IL-10 (0.75 mg/kg 매일)과 비교하여 소형 포맷 표적화된 IL-10 융합 단백질 (1 mg/kg, 0.25 mg/kg)의 주 3회 투여 연구로부터의 결과이다.
도 19a-19b는 항-CD3α 및 항-EGFR로부터의 가변 영역을 포함하고 V31L 돌연변이를 갖는 EBV IL-10 변이체를 가진 디아바디를 사용하는 생체내 콜레스테롤 연구로부터의 결과이다.
도 20a-20b는 대식세포 및 T-세포에서 2가지 IL-10 변이체 융합 단백질에 대한 시험관내 비교 연구로부터의 결과이다. 검정은 인간 IL-10과 비교하여 DV06 융합 단백질의 2가지 형태의 시험관내 유효성을 실험한다. 도 20a는 DhivDebo:DV06 (서열식별번호: 26 및 27) 및 DmadcamDEbo:DV06 (서열식별번호: 41 및 42)을 사용하는 단핵구/대식세포 검정이다. 도 20b는 DhivDebo:DV06 (서열식별번호: 26 및 27) 및 DmadcamDEbo:DV06 (서열식별번호: 41 및 42)을 이용하여 IFN-감마에 의해 측정된 T-세포 반응 검정이다.
도 21a-21d는 EBV IL-10 아미노산 서열이다. 도 21a는 EBV IL-10이다. 도 21b는 V31L 치환을 포함하는 DV05이다. 도 21c는 A75I 치환을 포함하는 DV06이다. 도 21d는 V31L 및 A75I 치환 둘 다를 포함하는 DV07이다.
다양한 실시양태 적용을 상세하게 기재하기 전에, 본 출원이 물론 달라질 수 있는 특정한 제형 또는 공정 파라미터로 제한되지 않음을 이해해야 한다. 본원에서 사용된 용어는 단지 다양한 실시양태를 설명하기 위한 목적이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본원에 기재된 것과 유사하거나 또는 동등한 수많은 방법 및 물질이 다양한 기재된 실시양태의 실시에 사용될 수 있지만, 바람직한 물질 및 방법이 본원에서 기재된다.
달리 나타내지 않는다면, 본원에 기재된 실시양태는 관련 기술분야의 기술자에게 널리 공지된 분자 생물학, 생화학, 약리학, 화학 및 면역학의 통상적인 방법 및 기술을 이용한다. IL-10의 인간, CMV 및/또는 EBV 형태를 비롯하여 이로 제한되지 않는 IL-10 변이체를 설계하고 제작하기 위한 여러 일반적인 기술, 뿐만 아니라 IL-10 변이체를 시험하기 위한 검정은 관련 기술분야에서 용이하게 입수가능하고 상세하게 설명된 널리 공지된 방법이다. 예를 들어, [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications); A. L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition)]을 참고한다. N-말단 알데히드 기반 PEG화 화학 또한 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
하기 용어를 사용하여 본원에서 논의된 다양한 실시양태를 기재할 것이고, 하기 나타낸 바와 같이 정의되는 것으로 의도된다.
다양한 실시양태를 기재하기 위해 본원에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 내용상 명백히 달리 지시되지 않는다면 복수 형태를 포함한다.
용어 "약"은 지정된 숫자 또는 숫자 범위로부터 0.0001-5%의 편차를 나타낸다. 한 실시양태에서, 용어 "약"은 지정된 숫자 또는 숫자 범위로부터 1-10%의 편차를 나타낸다. 한 실시양태에서, 용어 "약"은 지정된 숫자 또는 숫자 범위로부터 25% 이하의 편차를 나타낸다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 용어 "약"은 야생형 서열과 비교할 때 뉴클레오티드 서열 상동성 또는 아미노산 서열 상동성의 측면에서 1-25%의 차이를 지칭한다.
용어 "인터류킨-10" 또는 "IL-10"은 동종이량체를 형성하기 위해 비공유적으로 연결된 2개의 서브유닛을 포함하는 단백질을 지칭하며, IL-10은 2개의 6개 나선 번들 (나선 A-F)의 삽입된 이량체이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 달리 나타내지 않는다면 "인터류킨-10" 및 "IL-10"은 인간 IL-10 ("hIL-10"; 진뱅크 수탁 번호 NP_000563; 또는 미국 특허 번호 6,217,857) 단백질 (서열식별번호: 1) 또는 핵산 (서열식별번호: 2); 마우스 IL-10 ("mIL-10"; 진뱅크 수탁 번호: M37897; 또는 미국 특허 번호 6,217,857) 단백질 (서열식별번호: 7) 또는 핵산 (서열식별번호: 8); 또는 바이러스 IL-10 ("vIL-10")을 나타낼 수 있다. 바이러스 IL-10 상동체는 EBV 또는 CMV (각각 진뱅크 수탁 번호 NC_007605 및 DQ367962)로부터 유래될 수 있다. 용어 EBV-IL10은 IL-10 단백질 (서열식별번호: 3) 또는 핵산 (서열식별번호: 4)의 EBV 상동체를 지칭한다. 용어 CMV-IL10은 IL-10 단백질 (서열식별번호: 5) 또는 핵산 (서열식별번호: 6)의 CMV 상동체를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 단량체 IL-10은 비공유적으로 연결될 때 IL-10 또는 변이체 IL-10의 동종이량체를 형성하는 IL-10 또는 변이체 IL-10의 개별 서브유닛을 지칭한다. 용어 "야생형", "wt" 및 "본래의"는 해당하는 특이적인 IL-10의 기원의 종에서 천연적으로 흔히 발견되는 단백질 (예를 들어 IL-10, CMV-IL10 또는 EBV-IL10)의 서열을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 따라서, 예를 들어 용어 "야생형" 또는 "본래의" EBV-IL10은 천연에서 가장 흔히 발견되는 아미노산 서열에 상응할 것이다.
용어 "유래한다", "유래된다", "로부터 유래한다" 또는 "로부터 유래된다"는 IL-10 분자의 바이러스 형태와 같은 분자의 원래의 공급원을 확인하기 위해 본원에서 사용되지만, 상기 분자가 제조되거나, 제작되거나, 조립되거나 또는 만들어지는 방법을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 여기에는 비제한적으로 화학적 또는 재조합 수단과 같은 방법이 포함될 것이다.
용어 "유도체"는 기준 분자 또는 변이체의 원하는 생물학적 활성 (예를 들어, 항염증 및/또는 T 세포 자극 없음)이 유지되는 한, 관심 기준 분자 또는 그의 유사체의 임의의 적합한 변형, 예컨대 황산화, 아세틸화, 글리코실화, 인산화, 중합체 접합 (예컨대 폴리에틸렌 글리콜과), HES화, 또는 외래 모이어티의 다른 부가를 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "변이체", "유사체" 및 "뮤테인"은 원하는 활성, 예를 들어 항염증 활성을 유지하는 기준 분자의 생물학적으로 활성인 유도체를 지칭한다. 일반적으로, 용어 "변이체", "변이체", "유사체" 및 "뮤테인"이 폴리펩티드와 관련이 있는 경우, 이는 본래의 분자에 비해 1개 이상의 아미노산 부가, 치환 (본질적으로 보존적임) 및/또는 결실을 갖는 본래의 폴리펩티드 서열 및 구조를 가진 화합물 또는 화합물들을 지칭한다. 따라서, 용어 "IL-10 변이체", "변이체 IL-10", "IL-10 변이체 분자", 및 그의 문법적 변형어 및 복수 형태는 모두 서열 동일성 또는 상동성이 야생형 IL-10과 1-25% 차이나는 IL-10 아미노산 (또는 핵산) 서열을 지칭하는 등가의 용어인 것으로 의도된다. 따라서, 예를 들어, EBV IL-10 변이체 분자는 1개 이상의 아미노산 (또는 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열) 부가, 치환 및/또는 결실을 가짐으로써 야생형 EBV IL-10과 상이한 것이다. 따라서, 한 형태에서, EBV IL-10 변이체는 약 1-42개 아미노산 차이에 해당하는 서열 상동성에서의 약 1% 내지 25% 차이를 가짐으로써 서열식별번호:3의 야생형 서열과 상이한 것이다.
용어 "융합 단백질"은 천연에서 일반적으로 존재하지 않는 단백질의 신규한 배열을 생성하는 2가지 이상의 단백질 또는 폴리펩티드의 조합 또는 접합을 지칭한다. 융합 단백질은 2가지 이상의 단백질 또는 폴리펩티드의 공유적인 연결의 결과이다. 융합 단백질을 구성하는 2가지 이상의 단백질은 아미노-말단에서부터 카르복시-말단까지 임의의 배치로 배열될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 한 단백질의 카르복시-말단은 또 다른 단백질의 카르복시 말단 또는 아미노 말단에 공유적으로 연결될 수 있다. 예시적인 융합 단백질은 단량체 IL-10 또는 단량체 변이체 IL-10 분자와 1개 이상의 항체 가변 도메인의 조합을 포함할 수 있다. 융합 단백질은 또한 이량체를 형성하거나 또는 동일한 유형의 다른 융합 단백질과 조합되어, 융합 단백질 복합체를 생성할 수 있다. 융합 단백질의 복합체화는 일부 경우에 복합체화되지 않은 융합 단백질과 비교할 때 융합 단백질의 기능성을 활성화시키거나 또는 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 1개 이상의 항체 가변 도메인을 갖는 단량체 IL-10 또는 단량체 변이체 IL-10 분자는 IL-10 수용체와 결합하는데 있어서 제한된 또는 감소된 능력을 가질 수 있지만; 융합 단백질이 복합체화될 때, IL-10 또는 변이체 IL-10 분자의 단량체 형태는 동종이량체가 되고, 가변 도메인은 기능적 디아바디와 회합한다.
"기능적 변이체"는 기준 분자의 생물학적 활성을 파괴하지 않는 변형 (예를 들어, 부가, 치환 및/또는 결실)을 포함하는 IL-10 변이체 분자이다. 이들 변이체는 하기 정의된 바와 같이 기준 분자와 "상동성"일 수 있다. 일반적으로, 2개의 서열을 정렬하였을 때, 이러한 유사체의 아미노산 서열은 기준 서열과 높은 정도의 서열 상동성, 예를 들어 50% 초과, 일반적으로 60%-70% 초과, 훨씬 더 특히 80%-85% 또는 그 초과, 예컨대 적어도 90%-95% 또는 그 초과의 아미노산 서열 상동성을 가질 것이다. 종종, 유사체는 동일한 개수의 아미노산을 포함할 것이지만, 치환을 포함할 것이다. 기능적 변이체는 본래의 분자에 비해 증강된, 감소된 또는 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 유지할 것이다. 구체적으로, 용어 "변이체" IL-10 분자는 용어 "조작된" IL-10 분자 또는 IL-10 변이체 분자 또는 IL-10 변이체와 상호교환적이며, IL-10 수용체 결합 도메인(들), 및/또는 IL-10 분자 또는 단백질에서 도메인간 각도 또는 동종이량체간 각도의 형성을 담당하는 영역 중 하나 또는 둘 다에 변형을 포함하는 IL-10 분자 또는 단백질을 지칭한다. 변이체 IL-10 "융합 단백질" 또는 "디아바디" 또는 "융합"은 일반적으로 변이체 IL-10 (단량체 형태 또는 동종이량체 형태) 및 적어도 하나의 다른 단백질을 포함하는 융합 단백질 (또는 융합 단백질 복합체)의 형성을 지칭한다. 본원에 기재된 바와 같이, 변이체 IL-10 "또는 그의 융합 단백질"은 본 명세서에 걸쳐 이러한 변이체 IL-10 융합 단백질을 기재하기 위해 사용될 수 있다.
"유사체" 또는 "유사체들"은 본질적으로 보존적인 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 보존적 치환은 비제한적으로 (1) 아스파르테이트 및 글루타메이트 사이의 산성 치환; (2) 리신, 아르기닌 또는 히스티딘 중 어느 하나 사이의 염기성 치환; (3) 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 또는 트립토판 중 어느 하나 사이의 비극성 치환; 및 (4) 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린 트레오닌, 또는 티로신 중 어느 하나 사이의 비하전 극성 치환과 같은 유형의 치환을 포함할 수 있다. 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 때때로 방향족 아미노산으로 분류된다. 또한, 원하는 및 특이적인 생물학적 활성이 손상되지 않는 한, 류신에서 이소류신 또는 발린으로, 아스파르테이트에서 글루타메이트로, 트레오닌에서 세린으로의 단리된 대체, 또는 아미노산에서 구조적으로 관련된 아미노산으로의 유사한 보존적 대체가 이루어질 수 있다. 예를 들어, 분자의 원하는 기능이 손상되지 않고 유지되는 한, 관심 폴리펩티드는 최대 약 1-10개의 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 또는 심지어 최대 약 15-25개의 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 또는 1-50 사이의 임의의 정수를 포함할 수 있다. 관련 기술분야의 기술자는 관련 기술분야에 널리 공지된 변화를 용인할 수 있는 관심 분자의 영역을 용이하게 결정할 수 있다.
"뮤테인"은 아미노 및/또는 이미노 분자만을 포함하는 화합물, 아미노산의 하나 이상의 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등)를 함유하는 폴리펩티드, 치환된 연결을 갖는 폴리펩티드, 뿐만 아니라 관련 기술분야에 공지된 다른 변형, 천연 발생 및 비-천연 발생 (예를 들어, 합성) 둘 다, 환형화된, 분지화된 분자 등을 비롯하여 이로 제한되지 않는 1개 이상의 아미노산-유사 분자를 갖는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 유사체 또는 뮤테인은 본래의 분자에 비해 증강되거나, 감소되거나 또는 실질적으로 동일한 일부 생물학적 활성을 유지할 것이다. 폴리펩티드 유사체 및 뮤테인의 제조 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
용어 "상동체", "상동성", "상동성인" 또는 "실질적으로 상동성인"은 적어도 2개의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 적어도 2개의 폴리펩티드 서열 사이의 % 동일성을 지칭한다. 서열이 정의된 길이의 분자에 걸쳐 적어도 약 50%, 바람직하게는 적어도 약 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 80%-85%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 및 가장 바람직하게는 적어도 약 95%-98% 서열 동일성을 나타낼 때, 서열은 서로 상동성이다.
용어 "서열 동일성"은 정확한 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 또는 아미노산-대-아미노산 대응을 지칭한다. 서열 동일성은 100% 서열 동일성 내지 50% 서열 동일성의 범위일 수 있다. % 서열 동일성은 서열을 정렬시키고, 정렬된 두 서열 사이의 정확한 매칭 개수를 카운팅하고, 기준 서열의 길이로 나누고, 결과에 100을 곱함으로써 두 분자 (기준 서열 및 기준 서열에 대한 % 동일성이 공지되지 않은 서열) 사이의 서열 정보의 직접적인 비교를 비롯하여 이로 제한되지 않는 다양한 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 용이하게 이용가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 % 동일성을 확인하는데 도움이 될 수 있다.
용어 "단편"은 전장 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열 및/또는 구조의 일부 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 폴리펩티드의 단편은 예를 들어 본래의 폴리펩티드의 C-말단 결실, N-말단 결실 및/또는 내부 결실을 포함할 수 있다. 특정 단백질의 활성 또는 기능적 단편은 일반적으로 전장 분자의 적어도 약 5-10개 연속 아미노산 잔기, 바람직하게는 전장 분자의 적어도 약 15-25개 연속 아미노산 잔기, 및 가장 바람직하게는 전장 분자의 적어도 약 20-50개 또는 그 초과의 연속 아미노산 잔기, 또는 5개 아미노산과 전장 서열 사이의 임의의 정수를 포함할 것이며, 단, 해당 단편은 생물학적 활성, 예컨대 항염증 활성을 유지한다. 항체와 관련이 있는 경우, 항체 단편은 온전한 항체의 항원 결합 부위 또는 가변 영역 (중쇄 및/또는 경쇄 영역)을 포함하는 온전한 항체의 일부분을 지칭한다. 이들에는 예를 들어 Fab, Fab', Fab'-SH, (Fab')2, Fv 단편, 디아바디, 단일 쇄 Fv (ScFv), 1개의 경쇄 가변 도메인을 갖는 단일 쇄 폴리펩티드, 경쇄 가변 도메인 또는 중쇄 가변 도메인의 3개의 CDR을 갖는 단편이 포함될 수 있다.
용어 "실질적으로 정제된"은 일반적으로 물질이 그가 존재하는 샘플의 대부분의 퍼센트를 차지하도록 물질을 단리하는 것을 지칭한다. 실질적으로 정제된 성분은 샘플의 50%, 바람직하게는 80%-85%, 더욱 바람직하게는 90-95%를 차지한다. 마찬가지로 용어 "단리된"이 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 관련하여 지칭될 때, 이는 지정된 분자가 천연에서 발견되거나 또는 동일한 유형의 다른 생물학적 거대 분자의 실질적인 부재하에 존재하는 전체 유기체로부터 분자가 분리되고 구별된 것을 의미한다.
용어 "대상체", "개체" 또는 "환자"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 척추동물, 바람직하게는 포유동물을 지칭한다. 포유동물에는 뮤린, 설치류, 유인원, 인간, 농장 동물, 스포츠 동물, 및 특정 애완 동물이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
용어 "투여하는"은 본 출원의 활성 성분이 그의 의도된 기능을 수행하도록 하는 투여 경로를 포함한다.
예를 들어 본원에 기재된 EBV-IL-10 변이체 또는 그의 융합 단백질의 투여와 관련하여 "치료 유효량"은 특정한 생물학적 활성을 촉진시키는데 충분한 양의 EBV-IL-10 변이체 또는 그의 융합 단백질을 지칭한다. 이들에는 예를 들어 골수 세포 기능의 억제, 증강된 쿠퍼 세포 활성, 및/또는 CD8+ T 세포에 대한 임의의 효과의 결여, 또는 증강된 CD8+ T-세포 활성, 뿐만 아니라 Fc 수용체의 비만 세포 상향조절의 차단, 또는 탈과립화의 예방이 포함될 수 있다. 따라서, "유효량"은 의학적 상태의 증상 또는 징후를 개선시키거나 또는 예방할 것이다. 유효량은 또한 진단을 가능하게 하거나 또는 용이하게 하는데 충분한 양을 의미한다.
용어 "치료하다" 또는 "치료"는 질환 또는 상태의 효과를 감소시키는 방법을 지칭한다. 치료는 또한 단지 증상이 아니라 질환 또는 상태 자체의 근본적인 원인을 감소시키는 방법을 지칭할 수 있다. 치료는 본래의 수준으로부터 임의의 감소일 수 있고, 질환, 상태, 또는 질환 또는 상태의 증상의 완전한 제거일 수 있지만 이로 제한되지 않는다.
"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학 물질이다. 화학요법제의 예에는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시클로스포스파미드 (시톡산(CYTOXAN)™); 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 에틸엔이민 및 메틸아멜라민, 예컨대 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스파오라미드 및 트리메틸올멜라밈 질소 머스타드, 예컨대 키오람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 펜에스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예컨대 아클라시노미신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아미신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스탄올, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK®; 라족산; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토프로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 (Ara-C); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 (탁솔(TAXOL)® 브리스톨-마이어스 스큅 온콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology), 뉴저지주 프린스톤) 및 독세탁셀 (탁소테레(Taxotere) ™, 롱-프랑 로리(Rhone-Poulenc Rorer), 프랑스 앙토니); 클로람부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토미신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 크셀로다(Xeloda)® 로슈(Roche), 스위스; 이반드로네이트; CPT11; 토모아이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노산; 에스페라미신; 카페시타빈; 및 임의의 상기 예의 제약상 허용가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다. 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하도록 작용하는 항호르몬제, 예컨대 항에스트로겐, 예를 들어 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜 (파레스톤(Fareston)); 및 항안드로겐, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드, 및 고세렐린; 및 임의의 상기 예의 제약상 허용가능한 염, 산 또는 유도체 또한 이 정의에 포함된다.
본 출원에서 사용된 바와 같이 용어 "접합체", "접합된", "접합" 또는 "접합하는"은 분자의 둘 이상의 부분을 함께 연결하는 것을 지칭한다. 연결은 공유 결합 (예컨대 펩티드 결합)에 의해 발생한다.
IL-10 변이체 단백질
본 출원의 IL-10 변이체 분자는 임의의 형태의 IL-10에 대한 변형을 포함한다. IL-10 분자에 대한 이들 변형에는 IL-10 수용체 결합에 관여하는 영역 및/또는 도메인, 및/또는 IL-10 분자에서 도메인간 또는 동종이량체간 각도를 부여하는데 수반되는 것들에서 1개 이상의 아미노산의 부가, 결실 및/또는 치환이 포함된다. 본 출원의 변이체 IL-10 분자를 구축하는데 사용될 수 있는 예시적인 IL-10 서열에는 엡스타인-바르 바이러스로부터 ("EBV"; 예를 들어, [Moore et al., Science (1990) 248:1230-1234; Hsu et al., Science (1990) 250:830-832; Suzuki et al., J. Exp. Med. (1995) 182:477-486] 참고), 시토메갈로바이러스 ("CMV"; 예를 들어, [Lockridge et al., Virol. (2000) 268:272-280; Kotenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97:1695-1700] 참고), 및 말 헤르페스바이러스 (예를 들어, [Rode et al., Virus Genes (1993) 7:111-116] 참고), OrF 바이러스 (예를 들어, [Imlach et al., J. Gen. Virol. (2002) 83:1049-1058 및 Fleming et al., Virus Genes (2000) 21:85-95] 참고)로부터의 상동체가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 다른 대표적인 IL-10 서열에는 NCBI 수탁 번호 NM010548, AF307012, M37897, M84340 (마우스 서열); U38200 (말); U39569, AF060520 (고양이 서열); U00799 (소); U11421, Z29362 (양 서열); L26031, L26029 (마카크 서열); AF294758 (원숭이); U33843 (개); AF088887, AF068058 (토끼 서열); AF012909, AF120030 (우드척 서열); AF026277 (포섬); AF097510 (기니 피그); U11767 (사슴); L37781 (게르빌); AB107649 (라마 및 낙타)에 기재된 서열이 포함된다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 IL-10 변이체 분자는 인간 (서열식별번호:1), CMV (서열식별번호: 5), EBV (서열식별번호:3) IL-10 서열, 또는 마우스 (서열식별번호: 7)의 야생형 단백질을 변형시킴으로써 수득된다. 다양한 IL-10 변이체 분자의 대표적인 예는 서열식별번호 9-23에 제공된다.
야생형 IL-10에 비한 변형은 (i) IL-10 수용체 결합 및/또는 (ii) IL-10 분자의 도메인간 또는 동종이량체간 각도의 형성을 담당하는 영역에서 1개 이상의 아미노산의 부가, 결실 및/또는 치환을 포함한다.
변이체 IL-10 분자: IL-10 수용체 결합 영역
수용체 결합을 담당하는 영역은 IL-10과 IL-10 수용체 1 (IL10R1) 및/또는 IL-10 수용체 2 (IL10R2)의 결합에 직접적으로 수반되거나 또는 그를 담당하는 영역 내에 위치하는 임의의 아미노산 부분을 포함한다. 이들 영역은 예를 들어 관련 기술분야에서 이전에 논의되고 맵핑된 IL-10 분자의 불연속 부분을 포함할 수 있다 (예를 들어, [Yoon 2005; Josephson 2001] 참고). 예를 들어, IL-10 수용체에 결합하는 IL-10과 연관된 접점 및 틈의 형성을 담당하는 임의의 영역, 예컨대 비제한적으로 나선 A, 나선 F 및 AB 루프에 대한 변형이 본 출원에서 구상된다. 바람직한 실시양태에서, 수용체 결합 도메인에 대한 변형 (예를 들어, 부가, 결실 및/또는 치환)에는 서열식별번호 3의 아미노산 31 및/또는 75가 포함된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 변형에는 서열식별번호 3에서 위치 31의 발린에서 류신으로의 치환 (V31L, 본원에서 "DV05"로 명명됨), 서열식별번호 3에서 위치 75의 알라닌의 이소류신으로의 치환 (A75I, 본원에서 "DV06"으로 명명됨), 또는 서열식별번호 3에서 V31L 및 A75I 치환 둘 다 (본원에서 "DV07"로 명명됨)가 포함된다. 한 측면에서, DV05는 서열식별번호: 55이고, DV06은 서열식별번호: 57이고, DV07은 서열식별번호: 59이다.
한 실시양태에서, 수용체 결합 도메인에 대한 변형은 [Josephson et al (Immunity, 2001, 15, p. 35-46, Figure 1)]에 의해 논의된 부위 Ia 및/또는 부위 Ib 계면 접점 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 본 출원의 한 실시양태에서, 부위 Ia 계면 접점은 나선 F의 굴곡부에 및 AB 루프에 위치한 1개 이상의 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 부위 Ib 계면 접점은 나선 A의 N-말단 및 나선 F의 C-말단에 위치한 1개 이상의 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 수용체 결합을 담당하는 IL-10에 위치한 임의의 1개 이상의 아미노산은 나선 A 내의 1-10개의 아미노산 및 AB 루프 내의 1-7개의 아미노산 중 임의의 하나 이상을 포함할 것이다. 또 다른 실시양태에서, 수용체 결합 영역은 하기 아미노산 또는 그의 주변에 집중된 1-10개의 아미노산의 하나 이상의 변형을 포함할 수 있고, 아미노산은 Glu-142, Lys-138, Asp-144, Gln-38, Ser-141, Asp-44, Gln-42, Gln-38, Arg-27, Glu-151, Arg-24, Pro-20, Ile-158, 또는 이들의 임의의 조합물이다.
한 측면에서, 수용체 결합 도메인에 대한 변형은 [Josephson et al (Immunity, 2001, 15, p. 35-46, Figure 1)]에 의해 논의된 부위 IIa 및/또는 부위 IIb 계면 접점 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 본 출원의 한 실시양태에서, 부위 IIa 계면 접점은 DE 루프에 위치하는 1개 이상의 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 수용체 결합 영역은 하기 아미노산 또는 그의 주변에 집중된 1-10개의 아미노산의 하나 이상의 변형을 포함할 수 있고, 아미노산은 Ser-11, Thr-13, Asn-18, Arg-104, Arg-107, 또는 이들의 임의의 조합물이다. 한 실시양태에서, 변이체 IL-10 분자는 수용체 결합 도메인에 영향을 미치는 1-100개의 (또는 그 안의 임의의 정수) 아미노산 부가, 결실 및/또는 치환을 포함할 것이며, 이러한 부가, 결실 및/또는 치환은 IL-10 수용체에 대한 변이체 IL-10 분자의 결합 친화도를 증가시키거나 또는 감소시킨다.
변이체 IL-10 분자: 도메인간 각도 변형
IL-10 분자의 도메인간 (또는 동종이량체간, 이는 상호교환적으로 사용됨) 각도의 형성을 담당하는 영역은 IL-10 동종이량체의 특이적인 도메인간 각도의 형성에 직접적으로 수반되거나 또는 그를 담당하는 영역 내에 위치하는 임의의 아미노산 부분을 포함한다. IL-10의 두 단량체 단위가 역평행 방식으로 얽힐 때, 야생형 IL-10은 "L-형태" 이량체를 형성한다. 인간 IL-10 및 EBV-IL10에 대해 생성된 도메인간 각도는 각각 대략 89 및 97도로 보고되었다. IL-10 수용체의 신호 전달을 조정하기 위해, 한 실시양태에서, 본 출원은 도메인간 각도의 형성을 담당하는 각각의 단량체에서 L-형태 이량체의 형성을 담당하는 나선 D 또는 나선 E의 부분인 DE 루프 내의 아미노산을 변형시키고자 한다. 또 다른 실시양태에서, 도메인간 각도를 담당하는 영역은 IL-10 단백질의 나선 D 및 나선 E 사이에 위치하는 약 12개의 아미노산 링커 영역을 포함한다. 부가, 결실 또는 치환에 의한 변형은 인간 IL-10 또는 EBV-IL10과 비교하여 제한된 또는 이완된 IL-10 도메인간 각도를 생성한다. 단량체 IL-10 분자가 변형되어, 동종이량체화될 때 제한된/팽팽한/폐쇄된 또는 이완된/느슨한/개방된 IL-10 도메인간 각도를 생성하면, 변형된 IL-10 분자는 그의 동족 수용체 (IL-10 수용체)와 결속하여 그를 조절하는 변경된 도메인간 각도를 갖는 변이체 IL-10 분자를 생성할 것이다. 또 다른 실시양태에서, 치환은 EBV-IL10의 D 나선 및 E 나선 사이에 및/또는 C 나선 및 D 나선 사이에 위치하는 아미노산 절편 내에 프롤린을 도입하는 것을 포함한다.
따라서, 한 실시양태에서, 변이체 IL-10 분자는 야생형 IL-10과 비교할 때 변경된 분자간 각도 또는 변경된 도메인간 각도를 나타내는 1개 이상의 부가, 결실 및/또는 치환을 포함할 것이다. 변경된 분자간 각도 또는 변경된 도메인간 각도는 동일한 또는 상이한 변이체 IL-10 분자와 이량체화하여, 야생형 IL-10 분자와 비교할 때 상이한 결속 각도로 IL-10 수용체와 결속하는 변이체 IL-10 분자를 생성할 수 있다. 변이체 IL-10 분자의 상이한 결속 각도는 염증 및/또는 면역 반응을 활성화시키거나 또는 억제하기 위해 IL-10 수용체의 신호 전달을 조절하거나 또는 "조정"하는 능력을 생성한다. 바람직한 실시양태에서, 변이체 IL-10 분자는 EBV-IL10이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 변이체 IL-10 분자는 변형을 위한 기반으로서 EBV-IL10 분자를 사용한다. 또 다른 실시양태에서, 변이체 IL-10 분자는 다른 IL-10 분자 (예컨대 비제한적으로 인간 IL-10, 마우스 IL-10, 및/또는 CMV-IL10)로부터의 부분 및 도메인을 취하는 혼성체 분자이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 변이체 IL-10 분자는 염증 세포 (골수 계통 세포) 반응을 억제하고, 림프구 세포, 예컨대 T-세포의 활성화를 유도하지 않는 이완된 도메인간 각도를 생성한다. 수용체 결합 도메인에 대한 변형, 바람직하게는 저하된 또는 변하지 않은 수용체 친화도를 생성하는 변형과 커플링될 때, 이완된 도메인간 각도를 갖는 변이체 IL-10 분자는 염증전 자극에 대한 반응으로 골수 세포 (단핵구, 대식세포, 호중구, 과립구, 비만 세포, 쿠퍼 세포) 시토카인 분비를 억제하는데 효과적일 것이다. 변이체 IL-10 분자의 이러한 배치는 예를 들어 염증 질환, 예컨대 비제한적으로 IBD, 크론 질환, 건선, 류마티스성 관절염, NAFLD, 및 NASH를 치료하는데 유용하다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 변이체 IL-10 분자는 면역 세포, 예컨대 T-세포의 활성화를 증강시키는 제한된 도메인간 각도를 생성한다. 수용체 결합 도메인에 대한 변형, 바람직하게는 더 높은 수용체 친화도를 생성하는 변형과 커플링될 때, 제한된 도메인간 각도를 갖는 변이체 IL-10 분자는 예를 들어 CD8+ T-세포, NK 세포 및 쿠퍼 세포 스케빈징을 증강시키는데 효과적일 것이다. 변이체 IL-10 분자의 이러한 배치는 예를 들어 전이성 암을 비롯하여 다양한 고형 및 혈액 암을 치료하는데 유용하다.
도메인간 각도의 형성을 담당하는 영역은 IL-10 분자 내에 위치하는 연속 또는 불연속 부분일 수 있다. 한 실시양태에서, IL-10 변이체 분자에 대한 도메인간 각도는 1-25 도의 각도 변화를 가질 것이고, 또 다른 바람직한 실시양태에서, 각도 변화는 1-10 도이고, 더욱 바람직한 실시양태에서, 각도 변화는 1-5 도이고, 가장 바람직한 실시양태에서, 각도 변화는 5 도 미만이다. 한 실시양태에서, 변이체 IL-10 분자는 도메인간 각도를 부여하는 1-100개의 (또는 그 안의 임의의 정수) 아미노산 부가, 결실 및/또는 치환을 포함할 것이다.
본 출원의 한 실시양태에서, 변이체 IL-10 분자는 IL-10 수용체 결합 및/또는 도메인간 각도를 가장 많이 담당하는 영역 또는 영역들을 예측하기 위해 컴퓨터-기반 모델링의 보조하에 설계되고 생성될 것이다. 컴퓨터-기반 모델링은 수용체 결합 도메인 및/또는 도메인간 각도에 대한 변형으로부터 가장 큰 이익을 얻는 영역을 예측하기 위한 더 빠르고 더 효율적인 수단을 제공하는데 도움이 될 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 출원의 분자는 변이체 IL-10 분자의 유도체를 포함한다. 이들은 변이체 분자의 크기, 반감기 및 생체이용률을 증가시키는 개체를 포함하도록 변이체 분자에 대한 변형을 포함할 수 있다.
변이체 IL-10 분자: PEG 변형
한 실시양태에서, 변이체 IL-10 분자는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 부가를 포함할 수 있다. PEG화 IL-10 변이체는 적어도 1개의 PEG 분자의 부착을 포함할 것이다. 임의의 특정한 이론에 구애되지 않고, IL-10 변이체에 대한 PEG의 부착은 단백질 가수분해로부터 보호하고, 면역원성을 감소시키고, 수용체 상에서 IL-10 변이체의 탈안정화를 촉진시켜 골수 세포에 대한 그의 억제 효과를 유지하고, T 세포 활성화를 방지할 수 있다.
그의 가장 일반적인 형태에서, PEG는 히드록실 기로 종결되고 하기 일반 구조를 갖는 선형 또는 분지형 폴리에테르이다:
HO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH
PEG와 본 출원의 변이체 IL-10 분자의 커플링 방법은 관련 기술분야에서 이미 확립된 이들 기술 / 프로토콜을 따를 것이다. 예를 들어, PEG의 접합 또는 커플링은 한 또는 양 말단에 관능기를 갖는 PEG의 유도체를 제조함으로써 PEG를 활성화시키는 것을 필요로 한다. 단백질의 PEG 접합을 위한 가장 일반적인 경로는 리신 및 N-말단 아미노산 기와의 반응에 적합한 관능기를 갖는 PEG를 활성화시키는 것이었다. 특히, PEG와 폴리펩티드의 커플링에 수반되는 가장 일반적인 반응기는 리신의 알파 또는 엡실론 아미노 기이다.
PEG화 링커와 변이체 IL-10 분자의 반응은 주로 하기 부위에서 PEG 모이어티의 부착을 유도한다: 단백질의 N-말단에서 알파 아미노 기, 리신 잔기의 측쇄 상의 엡실론 아미노 기, 및 히스티딘 잔기의 측쇄 상의 이미다졸 기. 일부 실시양태에서, 변이체 IL-10 분자가 단일 알파 및 수많은 엡실론 아미노 및 이미다졸 기를 갖는 재조합 단백질이기 때문에, 링커 화학에 따라 수많은 위치 이성질체가 생성될 수 있다.
널리 사용되는 2가지 1세대 활성화 모노메톡시 PEG (mPEG)는 숙신이미딜 카르보네이트 PEG (SC-PEG; 예를 들어, [Zalipsky, et al. (1992) Biotechnol. Appl. Biochem 15:100-114; 및 Miron and Wilcheck (1993) Bioconjug. Chem. 4:568-569] 참고) 및 벤조트리아졸 카르보네이트 PEG (BTC-PEG; 예를 들어, 돌렌스(Dolence) 등의 미국 특허 번호 5,650,234 참고)이었으며, 이들은 리신 잔기와 우선적으로 반응하여 카르바메이트 연결을 형성하지만, 히스티딘 및 티로신 잔기와도 반응하는 것으로 공지되어 있다. IFNα 상의 히스티딘 잔기에 대한 연결은 가수분해적으로 불안정한 이미다졸카르바메이트 연결인 것으로 나타났다 (예를 들어, 리(Lee) 및 맥네마르(McNemar)의 미국 특허 번호 5,985,263을 참고하며, 이는 그의 전문이 본원에 참고로 포함됨).
2세대 PEG화 기술은 이들 불안정한 연결 뿐만 아니라 잔기 반응성에서의 선택성 결여를 피하도록 설계되었다. PEG-알데히드 링커의 사용은 환원성 아미노화를 통해 폴리펩티드 및/또는 단백질 서브유닛의 N-말단 상의 단일 부위를 표적화한다. IL-10을 상이한 유형의 링커 및 pH를 이용하여 PEG화시켜, 다양한 형태의 PEG화 분자에 도달할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,252,714, 미국 특허 번호 5,643,575, 미국 특허 번호 5,919,455, 미국 특허 번호 5,932,462, 미국 특허 번호 5,985,263, 미국 특허 번호 7,052,686을 참고하며, 모두 그들의 전문이 본원에 참고로 포함됨).
IL-10 모방체 분자
또 다른 실시양태에서, 본 출원은 IL-10 변이체 분자의 생물학적 기능을 반영하는 모방체 분자를 포함한다. 이들 모방체에는 펩티드, 소분자, 변형된 호르몬, 및 변이체 IL-10 분자와 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 구조 및 또는 기능을 갖는 항체가 포함되나 이로 제한되지 않는다. IL-10 변이체 분자를 복제하거나 또는 반영하는 변형에 대한 기반을 형성할 수 있는 IL-10 모방체 분자에는 US20080139478, US20120238505 및/또는 US20150218222에 기재된 것들이 포함되며, 모두 그들의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
IL-10 혼성체 분자 및 IL-10 융합 단백질
또 다른 실시양태에서, 본 출원은 인간 IL-10, EBV-IL10 및/또는 CMV-IL10으로부터 수득된 부분으로 구성된 혼성체 분자인 IL-10 변이체 분자를 포함한다. 예를 들어, 각각의 인간 IL-10, EBV-IL10 및/또는 CMV-IL10 내의 상이한 도메인이 함께 조합되어 혼성체 분자를 생성할 수 있으며, 그에 따라 조합물은 수용체 결합 도메인 및/또는 IL-10에서 도메인간 각도를 담당하는 도메인의 전부 또는 일부를 채택한다.
다른 한 실시양태에서, 변이체 IL-10 분자는 조작된 융합 단백질의 일부이다. 링커 또는 스페이서는 무작위 아미노산 서열 (예컨대 SSGGGGS (서열식별번호: 30, GGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 31) 또는 SSGGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호 54)), 항체의 불변 영역, scFv 또는 디아바디일 수 있다. 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgD, 또는 IgE로부터 유래될 수 있지만 이로 제한되지 않는다. 링커 또는 스페이서는 바람직하게는 불변 중쇄 (CH) 영역 1, CH2, 또는 CH3일 수 있다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 스페이서의 링커는 서열식별번호: 30 및/또는 31의 무작위 아미노산 서열이다. 또 다른 측면에서, 링커 또는 스페이서는 적어도 2개의 쇄간 디술피드 결합을 추가로 포함할 수 있다.
융합 단백질은 또한 융합 단백질의 N-말단, C-말단 또는 이들 둘 다에서 접합된 IL-10 또는 IL-10 변이체 분자 중 적어도 1개의 단량체를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, IL-10 또는 IL-10 변이체를 포함하는 융합 단백질은 또한 IL-10 또는 변이체 IL-10의 반대쪽 말단에서 접합된 적어도 1개의 시토카인을 포함할 수 있고, IL-2, IL-7, IL-15, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-10, IL-10 변이체 분자, IFN-알파, TGF-베타, 염기성-FGF, EGF, PDGF, IL-4, IL-11, 또는 IL-13 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 일부 바람직한 실시양태에서, 융합 단백질은 융합 단백질의 N-말단에서 접합된 IL-10 또는 IL-10 변이체 분자 및 융합 단백질의 C-말단에서 접합된 2개의 IL-10 또는 IL-10 변이체 분자의 2가지 단량체 형태를 포함하고; 융합 단백질은 융합 단백질의 N-말단에서 접합된 IL-10 또는 IL-10 변이체 분자 및 융합 단백질의 C-말단에서 접합된 적어도 1개의 IL-2 분자의 2개의 단량체 형태를 포함하고; 융합 단백질은 융합 단백질의 N-말단에서 접합된 2개의 IL-10 또는 IL-10 변이체 분자 및 융합 단백질의 C-말단에서 접합된 적어도 1개의 IL-15 분자를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 융합 단백질의 C-말단은 IL-2, IL-7, IL-15, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-10, IL-10 변이체 분자, IFN-알파, TGF-베타, 염기성-FGF, EGF, PDGF, IL-4, IL-11, 또는 IL-13으로부터 선택된 적어도 2가지 상이한 시토카인을 가질 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 융합 단백질은 IL-10의 1개의 단량체 또는 2개의 단량체, IL-10 변이체 분자의 1개의 단량체 또는 2개의 단량체, IL-2, IL-7, IL-15, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IFN-알파, TGF-베타, 염기성-FGF, EGF, PDGF, IL-4, IL-11, 또는 IL-13, 또는 이들의 조합물이 접합되는 기본 스캐폴드로서 단일 쇄 가변 단편 (scFv), 디아바디, Fab, 또는 임의의 항체 단편을 사용하여 제작된다.
한 특히 바람직한 실시양태에서, 융합 단백질은 IL-10 또는 IL-10 변이체 분자에 연결된 가변 중쇄 (VH) 및/또는 가변 경쇄 (VL)를 갖는 적어도 1개의 가변 영역을 포함한다. 이러한 배치에서, 융합 단백질은 항체의 적어도 1개의 가변 영역에 연결된 IL-10 단량체 또는 변이체 IL-10 단량체를 포함한다. 한 측면에서, 이 융합 단백질은 VH에 연결되고, VL에 연결되고, IL-10 단량체에 연결된 IL-10 단량체 또는 IL-10 단량체 변이체 분자를 포함하는 선형 연속 서열이고, 항체의 가변 영역은 가변 중쇄 (VH) 영역, 가변 경쇄 (VL) 영역, 또는 이들 둘 다일 수 있다. 제1 융합 단백질은 IL-10 단량체 또는 변이체 IL-10 단량체가 가변 영역 (VH 또는 VL 또는 이들 둘 다)의 카르복시 말단에 접합되도록 선형 연속 배치를 갖는 단백질 서열을 포함한다. 제2 융합 단백질은 IL-10 단량체 또는 변이체 IL-10 단량체가 가변 영역 (VH 또는 VL 또는 이들 둘 다)의 아미노 말단에 연결되도록 선형 연속 배치를 갖는 단백질 서열을 포함할 수 있다. 상기 기재된 제1 융합 단백질의 대표적인 예에는 하기 배치가 포함될 수 있다:
a) NH2(Ab1VL)COOH-(링커)-NH2(모노IL10)COOH
상기 기재된 제2 융합 단백질의 대표적인 예에는 하기 배치가 포함될 수 있다:
b) NH2(모노IL10)COOH-(링커)-NH2(Ab1VH)COOH
제1 (a) 및 제2 (b) 융합 단백질은 함께 역평행 방식으로 기능적 단백질 복합체를 형성하고, 이로써 IL-10 또는 변이체 IL-10의 말단 연결된 단량체는 기능적 동종이량체를 형성하고, 가변 영역은 함께 기능적 항원 결합 부위 ("ABS")를 형성할 수 있다 (예를 들어, 도 9(a)- (f) 참고).
대안적인 실시양태에서, IL-10 단량체 또는 변이체 IL-10 단량체는 동일한 항체로부터 또는 2가지 상이한 항체로부터의 적어도 2개의 가변 영역에 접합될 수 있다. 이러한 배치에서, 적어도 2개의 가변 영역은 VH 및 VL이다. 이러한 배치의 예에는 IL-10의 단량체 또는 IL-10 변이체 분자의 단량체의 아미노 말단에 후속적으로 연결된 제2 항체의 VL 영역의 아미노 말단에 그의 카르복시 말단에서 연결된 제1 항체의 VH 영역의 선형 연속 단백질 서열을 갖는 제1 융합 단백질이 포함될 것이다. 대안적인 배치에는 제1 항체의 VL 영역의 아미노 말단에 후속적으로 연결된 제2 항체의 VH 영역의 아미노 말단에 그의 카르복시 말단에서 연결된 단량체 IL-10 또는 IL-10 변이체 분자 단량체의 선형 연속 단백질 서열을 갖는 제2 융합 단백질이 포함될 것이다. 상기 기재된 제1 융합 단백질의 대표적인 예에는 하기 배치가 포함될 수 있다:
a) NH2(Ab1-VH)COOH--(링커)-NH2(Ab2VL)COOH-(링커)-NH2(모노IL10)COOH
상기 기재된 제2 융합 단백질의 대표적인 예에는 하기 배치가 포함될 수 있다:
b) NH2(모노IL10)COOH-(링커)-NH2(Ab2VH)COOH-(링커)-NH2(Ab1-VL)COOH
제1 (a) 및 제2 (b) 융합 단백질은 함께 역평행 방식으로 기능적 단백질 복합체를 형성하고, 이로써 IL-10 또는 변이체 IL-10의 말단 연결된 단량체는 기능적 동종이량체를 형성하고, 가변 영역은 함께 ABS를 형성할 수 있다 (예를 들어, 도 9(a) - (c) 참고).
또 다른 실시양태에서, 융합 단백질은 함께 융합된 2개의 IL-10 단량체 또는 2개의 변이체 IL-10 단량체, 및 1개 이상의 VH 및 VL 영역을 포함한다. 각각의 단량체는 개별적으로 항체의 1개 이상의 VH 영역 및/또는 VL 영역에 연결된다. 1개 초과의 VH 및/또는 VL 영역이 이러한 융합 단백질 배치에서 사용되는 경우, VH 및 VL 영역은 동일한 항체로부터 또는 적어도 2가지 상이한 항체로부터의 것일 수 있다. 이러한 융합 단백질의 한 특정한 배치에서, VH 또는 VL 영역은 제1 단량체의 아미노 말단에 연결된 다음, 그의 카르복시 말단에서 제2 단량체의 아미노 말단에 연결된 다음, VL 또는 VH의 아미노 말단에 연결된다. 임의적으로, 추가의 VH 또는 VL 영역이 아미노 또는 카르복시 말단에서 연결될 수 있고, VH 또는 VL 영역은 동일한 항체로부터 또는 상이한 항체로부터의 것일 수 있다. 상기 기재된 융합 단백질의 대표적인 예에는 하기 배치가 포함될 수 있다 (예를 들어, 도 10 (d) - (f) 참고):
NH2(Ab1-VH)COOH--(링커)-NH2(모노IL10)COOH-(링커)-NH2(모노IL10)COOH-(링커)-NH2(Ab1-VL)COOH
상기 기재된 융합 단백질은 IL-10의 단량체가 동종이량체를 형성하고, 항체의 가변 도메인 (VH 및 VL)이 기능적 ABS를 형성하도록 하는 방식으로 폴딩될 것이다.
또 다른 실시양태에서, 융합 단백질은 융합 단백질의 양 말단에 위치하는 2개의 IL-10 단량체 또는 2개의 변이체 IL-10 단량체, 및 적어도 1개의 VH 및 VL 영역을 포함하고, VH 및 VL 영역은 함께 연결된다. 이러한 배치에서, VH 및 VL 영역은 함께 융합되고, 각각의 단량체는 제1 항체의 VL 영역 또는 VH 영역에 개별적으로 연결된다. 이러한 배치에서, IL-10 단량체 또는 변이체 IL-10 단량체는 각각 제1 항체의 VH 또는 VL에 개별적으로 연결된다. 상기 기재된 융합 단백질의 대표적인 예에는 하기 배치가 포함될 수 있다 (예를 들어, 도 10(a)-(c) 참고):
a) NH2(모노IL10)COOH-(링커)-NH2(Ab1-VH)COOH-(링커)-NH2(Ab1-VL)COOH-(링커)- NH2(모노IL10)COOH
b) NH2(모노IL10)COOH-(링커)-NH2(Ab1-VL)COOH-(링커)-NH2(Ab1-VH)COOH-(링커)- NH2(모노IL10)COOH
IL-10의 단량체 또는 변이체 IL-10의 단량체는 링커 서열을 통해 VH 또는 VL 서열에 연결될 수 있다. 링커는 가변 쇄 영역 (VH 또는 VL)의 카르복시 말단을 IL-10의 단량체 또는 단량체 IL-10 변이체 분자의 아미노 말단에 연결하는 카르복시 말단 링커일 수 있다. 대안적으로, 링커는 아미노 말단 링커일 수 있고, 이로써 단량체 IL-10 또는 단량체 IL-10 변이체 분자의 카르복시 말단은 가변 쇄 영역 (VH 또는 VL)의 아미노 말단에 연결된다.
따라서, 한 형태에서, 융합 단백질은 적어도 2가지 상이한 항체로부터의 2개의 가변 영역에 연결된 단량체 IL-10 분자 또는 변이체 IL-10 분자를 포함하고, 2개의 가변 영역은 제2 항체로부터의 VL 영역에 연결된 제1 항체로부터의 VH 영역 또는 제2 항체로부터의 VH에 연결된 제1 항체로부터의 VL로서 배치된다. 이러한 형태에 따른 융합 단백질은 IL-10 수용체에 대한 친화도를 증가시키거나 또는 감소시키는 적어도 1개의 아미노산 치환을 포함하는 단량체 IL-10 분자 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다. IL-10 수용체 결합에 영향을 미치는 아미노산 치환은 인간, CMV 또는 EBV IL-10에서 발생할 수 있다. 아미노산 치환은 바람직하게는 EBV IL-10에 있을 수 있고, 위치 31, 75 또는 이들 둘 다에서 아미노산 치환을 포함한다. 아미노산 치환은 V31L 또는 A75I 치환 또는 이들 둘 다 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다. IL-10 수용체 결합 친화도에 영향을 미치는 아미노산 치환 외에도, IL-10 변이체는 또한 도메인간 각도에 영향을 미치는 변형을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 융합 단백질은 하기로부터 선택된 배치를 포함한다: (a) IL-10의 단량체 또는 그의 변이체의 카르복시 말단에 후속적으로 연결된 제2 항체의 VL 영역의 아미노 말단에 그의 카르복시 말단에서 연결된 제1 항체의 VH 영역; 또는 (b) 제1 항체의 VL 영역의 아미노 말단에 후속적으로 연결된 제2 항체의 VH 영역의 아미노 말단에 그의 카르복시 말단에서 연결된 IL-10 분자 또는 그의 변이체. 한 바람직한 실시양태에서, 이들 융합 단백질 배치는 서열식별번호: 24-28, 29 및 33-53의 서열을 포함한다. 이들 융합 단백질 서열은 복합체를 형성할 수 있고, IL-10의 단량체 또는 변이체 IL-10의 단량체는 동종이량체를 형성할 수 있다. 이러한 복합체는 디아바디 복합체를 포함할 수 있고/거나 그렇게 배치될 수 있다.
또 다른 형태에서, 융합 단백질은 IL-10의 단량체에 추가로 연결된 제2 항체의 경쇄 가변 영역 (VL)에 연결된 제1 항체의 중쇄 가변 영역 (VH)을 그의 아미노 말단에서 포함하는 제1 융합 단백질; 및 제1 항체의 VL에 추가로 연결된 제2 항체의 VH에 연결된 IL-10의 단량체를 그의 아미노-말단에서 포함하는 제2 융합 단백질을 포함하는 면역접합체로서 제작될 수 있고, 제1 및 제2 항체의 VH 및 VL은 디아바디와 회합하고, IL-10의 단량체는 기능적 이량체 IL-10 분자를 형성한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 면역접합체 복합체는 제1 항체의 VH 영역 및 그의 아미노 말단에 의해 연결된 단량체 IL-10 분자를 그의 아미노 말단에서 포함하는 제1 융합 단백질; 및 제1 항체의 VL에 연결된 IL-10의 단량체를 그의 아미노 말단에서 포함하는 제2 융합 단백질을 포함하고, 제1 항체의 VH 영역은 제1 항체의 VL 영역과 회합하여, 각각의 펩티드 쇄 상의 단량체 IL-10 분자가 기능적 IL-10 이량체를 형성하도록 한다. IL-10의 단량체(들) 또는 변이체 IL-10의 단량체(들)은 상기 기재된 바와 같이 IL-10 수용체 결합 및/또는 도메인간 각도에 영향을 미치는 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 면역접합체 복합체는 단량체 IL-10 분자에 연결된 제1 항체의 VH 영역을 그의 아미노 말단에서 포함하는 제1 융합 단백질; 및 제1 항체의 VL에 연결된 IL-10의 단량체를 그의 아미노 말단에서 포함하는 제2 융합 단백질을 포함하고, 제1 항체의 VH 영역은 제1 항체의 VL 영역과 회합하여, 각각의 펩티드 쇄 상의 단량체 IL-10 분자가 기능적 IL-10 이량체를 형성하도록 한다. 또 다른 실시양태에서, 면역접합체는 제2 IL-10의 단량체 (또는 IL-10 변이체 분자)에 연결된 제1 항체의 VL 영역에 연결된 제1 항체의 VH 영역에 연결된 제1 IL-10의 단량체 (또는 IL-10 변이체 분자) 단량체를 그의 아미노 말단에서 포함하고, 2개의 IL-10 단량체는 함께 회합하여 IL-10의 기능적 이량체를 형성할 수 있다. 기재된 VH 및 VL 영역은 항원 (예를 들어, 수용체, 단백질, 핵산 등)을 특이적으로 표적화하는 항원 결합 부위를 형성할 수 있다. 따라서, 함께 기능적 IL-10 (또는 IL-10 변이체 분자) 동종이량체를 생성하는 융합 단백질 복합체를 위한 2개의 쇄, 쇄 1 및 쇄 2가 있다. 대표적인 융합 단백질 쇄 (즉, 쇄 1 및 쇄 2)에는 하기가 포함된다:
Figure pct00001
융합 단백질은 적어도 1개의 항체로부터의 VH 및 VL 쌍을 포함한다. VH 및 VL 쌍은 IL-10의 단량체 또는 그의 변이체가 기능적 IL-10 분자로 동종이량체화할 수 있도록 부착될 수 있는 스캐폴드로서 작용한다. 따라서, 관련 기술분야의 기술자는 융합 단백질에서 사용되는 VH 및 VL 스캐폴드가 적절한 IL-10 또는 IL-10 변이체 단백질 이량체화를 위해 필요한 원하는 물리적 성질 및/또는 VH 및 VL 표적화 능력을 유지하기 위한 요구를 기반으로 하여 선택될 수 있음을 이해할 것이다. 마찬가지로, 관련 기술분야의 기술자는 VH 및 VL 쌍 내의 CDR 영역이 또한 특이적으로 표적화된 융합 단백질을 수득하기 위해 다른 CDR 영역으로 치환될 수 있음을 또한 이해할 것이다. 또한, 융합 단백질이 임의의 특이적인 항원을 표적화하도록 의도되지 않는 경우에, VH 및 VL 쌍, 예컨대 항-HIV 및/또는 항-에볼라 항체로부터의 VH 및 VL 쌍이 임의의 특정한 항원을 표적화하지 않는 (또한 생체내에서 낮은 존재비를 갖는 항원인) 스캐폴드로서 선택될 수 있는 것으로 구상된다. 융합 단백질은 1-4개의 가변 영역 범위를 포함할 수 있다. 가변 영역은 동일한 항체로부터 또는 적어도 2가지 상이한 항체로부터의 것일 수 있다. 항체 가변 쇄는 다수개의 항체 (예를 들어, 단백질, 세포 수용체 및/또는 항원과 연관된 종양 등을 표적화하는 것들)로부터 수득되거나 또는 유래될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 가변 영역은 다양한 질환 (예를 들어, 암)과 연관된 항원을 표적화하는 항체, 또는 건강한 대상체의 혈청에서 전형적으로 발견되지 않거나 또는 드물게 발견되는 것들, 예를 들어 EGFR, PDGFR, VEGFR, Her2Neu, FGFR, GPC3, 또는 다른 종양 연관된 항원, MadCam, ICAM, VCAM, 또는 다른 염증 연관된 세포 표면 단백질, HIV 및/또는 에볼라에 대한 항체로부터의 가변 영역으로부터 수득된다. 따라서, 한 실시양태에서, 가변 영역은 예를 들어 항-EGFR, 항-MadCam, 항-HIV (Chan et al, J. Virol, 2018, 92(18):e006411-19), 항-ICAM, 항-VCAM, 또는 항-에볼라 (미국 공개 출원 2018/0180614, 그의 전문에 참로로 포함됨, 특히 표 2, 3 및 4에 기재된 mAb) 항체로부터 수득되거나 또는 유래된다. 또 다른 실시양태에서, 가변 영역은 IL-10이 그의 생물학적 효과를 유도할 수 있도록 특정한 표적 영역에 대해 시토카인, 예컨대 IL-10의 농도를 농축시킬 수 있는 항체로부터 수득되거나 또는 유래된다. 이러한 항체는 특정한 발병 영역에서 과발현되거나 또는 상향조절된 수용체 또는 항원을 표적화하는 것들 또는 영향을 받은 특정한 영역에서 특이적으로 발현되는 것들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 가변 영역은 표피 성장 인자 수용체 (EGFR); CD52; 다양한 면역 체크포인트 표적, 예컨대 비제한적으로 몇가지 예를 들면 PD-L1, PD-1, TIM3, BTLA, LAG3 또는 CTLA4; CD20; CD47; GD-2; HER2; EpCAM; ICAM (ICAM-1, -2, -3, -4, -5), VCAM, FAPα; 5T4; Trop2; EDB-FN; TGFβ 트랩; MadCam, β7 인테그린 서브유닛; α4β7 인테그린; α4 인테그린 SR-A1; SR-A3; SR-A4; SR-A5; SR-A6; SR-B; dSR-C1; SR-D1; SR-E1; SR-F1; SR-F2; SR-G; SR-H1; SR-H2; SR-I1; 및 SR-J1에 대한 특이적인 항체로부터 수득될 수 있다. IL-10 (예를 들어, 인간, CMV, 또는 EBV) 또는 변이체 IL-10 분자 (본원에 기재됨)의 단량체는 가변 영역 (VH 또는 VL)의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에 접합되어, IL-10 또는 변이체 IL-10 분자가 서로 이량체화할 수 있게 한다.
융합 단백질 또는 융합 단백질 복합체는 또한 항원 표적화 기능성을 가질 수 있다. 융합 단백질 또는 융합 단백질 복합체는 함께 회합하여 항원 결합 부위 또는 ABS를 형성할 수 있는 VH 및 VL 영역을 포함할 것이다. 일부 배치에서, IL-10 또는 IL-10 변이체 분자 또는 그의 단량체는 항원 결합 부위를 포함하는 말단에 공유적으로 연결될 것이다. 이들 표적화 융합 단백질은 융합 단백질이 항원을 표적화하는 능력을 보유할 뿐만 아니라 IL-10 또는 IL-10 변이체 분자의 기능적 동종이량체를 갖도록 융합 단백질의 한 말단에 적어도 1개의 기능적 가변 영역 또는 쌍 형성된 VH 및 VL을 포함할 수 있다 (도 9 (a)-(f) 및 10 (a)-(f) 참고). 가변 영역은 대상체에서 항원성을 감소시키는 1개 이상의 아미노산을 변경시킴으로써 (예를 들어, 부가, 차감 또는 치환에 의해) 추가로 변형될 수 있다. VH 및 VL 쌍은 다수개의 항체에 대해 수득된 CDR 영역이 그래프팅될 수 있는 스캐폴드를 형성한다. 이러한 항체 CDR 영역은 공지되고 상기 기재된 이들 항체를 포함한다. 예를 들어, 임의의 항체로부터의 CDR 영역은 VH 및 VL 쌍, 예컨대 서열식별번호: 37, 44 또는 45에 기재된 것들, 또는 융합 단백질 복합체를 형성할 수 있는 이들 융합 단백질, 예컨대 서열식별번호: 46 및 47; 48 및 49; 또는 50 및 51에 기재된 것들 상에 그래프팅될 수 있다. 상기 기재된 VH 및 VL 스캐폴드에서 CDR 영역은 CDR 접목/삽입을 위해 이용가능한 하기 개수의 아미노산 위치를 포함할 것이다:
Figure pct00002
또 다른 측면에서, 상기 기재된 융합 단백질은 하기 일반식 중 하나로 표현될 수 있다:
1) IL10-L1-X1-L1-X2-L1-IL10 (화학식 I);
2) (Z)n-X1-L2-Y2-L1-IL10 (화학식 II);
3) IL10-L1-Y1-L2-X2-(Z)n (화학식 III);
4) X1-L2-X2-L1-IL10 (화학식 IV);
5) IL10-L1-X1-L2-X2 (화학식 V);
6) X1-L1-IL10 (화학식 VI); 및
7) IL10-L1-X2 (화학식 VII)
상기 식에서,
"IL-10"은 인간 Il-10 (서열식별번호: 1); EBV IL-10 (서열식별번호: 3), DV05 (서열식별번호:14, 18, 또는 55), DV06 (서열식별번호: 15, 19, 또는 57), 또는 DV07 (서열식별번호:16, 20, 또는 59)이고, 바람직한 실시양태에서, "IL-10"은 DV05, DV06 또는 DV07로 이루어지고, 더욱 바람직하게는 "IL-10"은 서열식별번호: 55, 57 또는 59로 이루어진다;
"L1"은 서열식별번호: 31 또는 54의 링커이고;
"L2"는 서열식별번호: 30의 링커이고;
"X1"은 표피 성장 인자 수용체 (EGFR); CD52; 다양한 면역 체크포인트 표적, 예컨대 비제한적으로 PD-L1, PD-1, TIM3, BTLA, LAG3 또는 CTLA4; CD20; CD47; GD-2; HER2; EpCAM; ICAM (ICAM-1, -2, -3, -4, -5), VCAM, FAPα; 5T4; Trop2; EDB-FN; TGFβ 트랩; MadCam, β7 인테그린 서브유닛; α4β7 인테그린; α4 인테그린 SR-A1; SR-A3; SR-A4; SR-A5; SR-A6; SR-B; dSR-C1; SR-D1; SR-E1; SR-F1; SR-F2; SR-G; SR-H1; SR-H2; SR-I1; SR-J1; HIV, 또는 에볼라에 대해 특이적인 제1 항체로부터 수득된 VH 영역이고;
"X2"는 X1과 동일한 항체로부터 수득된 VL 영역이고;
"Y1"은 표피 성장 인자 수용체 (EGFR); CD52; 다양한 면역 체크포인트 표적, 예컨대 비제한적으로 PD-L1, PD-1, TIM3, BTLA, LAG3 또는 CTLA4; CD20; CD47; GD-2; HER2; EpCAM; ICAM (ICAM-1, -2, -3, -4, -5), VCAM, FAPα; 5T4; Trop2; EDB-FN; TGFβ 트랩; MadCam, β7 인테그린 서브유닛; α4β7 인테그린; α4 인테그린 SR-A1; SR-A3; SR-A4; SR-A5; SR-A6; SR-B; dSR-C1; SR-D1; SR-E1; SR-F1; SR-F2; SR-G; SR-H1; SR-H2; SR-I1; SR-J1; HIV, 또는 에볼라에 대해 특이적인 제2 항체로부터 수득된 VH 영역이고;
"Y2"는 Y1과 동일한 항체로부터 수득된 VL 영역이고;
X 및 Y는 동일한 또는 상이한 항체로부터 수득되고;
"Z"는 IL-6, IL-4, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL_15, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, GM-CSF, G-CSF, 인터페론 -α, -β, -γ, TGF-β, 또는 종양 괴사 인자 -α, -β, 염기성 FGF, EGF, PDGF, IL-4, IL-11, 또는 IL-13으로부터 선택된 시토카인이고;
"n"은 0-2로부터 선택된 정수이다.
한 실시양태에서, 상기 화학식 I-VII의 치환체는 바람직하게는 하기로부터 선택된다: IL-10은 바람직하게는 DV05, DV06 또는 DV07이고, 더욱 바람직하게는 IL-10은 DV05, DV06 또는 DV07로 이루어지거나, 또는 가장 바람직하게는 IL-10은 서열식별번호: 55, 57 또는 59로 이루어지고; X1 및 X2는 바람직하게는 항-EGFR, 항-PDGFR, 항-FGFR, 항-VEGF, 항-Her2Neu, 항-GPC3, 항-MAdCAM, 항-ICAM-1, -2, -3, -4, 항-VCAM, 항-HIV, 또는 항-에볼라이고; Y1 및 Y2는 바람직하게는 항-EGFR, 항-MAdCAM, 항-ICAM-1, -2, -3, -4, 항-VCAM, 항-HIV, 또는 항-에볼라이고; Z는 IL-2, IL-7 또는 IL-15로부터 선택되고; n은 1이다. 가장 바람직한 실시양태에서, 융합 단백질은 서열식별번호: 33-53, 61, 63, 65 또는 67 중 어느 하나이다. 관련 기술분야의 기술자는 히스티딘 태그의 존재가 융합 단백질의 정제 과정에서 사용되고, 온전하게 남아 있거나 또는 최종 생성물로부터 제거될 수 있음을 이해할 것이다. 관련 기술분야의 기술자는 또한 상기 기재된 임의의 항체의 VH 및 VL 프레임워크 영역이 다른 상보성 결정 영역 (CDR) 영역으로 치환될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, VH 및 VL 영역이 항-에볼라 항체로부터의 것인 경우, 6개의 CDR 영역 (즉, VH 및 VL 둘 다의 CDR 1-3)은 항-EGFR 항체 (예를 들어, 세툭시맙)의 6개의 CDR 영역으로 치환될 수 있다. 따라서, 한 바람직한 실시양태에서, 융합 단백질은 서열식별번호: 33-34, 52 또는 53이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 융합 단백질은 서열식별번호: 37; 44; 45; 46-47; 48-49; 또는 50-51에 의해 표시되는 스캐폴드를 갖는 것이고, 임의의 항체로부터의 임의의 6개의 CDR 영역이 그래프팅될 수 있다. 다른 바람직한 실시양태에서, 항-에볼라 항체의 VH 및 VL 영역으로부터의 CDR 영역은 항-MAdCAM, 항-VCAM, 또는 항-ICAM-1, -2, -3, -4 항체로부터의 CDR 영역에 그래프팅될 수 있고, 바람직한 실시양태에서 CDR 영역은 서열식별번호: 37의 융합 단백질에 그래프팅될 수 있다. 상기 화학식 II 및 III; 화학식 IV 및 V; 및 화학식 VI 및 VII에 기재된 융합 단백질은 함께 회합하여 IL-10 (또는 그의 변이체)의 생물학적으로 활성인 동종이량체를 형성하도록 설계된다. 상기 기재된 융합 단백질은 선택된 VH 및 VL 영역의 쌍 및/또는 VH 및 VL에 접목된 CDR 영역에 따라 비표적화 또는 표적화로 설계된다. 용어 "비표적화"는 항원이 존재하지 않거나 또는 항원 결합 부위 (ABS)가 비활성화되거나 변형되어 ABS 기능성이 제거되었기 때문에, 생체내에 위치한 특이적인 항원을 표적화할 수 없는 VH 및 VL 영역을 기재하는 것을 의미한다.
상기 기재된 융합 단백질은 보조 단백질/분자에 추가로 접합될 수 있다. 본원에서 사용되는 보조 단백질은 융합 단백질 또는 융합 단백질 복합체에 접합된 단백질이어서, 이는 IL-10 단량체 또는 변이체 IL-10 단량체 분자의 반대쪽에 연결된다. 보조 단백질의 추가는 IL-10 또는 IL-10 변이체 분자 기능성 및 보조 단백질의 기능성 둘 다를 포함시킨 다기능적 분자를 효과적으로 생성한다. 보조 단백질 (예를 들어, 시토카인 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15 등)의 부착은 예를 들어 VH 영역의 N-말단에서 VH 및 VL 스캐폴드를 포함하는 융합 단백질에 부착될 수 있다. 예를 들어, 이는 종양학 치료를 위한 융합 단백질 또는 융합 단백질 복합체에 적용되기 때문에, 보조 단백질에는 IL-10, IL-10 변이체 분자 IL-6, IL-4, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-15, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, GM-CSF, G-CSF, 인터페론 -α, -β, -γ, TGF-β, 또는 종양 괴사 인자 -α, -β, 염기성 FGF, EGF, PDGF, IL-4, IL-11, 또는 IL-13 또는 이들의 임의의 조합물이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 이는 염증 질환의 치료를 위한 융합 단백질 또는 융합 단백질 복합체에 적용되기 때문에, 보조 단백질에는 TGFβ가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 이는 자가면역 질환 (예컨대 비제한적으로 지방간 질환)의 치료를 위한 융합 단백질 또는 융합 단백질 복합체에 적용되기 때문에, 보조 분자에는 오브티콜산, 아람콜, 엘라피브라노르, 리라글루티드, 셀론세르티브 또는 심투주맙이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 상기 정의된 보조 단백질이 상기 화학식 I-V를 이용하여 기재될 때 이는 스캐폴드의 VH 부분의 N-말단 측에서 치환체 X1 또는 Y1에 부착될 수 있다.
상기 기재된 융합 단백질은 또한 제작 과정 동안에 융합 단백질의 회수 또는 정제에 도움이 되는 추가의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이들에는 다양한 서열 변형 또는 친화도 태그, 예컨대 비제한적으로 단백질 A, 알부민-결합 단백질, 알칼리성 포스파타제, FLAG 에피토프, 갈락토스-결합 단백질, 히스티딘 태그, 및 관련 기술분야에 널리 공지된 임의의 다른 태그가 포함될 수 있다. 예를 들어, [Kimple et al (Curr. Protoc. Protein Sci., 2013, 73:Unit 9.9, Table 9.91)]을 참고하며, 그의 전문이 참고로 포함된다. 한 측면에서, 친화도 태그는 HHHHHH (서열식별번호: 32)의 아미노산 서열을 갖는 히스티딘 태그이다. 히스티딘 태그는 최종 생성물로부터 제거되거나 또는 온전하게 남아 있을 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 친화도 태그는 융합 단백질에 (예를 들어, 본원에 기재된 융합 단백질의 VH 영역에) 포함된 단백질 A 변형, 예컨대 서열식별번호: 34 또는 44-53에 기재된 것들이다. 관련 기술분야의 기술자는 본원에 기재된 임의의 융합 단백질 서열이 관련 기술분야에 기재된 바와 같이 항체 프레임워크 영역 내에 아미노산 점 치환을 삽입시킴으로써 단백질 A 변형을 포함하도록 변형될 수 있음을 이해할 것이다.
또 다른 실시양태에서, 상기 기재된 다양한 융합 단백질이 암을 치료하는, IBD 또는 크론 질환, 자가면역 질환, NAFLD, 또는 NASH을 치료하거나 또는 예방하는 방법에서 사용될 수 있다.
IL-10 변이체 폴리뉴클레오티드
상기 기재된 변이체 IL-10 분자 및 다양한 융합 단백질 및/또는 면역시토카인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또한 본 출원의 범위 내에 포함된다. 주요 IL-10 수용체 결합 영역 및/또는 본 출원의 변이체 IL-10 분자에서 도메인간 각도를 위한 영역의 국재화시, 아미노산 서열에 원하는 변형을 생성하기 위한 DNA 변형은 관련 기술분야의 기술자의 기술 집합 내에 있다. 이러한 변형은 통상적인 재조합 DNA 기술 및 방법을 이용할 것이다. 예를 들어, 특이적인 아미노산 서열의 부가 또는 치환은 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하는 부위-지정 돌연변이 유발 방법을 이용하여 핵산 (DNA) 수준에서 IL-10 서열에 도입될 수 있으며, 이러한 방법 또한 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 변이체 IL-10 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 분자 생물학의 표준 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 기재된 변이체 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 재조합 방법을 이용하여, 예컨대 유전자를 발현하는 세포로부터 cDNA 및 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써, 또는 그를 포함하는 것으로 공지된 벡터로부터 유전자를 유도함으로써 수득될 수 있다. 관심 유전자는 또한 공지된 서열을 기반으로 하여 클로닝되는 것이 아니라 합성에 의해 생성될 수 있다. 분자는 특정한 서열에 대한 적절한 코돈을 갖도록 설계될 수 있다. 이어서, 완전한 서열이 표준 방법에 의해 제조된 중첩 올리고뉴클레오티드로부터 조립되고, 완전한 코딩 서열로 조립된다. 예를 들어, [Edge, Nature (1981) 292:756; Nambair et al., Science (1984) 223:1299; 및 Jay et al., J. Biol. Chem. (1984) 259:6311]를 참고한다.
한 실시양태에서, IL-10 변이체 분자 또는 그의 융합 단백질은 임의의 서열식별번호: 9-29, 33-53, 55, 57 또는 59를 코딩하는 핵산 분자이다. 또 다른 실시양태에서, IL-10 변이체 분자는 각각 서열식별번호: 56, 58 또는 60의 DV05, DV06 또는 DV07이다. DV05, DV06 또는 DV07을 코딩하는 핵산 분자는 IL-10 변이체 분자의 기능성을 변경시키지 않는 삽입, 결실 또는 치환 (예를 들어, 축퇴 코드)을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 IL-10 변이체 및 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9-29, 33-53, 55, 57, 59, 61, 63, 65 또는 67의 서열과 상이할 수 있고, 상기 언급된 서열과 70-99%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성일 수 있다. 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9-29, 33-53, 55, 57, 59, 61, 63, 65 또는 67의 IL-10 변이체 및 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또한 적어도 1개의 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환으로 인해 70%-99%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성일 수 있다. 적어도 1개의 뉴클레오티드의 삽입, 부가, 결실 또는 치환으로 인해 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 56, 58, 60, 62, 64, 66 및 68과 70-99%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열 또한 본 출원에서 구상된다. 더욱이, 본원에 기재된 IL-10 변이체 및 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 예를 들어 단백질의 발현, 생성 또는 분비에 도움이 되는 널리 공지된 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 서열에는 예를 들어 리더 서열, 신호 펩티드 및/또는 번역 개시 부위/서열 (예를 들어 코작 컨센서스 서열)이 포함될 수 있다. 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열은 또한 다양한 발현 시스템/벡터로의 삽입을 가능하게 하는 1개 이상의 제한 효소 부위를 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 원하는 IL-10 서열을 포함하는 벡터에 보유되거나, 또는 관련 기술분야에 공지된 올리고뉴클레오티드 합성 기술, 예컨대 부위-지정 돌연변이 유발 및 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 기술을 이용하여 인공적으로 합성된다. 예를 들어, 상기 샘브룩(Sambrook)의 문헌을 참고한다. 또 다른 실시양태에서, 변이체 IL-10 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 자동화된 폴리뉴클레오티드 합성기에서 생성된 상보적인 중첩 합성 올리고뉴클레오티드를 어닐링한 후, 라이게이션하고, 라이게이션된 뉴클레오티드 서열을 PCR을 통해 중폭시키는 과정을 통해 수득된다. 예를 들어, [Jayaraman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:4084-4088]을 참고한다. 추가로, 올리고뉴클레오티드-지정된 합성 (Jones et al., Nature (1986) 54:75-82), 기존 뉴클레오티드 영역의 올리고뉴클레오티드 지정된 돌연변이 유발 (Riechmann et al., Nature (1988) 332:323-327 및 Verhoeyen et al., Science (1988) 239:1534-1536), 및 T4 DNA 폴리머라제를 사용하는 갭이 있는 올리고뉴클레오티드의 효소적 충전 (Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86:10029-10033)을 이용하여 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 분자를 제공할 수 있다.
변이체 IL-10 분자 및 융합 단백질의 발현 및 도입을 위해 사용될 수 있는 다양한 적합한 발현 벡터가 사용될 수 있고, 관련 기술분야의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 이들 벡터에는 예를 들어 pUC-유형 벡터, pBR-유형 벡터, pBI-유형 벡터, pGA-유형, pBinl9, pBI121, pGreen 시리즈, pCAMBRIA 시리즈, pPZP 시리즈, pPCV001, pGA482, pCLD04541, pBIBAC 시리즈, pYLTAC 시리즈, pSB11, pSB1, pGPTV 시리즈, 및 바이러스 벡터 등이 포함되고 사용될 수 있다.
IL-10 변이체 분자를 보유하는 벡터는 벡터 기능성을 위해 필요한 다른 벡터 성분을 또한 포함할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 변이체 IL-10 분자의 적절한 복제 및 발현을 위해 필요한 신호 서열, 태그 서열, 프로테아제 식별 서열, 선택 마커 및 다른 서열 조절 서열, 예컨대 프로모터를 포함할 수 있다. 벡터에서 사용되는 특정한 프로모터는 다양한 숙주 세포 유형에서 변이체 IL-10 분자의 발현을 유도할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 마찬가지로, 태그 서열이 발현된 변이체 IL-10 분자의 정제를 더욱 간단하거나 또는 용이하게 만드는 한, 태그 프로모터의 유형은 제한되지 않는다. 이들에는 예를 들어 6-히스티딘, GST, MBP, HAT, HN, S, TF, Trx, Nus, 비오틴, FLAG, myc, RCFP, GFP 등이 포함되고 사용될 수 있다. 프로테아제 인식 서열은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 인식 서열, 예컨대 인자 Xa, 트롬빈, HRV, 3C 프로테아제가 사용될 수 있다. 선택된 마커는 형질전환된 벼 식물 세포를 검출할 수 있는 한 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 네오마이신-내성 유전자, 카나마이신-내성 유전자, 히그로마이신-내성 유전자 등이 사용될 수 있다.
이어서, 원하는 IL-10 변이체 또는 융합 단백질을 보유하는 생성된 DNA 구축물은 유전자 요법에서 직접적으로 사용될 수 있거나, 또는 재조합 IL-10 변이체 또는 융합 단백질을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 출원의 변이체 IL-10 분자 또는 융합 단백질은 돌연변이성 IL-10 단백질의 직접적인 투여, 및 돌연변이성 IL-10 단백질을 코딩하는 벡터에 의한 유전자 요법을 비롯한 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 전달될 수 있다. 유전자 요법은 플라스미드 DNA 또는 바이러스 벡터, 예컨대 아데노-관련 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등을 이용하여 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 출원의 바이러스 벡터는 바이러스 입자로서 투여되고, 다르게는 이들은 플라스미드로서 (예를 들어 "네이키드" DNA로서) 투여된다.
뉴클레오티드 서열의 전달을 위한 다른 방법에는 관련 기술분야에 이미 공지된 것들이 포함된다. 이들에는 세포 투과 펩티드, 소수성 모이어티, 정전기 복합체, 리포솜, 리간드, 리포솜 나노입자, 지단백질 (바람직하게는 HDL 또는 LDL), 엽산염 표적화된 리포솜, 항체 (예컨대 엽산염 수용체, 트랜스페린 수용체), 표적화 펩티드, 또는 압타머에 의해 IL-10 또는 IL-10 변이체 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예컨대 비제한적으로 DNA, RNA, siRNA, mRNA, 올리고뉴클레오티드, 또는 그의 변이체의 전달이 포함된다. IL-10 변이체 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 직접적인 주사, 주입, 패치, 붕대, 미스트 또는 에어로졸에 의해, 또는 박막 전달에 의해 대상체에게 전달될 수 있다. 뉴클레오티드 (또는 단백질)는 시토카인 자극의 표적화된 전달을 위해 필요한 임의의 영역으로 지시될 수 있다. 이들에는 예를 들어 폐, GI 관, 피부, 간, 두개뇌 주사를 통한 뇌, 초음파 유도된 주사를 통한 심재성 전이성 종양 병변이 포함된다.
IL-10 변이체의 시험
한 실시양태에서, 변이체 IL-10 분자 또는 그의 융합 단백질은 대식세포에 의해 염증유발 시토카인 분비를 억제하지만 T 세포를 활성화시키지 않는 IL-10 동종이량체 서열을 이용하여 이전에 생성되지 않은 신규한 기능에 대해 스크리닝될 것이다. 한 바람직한 실시양태에서, 변이체 IL-10 분자 또는 그의 융합 단백질은 항염증 반응을 갖지만 T-세포를 자극하는 능력은 결여된 EBV-IL10 백본을 기반으로 할 것이다. 이들 변이체 EBV-IL10 분자 또는 그의 융합 단백질은 IL-10 동종이량체 사이의 각도를 제한하거나 또는 넓히기 위해 일차, 이차 및 삼차 구조를 변경시키는 수용체 결합 도메인 및 이전에 탐색되지 않은 영역에 대한 변형을 포함할 것이다. 또 다른 실시양태에서, 연결 영역 또는 도메인간 각도 형성을 담당하는 영역에 대한 변형을 포함하는 IL-10 변이체 분자는 증강된 CD8+ T-세포 기능을 가질 것이다. 또 다른 실시양태에서, 연결 영역 또는 도메인간 각도 형성을 담당하는 영역에 대한 변형을 포함하는 IL-10 변이체 분자 또는 그의 융합 단백질은 억제된 골수 기능 및 증강된 쿠퍼 세포 기능을 가질 것이다.
변이체 IL-10 분자 또는 그의 융합 단백질이 구축되고 발현되면, 관련 기술분야의 기술자는 분자가 IL-10 수용체 결합 영역 및/또는 도메인간 각도에 대한 변형에 의해 부여된 원하는 생물학적 기능을 갖는지 여부를 결정하기 위해 IL-10 변이체 분자 또는 그의 융합 단백질에 대한 스크리닝 검정을 수행할 수 있다. 원하는 생물학적 기능을 시험하기 위한 다수개의 스크리닝 검정이 관련 기술분야의 기술자에게 공지되어 있고 이용가능하다. 한 실시양태에서, 원하는 생물학적 기능에는 감소된 항염증 반응, 감소된 T-세포 자극, 증강된 T-세포 기능, 증강된 쿠퍼 세포 기능성 및 감소된 비만 세포 탈과립화가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
예를 들어, IL-10 노출이 T 세포 수용체 자극시에 T 세포가 더 많은 IFNγ를 생성하고 분비하도록 허용한다는 것이 공지되어 있다. 동시에, IL-10 노출은 LPS에 대한 반응으로 단핵구/대식세포로부터 분비되는 TNFα, IL-6 및 다른 염증유발 시토카인의 분비를 방지한다. IL-10은 또한 FoxP3+CD4+ Treg 증식을 억제한다. 한 실시양태에서, 자극성 및 억제성 반응 둘 다를 비롯하여 단핵구/대식세포 억제를 최대화하지만 T 세포 효과가 결여된 이들 IL-10 변이체 분자 또는 그의 융합 단백질은 양성으로 선택될 것이다. 한 실시양태에서, 증가된 항염증 효과를 갖는 IL-10 변이체 분자 또는 그의 융합 단백질에 대한 스크리닝은 자가면역, 항염증 질환 또는 이들 둘 다의 치료를 위해 양성으로 선택될 것이다. 또 다른 실시양태에서, 쿠퍼 세포 스캐빈징을 증강시키고 Treg 억제가 결여된 IL-10 변이체 분자 또는 그의 융합 단백질 또한 비알콜성 지방간염 (NASH) 및/또는 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD)의 치료를 위해 개발되도록 선택될 것이다. 또 다른 실시양태에서, 자극성 및 억제성 반응 둘 다를 비롯하여 T 세포 생물학을 최대화하고 증강된 쿠퍼 세포 스캐빈징을 또한 갖는 IL-10 변이체는 암의 치료를 위해 개발되도록 선택될 것이다.
문헌에는 예를 들어 면역계의 세포, 예컨대 T 세포, 단핵구/대식세포, 쿠퍼 세포, Treg 세포, 및 비만 세포에 대한 시토카인의 효과를 검정하는 것에 대한 설명이 충분하다. 본 출원은 본 출원의 변이체 IL-10 분자 또는 그의 융합 단백질을 접촉시킴으로써 유사한 검정을 이용하는 생물학적 반응을 시험하기 위해 이들 검정 시스템을 적용할 것이다.
T 세포 반응을 유도하는 유효성을 검정하기 위한 다양한 방법이 선행 기술에 기재되어 있다. 이들 방법 중 어느 하나는 본원에 기재된 변이체 IL-10 분자를 시험하기 위해 적용가능하다. 예를 들어, 찬(Chan) 등 (2015)은 변이체 IL-10 분자에 적용가능한 이러한 한 방법을 기재한다. CD8+ T 세포는 항-CD8 마이크로비드를 사용하여 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 단리된다. 단리된 CD8+ T 세포는 항-CD3 및 항-CD28 항체를 이용하여 활성화된다. 예를 들어, 약 3 일의 기간에 걸쳐 적어도 약 5 내지 20 마이크로그램/mL의 항-CD3 항체 및 적어도 약 1 내지 5 마이크로그램/mL의 항-CD28 항체로 코팅된 플레이트를 사용하여 활성화를 일으킬 수 있다. 활성화 후에, T 세포를 수집하고, 플레이팅하고, EBV-IL10 변이체 또는 그의 융합 단백질로 약 3-5 일의 기간 동안 처리한다. 상업적으로 입수가능한 PEG화 재조합 인간 IL-10 또는 EBV-IL10은 대조군으로 사용될 수 있다. EBV-IL10 변이체로 처리한 후에, T 세포를 가용성 항-CD3으로 처리하였다. 항-CD3으로 처리한 후에, 세포 배양 배제를 수집하고, 인터페론 감마 (IFNγ)의 분비에 대해 ELISA에 의해 검정한다.
시토카인에 의한 단핵구/대식세포 자극을 검정하기 위한 다양한 방법이 선행 기술에 기재되어 있다. 이들 방법 중 어느 하나는 본원에 기재된 변이체 IL-10 분자를 시험하기 위해 적용가능하다. 예를 들어, 콘웨이(Conway) 등 (2017)은 변이체 IL-10 분자에 적용가능한 이러한 한 방법을 기재한다. 인간 단핵구를 피콜(Ficoll) 구배를 이용하여 신선한 공여자 혈액의 버피 코트로부터 단리한 후, 퍼콜(Percoll)에서 고장성 밀도 원심분리를 수행한다. 5% 인간 혈청 및 1% L-글루타민으로 보충된 RPMI에서 30 분 배양한 후에, 단핵구는 부착성이 되고, SMEM 스피너(Spinner) 배지로 세척하여 오염 림프구를 제거한다. LPS의 부재를 보장하기 위해 용액 및 물질을 시험하였다. 배양 4 일 후에, 단핵구/대식세포를 적어도 24 시간의 기간 동안 10 ng/ml LPS 및 상이한 농도의 변이체 IL-10 분자와 접촉시키거나 또는 그와 함께 인큐베이션한다. 배양물 상청액을 수확하고, TNF-α 및 IL-1β 농도를 ELISA에 의해 결정한다.
시토카인에 대한 쿠퍼 세포 반응을 검정하기 위한 다양한 방법이 선행 기술에 기재되어 있다. 이들 방법 중 어느 하나는 본원에 기재된 변이체 IL-10 분자를 시험하기 위해 적용가능하다. 예를 들어, 찬 등 (2016)은 변이체 IL-10 분자에 적용가능한 이러한 한 방법을 기재한다. 쿠퍼 세포를 24-웰 또는 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 간세포 인큐베이션 배지 (페놀-레드 무함유 RPMI, pen/strep, 세포 유지 보충제 B (인비트로젠(Invitrogen)))에서 밤새 인큐베이션한다. 세포를 세척하고, 변이체 IL-10 분자에 24 시간 동안 노출시켰다. 세포를 1회 세척하고, 15-20 μl DiI-LDL, DiI-VLDL, DiI-OxLDL 또는 DiI-AcLDL, 2 μl DMSO, 15 μl 시토칼라신 D에 노출시키고, 4 시간 후에 흡수를 측정한다. 모든 세포를 1X PBS로 1회 세척하고, 110 μl 세포 용해 완충제에 의해 용해시킨다. 45 μl의 세포 용해물을 투명 바닥 흑색 벽 플레이트로 옮기고, 575 nm에서 형광을 판독한다.
시토카인을 이용하여 T 조절 세포 반응을 자극하는 유효성을 검정하기 위한 다양한 방법이 선행 기술에 기재되어 있다. 이들 방법 중 어느 하나는 본원에 기재된 변이체 IL-10 분자를 시험하기 위해 적용가능하다. 예를 들어, 찬 등 (2016)은 변이체 IL-10 분자에 적용가능한 이러한 한 방법을 기재한다. CD4+ T 세포를 CD4+ 마이크로비드에 의해 단리하고, 다양한 농도의 변이체 IL-10 분자 및 2 마이크로그램/mL 고정된 항-CD3 및 1 mg/mL 항-CD28을 함유하는 AIMV 배지에서 5-6 일 동안 배양한다. TGF-β 또는 IL-2가 FOX P3+ CD4+ T 조절 세포에서 유도되는지를 결정하기 위해 세포를 유세포 분석에 의해 FoxP3 발현에 대해 분석한다.
시토카인 자극에 대한 반응으로 비만 세포를 증식시키는 유효성을 검정하기 위한 다양한 방법이 선행 기술에 기재되어 있다. 뮤린 비만 세포주 MC/9는 IL-10 분자의 제조 방출 시험을 위해 사용되는 일반적인 세포주이다. 구체적으로, IL-10 및 IL-10 변이체 분자는 비만 세포의 용량 적정가능한 증식을 유도한다. 반대로, IL-10은 비만 세포에 의해 Fc 발현을 억제하고, 이는 IL-10이 이들 세포에 대한 자극 및 억제 효과 둘 다를 발휘함을 시사한다. 이들 방법 중 어느 하나는 본원에 기재된 변이체 IL-10 분자를 시험하기 위해 적용가능하다. 예를 들어, 톰슨-스나이프스(Thompson-Snipes) 등 (1991)은 변이체 IL-10 분자에 적용가능한 이러한 한 방법을 기재한다. 1 ml의 RPMI 1640, 10% FCS, 50 mM 2-ME, 및 다양한 농도의 변이체 시토카인을 함유하는 편평-바닥 24-웰 플레이트에 MC/9 비만 세포를 플레이팅한다. 3 일 동안 배양한 후, 비만 세포 증식에 대한 변이체 IL-10 분자의 영향을 결정하기 위해 세포 카운터를 이용하여 세포를 카운팅한다.
IL-10은 IgE 수용체, FcεRI 및 IgE-매개된 시토카인 생성의 비만 세포 발현을 억제하는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 비만 세포에 대한 IL-10의 영향을 시험하기 위한 방법이 선행 기술에서 기재되었다. 이들 방법은 본원에 기재된 IL-10 변이체 분자를 시험하기 위해 적용가능한다. 예를 들어, 케네디 노튼(Kennedy Norton) 등 (2008)은 이러한 한 방법을 기재한다. 인간 비만 세포를 공여자 피부 샘플로부터 단리하고, IL-10의 존재 또는 부재하에 줄기 세포 인자 (SCF)를 함유하는 배지에서 배양하였다. FcεRI 발현은 항-FcεRI 특이적인 항체에 이어 FITC-표지된 항-마우스 F(ab')2를 사용하여 유세포 분석에 의해 결정되었다.
IL-10 변이체 분자를 포함하는 조성물 및 제형
본 출원의 IL-10 변이체 분자 또는 그의 융합 단백질은 또한 치료 유효량의 변이체 IL-10 분자 및 제약학적 담체 및/또는 제약상 허용가능한 부형제를 포함하는 제약 조성물로 제형화될 수 있다. 제약 조성물은 일반적으로 사용되는 완충제, 부형제, 보존제, 안정화제에 의해 제형화될 수 있고, 제약 조성물은 원하는 치료 결과를 제공하는데 충분한 치료 유효량으로 환자에게 투여하기 위해 제형화될 것이다. 바람직하게는, 이러한 양은 최소한의 부정적인 부작용을 갖는다. 한 실시양태에서, 변이체 IL-10 분자 또는 그의 융합 단백질의 투여량은 염증 질환 또는 상태를 치료하는데 충분할 것이다. 또 다른 실시양태에서, 변이체 IL-10 분자 또는 그의 융합 단백질의 투여량은 암을 치료하는데 충분할 것이다. 투여량은 환자마다 다를 것이고, 대상체 또는 환자의 질환 또는 상태, 환자의 전반적인 건강, 투여 방법, 부작용의 중증도 등을 고려하여 결정되어야 할 것이다. 바람직한 실시양태에서, 제약 조성물은 IL-10의 수용체 결합 도메인 및/또는 도메인간 각도에 대한 변형 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 변이체 IL-10 분자 또는 그의 융합 단백질을 포함할 것이다. 또 다른 실시양태에서, 변이체 IL-10 분자는 변이체 IL-10 분자의 PEG화 형태이다. 여전히 더 바람직한 실시양태에서, 제약 조성물은 융합 단백질 또는 면역시토카인으로서 포함된 변이체 IL-10 분자 및 제약학적 부형제를 포함한다.
특정 환자에 대한 유효량은 치료할 상태, 환자의 전반적인 건강, 투여 방법의 경로 및 용량, 및 부작용의 중증도와 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 환자에게 투여되는 적절한 용량은 전형적으로 치료에 영향을 미치는 것으로 관련 기술분야에서 공지되거나 의심되거나, 또는 치료에 영향을 미치는 것으로 예측되는 파라미터 또는 인자를 이용하여 임상의에 의해 결정된다. 일반적으로, 용량은 최적 용량보다 다소 적은 양으로 시작하고, 그 후에 임의의 부정적인 부작용에 비해 원하는 또는 최적의 효과가 달성될 때까지 소량씩 증가된다. 중요한 진단 척도에는 예를 들어 염증의 증상 또는 생성된 염증유발 시토카인의 수준이 포함된다.
환자에게 투여되는 용량은 또한 IL-10 또는 변이체 IL-10 분자에 대한 특정한 혈청 반감기 연장 변형의 추가를 기반으로 하여 최적화될 수 있다 (예를 들어, PEG화 IL-10을 참고하며, 예를 들어 미국 특허 9,943,568, 10,010,588 및 10,143,726에서 상세하게 논의되어 있고, IL-10의 순환 반감기를 개선시키는 것으로 공지되어 있음). 본원에 개시된 IL-10 또는 변이체 IL-10을 포함하는 융합 단백질, 면역접합체, 융합 단백질, 미노바디, 및 디아바디는 또한 IL-10 수용체에 대한 높은 친화도 결합을 유지하면서 동시에 순환 반감기를 연장시킬 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, IL-10과 연관이 있거나 또는 IL-10 또는 변이체 IL-10을 포함하는 융합 단백질, 융합 단백질의 복합체, 면역접합체, 또는 디아바디를 투여함으로써 개선될 수 있는 다양한 질환, 장애 또는 상태는 그를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, IL-10과 연관된 질환, 장애 또는 상태는 그를 필요로 하는 환자에게 EBV IL-10 또는 그의 변이체 (IL-10 수용체 결합 친화도에 영향을 미치는 변이체 포함)를 갖는 면역접합체 복합체, 융합 단백질, 또는 디아바디의 치료 유효량을 투여함으로써 치료되거나 또는 예방될 수 있고, 면역접합체 복합체, 융합 단백질, 또는 디아바디는 약 60 내지 155 kDa의 분자량을 갖고, 치료 유효량은 약 0.5 마이크로그램/킬로그램 내지 100 마이크로그램/킬로그램의 범위이다. 본원에 기재된 면역접합체, 융합 단백질, 또는 디아바디는 매일, 주 3회, 주 2회, 매주, 격월로, 또는 매월 투여될 수 있다. 면역접합체, 융합 단백질, 또는 디아바디의 EBV IL-10 부분 및 가변 영역은 본원에서 논의된 이들 구조의 임의의 배치 또는 조합일 수 있다. 본원에 기재된 반감기 연장된 분자는 암, 염증 질환, 자가면역 질환 (예를 들어, 비알콜성 지방간염 (NASH) 또는 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD)), 및 상승된 콜레스테롤을 비롯하여 이로 제한되지 않는 다양한 질환을 치료하는데 효과적일 것이다.
제2 치료제, 예를 들어 시토카인, 스테로이드, 화학요법제, 항생제, 항염증제, 또는 방사선에 의한 공동 투여 또는 치료 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이들은 다른 치료제, 예컨대 비제한적으로 다음 중 하나 이상과의 조합 치료를 포함할 수 있다: 인터페론-β, 예를 들어, IFNβ-1α 및 IFN-β-1 β; 미엘린 염기성 단백질을 시뮬레이션하는 단백질; 코르티코스테로이드; IL-1 억제제; TNF 억제제; 항-TNFα 항체, 항-IL-6 항체, IL-1br-Ig 융합, 항-IL-23 항체, CD40 리간드 및 CD80에 대한 항체; IL-12 및 IL-23의 길항제, 예를 들어 IL-12 및 IL-23의 p40 서브유닛의 길항제 (예를 들어, p40 서브유닛에 대한 억제성 항체); IL-22 길항제; 소분자 억제제, 예를 들어 메토트렉세이트, 레플루노미드, 시롤리무스 (라파마이신) 및 그의 유사체, 예를 들어 CCI-779; Cox-2 및 cPLA2 억제제; NSAID; p38 억제제; TPL-2; Mk-2; NFkβ 억제제; RAGE 또는 가용성 RAGE; P-셀렉틴 또는 PSGL-1 억제제 (예를 들어, 소분자 억제제, 그에 대한 항체, 예를 들어 P-셀렉틴에 대한 항체); 에스트로겐 수용체 베타 (ERB) 효능제 또는 ERB-NFkβ 길항제.
추가로, IL-10 변이체 분자 또는 그의 융합 단백질과의 투여에 유용한 조합 치료에는 TNF 억제제, 예를 들어, TNF에 결합하는 키메라, 인간화, 효과적으로 인간, 인간 또는 시험관내 생성된 항체, 또는 그의 항원-결합 단편; TNF 수용체의 가용성 단편, 예를 들어, p55 또는 p75 인간 TNF 수용체 또는 그의 유도체, 예를 들어, 75 kdTNFR-IgG (75 kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질, 엔브렐(ENBREL)™), p55 kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질; 및 TNF 효소 길항제, 예를 들어, TNFα 전환 효소 (TACE) 억제제가 포함될 수 있다. 항염증제/약물과의 다른 조합 치료에는 표준 비스테로이드성 항염증 약물 (NSAID) 및 시클로-옥시게나제-2 억제제가 포함되나 이로 제한되지 않는다. NSAID에는 아스피린, 셀레콕시브, 디클로페낙, 디플루니살, 에토돌락, 이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 케토롤락, 나부메톤, 나프록센, 옥사프로진, 피록시캄, 살사레이트, 술린닥, 및/또는 톨메틴이 포함될 수 있다. 본 출원에 따른 조성물에서 사용되는 시클로-옥시게나제-2 억제제는 예를 들어 셀레콕시브 또는 로페콕시브일 수 있다.
IL-10 변이체 분자 또는 그의 융합 단백질과 공동 투여될 수 있고/거나 공동 제형화될 수 있는 추가의 치료제에는 다음 중 하나 이상이 포함된다: 인터페론-β, 예를 들어, IFN β-1α 및 IFN β-1β; 코팍손(COPAXONE)®; 코르티코스테로이드; IL-1 억제제; TNF 길항제 (예를 들어, TNF 수용체의 가용성 단편, 예를 들어 p55 또는 p75 인간 TNF 수용체 또는 그의 유도체, 예를 들어, 75 kdTNFR-IgG; CD40 리간드 및 CD80에 대한 항체; 및 IL-12 및/또는 IL-23의 길항제, 예를 들어 IL-12 및 IL-23의 p40 서브유닛의 길항제 (예를 들어, IL-12 및 IL-23의 p40 서브유닛에 결합하는 억제성 항체); 메토트렉세이트, 레플루노미드, 및 시롤리무스 (라파마이신) 또는 그의 유사체, 예를 들어, CCI-779. 다른 치료제에는 임핌지 또는 아테졸리줌브가 포함될 수 있다.
NASH를 치료하기 위해, 예를 들어 IL-10 변이체 분자 또는 그의 융합 단백질을 콜레스테롤 강하제, 예컨대 스타틴 및 비-스타틴 약물과 조합할 수 있다. 이들 작용제에는 심바스타틴, 아토르바스타틴, 로수바스타틴, 로바스타틴, 프라바스타틴, 겜피브로질, 플루바스타틴, 콜레스티라민, 페노피브레이트, 콜레스테롤 흡수 억제제, 담즙산-결합 수지 또는 격리제, 및/또는 마이크로솜 트리글리세리드 전달 단백질 (MTP) 억제제가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
치료제의 유효량은 증상을 완화시킴으로써 염증 또는 질환 또는 상태의 수준에 영향을 미칠 것이다. 예를 들어, 질환 또는 상태가 경감되거나 또는 완전히 치료되도록 상기 영향에는 적어도 10%; 적어도 20%; 적어도 약 30%; 적어도 40%; 적어도 50%; 또는 그 초과인 영향의 수준이 포함될 수 있다.
변이체 IL-10 분자 또는 그의 융합 단백질을 포함하는 제약 조성물은 제약상 허용가능한 담체 또는 부형제와 혼합된다. 다양한 제약학적 담체가 관련 기술분야에 공지되어 있고, 제약 조성물에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 담체는 본 출원의 변이체 IL-10 분자 조성물을 환자에게 전달하기에 적합한 임의의 상용성 무독성 물질일 수 있다. 적합한 담체의 예에는 생리식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 및 행크스 용액이 포함된다. 담체에는 또한 2900 (L64), 3400 (P65), 4200 (P84), 4600 (P85), 11,400 (F88), 4950 (P103), 5900 (P104), 6500 (P105), 14,600 (F108), 5750 (P123), 및 12,600 (F127)의 분자량을 갖는 것들을 비롯하여 이로 제한되지 않는 관련 기술분야의 기술자에게 일반적으로 공지된 임의의 폴록사머가 포함될 수 있다. 담체에는 또한 몇가지 예를 들면 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 및 폴리소르베이트 80을 비롯하여 이로 제한되지 않는 유화제가 포함될 수 있다. 비수성 담체, 예컨대 고정유 및 에틸 올레에이트 또한 사용될 수 있다. 담체에는 또한 첨가제, 예컨대 등장성 및 화학적 안정성을 증강시키는 물질, 예를 들어 완충제 및 보존제가 포함될 수 있으며, 예를 들어 [Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1984)]를 참고한다. 치료적 및 진단적 작용제의 제형은 예를 들어 동결건조된 분말, 슬러리, 수성 용액 또는 현탁액의 형태로 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 제조될 수 있다.
본 출원의 조성물은 경구로 투여되거나 또는 신체로 주사될 수 있다. 경구 사용을 위해 제형은 위장관에서 프로테아제로부터 변이체 IL-10 분자를 추가로 보호하기 위한 화합물을 포함할 수 있다. 주사는 일반적으로 근육내, 피하, 피내 또는 정맥내이다. 대안적으로, 적절한 상황에서 관절내 주사 또는 다른 경로가 이용될 수 있다. 비경구 투여되는 변이체 IL-10 분자는 바람직하게는 제약학적 담체 및/또는 제약상 허용가능한 부형제와 회합된 단위 용량 주사가능한 형태 (용액, 현탁액, 에멀젼)로 제형화된다. 다른 실시양태에서, 본 출원의 조성물은 이식가능한 또는 주사가능한 약물 전달 시스템에 의해 환자의 신체로 도입될 수 있다.
IL-10 변이체의 치료적 용도
한 실시양태에서, 본 출원은 염증, 염증 질환 또는 자가면역 질환과 연관된 증상을 치료하거나, 경감시키거나 또는 감소시키는 방법을 제공한다. 본 출원은 또한 염증, 염증 질환 또는 자가면역 질환, 암, 또는 종양을 위한 의약으로서 사용하기 위한 IL-10, IL-10 변이체 분자, 그의 융합 단백질 또는 키메라 분자를 제공한다. 본 출원은 또한 염증 또는 염증 질환, 또는 자가면역 질환, 암, 또는 종양의 치료에 사용하기 위해 IL-10, IL-10 변이체 분자, 그의 융합 단백질 또는 키메라 분자의 사용을 고려한다. 이들에는 예를 들어 몇가지 예를 들면 IBD, 크론 질환, 궤양성 대장염, NASH, NAFLD, 고콜레스테롤혈증, 또는 암이 포함된다. 상기 방법은 본원에 기재된 변이체 IL-10 분자 또는 그의 융합 단백질 중 하나 이상의 치료 유효량을 투여하는 것을 고려한다. 한 실시양태에서, 본 출원은 수용체 결합 도메인 및/또는 도메인간 각도의 형성을 담당하는 영역과 연관된 하나 이상의 변형을 포함하는 변이체 IL-10 분자의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 염증 질환 또는 자가면역 질환의 치료 방법을 포함한다. 한 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 변이체 EBV-IL10 분자 또는 그의 융합 단백질을 투여하는 것을 포함한다. 한 바람직한 실시양태에서, 염증 질환의 치료에 유용한 변이체 IL-10 분자 또는 그의 융합 단백질은 야생형 IL-10 분자와 비교하여 제한된 도메인간 각도를 갖고/거나 또한 더 낮은 수용체 친화도를 나타내는 변이체 분자를 포함한다. 다른 실시양태에서, 염증 질환의 치료에 유용한 변이체 IL-10 분자 또는 그의 융합 단백질은 야생형 IL-10 분자와 비교하여 이완된 도메인간 각도를 갖고/거나 또한 더 낮은 수용체 친화도를 나타내는 변이체 분자를 포함한다. 염증 질환 또는 염증을 위한 변이체 IL-10 분자의 PEG화 형태 또한 본 출원의 일부로서 구상된다.
본 출원의 염증 질환 또는 자가면역 질환에는 원치않는 또는 바람직하지 않은 염증 및 면역 반응과 연관된 임의의 질환 또는 상태가 포함된다. 이들 질환에는 염증성 장 질환 (IBD), 크론 질환, 건선, 류마티스성 관절염, 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD) 또는 비알콜성 지방간염 (NASH)이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 다른 실시양태에서, 질환 또는 상태에는 신경변성 장애, 예컨대 파킨슨(Parkinson) 질환, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 치명적인 가족성 불면증, 라스무센(Rasmussen) 뇌염, 다운(Down) 증후군, 헌팅턴(Huntington) 질환, 게르스트만-스트라우슬러-샤인커(Gerstmann-Straussler-Scheinker) 질환, 결절성 경화증, 신경원성 세로이드 리포푸신증, 아급성 경화성 범뇌염, 라임(Lyme) 질환; 체체(tse tse) 질환 (아프리카 수면병), HIV 치매, 소 해면모양 뇌병증 ("광우병" 질환); 크로이츠펠트 야콥(Creutzfeldt Jacob) 질환; 단순 포진 뇌염, 대상포진 소뇌염, 진행성 마비 (매독), 결핵성 수막염, 결핵성 뇌염, 시신경염, 육아종성 혈관염, 측두 관절염, 대뇌 맥관염, 스파츠-린덴베르그(Spatz-Lindenberg) 질환, 메트암페타민-관련 맥관염, 코카인-관련 맥관염, 외상성 뇌 손상, 졸중, 란스-아담스(Lance-Adams) 증후군, 무산소후 뇌병증, 방사선 괴사, 변연계 뇌염, 알츠하이머(Alzheimer) 질환, 진행성 핵상 마비, 선조체흑질 변성, 피질기저 신경절 변성, 원발성 진행성 실어증, 염색체 17과 연관된 전두측두 치매, 척추 근위축증, HIV-관련 골수병증, HTLV-1-관련 골수병증 (열대성 경련성 마비), 척수로 (매독), 횡단 척수염, 폴리오후 증후군, 척수 손상, 방사선 골수병증, 샤르코-마리-투쓰(Charcot-Marie-Tooth), HIV-관련 다발신경병증, 캄필로박터-관련 운동 축삭병, 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증, 당뇨병성 근위축증 박리, 환각지, 복합 부위 통증 증후군, 당뇨병성 신경병증, 부신생물성 신경병증, 근긴장성 이영양증, HTLV-1-관련 근병증, 선모충증, 염증성 근병증 (다발근육염, 봉입체 근육염, 피부근육염), 겸상 세포 질환, 알파-1-항트립신 결핍, 결핵, 아급성 세균성 심내막염, 만성 바이러스성 간염, 바이러스성 심근병증, 샤가스(Chaga's) 질환, 말라리아, 콕사키 B 감염, 황반 변성, 색소성 망막염, 맥관염, 염증성 장 질환, 류마티스성 관절염, 수포성 천포창, 처그-스트라우스(Churg-Strauss) 증후군, 심근 경색, 독성 표피 괴사성 용해, 쇼크 (예를 들어, 급성 아나필락시스성 쇼크), 제1형 당뇨병, 자가면역 갑상선염, 림프종, 난소암, 낭창 (전신 홍반성 낭창), 천식, 조로증, 유육종증, 제2형 당뇨병 및 대사 증후군이 포함된다. 본 출원의 실시양태인 염증과 연관된 다른 질환 또는 상태에는 염증성 폐 장애, 예컨대 기관지염, 산화제-유도된 폐 손상 및 만성 폐쇄성 기도 질환; 눈의 염증 장애, 예컨대 각막 이영양증, 고안압증, 트라코마, 사상충증, 망막염, 포도막염, 교감성 안염 및 내안구염; 치은의 만성 염증 장애, 예컨대 치주염; 관절의 만성 염증 장애, 예컨대 관절염, 패혈성 관절염 및 골관절염, 결핵 관절염, 나병 관절염, 유육종 관절염; 피부의 장애, 예컨대 경화성 피부염, 일광 화상, 건선 및 습진; 뇌척수염 및 바이러스 또는 자가면역 뇌염; 자가면역 질환, 예컨대 면역-복합체 맥관염, 및 심장의 질환, 예컨대 허혈성 심장 질환, 심부전 및 심근병증이 포함된다. 변이체 IL-10 분자 또는 그의 융합 단백질로부터 이익을 얻을 수 있는 질환의 다른 비제한적인 예에는 부신 기능부전; 고콜레스테롤혈증; 아테롬성 동맥 경화증; 증가된 골 재흡수와 연관된 골 질환, 예를 들어 골다공증, 전자간증, 자간증, 요독 합병증; 만성 간부전, 및 염증과 연관된 다른 장애, 예컨대 낭성 섬유증, 결핵, 악액질, 허혈/재관류, 혈액투석 관련 상태, 사구체 신염, 재발 협착증, 바이러스 감염의 염증성 후유증, 저산소증, 고압 산소 경련 및 독성, 치매, 시드남(Sydenham) 무도병, 헌팅턴 질환, 간질, 코르사코프(Korsakoff) 질환, 뇌혈관 장애와 관련된 저능, NO 매개된 뇌 외상 및 관련된 후유증, 허혈성 뇌부종 (졸중), 편두통, 구토, 면역 복합 질환, 동종 이식편 거부반응, 침습성 미생물에 의해 유발된 감염; 및 노화가 포함된다.
항염증 질환 또는 상태를 치료하는데 가장 효과적인 IL-10 변이체 또는 그의 융합 단백질에는 T-세포를 자극하는 능력이 저하된 것들이 포함된다. 따라서, 위치 75에서 아미노산 치환을 통한 수용체 결합 도메인의 변형이 최소량의 T 세포 자극을 유도하는 것으로 본 출원의 발명자들에 의해 나타났다. 특히, 서열식별번호: 3에서 A75I 치환 (또는 서열식별번호 57)을 보유하는 EBV IL-10은 T-세포 자극을 감소시키는 것으로 나타났다 (예를 들어, 도 8e 참고, DV06으로 표시됨). 따라서, 한 특히 바람직한 실시양태는 DV06 기반 돌연변이 (서열식별번호: 3의 아미노산 위치 75에서의 치환, 또는 서열식별번호 57)를 보유하는 IL-10 변이체 분자를 갖는 디아바디 및 모노바디의 사용을 고려한다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 염증 질환의 방법은 서열식별번호: 26-27; 37; 40;41-42, 43, 48-49 또는 이들의 조합물을 포함하는 융합 단백질 또는 융합 단백질 복합체를 사용할 것이다.
본 출원의 또 다른 실시양태에서, 치료 방법은 암과 연관된 증상을 치료하거나 또는 감소시키기 위해 IL-10 또는 변이체 IL-10 분자 또는 그의 융합 단백질을 투여하는 것을 포함한다. 상기 방법은 본원에 기재된 IL-10 또는 변이체 IL-10 분자 또는 그의 융합 단백질 중 하나 이상의 치료 유효량을 투여하는 것을 고려한다. 한 실시양태에서, 본 출원은 수용체 결합 도메인 및/또는 도메인간 각도의 형성을 담당하는 영역과 연관된 하나 이상의 변형을 포함하는 변이체 IL-10 분자의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 암과 연관된 증상을 치료하거나 또는 감소시키는 방법을 포함한다. 한 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 변이체 EBV-IL10 분자 또는 그의 융합 단백질을 투여하는 것을 포함한다. 암의 치료에 유용한 변이체 IL-10 분자 또는 그의 융합 단백질은 야생형 IL-10 분자와 비교하여 제한된 도메인간 각도를 갖고/거나 또한 더 높은 수용체 친화도를 나타내는 변이체 분자를 포함한다. 암과 연관된 증상을 치료하거나 또는 감소시키는데 유용한 변이체 IL-10 분자 또는 그의 융합 단백질은 야생형 IL-10 분자와 비교하여 이완된 도메인간 각도를 갖고/거나 또한 더 높은 수용체 친화도를 나타내는 변이체 분자를 포함한다. 암의 치료를 위한 변이체 IL-10 분자의 PEG화 형태 또한 본 출원의 일부로 구상된다. 생체내 종양 부피를 감소시킬 수 있는 융합 단백질의 한 특정한 예에는 서열식별번호: 3의 아미노산 위치 31 및 75에서 2개의 치환을 보유하는 IL-10 변이체가 포함되며, 이는 DV07 (예를 들어, 서열식별번호:59)로 명명되는 V31L 및 A75I의 특이적인 치환을 포함한다. 도 16a-c는 다양한 용량에서 D:DV07로 명명되는 디아바디 구조에 접합된 DV07 EBV IL-10 분자를 포함하는 융합 단백질이 7 및 10 일의 시간 경과에 따라 종양 부피를 감소시켰음을 입증한다. 따라서, 한 특히 바람직한 실시양태는 DV07 기반 돌연변이 (서열식별번호: 3의 아미노산 위치 31 및 75에서의 치환; 또는 서열식별번호: 59)를 보유하는 IL-10 변이체 분자를 갖는 디아바디 및 모노바디의 사용을 고려한다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 암 또는 종양학 또는 종양학의 치료 방법은 서열식별번호: 28-29; 33; 34; 35-36; 38-39; 46-47, 61, 63, 65 또는 67; 또는 이들의 조합물을 포함하는 융합 단백질 또는 융합 단백질 복합체를 사용할 것이다.
본원에 기재된 변이체 IL-10 분자 또는 그의 융합 단백질에 의해 치료가능한 암 또는 증식성 장애에는 자궁, 자궁경부, 유방, 전립선, 고환, 음경, 위장관, 예를 들어, 식도, 구인두, 위, 소장 또는 대장, 결장, 또는 직장, 신장, 신장 세포, 방광, 골, 골수, 피부, 두경부, 피부, 간, 담낭, 심장, 폐, 췌장, 타액선, 부신, 갑상선, 뇌, 예를 들어 신경교종, 결절종, 중추신경계 (CNS) 및 말초신경계 (PNS), 및 면역계, 예를 들어, 비장 또는 흉선의 암을 비롯하여 이로 제한되지 않는 다양한 형태의 암이 포함된다. 본 출원은 예를 들어 면역원성 종양, 비-면역원성 종양, 휴면 종양, 바이러스-유도된 암, 예를 들어 상피 세포암, 내피 세포암, 편평상피 세포 암종, 유두종 바이러스, 선암종, 림프종, 암종, 흑색종, 백혈병, 골수종, 육종, 기형암종, 화학적으로-유도된 암, 전이, 및 혈관신생을 치료하는 방법을 제공한다. 본 출원은 또한 예를 들어 조절 T 세포 (Treg) 및 또는 CD8+ T 세포의 활성을 조절함으로써 종양 세포 또는 암 세포 항원에 대한 내성을 감소시키는 것을 고려한다. 바람직한 실시양태에서, IL-10 변이체 분자는 전이성 간 질환을 가진 환자 또는 대상체를 치료하는데 특히 유용하다.
여전히 다른 실시양태에서, 염증 질환 또는 암과 연관된 증상을 치료하거나 또는 감소시키는 방법은 변이체 IL-10 분자 또는 그의 융합 단백질 또는 그의 유도체화된 형태 (예를 들어, PEG화)를 다른 치료제와 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 이들 치료제에는 비제한적으로 시토카인 또는 시토카인 길항제, 예컨대 IL-12, IL-2, IL-15, 인터페론-알파, 또는 항-표피 성장 인자 수용체, 독소루비신, 에피루비신, 항엽산제, 예를 들어, 메토트렉세이트 또는 플루오르우라실, 이리노테칸, 시클로포스파미드, 방사선 요법, 호르몬 또는 항-호르몬 요법, 예를 들어, 안드로겐, 에스트로겐, 항-에스트로겐, 플루타미드, 또는 디에틸스틸베스트롤, 수술, 타목시펜, 이포스파미드, 미토락톨, 알킬화제, 예를 들어, 멜팔란 또는 시스-플라틴, 에토포시드, 비노렐빈, 빈블라스틴, 빈데신, 글루코코르티코이드, 히스타민 수용체 길항제, 혈관신생 억제제, 방사선, 방사선 민감제, 안트라시클린, 빈카 알칼로이드, 탁산, 예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀, 세포 주기 억제제, 예를 들어, 시클린-의존성 키나제 억제제, 또 다른 종양 항원에 대한 모노클로날 항체, 모노클로날 항체 및 독소의 복합체, T 세포 아주반트, 골수 이식편, 또는 항원 제시 세포, 예를 들어, 수지상 세포 요법이 포함된다.
다른 실시양태에서, 본 출원은 또한 변이체 IL-10 분자 또는 그의 유도체화된 형태 (예를 들어, PEG화)를 투여하는 것을 포함하는, 지질-관련 장애, 예컨대 고콜레스테롤혈증 및 고트리글리세리드혈증을 치료하고/거나 지질 파라미터, 예컨대 총 콜레스테롤, 고밀도 지단백질 (HDL) 콜레스테롤, 저밀도 지단백질 (LDL) 콜레스테롤, 초저밀도 지단백질 (VLDL) 콜레스테롤, 트리글리세리드, 및 비-HDL 콜레스테롤을 개선시키는 방법을 구현한다.
지질-관련 질환 또는 장애를 치료하는데 가장 효과적인 IL-10 변이체 또는 그의 융합 단백질에는 대식세포에 대한 최소의 억제 능력을 갖는 것들이 포함된다. 따라서, (동종이량체의 증가된 도메인간 각도와 커플링된) 위치 31의 아미노산 치환을 통한 수용체 결합 도메인의 변형이 최소량의 대식세포 반응을 유도하는 것으로 본 출원의 발명자들에 의해 나타났다. 특히, 서열식별번호: 3에서 V31L 치환을 보유하는 EBV IL-10은 대식세포 반응을 감소시키는 것으로 나타났다 (예를 들어, 도 8a 참고, DV05 또는 서열식별번호 55로 표시됨). 따라서, 한 특히 바람직한 실시양태는 DV05 기반 돌연변이 (서열식별번호: 3의 아미노산 위치 31에서의 치환, 또는 서열식별번호 55)를 보유하는 IL-10 변이체 분자를 갖는 디아바디 및 모노바디의 사용을 고려한다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 지질 기반 질환 또는 장애를 치료하는 방법은 서열식별번호: 24-25; 50-51; 또는 45를 포함하는 융합 단백질 또는 융합 단백질 복합체를 사용할 것이다.
본 출원의 또 다른 실시양태에서, IL-10 변이체 분자 또는 그의 융합 단백질, 바이러스 IL-10 (EBV 또는 CMV IL-10 포함), 또는 야생형 IL-10 (이들 중 임의의 것은 임의적으로 PEG화 또는 HES화를 포함할 수 있음)은 비만 세포 탈과립화를 감소시킴으로써 비만 세포를 표적화하는 방법에서 사용된다. 바람직한 실시양태에서, 비만 세포의 표적화 방법은 계절성 알러지 또는 급성 아나필락시스성 반응을 치료하기 위해 바이러스 IL-10 또는 IL-10 변이체 분자를 접촉시키는 것을 포함한다. 또 다른 측면에서, IL-10 변이체 분자, 바이러스 IL-10 (EBV 또는 CMV IL-10 포함), 또는 야생형 IL-10은 IgE 반응성을 감소시키는 방법에서 사용된다.
또 다른 실시양태에서, 바람직하게는 본 출원의 IL-10 변이체 분자 또는 그의 융합 단백질은 환자 집단을 스크리닝할 때 기재된 방법 (예를 들어, 항염증 및/또는 암)에서 유용하다. 한 실시양태에서, 상승된 또는 높은 IFNγ 반응인 프로파일을 나타내는 이들 환자는 암을 치료하기 위해 IL-10 변이체 분자를 사용하는데 가장 민감하거나 또는 이상적이다. 또 다른 실시양태에서, 감소된 또는 낮은 IFNγ 반응인 프로파일을 나타내는 이들 환자는 항염증을 치료하기 위해 IL-10 변이체 분자를 사용하는데 가장 민감하거나 또는 이상적이다.
본 출원의 넓은 범위는 하기 실시예를 참고하여 가장 잘 이해되며, 본 출원은 임의의 구체적인 실시양태로 제한되는 것으로 의도된지 않는다. 본원에서 모든 인용은 각각의 개별 공보 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참고로 포함되는 것으로 나타낸 것과 같이 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다.
관련 기술분야의 기술자에게 자명한 바와 같이 본 출원의 여러 변형 및 변동은 그의 개념 및 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다. 본원에 기재된 구체적인 실시양태는 예시를 위해 제공되며, 본 출원은 청구범위가 부여된 등가물의 전체 범위와 함께 첨부된 청구범위의 측면에서 제한되어야 하고; 본 출원은 예시를 위해 본원에 제시된 구체적인 실시양태로 제한되지 않아야 한다. 추가로, 상기 명세서에 인용된 모든 참고문헌, 특허 및 특허 출원은 본원에 참고로 포함된다.
실시예
하기 실시예는 단지 본 출원의 다양한 실시양태를 예시하는 것이며, 어떠한 방식으로도 본 출원의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1
EBV-IL-10 변이체 또는 그의 융합 단백질은 표준 분자 생물학 클로닝 기술을 통해 일차 서열을 변경시킴으로써 구축된다. 일차 서열에서의 변경은 수용체 결합 도메인의 친화도를 변경시키는 것 뿐만 아니라 도메인간 각도를 개방 또는 폐쇄하도록 설계된다. 수용체 친화도는 성숙한 분비된 서열에서 위치 31 및/또는 75에서 및 그 주변에서 아미노산을 변화시킴으로써 변경될 수 있다. 도메인간 각도가 변경될 수 있으며, 예를 들어 비제한적으로 나선 C 및 D, 및 D 및 E 사이의 비-알파 나선 서열에서 프롤린을 도입시킬 수 있다. 프롤린은 일차 아미노산 서열의 선형 방향으로 꼬임을 유도하고, 이는 D 및 E 나선의 이차 및 삼차 구조에 의해 유도된 후속적인 도메인간 각도를 잠재적으로 변경시킨다. 유사하게, 벌크 측쇄를 갖는 아미노산, 예컨대 트립토판의 도입은 일차 아미노산 백본의 선형 구조에 덜 유의한 변경을 도입시켜, 이차 및 삼차 구조에 대해 덜 현저한 변화를 생성할 수 있다.
실시예 2
하기 실시예는 변이체 IL-10 분자 또는 그의 융합 단백질이 대식세포에서 어떻게 평가되는지에 대한 설명을 제공한다.
건강한 환자 집단으로부터 또는 염증 질환 (예를 들어, 크론 질환)을 앓고 있는 환자로부터의 인간 혈액을 채취하고, 새로 채취된 버피 코트를 가공하여, 표준 피콜 밀도 구배 원심분리 절차를 이용하여 PBMC를 수확한다. 이어서, 제조자의 지침에 따라 이지셉(EasySep)TM 인간 단핵구 농축 키트 (Cat# 19059, 스템 셀 테크놀로지즈(Stem Cell Technologies))를 사용하여 PBMC를 CD14+ 단핵구 세포의 농축에 적용시킨다. 농축 효율은 표준 유세포 분석에 의해 평가된다.
농축된 단핵구를 5% 인간 혈청 및 PSG로 보충된 RPMI 배지에서 2 x 106 세포/mL/웰로 24-웰 플레이트에 플레이팅한다. 세포를 37℃/5%CO2 가습 인큐베이터에서 1 시간 동안 변이체 IL-10 분자의 계열 희석 (0, 0.1, 1, 10, 100, 1000 ng/mL)으로 처리한 다음, 10 ng/mL LPS (Cat# L4391, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))에 12-16 시간 동안 노출시킨다. 밤새 인큐베이션한 후에, 상청액을 수확하고, 염증유발 시토카인 (IL-6, TNFα, IL-1β)을 표준 ELISA에 의해 또는 아이큐 스크리너(iQue Screener) (인텔리사이트(Intellicyt))를 이용하여 측정한다.
연구에서, 상기 기재된 절차를 이용하여, 대식세포에 대한 면역 억제 능력에 대한 비-PEG화 EBV-IL10 및 비-PEG화 인간 IL-10의 영향을 비교한다. 도 2a, 2b 및 3a, 3b는 EBV-IL10이 염증유발 시토카인 IL-1β 및 TNFα을 억제하는 능력을 유지하였음을 도시하고, 이는 도메인간 각도에서 차이가 있음에도 불구하고, EBV-IL10이 인간 IL-10과 유사한 방식으로 그의 염증 억제 능력을 유지할 수 있음을 나타낸다.
실시예 3
하기 실시예는 변이체 IL-10 분자 또는 그의 융합 단백질이 인간 CD8+ T-세포에서 어떻게 평가되는지에 대한 설명을 제공한다.
건강한 환자 집단으로부터 또는 염증 질환 (예를 들어, 크론 질환)을 앓고 있는 환자로부터의 인간 혈액을 채취하고, 새로 채취된 버피 코트를 가공하여, 표준 피콜 밀도 구배 원심분리 절차를 이용하여 PBMC를 수확한다. 이어서, 제조자의 지침에 따라 이지셉TM 인간 CD8+ T 세포 농축 키트 (Cat# 19053, 스템 셀 테크놀로지즈)를 사용하여 PBMC를 CD8+ T 세포의 농축에 적용시킨다. 농축 효율은 표준 유세포 분석 방법에 의해 평가된다. 농축된 세포를 AIMV (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), Cat# 12055083) 배양 배지에 현탁시킨다. 37℃/5%002 가습 세포 배양 인큐베이터에서 인큐베이션함으로써 24-웰 플레이트를 2 시간 동안 10 마이크로그램/mL의 항-CD3 (Cat# 16-0039-85, 써모 피셔 사이언티픽) 및 2 마이크로그램/mL의 항-CD28 (Cat# 16-0289-85, 써모 피셔 사이언티픽)로 코팅한 후, 1X PBS로 1-2회 세척한다.
농축된 CD8+ T 세포 (3 x 106/mL/웰)를 항-CD3/항-CD28 코팅된 플레이트에 첨가하고, 72 시간 동안 37℃/5%CO2 가습 세포 배양 인큐베이터에서 인큐베이션한다.
72 시간 후에, 세포를 수확하고, 카운팅하고, 변이체 IL-10 분자 또는 대조군 샘플의 계열 희석 (0, 0.1, 1, 10, 100, 1000 ng/mL - 100 μL/웰에서 첨가)의 존재/부재하에 100 μl를 둥근 바닥 96-웰 플레이트 (2 x105 세포/웰)에 재플레이팅한다. 시험은 3중으로 실시한다. 변이체 IL-10 분자 또는 그의 융합 단백질을 갖는 세포를 72 시간 동안 37℃/5%CO2 가습 인큐베이터에서 인큐베이션한다. 72 시간 후에, 세포를 수집하고, 세척하고, 가용성 항-CD3 (Cat# 16-0039-85, 써모 피셔 사이언티픽)의 존재하에 4 시간 동안 37℃/5%CO2 가습 인큐베이터에서 새로운 둥근 바닥 96 웰-플레이트에 재플레이팅한다.
연구에서, 상기 기재된 절차를 이용하여, CD8+ T 세포의 자극에 대한 비-PEG화 EBV-IL10 및 비-PEG화 인간 IL-10의 영향을 비교한다. 도 2c 및 3c는 EBV-IL10이 인간 IL-10과 비교할 때 감소된 수준의 IFNγ (T-세포 자극의 척도)를 나타내었음을 도시한다. 이는 도메인간 각도를 변경시킴으로써 T-세포의 자극을 조절하는 능력이 있음을 나타낸다. 도 4a 및 4b는 처리된 공여자의 절반은 원하는 완전한 항염증 효과를 나타내고, 절반은 그렇지 않음을 도시한다. 개발을 위해 선택된 변이체는 공여자 1의 반응, 대식세포 세포에 의한 LPS에 대한 반응으로 염증유발 시토카인 분비의 완전한 억제, 및 활성화된 CD8+ T 세포로부터 IFNγ 유도의 결여를 모방할 것이다. 공여자 2는 공여자 1에 대한 단핵구/대식세포에 의한 염증유발 시토카인 분비의 유사한 억제를 나타내었지만, T 세포 IFNγ 분비의 곡선 및 최대 활성화만을 우측으로 이동시켰다. 수용체 친화도 및 도메인간 각도를 변경시키는 IL-10 변이체 분자는 공여자 2와 유사한 환자에서 T 세포 활성화를 추가로 감소시켜야 한다.
실시예 4
ATCC로부터 구입한 인간 단핵구/대식세포, T 세포 및 뮤린 MC/9 세포를 이전에 나타낸 바와 같이 배양하였고, 모노 또는 디-N-말단 5kDa PEG화 EBV-IL10에 대한 반응을 평가하였다. EBV-IL10의 PEG화는 LPS에 대한 대식세포 반응을 약간 감소시키지만 (도 5b), 자극된 T 세포로부터 IFNγ 유도를 거의 완전히 억제시킨다 (도 5c). 마찬가지로, EBV-IL10의 PEG화는 MC/9 세포에 대한 그의 자극 효과를 거의 제거한다 (도 5a).
항-CD3α 및 항-EGFR VH 및 VL 영역을 갖는 다양한 형태의 EBV-IL-10 변이체 디아바디를 MC/9 세포 증식 검정을 이용하여 시험하였다. EBV-10 변이체 부분은 D:DV05 (V31L 돌연변이를 갖는 EBV IL-10), D:DV06 (A75I 돌연변이를 갖는 EBV IL-10), 및 D:DV07 (V31L 및 A75I 돌연변이를 가짐)을 포함하였다. 추가로, 항-HIV 및 항-에볼라 VH 및 VL 영역을 포함하는 DV07 디아바디 또한 시험하였다. 다양한 변이체 디아바디 형태를 인간 IL-10 및 EBV IL-10과 비교하였다. 결과는 도 15에 제공된다.
다른 형태의 EBV-IL-10 융합 단백질 또한 시험관내에서 시험하였다. 특정한 DhivDebo:DV06 (서열식별번호: 26 및 27) 및 DmadcamDebo:DV06 (서열식별번호: 41 및 42)를 본원에 기재된 대식세포 및 T-세포 반응 검정에서 인간 IL-10과 비교하였다. 결과는 도 20a 및 20b에 제공된다.
실시예 5
하기 실시예는 생체내 종양 모델에서 IL-10 및 IL-10 변이체 분자 및 그의 융합 단백질을 시험하기 위한 대표적인 프로토콜을 제공한다. 모든 생체내 연구는 표준 작업 절차 및 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee, "IACUC")에 의해 승인된 확립된 지침에 따라 수행한다.
8주령 암컷 Balb/C 마우스를 구입하고, 1 주일 동안 격리시키고, 표준 24 시간 명암 주기하에 주 1회 침구 교체하면서 정상적인 먹이 및 물에서 유지시킨다.
CT26 종양 세포 (2 x 105)를 행크스 완충된 염 용액에 현탁시키고, 8주령 마우스에게 피하 이식하고, 성장시킨다. CT26 종양 (평균 50 - 150mm3) 보유 야생형 Balb/C 엔비고(Envigo)), 또는 B 세포 녹아웃 (잭슨(Jackson)) 마우스를 0.4 및 0.2 mg/kg 주 3회 (q3w), 0.2 및 0.1 mg/kg 매일 (qd) 5 일 및 휴약 2 일의 IL-10 또는 IL-10 변이체 분자 또는 그의 융합 단백질 (예를 들어, 2가지 상이한 항체 또는 디아바디로부터의 VH 및 VL에 공유적으로 연결된 2개의 수용체 결합 치환을 보유하는 EBV IL-10 변이체 분자, DV07 (도 8c))로 피하로 (목덜미) 10 일 동안 처리한다. 종양의 길이 및 너비를 전자 캘리퍼스에 의해 3 일마다 측정하고, 종양 부피를 계산한다 ((LxW2)/2)). 200 μg/마우스 항-뮤린 CD20의 정맥내 (i.v.) 투여에 의해 야생형 마우스에서 B 세포를 고갈시킨다. 이러한 한 연구의 결과는 도 16에 제공되며, 이는 항-CD3α 및 항-EGFR로부터의 가변 영역을 포함하는 V31L 및 A75I 돌연변이를 보유하는 IL-10 변이체인 D:DV07로 명명되는 IL-10 변이체 분자를 사용하였다.
도 17a 및 17b에서, 도 9c (대형 포맷) 및 9f (소형 포맷)에 의해 표시된 2가지 포맷의 IL-10 변이체 융합 단백질 (즉, V31L 및 A75I 돌연변이 둘 다를 포함하는 IL-10 변이체, DV07)을 생체내 종양 모델에서 비교한다. 융합 단백질은 비표적화 융합 단백질이며, 항-HIV 항체 및 항-에볼라 항체로부터의 VH 및 VL 영역 (대형 포맷) 및 항-에볼라 항체로부터의 VH 및 VL 영역을 포함한다. 투여 연구는 PEG화 재조합 인간 IL-10 (0.75 mg/kg 매일)과 비교하여 5 일 투여 2 일 중단으로 투여되는 소형 포맷 비표적화 IL-10 융합 단백질 (도 17a)의 효과를 실험하였다. 투여 연구는 또한 PEG화 IL-10 (0.75 mg/kg 매일)과 비교하여 주 3회 투여되는 대형 및 소형 포맷 비표적화 IL-10 융합 단백질 (도 17b)의 효과를 실험하였다.
종양 표적화 능력을 갖는 소형 및 대형 포맷 IL-10 융합 단백질 (즉, V31L 및 A75I 돌연변이 둘 다를 포함하는 IL-10 변이체, DV07)을 이용하는 연구를 또한 생체내에서 시험하였다. 도 18a는 다양한 표적화 IL-10 변이체 융합 단백질의 매일 투여로부터의 결과이고, 여기서 대형 포맷 (DegfDebo:DV07) 및 소형 포맷 (Degf:DV07)을 소형 포맷 비표적화 (Debo:DV07) IL-10 융합 단백질 및 PEG화 IL-10과 비교하였다. 도 18b는 다양한 대형 포맷 표적화 IL-10 변이체 융합 단백질의 주 3회 투여로부터의 결과이고, 여기서 다양한 용량의 (1 mg/kg 및 0.25 mg/kg) 대형 포맷 (DegfDebo:DV07)을 소형 포맷 비표적화 (DhDe:DV07) IL-10 융합 단백질 및 PEG화 IL-10과 비교하였다. 도 18c는 다양한 소형 포맷 표적화 IL-10 변이체 융합 단백질의 주 3회 투여로부터의 결과이고, 여기서 다양한 용량 (1 mg/kg 및 0.25 mg/kg)의 소형 포맷 (Degf:DV07)을 소형 포맷 비표적화 (Debo:DV07) IL-10 융합 단백질 및 PEG화 IL-10과 비교하였다.
실시예 6
하기 실시예는 생체내 콜레스테롤 모델에서 IL-10 및 IL-10 변이체 분자 및 그의 융합 단백질을 시험하기 위한 대표적인 프로토콜을 제공한다. 모든 생체내 연구를 표준 작업 프로토콜 및 IACUC에 의해 승인된 확립된 지침에 따라 수행하였다.
8주령 암컷 C57BL/6J 마우스를 적절한 공급업체로부터 구입하고, 1 주일 동안 격리시키고, 표준 24 시간 명암 주기하에 주 1회 침구 교체하면서 정상적인 먹이 및 물에서 유지시킨다.
8주령 암컷 C57BL/6J 마우스 잭슨 래버러토리즈(Jackson Laboratories)에게 3 주 동안 고지방 식사 (엔비고)를 먹인다. IL-10 또는 IL-10 변이체 또는 그의 융합 단백질 (예를 들어, 디아바디에 연결된 서열식별번호: 3의 아미노산 위치 31에서 단일 치환 (V31L)을 포함하는 EBV IL-10 변이체 (D:DV05 EBV IL-10 변이체))로 처리하기 전에 각각의 마우스의 안구뒤 출혈에 의해 혈장 샘플을 수득한다. 마우스를 2 주 동안 피하로 0.4 및 0.2 mg/kg 주 3회 (q3w) 뿐만 아니라 0.2 및 0.1 mg/kg 매주 (qd) 5 일 처리 및 2 일 휴약 요법으로 처리한다. 동물을 2 주 동안 처리하고, 말초 혈액을 채취한 후에, 투여 전 및 후 혈장 콜레스테롤 농도를 정량화한다. 처리를 시작하기 전날, 200 μg/마우스 항-뮤린 CD20의 정맥내 (i.v.) 투여에 의해 B 세포를 고갈시킨다. 이러한 한 연구의 결과는 도 19a 및 19b에 제공된다.
실시예 7
하기 실시예는 생체내 덱스트란 황산나트륨 ("DSS") 염증 모델에서 IL-10 및 IL-10 변이체 분자 및 그의 융합 단백질을 시험하는 대표적인 프로토콜을 제공한다. 모든 생체내 연구를 표준 작업 프로토콜 및 IACUC에 의해 승인된 확립된 지침에 따라 수행한다.
8주령 암컷 Balb/C 마우스를 적절한 공급업체로부터 구입하고, 1 주일 동안 격리시키고, 표준 24 시간 명암 주기하에 주 1회 침구 교체하면서 정상적인 먹이 및 물에서 유지시킨다. B 세포 녹아웃 (잭슨) 마우스에게 6 일 동안 물 중 4% DSS를 자유롭게 먹인 후에, 이들에게 정상적인 물을 제공한다. 5 일째에, 마우스를 0.4 및 0.2 mg/kg 주 3회 (q3w), 0.2 및 0.1 mg/kg 매일 (qd) 5 일 및 휴약 2 일의 IL-10 또는 IL-10 변이체 또는 그의 융합 단백질 (예를 들어, 디아바디에 연결된 서열식별번호: 3의 아미노산 위치 75에서 단일 치환 (A75I)을 포함하는 EBV IL-10 변이체 (D:DV06 EBV IL-10 변이체))로 피하로 (목덜미) 10 일 동안 처리한다. 마우스을 다음에 대해 매일 평가한다:
1.) 체중
2.) 대변 혈액
3.) 심한 출혈
4.) 대변 점조도
질환 활성 지표는 다음의 점수를 조합하여 결정된다;
1. 체중 손실
2. 대변 점조도
3. 출혈 (3으로 나누어짐)
각각의 점수는 다음과 같이 결정된다: 체중 변화 (0:<1%, 1: 1-5%, 2: 5-10%, 3: 10-15%, 4>15%, 대변 혈액 (0: 음성, 2: 양성) 또는 심한 출혈 (4) 및 대변 점조도 (0: 정상, 2: 묽은 대변, 4: 설사).
바람직한 실시양태의 목록
1. 야생형 EBV-IL10과 비교할 때 변경된 도메인간 각도 및/또는 동족 수용체에 대한 변경된 친화도를 나타내는 1개 이상의 아미노산 부가, 결실 및/또는 치환을 포함하는 엡스타인-바르 바이러스 IL-10 (EBV-IL10) 변이체 단백질이며, 변경된 도메인간 각도는 이량체화될 때 동족 수용체와의 결속 각도를 조절하는 것인 EBV-IL10 단백질.
2. 이전 실시양태에 있어서, 1개 이상의 아미노산 부가, 결실 및/또는 치환이 IL-10 수용체 결합 도메인에 위치하는 것인 EBV-IL10 단백질.
3. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 1개 이상의 아미노산 부가, 결실 및/또는 치환이 알파 나선 A 및/또는 나선 D 내에 위치하는 것인 EBV-IL10 단백질.
4. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 1개 이상의 아미노산 부가, 결실 및/또는 치환이 EBV-IL10의 연결 도메인에 존재하는 것인 EBV-IL10 단백질.
5. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 1개 이상의 아미노산 부가, 결실 및/또는 치환이 EBV-IL10의 DE 루프 내에 위치하는 것인 EBV-IL10 단백질.
6. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 1개 이상의 아미노산 부가, 결실 및/또는 치환이 알파 나선 D 및 알파 나선 E 또는 알파 나선 C 및 알파 나선 D 사이에서 발견된 12개의 아미노산 링커 영역 내에 위치하고, 바람직하게는 12개의 아미노산 링커 영역 내의 프롤린의 부가 또는 치환인 EBV-IL10 단백질.
7. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 동족 수용체에 대한 변경된 친화도가 IL-10 수용체 결합 도메인에서 1개 이상의 아미노산 부가, 결실 및/또는 치환을 포함하는 것인 EBV-IL10 단백질.
8. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 알파 나선 A 및/또는 알파 나선 D 내에 위치하는 1개 이상의 아미노산 부가, 결실 및/또는 치환을 추가로 포함하는 EBV-IL10 단백질.
9. 임의의 이전 실시양태에 있어서, IL-10 수용체 결합 도메인에서 1개 이상의 아미노산 부가, 결실 및/또는 치환을 추가로 포함하는 EBV-IL10 단백질.
10. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 알파 나선 A 및/또는 알파 나선 D 내에 위치하는 1개 이상의 아미노산 부가, 결실 및/또는 치환을 추가로 포함하는 EBV-IL10 단백질.
11. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 1개 이상의 아미노산 부가, 결실 및/또는 치환이 서열식별번호 3의 아미노산 위치 31 및/또는 75에 있는 것인 EBV-IL10 단백질.
12. 동일한 단량체 단백질을 갖는 동종이량체를 형성할 수 있으며 A-F로 넘버링된 6개의 알파 나선을 포함하는 단량체 재조합 단백질이며, 알파 나선 D 및 E는 쇄간 아미노산 링커에 의해 연결되고, 링커는 동종이량체화될 때 단백질의 분자간 각도를 변경시키는 적어도 1개의 아미노산의 부가, 결실 또는 치환을 갖도록 변형된 것인 단량체 재조합 단백질.
13. 이전 실시양태에 있어서, 단백질이 바이러스로부터의 단백질인 재조합 단백질.
14. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 바이러스가 엡스타인-바르 바이러스 (EBV)인 재조합 단백질.
15. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 2개의 동일한 단량체 단백질 사이에서 형성된 동종이량체가 그의 동족 수용체와 특이적인 상호작용 각도를 형성하는 것인 재조합 단백질.
16. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 상호작용 각도가 천연 야생형 단백질보다 큰 것인 재조합 단백질.
17. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 동종이량체화시에 형성된 상호작용 각도가 동족 수용체에 대해 더 높은 친화도를 갖는 단백질을 생성하는 것인 재조합 단백질.
18. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 동종이량체화시에 형성된 상호작용 각도가 동족 수용체에 대해 더 낮은 친화도를 갖는 단백질을 생성하는 것인 재조합 단백질.
19. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 상호작용 각도가 천연 야생형 단백질보다 작은 것인 재조합 단백질.
20. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 상호작용 각도가 동족 수용체에 대해 더 높은 친화도를 갖는 단백질을 생성하는 것인 재조합 단백질.
21. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 상호작용 각도가 동족 수용체에 대해 더 낮은 친화도를 갖는 단백질을 생성하는 것인 재조합 단백질.
22. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 단량체 단백질이 인터류킨 10인 재조합 단백질.
23. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 단량체 단백질이 EBV-IL10인 재조합 단백질.
24. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 단백질의 각도가 링커에 대한 변형에 의해 부여되어 동족 수용체와의 상호작용 각도를 생성하는 것인 재조합 단백질.
25. EBV-IL10의 알파 나선 D 및 E 사이의 링커 영역에 및/또는 EBV-IL10의 수용체 결합 영역에 적어도 1개의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 포함하는 재조합 변이체 엡스타인-바르 바이러스 IL-10 (EBV-IL10) 단백질.
26. 이전 실시양태에 있어서, 변이체 EBV-IL10 단백질이 동일한 단백질과 상호작용하여, 그의 동족 수용체와의 변경된 상호작용 각도 및/또는 변경된 동종이량체간 각도를 갖는 동종이량체를 생성하는 것인 재조합 단백질.
27. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 변이체 EBV-IL10 단백질이 야생형 EBV-IL10 단백질보다 큰 상호작용 각도 및/또는 변경된 동종이량체간 각도를 형성하는 것인 재조합 단백질.
28. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 변이체 EBV-IL10 단백질이 야생형 EBV-IL10 단백질보다 작은 상호작용 각도 및/또는 변경된 동종이량체간 각도를 형성하는 것인 재조합 단백질.
29. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 동종이량체 형성시 상호작용 각도 형태가 그의 동족 수용체에 대해 증가된 친화도를 갖는 변이체 EBV-IL10 단백질을 생성하는 것인 재조합 단백질.
30. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 동종이량체 형성시 상호작용 각도 형태가 그의 동족 수용체에 대해 감소된 친화도를 갖는 변이체 EBV-IL10 단백질을 생성하는 것인 재조합 단백질.
31. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 상호작용 각도가 그의 동족 수용체에 대한 친화도의 증가를 부여하는 것인 재조합 단백질.
32. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 상호작용 각도가 그의 동족 수용체에 대한 친화도의 감소를 부여하는 것인 재조합 단백질.
33. 임의의 이전 실시양태에 따른 단백질을 코딩하는 단리된 재조합 폴리뉴클레오티드.
34. 임의의 이전 실시양태에 따른 단백질을 코딩하는 단리된 재조합 폴리뉴클레오티드.
35. 임의의 이전 실시양태에 따른 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터.
36. 임의의 이전 실시양태에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
37. 대상체에게 임의의 이전 실시양태에 따른 변이체 단백질의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 염증을 치료하거나 또는 예방하는 방법.
38. 이전 실시양태에 있어서, 변이체 단백질의 변경된 각도가 야생형 EBV-IL10보다 작은 것인 방법.
39. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 변이체 단백질이 야생형 EBV-IL10과 비교할 때 IL10 수용체에 대해 중간 정도의 친화도로 결합하는 것인 방법.
40. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 염증이 염증성 장 질환 (IBD), 크론 질환, 비알콜성 지방간염 (NASH), 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 건선, 류마티스성 관절염, 급성 아나필락시스성 쇼크, 및/또는 계절성 알러지인 방법.
41. 대상체에게 임의의 이전 실시양태에 따른 변이체 단백질의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 자가면역 질환을 치료하거나 또는 예방하는 방법.
42. 이전 실시양태에 있어서, 변이체 단백질의 변경된 각도가 야생형 EBV-IL10보다 작은 것인 방법.
43. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 변이체 단백질이 야생형 EBV-IL10과 비교할 때 IL10 수용체에 대해 중간 정도의 친화도로 결합하는 것인 방법.
44. 대상체에게 임의의 이전 실시양태에 따른 변이체 단백질의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 IBD 또는 크론 질환을 치료하거나 또는 예방하는 방법.
45. 이전 실시양태에 있어서, 변이체 단백질의 변경된 각도가 야생형 EBV-IL10보다 작은 것인 방법.
46. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 변이체 단백질이 야생형 EBV-IL10과 비교할 때 IL10 수용체에 대해 중간 정도의 친화도로 결합하는 것인 방법.
47. 대상체에게 제1항에 따른 변이체 단백질의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD) 또는 비알콜성 지방간염 (NASH)을 치료하거나 또는 예방하는 방법.
48. 이전 실시양태에 있어서, 변이체 단백질의 변경된 각도가 야생형 EBV-IL10보다 작은 것인 방법.
49. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 변이체 단백질이 야생형 EBV-IL10과 비교할 때 IL10 수용체에 대해 중간 정도의 친화도로 결합하는 것인 방법.
50. 대상체에게 임의의 이전 실시양태에 따른 변이체 단백질의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하거나 또는 예방하는 방법.
51. 이전 실시양태에 있어서, 변이체 단백질의 변경된 각도가 야생형 EBV-IL10보다 큰 것인 방법.
52. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 변이체 단백질이 야생형 EBV-IL10과 비교할 때 IL10 수용체에 대해 증가된 친화도로 결합하는 것인 방법.
53. 융합 단백질의 제1 말단에서 접합된 IL-10 또는 IL-10 변이체 분자 중 적어도 1개의 단량체, 융합 단백질의 제2 말단에서 접합된 적어도 1개의 시토카인 또는 그의 단량체, 및 링커 또는 스페이서를 포함하고, 링커 또는 스페이서는 제1 및 제2 말단을 연결하는 것인 조작된 융합 단백질.
54. 이전 실시양태에 있어서, 링커 또는 스페이서가 항체의 불변 영역인 융합 단백질.
55. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 불변 영역이 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgD, 또는 IgE로부터 유래된 것인 융합 단백질.
56. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 링커 또는 스페이서가 적어도 2개의 쇄간 디술피드 결합을 추가로 포함하는 것인 융합 단백질.
57. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 링커 또는 스페이서가 scFv, 디아바디, 또는 그의 단편인 융합 단백질.
58. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 불변 영역이 중쇄 불변 (CH) 영역 1, CH2, CH3, 또는 이들의 임의의 조합물인 융합 단백질.
59. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 적어도 1개의 IL-10 또는 IL-10 변이체 분자가 융합 단백질의 N-말단, C-말단 또는 이들 둘 다에서 접합된 것인 융합 단백질.
60. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 또 다른 말단에서 접합된 적어도 1개의 시토카인이 IL-10, IL-10 변이체 분자 IL-6, IL-4, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-15, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, GM-CSF, G-CSF, 인터페론 -α, -β, -γ, TGF-β, 또는 종양 괴사 인자 -α, -β, 염기성 FGF, EGF, PDGF, IL-4, IL-11, 또는 IL-13, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는 것인 융합 단백질.
61. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 융합 단백질이 융합 단백질의 N-말단에서 접합된 2개의 IL-10 또는 IL-10 변이체 분자 및 융합 단백질의 C-말단에서 접합된 2개의 IL-10 또는 IL-10 변이체 분자를 포함하는 것인 융합 단백질.
62. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 융합 단백질이 융합 단백질의 N-말단에서 접합된 2개의 IL-10 또는 IL-10 변이체 분자 및 융합 단백질의 C-말단에서 접합된 적어도 1개의 IL-2 분자를 포함하는 것인 융합 단백질.
63. 임의의 이전 실시양태에 있어서, C-말단이 IL-6, IL-4, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-15, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, GM-CSF, G-CSF, 인터페론 -α, -β, -γ, TGF-β, 또는 종양 괴사 인자 -α, -β, 염기성 FGF, EGF, PDGF, IL-4, IL-11, 또는 IL-13을 추가로 포함하는 것인 융합 단백질.
64. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 융합 단백질이 융합 단백질의 N-말단에서 접합된 2개의 IL-10 또는 IL-10 변이체 분자 및 융합 단백질의 C-말단에서 접합된 적어도 1개의 IL-15 분자를 포함하는 것인 융합 단백질.
65. C-말단이 IL-6, IL-4, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-15, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, GM-CSF, G-CSF, 인터페론 -α, -β, -γ, TGF-β, 또는 종양 괴사 인자 -α, -β, 염기성 FGF, EGF, PDGF, IL-4, IL-11, 또는 IL-13을 추가로 포함하는 것인 융합 단백질.
66. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 융합 단백질이 융합 단백질의 N-말단에서 접합된 2개의 IL-10 또는 IL-10 변이체 분자 및 융합 단백질의 C-말단에서 접합된 적어도 1개의 IL-2 분자를 포함하는 것인 융합 단백질.
67. 임의의 이전 실시양태에 있어서, C-말단이 IL-10, IL-10 변이체 분자 IL-6, IL-4, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-15, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, GM-CSF, G-CSF, 인터페론 -α, -β, -γ, TGF-β, 또는 종양 괴사 인자 -α, -β, 염기성 FGF, EGF, PDGF, IL-4, IL-11, 또는 IL-13을 추가로 포함하는 것인 융합 단백질.
68. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 융합 단백질이 단일 쇄 가변 단편 (scFv) 스캐폴드 상에서 제작되는 것인 융합 단백질.
69. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 융합 단백질이 디아바디 스캐폴드 상에서 제작되는 것인 융합 단백질.
70. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 융합 단백질이 Fab 스캐폴드 상에서 제작되는 것인 융합 단백질.
71. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 융합 단백질이 융합 단백질의 제1 말단에서 접합된 IL-10 또는 IL-10 변이체 분자 중 적어도 1개의 단량체, 융합 단백질의 제2 말단에서 접합된 적어도 1개의 시토카인 또는 그의 단량체, 및 링커 또는 스페이서를 갖는 또 다른 융합 단백질과 복합체화하고, 링커 또는 스페이서가 제1 및 제2 말단을 연결하는 것인 융합 단백질.
72. 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 임의의 이전 실시양태에 따른 조작된 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
73. 대상체에게 임의의 이전 실시양태에 따른 조작된 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, IBD 또는 크론 질환을 치료하거나 또는 예방하는 방법.
74. 대상체에게 임의의 이전 실시양태에 따른 조작된 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD) 또는 비알콜성 지방간염 (NASH)을 치료하거나 또는 예방하는 방법.
75. 임의의 이전 실시양태에 따른 조작된 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, CD8 양성 T-세포를 활성화시키는 방법.
76. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 투여가 시험관내 투여인 방법.
77. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 투여가 그를 필요로 하는 대상체에게 생체내 투여이며, 대상체가 암, IBD 또는 크론 질환, 또는 NAFLD 또는 NASH로 진단된 적이 있는 것인 방법.
78. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 융합 단백질이 융합 단백질의 제1 말단에서 IL-10 또는 IL-10 변이체 분자 및 융합 단백질의 제2 말단에서 IL-2 및/또는 IL-15를 포함하는 것인 방법.
79. 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 이중특이적 T-세포 인게이저 (BITE) 및 IL-10, IL-10 변이체 분자, 또는 IL-10 또는 IL-10 변이체 분자를 포함하는 조작된 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
80. 이전 실시양태에 있어서, 조작된 융합 단백질이 융합 단백질의 제1 말단에서 접합된 적어도 1개의 IL-10 또는 IL-10 변이체 분자, 융합 단백질의 제2 말단에서 접합된 적어도 1개의 시토카인, 및 링커 또는 스페이서를 포함하고, 링커 또는 스페이서가 제1 및 제2 말단을 연결하는 것인 방법.
81. 임의의 이전 실시양태에 있어서, IL-10, IL-10 변이체 분자, 또는 IL-10 또는 IL-10 변이체 분자를 포함하는 조작된 융합 단백질이 T-세포 수용체 복합체 (CD3) 신호 전달을 증가시키고 지속시키는 것인 방법.
82. 대상체에게 변이체 IL-10 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 염증을 치료하거나 또는 예방하는 방법.
83. 이전 실시양태에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 DNA, RNA, 또는 그의 변형된 변이체인 방법.
84. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 뉴클레오시드에 연결된 mRNA 또는 변형된 mRNA인 방법.
85. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 세포, 조직 또는 유기체 내에서 변이체 IL-10 분자를 생체내 발현할 수 있는 것인 방법.
86. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 세포 투과 펩티드, 소수성 모이어티, 정전기 복합체, 리포솜, 리간드, 리포솜 나노입자, 지단백질 (바람직하게는 HDL 또는 LDL), 엽산염 표적화된 리포솜, 항체 (예컨대 엽산염 수용체, 트랜스페린 수용체), 표적화 펩티드, 또는 압타머에 의해 세포, 조직 또는 유기체에 전달되는 것인 방법.
87. 대상체에게 변이체 IL-10 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 자가면역 질환을 치료하거나 또는 예방하는 방법.
88. 이전 실시양태에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 DNA, RNA, 또는 그의 변형된 변이체인 방법.
89. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 뉴클레오시드에 연결된 mRNA 또는 변형된 mRNA인 방법.
90. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 세포, 조직 또는 유기체 내에서 변이체 IL-10 분자를 생체내 발현할 수 있는 것인 방법.
91. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 세포 투과 펩티드, 소수성 모이어티, 정전기 복합체, 리포솜, 리간드, 리포솜 나노입자, 지단백질 (바람직하게는 HDL 또는 LDL), 엽산염 표적화된 리포솜, 항체 (예컨대 엽산염 수용체, 트랜스페린 수용체), 표적화 펩티드, 또는 압타머에 의해 세포, 조직 또는 유기체에 전달되는 것인 방법.
92. 대상체에게 변이체 IL-10 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 IBD 또는 크론 질환을 치료하거나 또는 예방하는 방법.
93. 이전 실시양태에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 DNA, RNA, 또는 그의 변형된 변이체인 방법.
94. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 뉴클레오시드에 연결된 mRNA 또는 변형된 mRNA인 방법.
95. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 세포, 조직 또는 유기체 내에서 변이체 IL-10 분자를 생체내 발현할 수 있는 것인 방법.
96. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 세포 투과 펩티드, 소수성 모이어티, 정전기 복합체, 리포솜, 리간드, 리포솜 나노입자, 지단백질 (바람직하게는 HDL 또는 LDL), 엽산염 표적화된 리포솜, 항체 (예컨대 엽산염 수용체, 트랜스페린 수용체), 표적화 펩티드, 또는 압타머에 의해 세포, 조직 또는 유기체에 전달되는 것인 방법.
97. 대상체에게 변이체 IL-10 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD) 또는 비알콜성 지방간염 (NASH)을 치료하거나 또는 예방하는 방법.
98. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 DNA, RNA, 또는 그의 변형된 변이체인 방법.
99. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 뉴클레오시드에 연결된 mRNA 또는 변형된 mRNA인 방법.
100. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 세포, 조직 또는 유기체 내에서 변이체 IL-10 분자를 생체내 발현할 수 있는 것인 방법.
101. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 세포 투과 펩티드, 소수성 모이어티, 정전기 복합체, 리포솜, 리간드, 리포솜 나노입자, 지단백질 (바람직하게는 HDL 또는 LDL), 엽산염 표적화된 리포솜, 항체 (예컨대 엽산염 수용체, 트랜스페린 수용체), 표적화 펩티드, 또는 압타머에 의해 세포, 조직 또는 유기체에 전달되는 것인 방법.
102. 적어도 2가지 상이한 항체로부터의 2개의 가변 영역에 연결된 단량체 IL-10 분자 또는 그의 변이체를 포함하는 융합 단백질이며, 2개의 가변 영역은 제2 항체로부터의 경쇄 가변 (VL) 영역에 연결된 제1 항체로부터의 중쇄 가변 (VH) 영역 또는 제2 항체로부터의 VH에 연결된 제1 항체로부터의 VL로서 배치된 것인 융합 단백질.
103. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 단량체 IL-10 분자 또는 그의 변이체가 IL-10 수용체에 대한 친화도를 증가시키거나 또는 감소시키는 적어도 1개의 아미노산 치환을 포함하는 것인 융합 단백질.
104. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 단량체 IL-10 분자 또는 그의 변이체가 IL-10 수용체에 대한 친화도를 증가시키는 적어도 1개의 아미노산 치환을 포함하는 것인 융합 단백질.
105. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 단량체 IL-10 분자 또는 그의 변이체가 서열식별번호: 3의 엡스타인 바르 바이러스 (EBV) IL-10 상동체인 융합 단백질.
106. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV IL-10 상동체가 위치 31, 75, 또는 이들 둘 다에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 융합 단백질.
107. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV-IL-10 상동체가 위치 31에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 융합 단백질.
108. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV-IL-10 상동체가 위치 75에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 융합 단백질.
109. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV-IL-10 상동체가 위치 31 및 75에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 융합 단백질.
110. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV-IL-10 상동체가 V31L 아미노산 치환을 포함하는 것인 융합 단백질.
111. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV-IL-10 상동체가 A75I 아미노산 치환을 포함하는 것인 융합 단백질.
112. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV-IL-10 상동체가 V31L 및 A75I 아미노산 치환을 포함하는 것인 융합 단백질.
113. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제1 항체의 VH 영역이 항-HIV 모노클로날 항체로부터의 것이고, 제2 항체의 VL 영역이 항-에볼라 모노클로날 항체로부터의 것인 융합 단백질.
114. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제1 항체의 VH 영역이 항-에볼라 모노클로날 항체로부터의 것이고, 제2 항체의 VL 영역이 항-HIV 모노클로날 항체로부터의 것인 융합 단백질.
115. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 융합 단백질이 서열식별번호: 24-28, 29, 33-51, 61, 63, 65 또는 67로부터 선택된 아미노산 서열인 융합 단백질.
116. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 융합 단백질이 디아바디인 융합 단백질.
117. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 융합 단백질이 하기로부터 선택된 배치를 포함하는 것인 융합 단백질:
(a) IL-10의 단량체 또는 그의 변이체의 아미노 말단에 후속적으로 연결된 제2 항체의 VL 영역의 아미노 말단에 그의 카르복시 말단에서 연결된 제1 항체의 VH 영역; 또는
(b) 제1 항체의 VL 영역의 아미노 말단에 후속적으로 연결된 제2 항체의 VH 영역의 아미노 말단에 그의 카르복시 말단에서 연결된 IL-10 분자 또는 그의 변이체.
118. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 배치 (a) 및 (b)가 함께 디아바디 복합체를 형성하는 것인 융합 단백질.
119. 임의의 이전 실시양태에 있어서, VH 영역과 VL 영역 사이에 링커를 추가로 포함하는 융합 단백질.
120. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 아미노산 서열이 서열식별번호: 24-28, 29, 33-53, 61, 63, 65, 67로부터 선택된 것인 융합 단백질.
121. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제1 및 제2 항체가 대상체에서 항원성을 감소시키는 1개 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것인 융합 단백질.
122. i) IL-10의 단량체 또는 그의 변이체에 추가로 연결된 제2 항체의 경쇄 가변 영역 (VL)에 연결된 제1 항체의 중쇄 가변 영역 (VH)을 그의 아미노 말단에서 포함하는 제1 융합 단백질; 및 ii) 제1 항체의 VL에 추가로 연결된 제2 항체의 VH에 연결된 IL-10의 단량체 또는 그의 변이체를 그의 아미노-말단에서 포함하는 제2 융합 단백질을 포함하는 면역접합체 복합체이며, 제1 및 제2 항체의 VH 및 VL은 디아바디에 회합하고, IL-10의 단량체는 기능적 이량체 IL-10 분자를 형성하는 것인 면역접합체 복합체.
123. 임의의 이전 실시양태에 있어서, IL-10의 단량체가 IL-10 수용체에 대한 친화도를 증가시키거나 또는 감소시키는 적어도 1개의 아미노산 치환을 포함하는 것인 면역접합체 복합체.
124. 임의의 이전 실시양태에 있어서, IL-10 분자가 IL-10 수용체에 대한 친화도를 증가시키는 적어도 1개의 아미노산 치환을 포함하는 것인 면역접합체 복합체.
125. 임의의 이전 실시양태에 있어서, IL-10의 단량체가 서열식별번호 3의 엡스타인 바르 바이러스 (EBV) IL-10 상동체인 면역접합체 복합체.
126. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV IL-10 상동체가 위치 31, 75, 또는 이들 둘 다에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 면역접합체 복합체.
127. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV-IL-10 상동체가 위치 31에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 면역접합체 복합체.
128. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV-IL-10 상동체가 위치 75에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 면역접합체 복합체.
129. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV-IL-10 상동체가 위치 31 및 75에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 면역접합체 복합체.
130. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV-IL-10 상동체가 V31L 아미노산 치환을 포함하는 것인 면역접합체 복합체.
131. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV-IL-10 상동체가 A75I 아미노산 치환을 포함하는 것인 면역접합체 복합체.
132. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV-IL-10 상동체가 V31L 및 A75I 아미노산 치환을 포함하는 것인 면역접합체 복합체.
133. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제1 항체가 항-HIV 모노클로날 항체로부터의 것이고, 제2 항체가 항-에볼라 모노클로날 항체로부터의 것인 면역접합체 복합체.
134. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제1 융합 단백질이 서열식별번호: 24, 26, 28, 35, 38, 41, 46, 48 또는 50으로부터 선택된 아미노산 서열인 면역접합체 복합체.
135. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제2 융합 단백질이 서열식별번호: 25,27, 29, 36, 39, 42, 47, 49 또는 51로부터 선택된 아미노산 서열인 면역접합체 복합체.
136. 임의의 이전 실시양태에 있어서, VH 영역과 VL 영역 사이에 링커를 추가로 포함하는 면역접합체 복합체.
137. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제1 융합 단백질의 IL-10의 단량체가 그의 아미노 말단에 의해 VL 영역에 연결된 것인 면역접합체 복합체.
138. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제2 융합 단백질의 IL-10의 단량체가 그의 카르복시 말단에 의해 VH 영역에 연결된 것인 면역접합체 복합체.
139. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제1 및 제2 항체가 대상체에서 항원성을 감소시키는 1개 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것인 면역접합체 복합체.
140. 제1 항체로부터의 중쇄 가변 영역 (VH), 제2 항체로부터의 경쇄 가변 영역 (VL), 및 단량체 IL-10을 포함하는 제1 펩티드 쇄; 및 제2 항체로부터의 VH 및 VL 및 단량체 IL-10 분자를 포함하는 제2 펩티드 쇄를 포함하는 디아바디이며, 제1 항체의 VH 영역은 제1 항체의 VL 영역과 회합하고, 제2 항체의 VH 영역은 제2 항체의 VL 영역과 회합하여, 각각의 펩티드 쇄 상의 단량체 IL-10 분자가 기능적 IL-10 이량체를 형성하도록 하는 것인 디아바디.
141. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 단량체 IL-10이 IL-10 수용체에 대한 친화도를 증가시키거나 또는 감소시키는 적어도 1개의 아미노산 치환을 포함하는 것인 디아바디.
142. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 단량체 IL-10 분자가 IL-10 수용체에 대한 친화도를 증가시키는 적어도 1개의 아미노산 치환을 포함하는 것인 디아바디.
143. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 단량체 IL-10 분자가 서열식별번호 3의 엡스타인 바르 바이러스 (EBV) IL-10 상동체인 디아바디.
144. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV IL-10 상동체가 위치 31, 75, 또는 이들 둘 다에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 디아바디.
145. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV-IL-10 상동체가 위치 31에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 디아바디.
146. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV-IL-10 상동체가 위치 75에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 디아바디.
147. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV-IL-10 상동체가 위치 31 및 75에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 디아바디.
148. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV-IL-10 상동체가 V31L 아미노산 치환을 포함하는 것인 디아바디.
149. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV-IL-10 상동체가 A75I 아미노산 치환을 포함하는 것인 디아바디.
150. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV-IL-10 상동체가 V31L 및 A75I 아미노산 치환을 포함하는 것인 디아바디.
151. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제1 항체가 항-HIV 모노클로날 항체로부터의 것이고, 제2 항체가 항-에볼라 모노클로날 항체로부터의 것인 디아바디.
152. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제1 펩티드 쇄가 서열식별번호: 24, 26, 28, 35, 38, 41, 46, 48 또는 50으로부터 선택된 아미노산 서열인 디아바디.
153. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제2 펩티드 쇄가 서열식별번호: 25, 27, 29, 36, 39, 42, 47, 49 또는 51로부터 선택된 아미노산 서열인 디아바디.
154. 임의의 이전 실시양태에 있어서, VH 영역과 VL 영역 사이에 링커를 추가로 포함하는 디아바디.
155. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제1 및 제2 항체가 대상체에서 항원성을 감소시키는 1개 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것인 디아바디.
156. 임의의 이전 실시양태에 있어서, IL-10의 단량체가 그의 카르복시 말단에 의해 제1 및 제2 펩티드 쇄에 연결된 것인 디아바디.
157. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제1 및 제2 항체가 대상체에서 항원성을 감소시키는 1개 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것인 디아바디.
158. i) 제1 항체의 중쇄 가변 (VH) 영역 및 그의 아미노 말단에 의해 연결된 단량체 IL-10 분자를 그의 아미노 말단에서 포함하는 제1 융합 단백질; 및 ii) 제1 항체의 경쇄 가변 영역 (VL)에 연결된 IL-10의 단량체를 그의 아미노 말단에서 포함하는 제2 융합 단백질을 포함하는 면역접합체 복합체이며, 제1 항체의 VH 영역은 제1 항체의 VL 영역과 회합하여, 각각의 펩티드 쇄 상의 단량체 IL-10 분자가 기능적 IL-10 이량체를 형성하도록 하는 것인 면역접합체 복합체.
159. 임의의 이전 실시양태에 있어서, IL-10의 단량체가 IL-10 수용체에 대한 친화도를 증가시키거나 또는 감소시키는 적어도 1개의 아미노산 치환을 포함하는 것인 면역접합체 복합체.
160. 임의의 이전 실시양태에 있어서, IL-10 분자가 IL-10 수용체에 대한 친화도를 증가시키는 적어도 1개의 아미노산 치환을 포함하는 것인 면역접합체 복합체.
161. 임의의 이전 실시양태에 있어서, IL-10의 단량체가 서열식별번호 3의 엡스타인 바르 바이러스 (EBV) IL-10 상동체인 면역접합체 복합체.
162. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV IL-10 상동체가 위치 31, 75, 또는 이들 둘 다에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 면역접합체 복합체.
163. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV-IL-10 상동체가 위치 31에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 면역접합체 복합체.
164. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV-IL-10 상동체가 위치 75에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 면역접합체 복합체.
165. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV-IL-10 상동체가 위치 31 및 75에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 면역접합체 복합체.
166. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV-IL-10 상동체가 V31L 아미노산 치환을 포함하는 것인 면역접합체 복합체.
167. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV-IL-10 상동체가 A75I 아미노산 치환을 포함하는 것인 면역접합체 복합체.
168. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV-IL-10 상동체가 V31L 및 A75I 아미노산 치환을 포함하는 것인 면역접합체 복합체.
169. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제1 항체의 VH 및 VL 영역이 항-표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 모노클로날 항체로부터의 것인 면역접합체 복합체.
170. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제1 융합 단백질이 제1 항체의 VH 영역을 단량체 IL-10에 연결하는 제2 항체로부터의 VL 영역을 추가로 포함하고, 제2 융합 단백질이 단량체 IL-10을 VL 영역에 연결하는 제2 항체로부터의 VH 영역을 추가로 포함하는 것인 면역접합체 복합체.
171. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제2 항체의 VH 및 VL 영역이 항-에볼라 모노클로날 항체로부터의 것인 면역접합체 복합체.
172. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 가변 영역이 링커를 통해 IL-10의 단량체에 연결된 것인 면역접합체 복합체.
173. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제1 및 제2 항체가 대상체에서 항원성을 감소시키는 1개 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것인 면역접합체 복합체.
174. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제1 및 제2 항체가 대상체에서 항원성을 감소시키는 1개 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것인 면역접합체 복합체.
175. IL-10의 단량체에 융합된 제1 항체의 가변 경쇄 (VL) 및 가변 중쇄 (VH) 영역을 포함하는 융합 단백질이며, IL-10 단량체는 서로 직접적으로 연결된 것인 융합 단백질.
176. 임의의 이전 실시양태에 있어서, IL-10 단량체가 제1 IL-10 단량체의 카르복시 말단에서부터 제2 IL-10 단량체의 아미노 말단까지 연결된 것인 융합 단백질.
177. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 융합 단백질이 아미노에서 카르복시 말단 방식으로 하기 배치를 포함하는 것인 융합 단백질: 제1 항체의 VL 영역이 제1 IL-10 단량체에 연결되고, 제2 IL-10 단량체에 연결되고, 제1 항체의 VH 영역에 연결됨.
178. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제1 항체의 VL 영역의 아미노 말단에 연결된 제2 항체의 VH 영역 및 제1 항체의 VH 영역의 카르복시 말단에 연결된 제2 항체의 VL 영역을 추가로 포함하는 융합 단백질.
179. 임의의 이전 실시양태에 있어서, IL-10 단량체 각각이 IL-10 수용체에 대한 친화도를 증가시키거나 또는 감소시키는 적어도 1개의 아미노산 치환을 포함하는 것인 융합 단백질.
180. 임의의 이전 실시양태에 있어서, IL-10 단량체 각각이 IL-10 수용체에 대한 친화도를 증가시키는 적어도 1개의 아미노산 치환을 포함하는 것인 융합 단백질.
181. 임의의 이전 실시양태에 있어서, IL-10 단량체가 서열식별번호: 3의 엡스타인 바르 바이러스 (EBV) IL-10 상동체인 융합 단백질.
182. 제181항에 있어서, EBV IL-10 상동체가 위치 31, 75, 또는 이들 둘 다에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 융합 단백질.
183. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV-IL-10 상동체가 위치 31에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 융합 단백질.
184. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV-IL-10 상동체가 위치 75에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 융합 단백질.
185. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV-IL-10 상동체가 V31L 아미노산 치환을 포함하는 것인 융합 단백질.
186. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV-IL-10 상동체가 A75I 아미노산 치환을 포함하는 것인 융합 단백질.
187. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제1 항체가 항-에볼라 모노클로날 항체인 융합 단백질.
188. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제1 항체가 항-표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 모노클로날 항체인 융합 단백질.
189. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제1 항체가 항-에볼라 모노클로날 항체이고, 제2 항체가 항-EGFR 모노클로날 항체인 융합 단백질.
190. 질환, 장애 또는 상태의 치료를 필요로 하는 환자에게 엡스타인 바르 바이러스 (EBV) IL-10 면역접합체 복합체의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 질환, 장애 또는 상태를 치료하는 방법이며, 면역접합체 복합체는 약 60 내지 155 kDa의 분자량을 갖고, 치료 유효량은 약 0.5 마이크로그램/킬로그램 내지 100 마이크로그램/킬로그램의 범위이고, 면역접합체의 EBV IL-10 부분은 서열식별번호: 3으로부터 유래된 것인 방법.
191. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 면역접합체 복합체가 매월, 격월, 매주, 주 2회, 주 3회, 또는 매일 투여되는 것인 방법.
192. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 변이체 EBV IL-10이 IL-10 수용체에 대한 결합을 증가시키거나 또는 감소시키는 적어도 1개의 아미노산 치환을 포함하는 변이체인 방법.
193. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 변이체 EBV IL-10이 서열식별번호: 3의 위치 31, 75 또는 이들 둘 다에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 방법.
194. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 변이체 EBV IL-10이 V31L 아미노산 치환을 포함하는 것인 방법.
195. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV IL-10이 A75I 아미노산 치환을 포함하는 것인 방법.
196. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV IL-10이 V31L 및 A75I 아미노산 치환을 포함하는 것인 방법.
197. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 면역접합체 복합체가 2가지 융합 단백질의 복합체인 방법.
198. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 면역접합체 복합체가 i. EBV IL-10의 단량체의 카르복시 말단에 추가로 연결된 제2 항체의 경쇄 가변 영역 (VL)에 연결된 제1 항체의 중쇄 가변 영역 (VH)을 그의 아미노-말단에서 포함하는 제1 융합 단백질; 및 ii. 제1 항체의 VL에 연결된 제2 항체의 VH에 연결된 EBV IL-10의 단량체를 그의 아미노-말단에서 포함하는 제2 융합 단백질을 포함하고, 제1 및 제2 항체의 VH 및 VL이 디아바디에 회합하고, EBV IL-10의 단량체가 기능적 이량체 EBV IL-10 분자를 형성하는 것인 방법.
199. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제1 항체 및 제2 항체가 상이한 항체인 방법.
200. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제1 항체가 항-HIV 모노클로날 항체이고, 제2 항체가 항-에볼라 모노클로날 항체인 방법.
201. 제202항에 있어서, 융합 단백질이 서열식별번호: 24-51로부터 선택된 아미노산 서열인 방법.
202. 제202항에 있어서, 제1 융합 단백질이 서열식별번호: 24, 26, 28, 35, 38, 41, 46, 48 또는 50으로부터 선택된 아미노산 서열인 방법.
203. 제202항에 있어서, 제2 융합 단백질이 서열식별번호: 25, 27, 29, 36, 39, 42, 47, 49 또는 51로부터 선택된 아미노산 서열인 방법.
204. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 면역접합체 복합체가 양 말단에 융합된 EBV IL-10 단량체를 포함하는 디아바디이고, EBV IL-10 단량체가 기능적 EBV IL-10 이량체에 회합할 수 있는 것인 방법.
205. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 질환, 장애 또는 상태가 암, 염증 질환, 자가면역 질환, 또는 콜레스테롤로부터 선택되는 것인 방법.
206. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV IL-10 면역접합체 복합체가 적어도 2 내지 3 일마다 투여하는 것을 기반으로 하여 일정한 IL-10 혈청 농도를 유지하는데 충분한 양으로 투여되는 것인 방법.
207. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 면역접합체가 야생형 IL-10과 유사한 농도에서 TNFα 분비를 억제하고 IFNγ 생성을 유도할 수 있는 것인 방법.
208. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV IL-10 면역접합체 복합체가 야생형 IL-10과 유사한 활성을 갖는 것인 방법.
209. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 면역접합체 복합체가 하기를 포함하는 것인 방법:
(a) IL-10 분자의 카르복시 말단에 연결된 제2 항체의 VL 영역에 N-말단에서 연결된 제1 항체의 VH 영역; 및
(b) 제1 항체의 VL 영역에 연결된 제2 항체의 VH 영역에 연결된 IL-10 분자.
210. 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 제1 항체로부터의 중쇄 가변 영역 (VH), 제2 항체로부터의 경쇄 가변 영역 (VL), 및 단량체 IL-10 분자를 갖는 제1 펩티드 쇄; 및 제2 항체로부터의 VH 및 VL, 및 단량체 IL-10 분자를 갖는 제2 펩티드 쇄를 포함하는 디아바디를 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법이며, 제1 항체의 VH 영역은 제1 항체의 VL 영역과 회합하고, 제2 항체의 VH 영역은 제2 항체의 VL 영역과 회합하여, 각각의 펩티드 쇄 상의 단량체 IL-10 분자가 기능적 IL-10 이량체를 형성하도록 하는 것인 방법.
211. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 단량체 IL-10이 서열식별번호: 3의 엡스타인 바르 바이러스 (EBV) IL-10 상동체인 방법.
212. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV IL-10이 서열식별번호: 3의 위치 31에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 방법.
213. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV IL-10이 V31L 아미노산 치환을 포함하는 것인 방법.
214. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제1 항체의 VH 영역이 항-HIV 모노클로날 항체로부터의 것이고, 제2 항체의 VL 영역이 항-에볼라 모노클로날 항체로부터의 것인 방법.
215. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제1 펩티드 쇄가 서열식별번호: 28, 35, 38, 46으로부터 선택된 아미노산 서열인 방법.
216. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제2 펩티드 쇄가 서열식별번호: 29, 36, 39, 47로부터 선택된 아미노산 서열인 방법.
217. 임의의 이전 실시양태에 있어서, VH 영역과 VL 영역 사이에 링커를 추가로 포함하는 방법.
218. 임의의 이전 실시양태에 있어서, VH 및 VL 각각이 환자에서 항원성을 감소시키는 1개 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것인 방법.
219. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제1 항체가 항-HIV 모노클로날 항체로부터의 것이고, 제2 항체가 항-에볼라 모노클로날 항체로부터의 것인 방법.
220. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 디아바디가 하기 아미노에서 카르복시 말단 배치로 2개의 펩티드 쇄에 의해 형성된 것인 방법:
(a) IL-10 단량체 또는 그의 변이체의 아미노 말단에 연결된 제2 항체의 VL 영역에 연결된 제1 항체의 VH 영역을 포함하는 제1 펩티드; 및
(b) 제1 항체의 VL 영역에 연결된 제2 항체의 VH 영역에 연결된 IL-10 단량체를 포함하는 제2 펩티드.
221. 제1 항체로부터의 중쇄 가변 영역 (VH), 제2 항체로부터의 경쇄 가변 영역 (VL), 및 단량체 IL-10을 갖는 제1 펩티드 쇄; 및 제2 항체로부터의 VH 및 VL, 및 단량체 IL-10 분자를 갖는 제2 펩티드 쇄를 포함하는 디아바디의 양을 감소시키는 콜레스테롤을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 콜레스테롤을 치료하는 방법이며, 제1 항체의 VH 영역은 제1 항체의 VL 영역과 회합하고, 제2 항체의 VH 영역은 제2 항체의 VL 영역과 회합하여, 각각의 펩티드 쇄 상의 단량체 IL-10 분자가 기능적 IL-10 이량체를 형성하도록 하는 것인 방법.
222. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 단량체 IL-10이 서열식별번호: 3의 엡스타인 바르 바이러스 (EBV) IL-10 상동체인 방법.
223. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV IL-10이 서열식별번호: 3의 위치 31에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 방법.
224. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV IL-10이 V31L 아미노산 치환을 포함하는 것인 방법.
225. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제1 항체의 VH 영역이 항-HIV 모노클로날 항체로부터의 것이고, 제2 항체의 VL 영역이 항-에볼라 모노클로날 항체로부터의 것인 방법.
226. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제1 펩티드 쇄가 서열식별번호: 24 또는 50으로부터 선택된 아미노산 서열인 방법.
227. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제2 펩티드 쇄가 서열식별번호: 25 또는 51로부터 선택된 아미노산 서열인 방법.
228. 임의의 이전 실시양태에 있어서, VH 영역과 VL 영역 사이에 링커를 추가로 포함하는 방법.
229. 임의의 이전 실시양태에 있어서, VH 및 VL 각각이 환자에서 항원성을 감소시키는 1개 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것인 방법.
230. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제1 항체가 항-HIV 모노클로날 항체로부터의 것이고, 제2 항체가 항-에볼라 모노클로날 항체로부터의 것인 방법.
231. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 디아바디가 하기 아미노에서 카르복시 말단 배치로 2개의 펩티드 쇄에 의해 형성된 것인 방법:
(a) IL-10 단량체 또는 그의 변이체의 아미노 말단에 연결된 제2 항체의 VL 영역에 연결된 제1 항체의 VH 영역을 포함하는 제1 펩티드; 및
(b) 제1 항체의 VL 영역에 연결된 제2 항체의 VH 영역에 연결된 IL-10 단량체 또는 그의 변이체를 포함하는 제2 펩티드.
232. 비알콜성 지방간염 (NASH) 또는 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD)의 치료를 필요로 하는 환자에게 제1 항체로부터의 중쇄 가변 영역 (VH), 제2 항체로부터의 경쇄 가변 영역 (VL), 및 단량체 IL-10을 갖는 제1 펩티드 쇄; 및 제2 항체로부터의 VH 및 VL, 및 단량체 IL-10 분자를 갖는 제2 펩티드 쇄를 포함하는 디아바디의 NASH 또는 NAFLD 양을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 비알콜성 지방간염 (NASH) 또는 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD)을 치료하는 방법이며, 제1 항체의 VH 영역은 제1 항체의 VL 영역과 회합하고, 제2 항체의 VH 영역은 제2 항체의 VL 영역과 회합하고, 각각의 펩티드 쇄 상의 단량체 IL-10 분자가 기능적 IL-10 이량체를 형성하도록 하는 것인 방법.
233. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 단량체 IL-10이 서열식별번호: 3의 엡스타인 바르 바이러스 (EBV) IL-10 상동체인 방법.
234. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV IL-10이 서열식별번호: 3의 위치 31에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 방법.
235. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV IL-10이 V31L 아미노산 치환을 포함하는 것인 방법.
236. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제1 항체의 VH 영역이 항-HIV 모노클로날 항체로부터의 것이고, 제2 항체의 VL 영역이 항-에볼라 모노클로날 항체로부터의 것인 방법.
237. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제1 펩티드 쇄가 서열식별번호: 24 또는 50으로부터 선택된 아미노산 서열인 방법.
238. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제2 펩티드 쇄가 서열식별번호: 25 또는 51로부터 선택된 아미노산 서열인 방법.
239. 임의의 이전 실시양태에 있어서, VH 영역과 VL 영역 사이에 링커를 추가로 포함하는 방법.
240. 임의의 이전 실시양태에 있어서, VH 및 VL 각각이 환자에서 항원성을 감소시키는 1개 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것인 방법.
241. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제1 항체가 항-HIV 모노클로날 항체로부터의 것이고, 제2 항체가 항-에볼라 모노클로날 항체로부터의 것인 방법.
242. 염증의 치료를 필요로 하는 환자에게 제1 항체로부터의 중쇄 가변 영역 (VH), 제2 항체로부터의 경쇄 가변 영역 (VL), 및 단량체 IL-10을 갖는 제1 펩티드 쇄; 및 제2 항체로부터의 VH 및 VL, 및 단량체 IL-10 분자를 갖는 제2 펩티드 쇄를 포함하는 디아바디의 항염증 양을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 염증을 치료하는 방법이며, 제1 항체의 VH 영역은 제1 항체의 VL 영역과 회합하고, 제2 항체의 VH 영역은 제2 항체의 VL 영역과 회합하여, 각각의 펩티드 쇄 상의 단량체 IL-10 분자가 기능적 IL-10 이량체를 형성하도록 하는 것인 방법.
243. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 단량체 IL-10이 서열식별번호: 3의 엡스타인 바르 바이러스 (EBV) IL-10 상동체인 방법.
244. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV IL-10이 서열식별번호: 3의 위치 75에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 방법.
245. 임의의 이전 실시양태에 있어서, EBV IL-10이 V31L 아미노산 치환을 포함하는 것인 방법.
246. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제1 항체의 VH 영역이 항-HIV 모노클로날 항체로부터의 것이고, 제2 항체의 VL 영역이 항-에볼라 모노클로날 항체로부터의 것인 방법.
247. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제1 펩티드 쇄가 서열식별번호: 26, 41 또는 48로부터 선택된 아미노산 서열인 방법.
248. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제2 펩티드 쇄가 서열식별번호: 27, 42, 49로부터 선택된 아미노산 서열인 방법.
249. 임의의 이전 실시양태에 있어서, VH 영역과 VL 영역 사이에 링커를 추가로 포함하는 방법.
250. 임의의 이전 실시양태에 있어서, VH 및 VL 각각이 환자에서 항원성을 감소시키는 1개 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것인 방법.
251. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 제1 항체가 항-HIV 모노클로날 항체로부터의 것이고, 제2 항체가 항-에볼라 모노클로날 항체로부터의 것인 방법.
252. 화학식 (I-VII)의 융합 단백질
IL10-L1-X1-L1-X2-L1-IL10 (화학식 I); (Z)n-X1-L2-Y2-L1-IL10 (화학식 II); IL10-L1-Y1-L2-X2-(Z)n (화학식 III); X1-L2-X2-L1-IL10 (화학식 IV); IL10-L1-X1-L2-X2 (화학식 V); X1-L1-IL10 (화학식 VI); IL10-L1-X2 (화학식 VII); 또는 이들의 임의의 조합물,
상기 식에서,
"IL-10"은 서열식별번호: 1, 3, 14, 18, 15, 19, 16 20, 55, 57 또는 59로부터 선택된 단량체 서열이고; 더욱 바람직하게는 "IL-10"은 서열식별번호: 55, 57 또는 59로 이루어지고;
"L1"은 서열식별번호: 31 또는 54의 링커이고;
"L2"는 서열식별번호: 30의 링커이고;
"X1"은 표피 성장 인자 수용체 (EGFR); CD52; 다양한 면역 체크포인트 표적, 예컨대 비제한적으로 PD-L1, PD-1, TIM3, BTLA, LAG3 또는 CTLA4; CD20; CD47; GD-2; HER2; EpCAM; ICAM (ICAM-1, -2, -3, -4, -5), VCAM, FAPα; 5T4; Trop2; EDB-FN; TGFβ 트랩; MadCam, β7 인테그린 서브유닛; α4β7 인테그린; α4 인테그린 SR-A1; SR-A3; SR-A4; SR-A5; SR-A6; SR-B; dSR-C1; SR-D1; SR-E1; SR-F1; SR-F2; SR-G; SR-H1; SR-H2; SR-I1; SR-J1; HIV, 또는 에볼라에 대해 특이적인 제1 항체로부터 수득된 VH 영역이고;
"X2"는 X1과 동일한 항체로부터 수득된 VL 영역이고;
"Y1"은 표피 성장 인자 수용체 (EGFR); CD52; 다양한 면역 체크포인트 표적, 예컨대 비제한적으로 PD-L1, PD-1, TIM3, BTLA, LAG3 또는 CTLA4; CD20; CD47; GD-2; HER2; EpCAM; ICAM (ICAM-1, -2, -3, -4, -5), VCAM, FAPα; 5T4; Trop2; EDB-FN; TGFβ 트랩; MadCam, β7 인테그린 서브유닛; α4β7 인테그린; α4 인테그린 SR-A1; SR-A3; SR-A4; SR-A5; SR-A6; SR-B; dSR-C1; SR-D1; SR-E1; SR-F1; SR-F2; SR-G; SR-H1; SR-H2; SR-I1; SR-J1; HIV, 또는 에볼라에 대해 특이적인 제2 항체로부터 수득된 VH 영역이고;
"Y2"는 Y1과 동일한 항체로부터 수득된 VL 영역이고;
X 및 Y는 동일한 또는 상이한 항체로부터 수득되고;
"Z"는 IL-10, IL-10 변이체 분자 IL-6, IL-4, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-15, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, GM-CSF, G-CSF, 인터페론 -α, -β, -γ, TGF-β, 또는 종양 괴사 인자 -α, -β, 염기성 FGF, EGF, PDGF, IL-4, IL-11, 또는 IL-13으로부터 선택된 시토카인이고;
"n"은 0-2로부터 선택된 정수이다.
253. 이전 실시양태에 있어서, 화학식 II 및 III이 융합 단백질 복합체를 형성할 수 있고, 화학식 II 및 III 각각으로부터의 IL-10 단량체가 기능적 동종이량체 IL-10 또는 그의 변이체를 형성할 수 있는 것인 융합 단백질.
254. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 화학식 II가 서열식별번호: 24, 26, 28, 41, 48 또는 50인 융합 단백질.
255. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 화학식 III이 서열식별번호: 25, 27, 29, 42, 49 또는 51인 융합 단백질.
256. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 융합 단백질 복합체가 서열식별번호: 24 및 25; 26 및 27, 28 및 29; 41 및 42; 48 및 49; 또는 50 및 51 사이에서 형성된 것인 융합 단백질.
257. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 화학식 IV 및 V가 융합 단백질 복합체를 형성할 수 있고, 화학식 IV 및 V 각각으로부터의 IL-10 단량체가 기능적 동종이량체 IL-10 또는 그의 변이체를 형성할 수 있는 것인 융합 단백질.
258. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 화학식 IV가 서열식별번호: 35, 38, 46, 48 또는 50인 융합 단백질.
259. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 화학식 V가 서열식별번호: 36, 39, 47, 49 또는 51인 융합 단백질.
260. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 융합 단백질 복합체가 서열식별번호: 35 및 36; 38 및 39, 46 및 47; 48 및 49; 또는 50 및 51 사이에서 형성된 것인 융합 단백질.
261. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 화학식 VI 및 VII이 융합 단백질 복합체를 형성할 수 있고, 화학식 VI 및 VII 각각으로부터의 IL-10 단량체가 기능적 동종이량체 IL-10 또는 그의 변이체를 형성할 수 있는 것인 융합 단백질.
262. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 화학식 I이 서열식별번호: 33-34, 40, 43-44, 45, 52 53, 61, 63, 65 또는 67인 융합 단백질.
263. 임의의 이전 실시양태에 있어서, "n" ≥1이고, Z가 IL-2, Il-7, IL-12, IL-15 또는 이들의 임의의 조합물인 융합 단백질.
264. 임의의 이전 실시양태에 있어서, Z가 X1, Y1, 또는 이들 둘 다의 N-말단 상에 접합된 것인 융합 단백질.
265. 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 임의의 이전 실시양태에 따른 융합 단백질을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
266. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 융합 단백질이 서열식별번호: 28-29, 35-36, 38-39, 46-47, 52 53, 61, 63, 65 또는 67인 방법.
267. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 융합 단백질이 단백질 복합체를 형성하고, 단백질 복합체가 서열식별번호: 28 및 29; 35 및 36; 38 및 39; 또는 46 및 47 사이에서 형성된 것인 방법.
268. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 조성물이 서열식별번호: 33, 34, 44, 52 또는 53, 61, 63, 65 또는 67의 융합 단백질을 포함하는 것인 방법.
269. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 융합 단백질이 서열식별번호 59의 DV07로 이루어진 IL-10을 포함하는 것인 방법.
270. 염증 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 임의의 이전 실시양태에 따른 융합 단백질을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 염증 질환을 치료하는 방법.
271. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 융합 단백질이 서열식별번호: 26-27, 41-42, 48 또는 49인 방법.
272. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 융합 단백질이 단백질 복합체를 형성하고, 단백질 복합체가 서열식별번호: 26 및 27; 41 및 42; 48 및 49 사이에서 형성된 것인 방법.
273. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 조성물이 서열식별번호: 37, 40 또는 43의 융합 단백질을 포함하는 것인 방법.
274. 제18항에 있어서, 융합 단백질이 서열식별번호 57의 DV06으로 이루어진 IL-10을 포함하는 것인 방법.
275. 지질 기반 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 임의의 이전 실시양태에 따른 융합 단백질을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 지질 기반 질환을 치료하는 방법.
276. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 융합 단백질이 서열식별번호: 24-25, 50 또는 51인 방법.
277. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 융합 단백질이 단백질 복합체를 형성하고, 단백질 복합체가 서열식별번호: 24 및 25; 및 50 및 51 사이에서 형성된 것인 방법.
278. 임의의 이전 실시양태에 있어서, 조성물이 서열식별번호: 45의 융합 단백질을 포함하는 것인 방법.
참고 문헌
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Figure pct00004
Figure pct00005
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Gln Val Lys Asn 130 135 140 Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu 145 150 155 160 Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile 165 170 175 Arg Asn <210> 2 <211> 1629 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 acacatcagg ggcttgctct tgcaaaacca aaccacaaga cagacttgca aaagaaggca 60 tgcacagctc agcactgctc tgttgcctgg tcctcctgac tggggtgagg gccagcccag 120 gccagggcac ccagtctgag aacagctgca cccacttccc aggcaacctg cctaacatgc 180 ttcgagatct ccgagatgcc ttcagcagag tgaagacttt ctttcaaatg aaggatcagc 240 tggacaactt gttgttaaag gagtccttgc tggaggactt taagggttac ctgggttgcc 300 aagccttgtc tgagatgatc cagttttacc tggaggaggt gatgccccaa gctgagaacc 360 aagacccaga catcaaggcg catgtgaact ccctggggga gaacctgaag accctcaggc 420 tgaggctacg gcgctgtcat cgatttcttc cctgtgaaaa caagagcaag gccgtggagc 480 aggtgaagaa tgcctttaat aagctccaag agaaaggcat ctacaaagcc atgagtgagt 540 ttgacatctt catcaactac atagaagcct acatgacaat gaagatacga aactgagaca 600 tcagggtggc gactctatag actctaggac ataaattaga ggtctccaaa atcggatctg 660 gggctctggg atagctgacc cagccccttg agaaacctta ttgtacctct cttatagaat 720 atttattacc tctgatacct caacccccat ttctatttat ttactgagct tctctgtgaa 780 cgatttagaa agaagcccaa tattataatt tttttcaata tttattattt tcacctgttt 840 ttaagctgtt tccatagggt gacacactat ggtatttgag tgttttaaga taaattataa 900 gttacataag ggaggaaaaa aaatgttctt tggggagcca acagaagctt ccattccaag 960 cctgaccacg ctttctagct gttgagctgt tttccctgac ctccctctaa tttatcttgt 1020 ctctgggctt ggggcttcct aactgctaca aatactctta ggaagagaaa ccagggagcc 1080 cctttgatga ttaattcacc ttccagtgtc tcggagggat tcccctaacc tcattcccca 1140 accacttcat tcttgaaagc tgtggccagc ttgttattta taacaaccta aatttggttc 1200 taggccgggc gcggtggctc acgcctgtaa tcccagcact ttgggaggct gaggcgggtg 1260 gatcacttga ggtcaggagt tcctaaccag cctggtcaac atggtgaaac cccgtctcta 1320 ctaaaaatac aaaaattagc cgggcatggt ggcgcgcacc tgtaatccca gctacttggg 1380 aggctgaggc aagagaattg cttgaaccca ggagatggaa gttgcagtga gctgatatca 1440 tgcccctgta ctccagcctg ggtgacagag caagactctg tctcaaaaaa 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ttcctcttgt agcaacgtga ggacgactac tccgtgtggc tcgacggtac 300 ggtggtcaaa ggctgttggg gatgcagcgt catggactgg ttgttgaggc ggtatctgga 360 gatcgtgttc cccgcaggcg accacgtcta tcctggactt aagacggaat tgcatagtat 420 gcgctcgacg ctagaatcca tctacaaaga catgcggcaa tgcgtaagtg tctctgtggc 480 ggcgctgtcc gcgcagaggt aacaacgtgt tcatagcacg ctgttttact tttgtcgggc 540 tcccagcctc tgttaggttg cggagataag tccgtgatta gtcggctgtc tcaggaggcg 600 gaaaggaaat cggataacgg cacgcggaaa ggtctcagcg agttggacac gttgtttagc 660 cgtctcgaag agtatctgca ctcgagaaag tag 693 <210> 7 <211> 178 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Met Pro Gly Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Leu Leu Leu Thr Gly Met 1 5 10 15 Arg Ile Ser Arg Gly Gln Tyr Ser Arg Glu Asp Asn Asn Cys Thr His 20 25 30 Phe Pro Val Gly Gln Ser His Met Leu Leu Glu Leu Arg Thr Ala Phe 35 40 45 Ser Gln Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Gln Leu Asp Asn Ile 50 55 60 Leu Leu Thr Asp Ser Leu Met Gln Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys 65 70 75 80 Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Val Glu Val 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 10 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gly Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln 20 25 30 Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe 35 40 45 Gln Thr Lys Asp Glu Val Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu 50 55 60 Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile 65 70 75 80 Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro 85 90 95 Glu Ala Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu 100 105 110 Arg Leu Arg Leu Arg Gln Cys Pro Leu Leu Gly Cys Gly Asp Lys Ala 115 120 125 Val Glu Gln Ile Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile 130 135 140 Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala 145 150 155 160 Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg 165 <210> 11 <211> 167 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 11 Met Asp Met Arg 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<222> (321)..(334) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (321)..(334) <223> This region may encompass 9-14 residues <220> <221> MOD_RES <222> (350)..(358) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (350)..(358) <223> This region may encompass 5-9 residues <220> <221> MOD_RES <222> (391)..(401) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (391)..(401) <223> This region may encompass 7-11 residues <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 45 Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp 1 5 10 15 Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Leu Asp 20 25 30 Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu 35 40 45 Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val 50 55 60 Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ala Lys Asp His Val Asn 65 70 75 80 Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys 85 90 95 His Arg Phe 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amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (95)..(105) <223> This region may encompass 7-11 residues <220> <221> MOD_RES <222> (150)..(163) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (150)..(163) <223> This region may encompass 9-14 residues <220> <221> MOD_RES <222> (179)..(187) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (179)..(187) <223> This region may encompass 5-9 residues <220> <221> MOD_RES <222> (220)..(230) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (220)..(230) <223> This region may encompass 7-11 residues <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 50 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Arg Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Thr Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Val 50 55 60 Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln 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Claims (26)

  1. 화학식 (I-VII)의 융합 단백질:
    IL10-L1-X1-L1-X2-L1-IL10 (화학식 I);
    (Z)n-X1-L2-Y2-L1-IL10 (화학식 II);
    IL10-L1-Y1-L2-X2-(Z)n (화학식 III);
    X1-L2-X2-L1-IL10 (화학식 IV);
    IL10-L1-X1-L2-X2 (화학식 V);
    X1-L1-IL10 (화학식 VI);
    IL10-L1-X2 (화학식 VII), 또는 이들의 임의의 조합물;
    상기 식에서,
    "IL-10"은 서열식별번호: 1, 3, 14, 15, 16, 18, 19, 55, 57 또는 59로부터 선택된 단량체 서열이고;
    "L1"은 서열식별번호: 31 또는 54의 링커이고;
    "L2"는 서열식별번호: 30의 링커이고;
    "X1"은 표피 성장 인자 수용체 (EGFR); CD52; 다양한 면역 체크포인트 표적, 예컨대 비제한적으로 PD-L1, PD-1, TIM3, BTLA, LAG3 또는 CTLA4; CD20; CD47; GD-2; HER2; EpCAM; ICAM (ICAM-1, -2, -3, -4, -5), VCAM, FAPα; 5T4; Trop2; EDB-FN; TGFβ 트랩; MadCam, β7 인테그린 서브유닛; α4β7 인테그린; α4 인테그린 SR-A1; SR-A3; SR-A4; SR-A5; SR-A6; SR-B; dSR-C1; SR-D1; SR-E1; SR-F1; SR-F2; SR-G; SR-H1; SR-H2; SR-I1; SR-J1; HIV, 또는 에볼라에 대해 특이적인 제1 항체로부터 수득된 VH 영역이고;
    "X2"는 X1과 동일한 항체로부터 수득된 VL 영역이고;
    "Y1"은 표피 성장 인자 수용체 (EGFR); CD52; 다양한 면역 체크포인트 표적, 예컨대 비제한적으로 PD-L1, PD-1, TIM3, BTLA, LAG3 또는 CTLA4; CD20; CD47; GD-2; HER2; EpCAM; ICAM (ICAM-1, -2, -3, -4, -5), VCAM, FAPα; 5T4; Trop2; EDB-FN; TGFβ 트랩; MadCam, β7 인테그린 서브유닛; α4β7 인테그린; α4 인테그린 SR-A1; SR-A3; SR-A4; SR-A5; SR-A6; SR-B; dSR-C1; SR-D1; SR-E1; SR-F1; SR-F2; SR-G; SR-H1; SR-H2; SR-I1; SR-J1; HIV, 또는 에볼라에 대해 특이적인 제2 항체로부터 수득된 VH 영역이고;
    "Y2"는 Y1과 동일한 항체로부터 수득된 VL 영역이고;
    여기서, X 및 Y는 동일한 또는 상이한 항체로부터 수득되고;
    "Z"는 IL-6, IL-4, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-15, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, GM-CSF, G-CSF, 인터페론-α, -β, -γ, TGF-β, 또는 종양 괴사 인자 -α, -β, 염기성 FGF, EGF, PDGF, IL-4, IL-11, 또는 IL-13으로부터 선택된 시토카인이고;
    "n"은 0-2로부터 선택된 정수이다.
  2. 제1항에 있어서, 화학식 II 및 III이 융합 단백질 복합체를 형성할 수 있고, 화학식 II 및 III 각각으로부터의 IL-10 단량체가 기능적 동종이량체 IL-10 또는 그의 변이체를 형성할 수 있는 것인 융합 단백질.
  3. 제2항에 있어서, 화학식 II가 서열식별번호: 24, 26, 28, 41, 48 또는 50인 융합 단백질.
  4. 제2항에 있어서, 화학식 III이 서열식별번호: 25, 27, 29, 42, 49 또는 51인 융합 단백질.
  5. 제2항에 있어서, 융합 단백질 복합체가 서열식별번호: 24 및 25; 26 및 27, 28 및 29; 41 및 42; 48 및 49; 또는 50 및 51 사이에서 형성된 것인 융합 단백질.
  6. 제1항에 있어서, 화학식 IV 및 V가 융합 단백질 복합체를 형성할 수 있고, 화학식 IV 및 V 각각으로부터의 IL-10 단량체가 기능적 동종이량체 IL-10 또는 그의 변이체를 형성할 수 있는 것인 융합 단백질.
  7. 제6항에 있어서, 화학식 IV가 서열식별번호: 35, 38, 46, 48 또는 50인 융합 단백질.
  8. 제6항에 있어서, 화학식 V가 서열식별번호: 36, 39, 47, 49 또는 51인 융합 단백질.
  9. 제6항에 있어서, 융합 단백질 복합체가 서열식별번호: 35 및 36; 38 및 39, 46 및 47; 48 및 49; 또는 50 및 51 사이에서 형성된 것인 융합 단백질.
  10. 제1항에 있어서, 화학식 VI 및 VII이 융합 단백질 복합체를 형성할 수 있고, 화학식 VI 및 VII 각각으로부터의 IL-10 단량체가 기능적 동종이량체 IL-10 또는 그의 변이체를 형성할 수 있는 것인 융합 단백질.
  11. 제1항에 있어서, 화학식 I이 서열식별번호: 33-34, 40, 43-44, 45, 52 또는 53인 융합 단백질.
  12. 제1항에 있어서, "n" ≥1이고, Z가 IL-2, Il-7, IL-12, IL-15 또는 이들의 임의의 조합물인 융합 단백질.
  13. 제12항에 있어서, Z가 X1, Y1, 또는 이들 둘 다의 N-말단에 접합된 것인 융합 단백질.
  14. 제1항에 따른 융합 단백질을 포함하는 조성물을 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 융합 단백질이 서열식별번호: 28-29, 35-36, 38-39, 46-47, 52, 53, 61, 63, 65 또는 67인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 융합 단백질이 단백질 복합체를 형성하고, 단백질 복합체가 서열식별번호: 28 및 29; 35 및 36; 38 및 39; 또는 46 및 47 사이에서 형성된 것인 방법.
  17. 제14항에 있어서, 융합 단백질이 서열식별번호 59의 DV07로 이루어진 IL-10을 포함하는 것인 방법.
  18. 제1항에 따른 융합 단백질을 포함하는 조성물을 염증 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 염증 질환을 치료하는 방법.
  19. 제17항에 있어서, 융합 단백질이 서열식별번호: 26-27, 41-42, 48 또는 49인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 융합 단백질이 단백질 복합체를 형성하고, 단백질 복합체가 서열식별번호: 26 및 27; 41 및 42; 48 및 49 사이에서 형성된 것인 방법.
  21. 제18항에 있어서, 조성물이 서열식별번호: 37, 40 또는 43의 융합 단백질을 포함하는 것인 방법.
  22. 제18항에 있어서, 융합 단백질이 서열식별번호 57의 DV06으로 이루어진 IL-10을 포함하는 것인 방법.
  23. 제1항에 따른 융합 단백질을 포함하는 조성물을 지질 기반 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 지질 기반 질환을 치료하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 융합 단백질이 서열식별번호: 24-25, 50 또는 51인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 융합 단백질이 단백질 복합체를 형성하고, 단백질 복합체가 서열식별번호: 24 및 25; 및 50 및 51 사이에서 형성된 것인 방법.
  26. 제23항에 있어서, 조성물이 서열식별번호: 45의 융합 단백질을 포함하는 것인 방법.
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