JP2021511081A - Il−2タンパク質およびcd80タンパク質を含む融合タンパク質およびその使用 - Google Patents
Il−2タンパク質およびcd80タンパク質を含む融合タンパク質およびその使用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本発明のもう一つ別の態様において、2つの融合タンパク質を相互に結合させることによって得られる融合タンパク質二量体が提供される。
本発明のその上さらにもう一つ別の態様において、該ポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。
本発明のその上さらにもう一つ別の態様において、該ベクターがその中に導入されている形質転換細胞が提供される。
本発明のその上さらにもう一つ別の態様において、がんまたは感染症を治療するための該融合タンパク質の使用が提供される。
本発明のその上さらにもう一つ別の態様において、がんまたは感染症の治療用の医薬を製造するための該融合タンパク質の使用が提供される。
本発明の態様において、IL−2タンパク質およびCD80タンパク質を含む融合タンパク質が提供される。
本明細書において使用される場合の、「IL−2」または「インターロイキン−2」なる語は、特記されない限り、哺乳類、例えば霊長類(ヒトなど)およびげっ歯類(マウスおよびラットなど)を含む、任意の脊椎動物源より得られる任意の野生型IL−2をいう。IL−2は動物細胞より得られてもよく、IL−2の産生能を有する組換え細胞より得られるものをも包含する。加えて、IL−2は野生型IL−2またはその変種であってもよい。
具体的には、IL−2変種は、R38A、F42A、Y45A、E61R、およびL72Gからなる群より選択される位置の中から2、3、4または5箇所でアミノ酸置換されることで得られてもよい。
好ましくは、IL−2変種の実施態様は、配列番号:10のアミノ酸配列において以下の(a)〜(d)の組み合わせから選択されるいずれのものを含有してもよい。
(a)R38A/F42A
(b)R38A/F42A/Y45A
(c)R38A/F42A/E61R
(d)R38A/F42A/L72G
具体的には、IL−2変種は、配列番号:6、22、23、または24のアミノ酸配列を有してもよい。
。免疫グロブリンはIgG、IgA、IgE、IgD、またはIgMであってもよく、好ましくはIgG4であってもよい。ここで、野生型免疫グロブリンG4のFcドメインは配列番号:4のアミノ酸配列を有してもよい。
N’は融合タンパク質のN−末端であり、
XはCD80タンパク質であり、
YはIL−2タンパク質であり、
リンカー(1)および(2)はペプチドリンカーであり、および
nおよびmは、各々独立して、0または1である]
で構成されてもよい。
本発明のさらにもう一つ別の態様において、IL−2タンパク質およびCD80タンパク質を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。具体的には、該ポリヌクレオチドは、配列番号:8、25、27、または29のヌクレオチド配列を含有してもよい。IL−2タンパク質およびCD80タンパク質を含む融合タンパク質は上記されるとおりである。ポリヌクレオチドにおいて、1または複数のヌクレオチドが、置換、欠失、挿入またはその組み合わせにより改変されてもよい。ヌクレオチド配列が化学合成によって製造される場合、EngelsおよびUhlmann(Angew Chem IntEd Eng.、37:73-127, 1988)に記載される方法などの当該分野にて周知の合成方法が使用され得る。かかる方法はトリエステル、ホスファイト、ホスホルアミダイトおよびH−ホスフェート方法、PCRおよび他のオートプライマー方法、固体支持体でのオリゴヌクレオチド合成等を含んでもよい。
本発明のその上さらにもう一つ別の態様において、該ポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。
本発明のその上さらにもう一つ別の態様において、ベクターが導入されている形質転換細胞が提供される。
本発明のその上さらにもう一つ別の態様において、IL−2タンパク質およびCD80タンパク質を含む融合タンパク質を産生する方法であって、形質転換細胞の培養を含む、方法が提供される。具体的には、該産生方法は、i)該形質転換細胞を培養して培養体を得;ii)融合タンパク質を該培養体より集める、ことを含んでもよい。
本発明のさらにもう一つ別の態様において、がんまたは感染症を治療または予防するための、および/またはがんまたは感染症を治療するのに効能を増大させるための医薬組成物であって、活性成分として、IL−2タンパク質およびCD80タンパク質を含む融合タンパク質、あるいは2個の融合タンパク質が結合している融合タンパク質二量体を含む、組成物が提供される。
IL−2タンパク質およびCD80タンパク質を含む融合タンパク質、または2個の融合タンパク質が結合している融合タンパク質二量体は上記されるとおりである。
本発明のその上さらにもう一つ別の態様において、がんまたは感染症に対する治療効果を高めるためにIL−2タンパク質およびCD80タンパク質を含む融合タンパク質の使用が提供される。
本発明のその上さらにもう一つ別の態様において、がんまたは感染症を治療する方法、および/またはがんまたは感染症に対する治療効果を強化する方法であって、対象に、IL−2タンパク質およびCD80タンパク質を含む融合タンパク質、または2つの融合タンパク質が結合している融合タンパク質二量体を投与することを含む、方法が提供される。
本発明を次の実施例を用いてさらに詳細に記載する。しかしながら、次の実施例は本発明を説明するに過ぎず、本発明の範囲がそれに限定されるものではない。
製造例1. hCD80−Fc−IL−2変種(2M):GI101の製造
ヒトCD80フラグメント、Fcドメイン、およびIL−2変種を含む融合タンパク質を産生するために、サーモフィッシャーサイエンティフィック社(Thermo Fisher Scientific)のインビトロゲン・ジンアート・ジン・シンセシス(Invitrogen GeneArt Gene Synthesis)サービスを通してポリヌクレオチドを合成した。具体的には、該ポリヌクレオチドは、シグナルペプチド(配列番号:1)、CD80フラグメント(配列番号:2)、Igヒンジ(配列番号:3)、Fcドメイン(配列番号:4)、リンカー(配列番号:5)、および2個のアミノ酸置換を有するIL−2変種(2M)(R38A、F42A)(配列番号:6)を、N−末端からこの順序で含有する、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列(配列番号:8)を含有する。該ポリヌクレオチドをpcDNA3_4ベクターに挿入した。加えて、該ベクターをCHO細胞(Expi−CHOTM)に導入し、配列番号:9の融合タンパク質を発現させた。該ベクターを導入した後、37℃、125RPM、および8%CO2濃度の環境下で7日間にわたって培養を行った。次に、該培養物を収穫し、そこから融合タンパク質を精製した。その精製した融合タンパク質を「GI101」と称した。
マウスCD80、Fcドメイン、およびIL−2変種を含む融合タンパク質を産生するために、サーモフィッシャーサイエンティフィック社のインビトロゲン・ジンアート・ジン・シンセシスサービスを通してポリヌクレオチドを合成した。具体的には、該ポリヌクレオチドは、シグナルペプチド(配列番号:1)、mCD80(配列番号:13)、Igヒンジ(配列番号:3)、Fcドメイン(配列番号:4)、リンカー(配列番号:5)、および2個のアミノ酸置換を有するIL−2変種(2M)(R38A、F42A)(配列番号:6)を、N−末端からこの順序で含有する、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列(配列番号:14)を含有する。該ポリヌクレオチドをpcDNA3_4ベクターに挿入した。加えて、該ベクターをCHO細胞(Expi−CHOTM)に導入し、配列番号:15の融合タンパク質を発現させた。該ベクターを導入した後、37℃、125RPM、および8%CO2濃度の環境下で7日間にわたって培養を行った。次に、該培養物を収穫し、そこから融合タンパク質を精製した。その精製した融合タンパク質を「mGI101」と称した。
ヒトCD80フラグメント、およびFcドメインを含む融合タンパク質を産生するために、サーモフィッシャーサイエンティフィック社のインビトロゲン・ジンアート・ジン・シンセシスサービスを通してポリヌクレオチドを合成した。具体的には、該ポリヌクレオチドは、シグナルペプチド(配列番号:1)、CD80フラグメント(配列番号:2)、Igヒンジ(配列番号:3)、およびFcドメイン(配列番号:4)を含有する、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列(配列番号:16)を含有する。該ポリヌクレオチドをpcDNA3_4ベクターに挿入した。加えて、該ベクターをCHO細胞(Expi−CHOTM)に導入し、配列番号:17の融合タンパク質を発現させた。該ベクターを導入した後、37℃、125RPM、および8%CO2濃度の環境下で7日間にわたって培養を行った。次に、該培養物を収穫し、そこから融合タンパク質を精製した。その精製した融合タンパク質を「GI101C1」と称した。
FcドメインおよびIL−2変種を含む融合タンパク質を産生するために、サーモフィッシャーサイエンティフィック社のインビトロゲン・ジンアート・ジン・シンセシスサービスを通してポリヌクレオチドを合成した。具体的には、該ポリヌクレオチドは、シグナルペプチド(配列番号:1)、Fcドメイン(配列番号:4)、リンカー(配列番号:5)、および2個のアミノ酸置換を有するIL−2変種(2M)(R38A、F42A)(配列番号:6)を、N−末端からこの順序で含有する、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列(配列番号:18)を含有する。該ポリヌクレオチドをpcDNA3_4ベクターに挿入した。加えて、該ベクターをCHO細胞(Expi−CHOTM)に導入し、配列番号:19の融合タンパク質を発現させた。該ベクターを導入した後、37℃、125RPM、および8%CO2濃度の環境下で7日間にわたって培養を行った。次に、該培養物を収穫し、そこから融合タンパク質を精製した。その精製した融合タンパク質を「GI101C2」と称した。
マウスCD80およびFcドメインを含む融合タンパク質を産生するために、サーモフィッシャーサイエンティフィック社のインビトロゲン・ジンアート・ジン・シンセシスサービスを通してポリヌクレオチドを合成した。具体的には、該ポリヌクレオチドは、シグナルペプチド(配列番号:1)、mCD80(配列番号:13)、Igヒンジ(配列番号:3)、およびFcドメイン(配列番号:4)を、N−末端からこの順序で含有する、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列(配列番号:20)を含有する。該ポリヌクレオチドをpcDNA3_4ベクターに挿入した。加えて、該ベクターをCHO細胞(Expi−CHOTM)に導入し、配列番号:21の融合タンパク質を発現させた。該ベクターを導入した後、37℃、125RPM、および8%CO2濃度の環境下で7日間にわたって培養を行った。次に、該培養物を収穫し、そこから融合タンパク質を精製した。その精製した融合タンパク質を「mGI101C1」と称した。
ヒトCD80フラグメント、Fcドメイン、およびヒトIL−2を含む融合タンパク質を産生するために、サーモフィッシャーサイエンティフィック社のインビトロゲン・ジンアート・ジン・シンセシスサービスを通してポリヌクレオチドを合成した。具体的には、該ポリヌクレオチドは、シグナルペプチド(配列番号:1)、CD80フラグメント(配列番号:2)、Igヒンジ(配列番号:3)、Fcドメイン(配列番号:4)、リンカー(配列番号:5)、および成熟ヒトIL−2(配列番号:10)を、N−末端からこの順序で含有する、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列(配列番号:31)を含有する。該ポリヌクレオチドをpcDNA3_4ベクターに挿入した。加えて、該ベクターをCHO細胞(Expi−CHOTM)に導入し、配列番号:32の融合タンパク質を発現させた。該ベクターを導入した後、37℃、125RPM、および8%CO2濃度の環境下で7日間にわたって培養を行った。次に、該培養物を収穫し、そこから融合タンパク質を精製した。その精製した融合タンパク質を「GI101w」と称した。融合タンパク質の精製および収集は製造例1での操作と同じ操作で実施された。
ヒトCD80フラグメント、Fcドメイン、および3個のアミノ酸置換を有するIL−2変種(3M)(R38A、F42A、Y45A)(GI102−M45)を含む融合タンパク質を産生するために、サーモフィッシャーサイエンティフィック社のインビトロゲン・ジンアート・ジン・シンセシスサービスを通してポリヌクレオチドを合成した。具体的には、該ポリヌクレオチドは、シグナルペプチド(配列番号:1)、CD80フラグメント(配列番号:2)、Igヒンジ(配列番号:3)、Fcドメイン(配列番号:4)、リンカー(配列番号:5)、およびIL−2変種(配列番号:22)を、N−末端からこの順序で含有する、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列(配列番号:25)を含有する。該ポリヌクレオチドをpcDNA3_4ベクターに挿入した。加えて、該ベクターをCHO細胞(Expi−CHOTM)に導入し、配列番号:26の融合タンパク質を発現させた。該ベクターを導入した後、37℃、125RPM、および8%CO2濃度の環境下で7日間にわたって培養を行った。次に、該培養物を収穫し、そこから融合タンパク質を精製した。その精製した融合タンパク質を「GI102−M45」と称した。
ヒトCD80フラグメント、Fcドメイン、および3個のアミノ酸置換を有するIL−2変種(3M)(R38A、F42A、E61R)(GI102−M61)を含む融合タンパク質を産生するために、サーモフィッシャーサイエンティフィック社のインビトロゲン・ジンアート・ジン・シンセシスサービスを通してポリヌクレオチドを合成した。具体的には、該ポリヌクレオチドは、シグナルペプチド(配列番号:1)、CD80フラグメント(配列番号:2)、Igヒンジ(配列番号:3)、Fcドメイン(配列番号:4)、リンカー(配列番号:5)、およびIL−2変種(配列番号:23)を、N−末端からこの順序で含有する、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列(配列番号:27)を含有する。該ポリヌクレオチドをpcDNA3_4ベクターに挿入した。加えて、該ベクターをCHO細胞(Expi−CHOTM)に導入し、配列番号:28の融合タンパク質を発現させた。該ベクターを導入した後、37℃、125RPM、および8%CO2濃度の環境下で7日間にわたって培養を行った。次に、該培養物を収穫し、そこから融合タンパク質を精製した。その精製した融合タンパク質を「GI102−M61」と称した。
ヒトCD80フラグメント、Fcドメイン、および3個のアミノ酸置換を有するIL−2変種(3M)(R38A、F42A、L72G)(GI102−M72)を含む融合タンパク質を産生するために、サーモフィッシャーサイエンティフィック社のインビトロゲン・ジンアート・ジン・シンセシスサービスを通してポリヌクレオチドを合成した。具体的には、該ポリヌクレオチドは、シグナルペプチド(配列番号:1)、CD80フラグメント(配列番号:2)、Igヒンジ(配列番号:3)、Fcドメイン(配列番号:4)、リンカー(配列番号:5)、およびIL−2変種(配列番号:24)を、N−末端からこの順序で含有する、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列(配列番号:29)を含有を含有する。該ポリヌクレオチドをpcDNA3_4ベクターに挿入した。加えて、該ベクターをCHO細胞(Expi−CHOTM)に導入し、配列番号:30の融合タンパク質を発現させた。該ベクターを導入した後、37℃、125RPM、および8%CO2濃度の環境下で7日間にわたって培養を行った。次に、該培養物を収穫し、そこから融合タンパク質を精製した。その精製した融合タンパク質を「GI102−M72」と称した。
マウスCD80フラグメント、Fcドメイン、および3個のアミノ酸置換を有するIL−2変種(3M)(R38A、F42A、E61R)(GI102−M61)を含む融合タンパク質を産生するために、サーモフィッシャーサイエンティフィック社のインビトロゲン・ジンアート・ジン・シンセシスサービスを通してポリヌクレオチドを合成した。具体的には、該ポリヌクレオチドは、シグナルペプチド(配列番号:1)、mCD80フラグメント(配列番号:13)、Igヒンジ(配列番号:3)、Fcドメイン(配列番号:4)、リンカー(配列番号:5)、およびIL−2変種(配列番号:23)を、N−末端からこの順序で含有する融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列(配列番号:33)を含有する。該ポリヌクレオチドをpcDNA3_4ベクターに挿入した。加えて、該ベクターをCHO細胞(Expi−CHOTM)に導入し、配列番号:34の融合タンパク質を発現させた。該ベクターを導入した後、37℃、125RPM、および8%CO2濃度の環境下で7日間にわたって培養を行った。次に、該培養物を収穫し、そこから融合タンパク質を精製した。その精製した融合タンパク質を「mGI102−M61」と称した。
融合タンパク質の精製および収集は製造例1での操作と同じ操作で実施された。
融合タンパク質と、そのリガンドとの間の結合親和性を同定するために、その結合親和性をOctet RED 384を用いて測定した。
AR2G(Amine Reactive 2nd gen)バイオセンサー(ForteBio、カタログ番号:18−5092)を、96ウェルのマイクロプレート(Greiner Bio-one、カタログ番号:655209)において、200μlの蒸留水で予め水和させた。該AR2Gバイオセンサーと結合させるリガンド(CTLA−4、ヒトCTLA−4/CD152、Hisタグ、Sino Biological、カタログ番号:11159−H08H)を10mM酢酸緩衝液(pH5、AR2G試薬キット(AR2G reagent Kit)、ForteBio、カタログ番号:18−5095)で5μg/mlの濃度に希釈した。加えて、該リガンドと結合させるGI101を1xAR2G カイネティック緩衝液(AR2G試薬キット、ForteBio、カタログ番号:18−5095)で1,000nM、500nM、250nM、125nM、または62.5nMの濃度に希釈した。20mM EDCと10mM s−NHS(AR2G試薬キット、ForteBio、カタログ番号:18−5095)とを蒸留水中で混合することによって活性化緩衝液を製造した。80μlの各試薬を384ウェルのマイクロプレート(Greiner Bio-one、カタログ番号:781209)に置き、プログラムをセットアップした。
Ni−NTA(ニッケルをチャージしたトリス−NTA、Ni−NTAバイオセンサー、ForteBio、18−5101)を、96ウェルのマイクロプレート(Greiner Bio-one、カタログ番号:655209)において、200μlの1xNi−NTAカイネティック緩衝液(10xカイネティック緩衝液、ForteBio、カタログ番号:18−1042)で予め水和させた。Ni−NTAバイオセンサーと結合させるリガンド(ヒトPD−L1/B7−H1タンパク質、His−タグ、Sino biological、カタログ番号:10084−H08H)を1xNi−NTAカイネティック緩衝液で5μg/mlの濃度に希釈した。該リガンドと結合させるGI101を1xNi−NTAカイネティック緩衝液で1,000nM、500nM、250nM、125nM、または62.5nMに希釈した。加えて、該リガンドと結合させるヒトPD−1/PDCD1(ヒトPD−1/PDCD1、Fc Tag、Sino Biological、カタログ番号:10377−H02H)を、1xNi−NTAカイネティック緩衝液で2,000nM、1,000nM、500nM、250nM、または125nMの濃度に希釈した。ついで、80μlの各試薬を384ウェルのマイクロプレートに置き、プログラムをセットアップした。
mCTLA−4とmGI101との間の結合親和性を実験例1と同様にして試験した。ここで、使用される用品は次のとおりである:バイオセンサー:AR2G、リガンド:mCTLA−4(組換えマウスCTLA−4 Fcキメラ、R&D Systems、カタログ番号:434−CT−200)、分析物:mGI101(500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.3nM)
mPD−L1とmGI101との間の結合親和性を実験例1と同様にして同定した。ここで、使用の用品は次のとおりである。バイオセンサー:AR2G、リガンド:mPD−L1(組換えマウスB7−H1/PD−L1 Fcキメラ、R&D Systems、カタログ番号:434−CT−200)、分析物:mGI101(500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.3nM)
結合キネティクスの測定は、オクテットRED384装置(ForteBio、Pall Life Science)を用い、30℃および1,000rpmでかき混ぜることでなされた。CTLA−4に対する結合能はアミン反応性第2世代(AR2G)バイオセンサーチップを用いて測定され、PD−L1に対する結合能はニッケルチャージのトリス−NTA(Ni−NTA)バイオセンサーチップを用いて測定された。AR2Gバイオセンサーチップは400mMのEDCを100mMのスルホ−NHSと合わせることで活性化された。次に、ヒトCTLA−4−His Tag(Sino Biological、カタログ番号:11159−H08H)を10mM 酢酸緩衝液(pH5)で5μg/mlに希釈し、AR2Gバイオセンサーチップ上に300秒間ローディングさせて固定した。
遮断実験は、オクテットRED384装置(ForteBio、Pall Life Science)を用い、30℃および1,000rpmでかき混ぜて行われた。ヒトPD−L1−His Tag(Sino biological、カタログ番号:10084−H08H)を1xNi−NTAカイネティック緩衝液で5μg/mlの濃度に希釈し、Ni−NTAバイオセンサーチップ上に600秒間ローディングさせて固定した。遮断実験を進行させるために、バイオセンサーチップに固定したhPD−L1を種々の濃度(300nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、および0nM)のGI−101と600秒間にわたって結合させ、次にさらなるhPD−1がそれとどの程度結合し得るかを測定するために、コンペチタ−のヒトPD−1(100nM)と600秒間にわたって再び結合させた。対照的に、hPD−L1はhPD−1と種々の濃度(300nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、および0nM)で600秒間にわたって結合させ、次にさらなるGI−101がそれとどの程度結合し得るかを測定するために、コンペチタ−のGI−101(100nM)と600秒間にわたって再び結合させた。遮断実験は、Pall Corporationより提供されるオクテットデータアナライシスHTソフトウェア バージョン10のエピトープビニングメニュー(epitope bining menu)を用いて分析された。結果を図23において示す。
IL−2Rαを標的とする結合親和性は、AR2Gバイオセンサーを用いて測定され、IL−2Rβを標的とする結合親和性はNi−NTAバイオセンサー(ニッケルをチャージしたトリス−NTA、Ni−NTAバイオセンサー、ForteBio、18−5101)を用いて測定された。
融合タンパク質とそのリガンドとの間の結合親和性を同定するために、オクテットRED384を用いて結合親和性を測定した。
AR2Gバイオセンサー(アミン反応性第2世代、ForteBio、カタログ番号:18−5092)を200μlの蒸留水(DW)を用いて96ウェルマイクロプレート(GreinerBio-one、カタログ番号:655209)において予め水和させた。該バイオセンサーと結合させるリガンド(ヒトIL−2Rアルファタンパク質、His Tag、Acro、ILA−H52H9)を10mM酢酸緩衝液(pH5)(AR2G試薬キット、ForteBio、カタログ番号:18−5095)で5μg/mlの濃度に希釈した。該リガンドと結合させる分析物(GI101−M45、GI101−M61、GI101−M72)を1xAR2Gカイネティック緩衝液(AR2G試薬キット、ForteBio、カタログ番号:18−5095)で、各々、500nM、250nM、125nM、および62.5nMに希釈した。20mM EDCおよび10mM s−NHS(AR2G試薬キット、ForteBio、カタログ番号:18−5095)をDW中で混合することによって活性化緩衝液を製造した。80μlの各試薬を384ウェルのマイクロプレート(Greiner Bio-one、カタログ番号:781209)に配置し、プログラムをセットアップした。
Ni−NTAバイオセンサーを、200μlの1xNi−NTAカイネティック緩衝液(10xカイネティック緩衝液、ForteBio、18−1042)で96ウェルのマイクロプレートにおいて予め水和させた。該バイオセンサーと結合させるリガンド(ヒトIL−2Rベータタンパク質、His−Tag、Acro、CD2−H5221)を1xNi−NTAカイネティック緩衝液で2μg/mlの濃度に希釈した。該リガンドと結合させるGI102−M45、GI102−M61、またはGI102−M72を1xNi−NTAカイネティック緩衝液で500nM、250nM、125nM、または62.5nMの濃度に希釈した。80μlの各試薬を384ウェルのマイクロプレートに配置し、プログラムをセットアップした。
実験例9. 融合タンパク質によって惹起されるIFN−γ産生の同定
実験例9.1. CFSE標識を付したPBMCの培養
ヒトから単離された末梢血単核細胞(PBMC)を、1μMセルトレース(CellTrace)CFSE色素と37℃で20分間にわたって反応させることにより、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)での標識に付した。細胞と結合していないCFSEは、5倍容量の染色反応溶液を含む培地で5分間反応させ、ついで1,300rpmで5分間遠心分離に付すことによって除去された。CFB標識を付したPBMCを培地(10%FBS、10mM HEPES、100U/mlのペニシリン/ストレプトマイシン、1mMピルビン酸ナトリウム、55μMの2−メルカプトエタノール、1mMの非必須アミノ酸、および2mMのL−グルタミンを含有するRPMI1640培地)に再び懸濁させ、次にウェルに付き1x105個の細胞で96ウェルのプレートに加えた。5μg/mlのPHA(インゲンマメ、アカインゲンマメから由来のラクチン、Sigma-Aldrich、St. Louis、MO、USA、カタログ番号L1668−5MG)、およびGI101、GI101C1、GI101C2、またはIL−2(アルデスロイキン;ヒト組換えIL−2、Novartis)を用いる処理を行い、インキュベーションを5%CO2のインキュベーター中、37℃で6日間にわたって行った。
上澄みを除去することによって得られた細胞ペレットをFACS緩衝液(3%FBS、10mM EDTA、1M HEPES、100単位/mLのペニシリン ストレプトマイシン、10μg/ml、1mMピルビン酸ナトリウム)で洗浄し、次にFcブロッカー(Biolegend、カタログ番号422302)と4℃で5分間反応させた。次に、APC抗−CD3Ab(Biolegend、カタログ番号300412)およびPE抗−CD8aAb(Biolegend、カタログ番号300908)での処理を行い、反応を4℃で20分間にわたって進行させた。ついで、得られた反応物をFACS緩衝液で洗浄した。細胞ペレットをFACS緩衝液に再び懸濁させ、次にBD LSR Fortessa(BD Biosciences、San Diego、CA、USA)およびFlowJoソフトウェアを用いて分析した。
細胞を培養した、各サンプルの上澄みに分泌されるヒトIFN−γの量を、ヒトIFN−γELISAキット(Biolegend、カタログ番号430103)を用いて測定した。簡単に言えば、抗−ヒト−IFN−γ抗体をELISAプレートに加え、これらの抗体がその上で被覆されるように、反応を4℃で一夜進行させた。次に、1%BSAを添加したPBS溶液を用いて遮断を室温で1時間行った。洗浄緩衝液(PBS中0.05%ツィーン20)での洗浄を行い、次に標準溶液および各サンプルを適切に希釈し、そこに添加した。ついで、室温で2時間にわたって反応を進行させた。
ヒトから単離された末梢血単核細胞(PBMC)を、1μMセルトレースCFSE色素と37℃で20分間にわたって反応させることにより、CFSEでの標識に付した。細胞と結合していないCFSEは、5倍容量の染色反応溶液を含む培地で5分間反応させ、ついで1,300rpmで5分間遠心分離に付すことによって除去された。CFB標識を付したPBMCを培地(10%FBS、10mM HEPES、100U/mlのペニシリン/ストレプトマイシン、1mMピルビン酸ナトリウム、55μMの2−メルカプトエタノール、1mMの非必須アミノ酸、および2mMのL−グルタミンを含有するRPMI1640培地)に再び懸濁させ、次にウェルに付き1x105個の細胞で96ウェルのプレートに加えた。
ヒトPBMCをAllcells(ロット番号3014928、USA)より購入した。1MのセルトレースのCFSE色素を用い、それをヒトPBMCと光遮断条件下にて室温で20分間反応させた。1MセルトレースのCFSE色素と37℃で20分間反応させることにより該細胞をCFSEでの標識に付した。細胞と結合していないCFSEは、5倍容量の染色反応溶液を含む培地で5分間反応させ、ついで1,300rpmで5分間遠心分離に付すことによって除去された。CFB標識を付したPBMCを培地(10%FBS、10mM HEPES、100U/mlのペニシリン/ストレプトマイシン、1mMピルビン酸ナトリウム、55μMの2−メルカプトエタノール、1mMの非必須アミノ酸、および2mMのL−グルタミンを含有するRPMI1640培地)に再び懸濁させ、次にウェルに付き1x105個の細胞で96ウェルのプレートに加えた。
Orient Bio(Busan、Korea)より購入した7週齢のC57BL/6マウスを、一群に付き3匹のマウスを有する3群に分け、それらにPBS、GI101、またはGI101wを腹腔内に注射した。ここで、GI101およびGI101wは、各々、200μlのPBS中に40.5μgを含むように製造され、それらの腹腔内に注射された。注射して5日経過した後、各群のマウスから脾臓を摘出した。そこから細胞を単離し、血球計数器を用いて細胞の全数を測定した。脾細胞を、APC−CD3ε抗体(Biolegend;145−2C11)、PE−NK1.1抗体(Biolegend;PK136)、およびパシフィック・ブルー(Pacific blue)−CD8α抗体(BD;53−6.7)を用いるFACSで、その中のCD8+T細胞とNK細胞の割合について試験した。それで、脾臓にあるCD8+T細胞およびNK細胞の数を算定した。
実験は、CTLA−4遮断バイオアッセイキット(Promega、カタログ番号JA4005)を用いて行われた。該実験は、簡単には、次のように記載される。液体窒素中に保持されたCTLA−4エフェクター細胞を37℃の恒温水浴にて3分間にわたって解凍し、0.8mlのCTLA−4エフェクター細胞を3.2mlの予め加温に供したアッセイ緩衝液(90%RPMI+10%FBS)とよく混合した。次に、該混合物を96ウェルの白色の細胞培養プレート(SPL、カタログ番号30196)にウェル当たり25μlで添加した。次に、25μlのGI101を種々の濃度でそれに添加した。負の対照として、25μlのアッセイ緩衝液をそこに添加した。次に、該白色プレートの細胞培養プレート(white plat cell culture plate)にカバーをかけ、aAPC/Raji細胞が製造されるまで、室温に置いた。
Orient Bio(Korea)より購入した7週齢のC57BL/6マウスを、一群に付き3匹のマウスを有する3群に分け、それらにPBSを、3mg/kg、6mg/kg、または12mg/kgのGI101を、あるいは3mg/kg、6mg/kg、または12mg/kgのmGI102(mGI102−M61)を静脈内に投与した。注射後の1、3、5、7、および14日目に、各群のマウスから脾臓を摘出した。その後で、脾臓組織について、エフェクターCD8+T細胞、NK細胞、およびTreg細胞の数を個々の抗体を用いるFACS分析で算定し、エフェクターCD8+T細胞およびNK細胞のTreg細胞に対する割合を個々に算定した。各細胞アッセイにおいて使用された抗体の情報は次のとおりである:
NK細胞:PB抗−マウスCD3ε抗体(Biolegend、#155612;KT3.1.1)、PE抗−マウスNK−1.1(Biolegend、#108708;PK136)
Treg細胞:FITC抗−マウスCD3抗体(Biolegend、#100204;17A2)、PB抗−マウスCD4抗体(Biolegend、#100531;RM4−5)、PE抗−マウスCD25抗体(Biolegend、#102008;PC61)、APC抗−マウスFoxp3抗体(Invitrogen、#FJK−16s、17−5773−82)
実験例15. GI101の、PD−L1を過剰発現するがん細胞に対する効果の同定
PD−L1を過剰発現するNCl−H292がん細胞株を、10μg/mlのミトマイシン(Mitomycin)C(Sigma)を含有する培地中で3時間にわたって培養し、次にミトマイシンCを該培地で洗浄することで除去した。その後で、ミトマイシンC処理のNCl−H292がん細胞の5x104個の細胞を96ウェルプレートにて1x105個のヒトPBMCの細胞と一緒にインキュベートした。ここで、5μg/mlのPHA(Sigma)での処理をT細胞の活性のために行った。加えて、GI101C1およびGI101を50nMの濃度でIgG1−Fc(Biolegend)またはアバタセプト(abatacept)(=オレンシア(Orencia);Bristol-Myers Squibb)と50nMの濃度で4℃にて30分間反応させ、ついで得られた反応物を用いてNCl−H292がん細胞を処理した。3日後、細胞培養物の上澄みを集め、IFN−γの数をELISAキット(Biolegend)を用いて定量した。
5x106個の細胞/0.05mlのマウス由来のCT−26がん細胞株を、0.05mlのマトリゲルマトリックスフェノールレッドフリー(Matrigel matrix phenol red-free)(BD)と混合し、該混合物(0.1ml)の移植は6週齢の雌BALB/cマウス(Orient Bio)の右背部に皮下投与されることでなされた。がん細胞を移植して特定期間経過した後に、腫瘍体積を測定し、約80mm3〜120mm3に達した対象を分離した。次に、対象に、GI101(0.1ml)を静脈内投与した。最初の投与から3日毎に1回の割合で合計にて3回の投与を行い、負の対照群にはPBSを投与した。腫瘍の大きさを毎日測定し、抗がん効果を同定した。
Orient Bioより購入したC57BL/6マウス(雌、7週齢)を7日間の順化期間に供した。次に、B16F10がん細胞株(ATCC、USA)の5x106個の細胞を、0.05mlのマトリゲルマトリックスフェノールレッドフリー(BD)と混合し、該混合物の同種間移植はマウスの右背部に0.1mlを皮下投与することによってなされた。がん細胞を移植して特定期間経過した後に、腫瘍体積を測定し、約50mm3〜120mm3に達した対象を選択し、選択したマウスを腫瘍の大きさおよび体重に基づいて均等に、各群が10匹のマウスを有するようにグループ分した。
Orient Bioより購入したBALB/cマウス(雌、7週齢)を7日間の順化期間に供した。次に、CT−26がん細胞株(ATCC、USA)の5x106個の細胞を0.05mlのマトリゲルマトリックスフェノールレッドフリー(BD)と混合し、該混合物の同種間移植はマウスの右背部に0.1mlを皮下投与することによってなされた。がん細胞を移植して特定期間経過した後に、腫瘍体積を測定し、約28mm3に到達した対象を選択し、次に選択したマウスを腫瘍の大きさおよび体重に基づいて均等に、各群が10匹のマウスを有するようにグループ分けした。その後で、使い捨てシリンジ(31G、1mL)を用い、hIgG4を6mg/kgの用量で負の対照群に投与した。実験群には、mGI101を3mg/kg、6mg/kg、または12mg/kgの用量でそれらに静脈内投与した。最初の投与から3日毎に1回の割合で合計にて3回の投与を行った。腫瘍の大きさを毎日測定した。
実験例19.1. 腫瘍阻害作用の同定
Orient Bioより購入したBALB/cマウス(雌、7週齢)を7日間の順化期間に供した。次に、CT−26がん細胞株(ATCC、USA)の5x106個の細胞を0.1mlのPBSに懸濁させ、該懸濁液の同種間移植はマウスの右背部に0.1mlを皮下投与することによってなされた。がん細胞を移植して特定期間経過した後に、腫瘍体積を測定し、約50mm3ないし200mm3に到達した対象を選択し、次に選択したマウスを腫瘍の大きさおよび体重に基づいて均等に、各群が10匹のマウスを有するようにグループ分けした。その後で、使い捨てシリンジ(31G、1mL)を用い、負の対照群には薬物を投与せず、正の対照群には抗−PD−1抗体を5mg/kgの用量で、または抗−PD−1抗体を5mg/kgの用量で、および抗−CTLA−4抗体を5mg/kgの用量で静脈内に投与した。実験群には、GI101を0.1mg/kgまたは1mg/kgの用量でそれらに静脈内投与した。最初の投与から3日毎に1回の割合で合計にて3回の投与を行った。腫瘍の大きさを毎日測定した。
実験例19.1における各群のマウスにて、腫瘍の体積が平均200mm3に達したならば、それらのマウスを殺し、がん組織を集めた。その後で、該がん組織を単一細胞レベルに分離し、その中の免疫細胞を分析し、次に以下の抗体を用いてがん組織における免疫細胞についてFACS分析を行った:抗−マウス−CD3(Biolegend、カタログ番号100320)、抗−マウス−CD4(Biolegend、カタログ番号100526)、抗−マウス−CD8(Biolegend、カタログ番号100750)、抗−マウス−FoxP3(eBioscience、カタログ番号12−5773−82)、抗−マウス−CD25(Biolegend、カタログ番号102049)、抗−マウス−CD44(eBioscience、カタログ番号61−0441−82)、抗−マウス−PD−1(Biolegend、カタログ番号135218)、抗−マウス−IFN−ガンマ(Biolegend、カタログ番号505832)、抗−マウス−CD49b(Biolegend、カタログ番号108906)、抗−マウス−H2(Invitrogen、カタログ番号A15443)、抗−マウス−CD11c(Biolegend、カタログ番号117343)、抗−マウス−CD80(eBioscience、カタログ番号47−4801−82)、抗−マウス−CD86(Biolegend、カタログ番号104729)、抗−マウス−F4/80(eBioscience、カタログ番号47−4801−82)、および抗−マウス−CD206(eBioscience、カタログ番号17−2061−80)。
実験例20.1. 腫瘍阻害作用の同定
Orient Bioより購入したC57BL/6マウス(雌、7週齢)を7日間の順化期間に供した。次に、LLC2がん細胞株(ATCC、USA)の5x106個の細胞を0.1ml PBSに懸濁させ、該懸濁液の同種間移植はマウスの右背部に0.1mlを皮下投与することによってなされた。がん細胞を移植して特定期間経過した後に、腫瘍体積を測定し、約50mm3ないし200mm3に到達した対象を選択し、次に選択したマウスを腫瘍の大きさおよび体重に基づいて均等に、各群が10匹のマウスを有するようにグループ分けした。その後で、使い捨てシリンジ(31G、1mL)を用い、負の対照群には薬物を投与せず、正の対照群には抗−PD−1抗体を5mg/kgの用量で、または抗−PD−1抗体を5mg/kgの用量で、および抗−CTLA−4抗体を5mg/kgの用量で静脈内に投与した。実験群には、GI101を0.1mg/kgまたは1mg/kgの用量でそれらに静脈内投与した。最初の投与から3日毎に1回の割合で合計にて3回の投与を行った。腫瘍の大きさを毎日測定した。
実験例20.1における各群のマウスは、腫瘍の体積が平均で200mm3に達した時に殺され、がん組織を集めた。その後で、実験例19.2と同じ方法にてFACS分析を行い、がん組織中の免疫細胞を分析した。
Orient Bioより購入したBALB/cマウス(雌、7週齢)を7日間の順化期間に供した。次に、CT−26がん細胞株(ATCC、USA)の5x106個の細胞を、0.05mlのマトリゲルマトリックスフェノールレッドフリー(BD)と混合し、該混合物の同種間移植はマウスの右背部に0.1mlを皮下投与することによってなされた。がん細胞を移植して特定期間経過した後に、腫瘍体積を測定し、約28mm3に到達した対象を選択し、次に該選択したマウスを腫瘍の大きさおよび体重に基づいて均等に、各群が10匹のマウスを有するようにグループ分けした。その後で、使い捨てシリンジ(31G、1mL)を用い、hIgG4を6mg/kgの用量で負の対照群に投与した。実験群には、mGI102−M61を3mg/kg、6mg/kg、または12mg/kgの用量でそれらに静脈内投与した。最初の投与から3日毎に1回の割合で合計にて3回の投与を行った。腫瘍の大きさを毎日測定した。
Orient Bioより購入したBALB/cマウス(雌、7週齢)を7日間の順化期間に供した。次に、CT−26がん細胞株(ATCC、USA)の5x106個の細胞を、0.05mlのマトリゲルマトリックスフェノールレッドフリー(BD)と混合し、該混合物の同種間移植はマウスの右背部に0.1mlを皮下投与することによってなされた。がん細胞を移植して特定期間経過した後に、腫瘍体積を測定し、約200mm3〜250mm3に到達した対象を選択し、ついで選択したマウスを腫瘍の大きさおよび体重に基づいて均等に、各群が10匹のマウスを有するようにグループ分けした。
実験例23. サルを用いてのGI101の毒性評価
実験例23.1. サルの飼育および薬物投与
この実験において、2ないし3歳の9匹の雄フィリピンザル(Philippine monkeys)(カニクイザル(Cynomolgus monkeys))を用いた。該実験は、日本における「動物の愛護および管理に関する法律(Act on Welfare and Management of Animals)」およびIna Research Incの「動物の管理と使用に関する指針(Guidance for Animal Care and Use)」に従って実施された。該実験プロトコルは、Ina Research IncのIACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)によってチェックされ、AAALACインターナショナルによって認証された(認証ユニット第001107号)。
臨床観察、および体重および食物摂取の変化の測定は、薬物投与の1日前に、薬物投与の1日、8日および15日後に行われた。結果として、毒性はGI101によって生じなかった(図66ないし69)。
薬物を投与する1日前に、そして薬物を投与した後の1日、8日および15日目に、実験例23.1のサルから採血を行った。ここで、血液は使い捨てシリンジ(22G)を用いて大腿静脈を通して集められた。採取血液を自動血球計数システム(Automated Hematology System)XN−2000(Sysmex Corporation)および自動血液凝固分析装置(Automated Blood Coagulation Analyzer)CA−510(Sysmex Corporation) を用いて以下の表2に列挙される項目について血液分析に供した。
薬物を投与する1日前に、そして薬物を投与した後の1日、8日および15日目に、実験例23.1のサルから採血を行った。ここで、血液は実験例23.3における方法と同じ方法で集められた。採取血液を臨床分析装置モデル7180(Hitachi High-Technologies Corporation)を用いて以下の表3に列挙される項目について臨床および化学分析に供した。
薬物を投与する1日前に、そして薬物を投与した後の1日、8日および15日目に、実験例23.1のサルから採血を行った。ここで、血液は実験例23.3における方法と同じ方法で集められた。バイオ−プレックス(Bio-Plex)200(Bio-Rad Laboratories, Inc.)装置およびヒト以外の霊長類サイトカイン磁性ビーズパネル(Non-Human Primate Cytokine Magnetic Bead Panel)(EMD Millipore)アッセイキット(Assay Kit)を用い、採取血液をTNF−α、IFN−γ、IL−1β、IL−2、IL−4、IL−6、IL−8、IL−10、およびIL−12について分析した。結果として、GI101によって惹起される毒性はサイトカイン分析に関して検出されなかった(図80および81)。
薬物を投与する1日前に、そして薬物を投与した後の1日、8日および15日目に、実験例23.1のサルから採血を行った。ここで、血液は実験例23.3における方法と同じ方法で集められた。フローサイトメーター(LSRFortessa X−20、Becton、Dickinson and Company)を用い、採取血液を以下の項目について分析した:
1)Ki67+CD4:CD45+/CD3+/CD4+/Ki67+
2)Ki67+CD8:CD45+/CD3+/CD8+/Ki67+
3)Ki67+Treg:CD45+/CD3+/FoxP3+/Ki67+
4)Ki67+ICOS+Treg:CD45+/CD3+/FoxP3+/Ki67+/CD278+
5)ICOS+Treg:CD45+/CD3+/FoxP3+/CD278+
6)Ki67+NK細胞:CD45+/CD16+およびCD56+/Ki67+
16日目に、実験例23.1にあるサルを殺し、すべての器官および組織を10%ホルマリンを用いて固定した。しかしながら、睾丸はホルマリン−シュークロース−酢酸(FSA)溶液を用いて固定し、眼および視神経はリン酸緩衝液中の1%ホルムアルデヒド−2.5%グルタルアルデヒドを用いて固定した。以下の表4にて列挙される項目にある器官および組織に対してはヘマトキシリン−エオシン染色を行い、観察を光学顕微鏡の下で行った。
実験例24. GI102−M45の抗がん作用の同定
実験例24.1. GI102−M45の、マウス由来の大腸がん細胞を移植したマウスにおける抗がん作用の同定
マウス由来のCT−26がん細胞株(0.05ml)中の5x106個の細胞を0.05mlのマトリゲルマトリックスフェノールレッドフリー(BD)と混合し、該混合物の移植は6週齢の雌BALB/cマウス(Orient Bio)の右背部に0.1mlを皮下投与することによってなされた。がん細胞を移植して特定期間経過した後に、腫瘍体積を測定し、約80mm3ないし120mm3に到達した対象を分離した。次に該対象に0.1mlのGI102−M45を静脈内投与した。最初の投与から3日毎に1回の割合で合計にて3回の投与を行い、負の対照にはPBSを投与した。腫瘍の大きさを毎日測定し、抗がん作用を同定した。GI102−M45の活性を実験例16にあるのと同じ方法で同定した。
Orient Bioより購入したC57BL/6マウス(雌、7週齢)を7日間の順化期間に供した。次に、LLC2がん細胞株(ATCC、USA)の5x106個の細胞を0.1ml PBSに懸濁させ、該懸濁液の同種間移植はマウスの右背部に0.1mlを皮下投与することによってなされた。がん細胞を移植して特定期間経過した後に、腫瘍体積を測定し、約50mm3ないし200mm3に到達した対象を選択し、次にその選択したマウスを腫瘍の大きさおよび体重に基づいて均等に、各群が10匹のマウスを有するようにグループ分けした。その後で、使い捨てシリンジ(31G、1mL)を用い、負の対照群には薬物を投与せず、正の対照群には抗−PD−1抗体を5mg/kgの用量で、または抗−PD−1抗体を5mg/kgの用量で、および抗−CTLA−4抗体を5mg/kgの用量で静脈内に投与した。実験群には、GI102−M45を0.1mg/kgまたは1mg/kgの用量でそれらに静脈内投与した。最初の投与から3日毎に1回の割合で合計にて3回の投与を行った。腫瘍の大きさを毎日測定した。GI102−M45の活性を実験例20.1と同じ方法にて同定した。
実験例25.1. GI102−M61の、マウス由来の大腸がん細胞を移植したマウスにおける抗がん作用の同定
マウス由来のCT−26がん細胞株(0.05ml)中の5x106個の細胞を、0.05mlのマトリゲルマトリックスフェノールレッドフリー(BD)と混合し、該混合物の移植は6週齢の雌BALB/cマウス(Orient Bio)の右背部に0.1mlを皮下投与することによってなされた。がん細胞を移植して特定期間経過した後に、腫瘍体積を測定し、約80mm3ないし120mm3に到達した対象を分離した。次に、該対象に0.1mlのGI102−M61を静脈内に投与した。最初の投与から3日毎に1回の割合で合計にて3回の投与を行い、負の対照にPBSを投与した。腫瘍の大きさを毎日測定し、抗がん作用を同定した。GI102−M61の活性を実験例16と同じ方法にて同定した。
Orient Bioより購入したC57BL/6マウス(雌、7週齢)を7日間の順化期間に供した。次に、LLC2がん細胞株(ATCC、USA)の5x106個の細胞を0.1ml PBSに懸濁させ、該懸濁液の同種間移植はマウスの右背部に0.1mlを皮下投与することによってなされた。がん細胞を移植して特定期間経過した後に、腫瘍体積を測定し、約50mm3ないし200mm3に到達した対象を選択し、次にその選択したマウスを腫瘍の大きさおよび体重に基づいて均等に、各群が10匹のマウスを有するようにグループ分けした。その後で、使い捨てシリンジ(31G、1mL)を用い、負の対照群には薬物を投与せず、正の対照群には抗−PD−1抗体を5mg/kgの用量で、または抗−PD−1抗体を5mg/kgの用量で、および抗−CTLA−4抗体を5mg/kgの用量で静脈内に投与した。実験群には、GI102−M61を0.1mg/kgまたは1mg/kgでそれらに静脈内投与した。最初の投与から3日毎に1回の割合で合計にて3回の投与を行った。腫瘍の大きさを毎日測定した。GI102−M61の活性を実験例20.1と同じ方法にて同定した。
実験例26.1. GI102−M72の、マウス由来の大腸がん細胞を移植したマウスにおける抗がん作用の同定
マウス由来のCT−26がん細胞株(0.05ml)中の5x106個の細胞を0.05mlのマトリゲルマトリックスフェノールレッドフリー(BD)と混合し、該混合物の移植は6週齢の雌BALB/cマウス(Orient Bio)の右背部に0.1mlを皮下投与することによってなされた。がん細胞を移植して特定期間経過した後に、腫瘍体積を測定し、約80mm3ないし120mm3に到達した対象を分離した。ついで、該対象に0.1mlのGI102−M72を静脈内に投与した。最初の投与から3日毎に1回の割合で合計にて3回の投与を行い、負の対照にPBSを投与した。腫瘍の大きさを毎日測定し、抗がん作用を同定した。GI102−M72の活性を実験例16と同じ方法にて同定した。
Orient Bioより購入したC57BL/6マウス(雌、7週齢)を7日間の順化期間に供した。次に、LLC2がん細胞株(ATCC、USA)の5x106個の細胞を0.1ml PBSに懸濁させ、該懸濁液の同種間移植はマウスの右背部に0.1mlを皮下投与することによってなされた。がん細胞を移植して特定期間経過した後に、腫瘍体積を測定し、約50mm3ないし200mm3に到達した対象を選択し、次にその選択したマウスを腫瘍の大きさおよび体重に基づいて均等に、各群が10匹のマウスを有するようにグループ分けした。その後で、使い捨てシリンジ(31G、1mL)を用い、負の対照群には薬物を投与せず、正の対照群には抗−PD−1抗体を5mg/kgの用量で、または抗−PD−1抗体を5mg/kgの用量で、および抗−CTLA−4抗体を5mg/kgの用量で静脈内に投与した。実験群には、GI102−M72を0.1mg/kgまたは1mg/kgの用量でそれらに静脈内投与した。最初の投与から3日毎に1回の割合で合計にて3回の投与を行った。腫瘍の大きさを毎日測定した。GI102−M72の活性を実験例20.1と同じ方法にて同定した。
Claims (33)
- IL−2タンパク質およびCD80タンパク質を含む、融合タンパク質。
- IL−2タンパク質およびCD80タンパク質が相互にリンカーを介して結合する、請求項1に記載の融合タンパク質。
- IL−2タンパク質が配列番号:10のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の融合タンパク質。
- IL−2タンパク質がIL−2変種である、請求項1に記載の融合タンパク質。
- IL−2変種が、配列番号:10のアミノ酸配列において38番、42番、45番、61番および72番目のアミノ酸より選択される少なくとも1つの置換によって得られる、請求項4に記載の融合タンパク質。
- IL−2変種が、配列番号:10のアミノ酸配列においてR38A、F42A、Y45A、E61R、およびL72Gからなる群より選択される少なくとも1つの置換によって得られる、請求項4に記載の融合タンパク質。
- IL−2変種が、配列番号:10のアミノ酸配列において次の置換の組み合わせ:
(a)R38A/F42A
(b)R38A/F42A/Y45A
(c)R38A/F42A/E61R
(d)R38A/F42A/L72G
より選択される、いずれか1つを含有する、請求項4に記載の融合タンパク質。 - IL−2変種が、配列番号:6、22、23、または24のアミノ酸配列を有する、請求項4に記載の融合タンパク質。
- CD80タンパク質が配列番号:11のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の融合タンパク質。
- CD80タンパク質がCD80フラグメントである、請求項1に記載の融合タンパク質。
- CD80フラグメントが、配列番号:11のアミノ酸配列において35番目のアミノ酸〜242番目のアミノ酸からなる、請求項10に記載の融合タンパク質。
- リンカーが、アルブミンまたは免疫グロブリンのFcドメインである、請求項2に記載の融合タンパク質。
- Fcドメインが野生型または変種である、請求項12に記載の融合タンパク質。
- Fcドメインが配列番号:4のアミノ酸配列を有する、請求項12に記載の融合タンパク質。
- Fcドメインの変種が配列番号:12のアミノ酸配列を有する、請求項13に記載の融合タンパク質。
- リンカー(1)が配列番号:3のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーである、請求項16に記載の融合タンパク質。
- リンカー(2)が配列番号:5のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーである、請求項16に記載の融合タンパク質。
- 融合タンパク質が構造式(I)からなる、請求項16に記載の融合タンパク質。
- 融合タンパク質が、配列番号:9、26、28、または30のアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有する、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 請求項1〜20のいずれか一項に記載の2つの融合タンパク質が相互に結合している、融合タンパク質二量体。
- 融合タンパク質二量体がホモ二量体である、請求項21に記載の融合タンパク質二量体。
- 請求項1〜20のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- ポリヌクレオチドが、配列番号:8、25、27または29のヌクレオチド配列と85%以上の配列同一性を有する、請求項23に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項23に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- 請求項25に記載のベクターが導入されている形質転換細胞。
- 活性成分として:
請求項1〜20のいずれか一項に記載の融合タンパク質;または
請求項21または22に記載の融合タンパク質二量体
を含む、がんまたは感染症を予防または治療するための医薬組成物。 - 医薬的に許容される担体をさらに含む、請求項27に記載の医薬組成物。
- がんが、胃がん、肝臓がん、肺がん、大腸がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、膵臓がん、子宮頸がん、甲状腺がん、咽頭がん、急性骨髄性白血病、脳腫瘍、神経芽細胞腫、網膜芽腫、頭頚部がん、唾液腺がん、およびリンパ腫からなる群より選択されるいずれかである、請求項27に記載の医薬組成物。
- 感染症が、B型肝炎、C型肝炎、ヒト・パピローマウイルス感染、サイトメガロウイルス感染、ウイルス性呼吸器疾患、およびインフルエンザからなる群より選択されるいずれかである、請求項27に記載の医薬組成物。
- がんまたは感染症を治療するための、請求項1に記載の融合タンパク質の使用。
- がんまたは感染症を治療するための医薬の製造のための、請求項1に記載の融合タンパク質の使用。
- がんまたは感染症を治療するための方法であって、
対象に、請求項1〜20のいずれか一項に記載の融合タンパク質を、または請求項21もしくは22に記載の融合タンパク質二量体を投与することを含む、方法。
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