JP2023531876A - 抗ｌａｇ－３抗体とｉｌ－２とを含む融合タンパク質及びその使用 - Google Patents

抗ｌａｇ－３抗体とｉｌ－２とを含む融合タンパク質及びその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、抗ＬＡＧ－３抗体とＩＬ－２又はそのバリアントとを含む融合タンパク質に関する。本発明による融合タンパク質では、抗ＬＡＧ－３抗体部分はＬＡＧ－３に結合することができ、これによってＬＡＧ－３とＭＨＣＩＩとの結合が制御される。さらに、ＩＬ－２タンパク質又はそのバリアントは、Ｔ細胞の活性を制御することができる。したがって、前記融合タンパク質を含む医薬組成物は、インビボにおいて免疫活性を高め、抗がん剤として効果的に使用されうるものであり、よって、産業的適用性が高いものである。【選択図】 図１０

Description

本発明は、抗ＬＡＧ－３抗体とＩＬ－２とを含む融合タンパク質、及びその使用に関する。詳細には、本発明は、がんを治療又は予防する有効性を有する新規の融合タンパク質に関する。
がん免疫療法は、身体の免疫応答を使用してがんを治療する方法である。がん免疫療法は、免疫系を、がん細胞の表面タンパク質等の抗原を標的化することによってがん細胞を攻撃するように誘導することができる。特に、抗がん免疫は、免疫チェックポイント経路を遮断することによって活性化されうることが報告されている。免疫チェックポイントは、腫瘍細胞が免疫回避を起こす主要な機序の１つである。したがって、免疫チェックポイントを阻害又は遮断することによってＴ細胞の活性化を高めることができ、よって抗腫瘍免疫を増強させることができる。
一方、ＩＬ－２は主に、活性化されたＴ細胞、特にＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞によって合成される。ＩＬ－２は、Ｔ細胞の増殖及び分化を刺激し、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の産生並びに末梢血リンパ球の細胞傷害性細胞及びリンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ細胞）への分化を誘導する。
しかしながら、ＩＬ－２は、免疫細胞の数及び活性の上昇の媒介に重要であるだけでなく、免疫寛容の維持にも重要であるという、免疫応答における二面的な機能を有する。さらに、ＩＬ－２は、腫瘍成長の阻害に最適ではない可能性があると報告されている。ＩＬ－２の存在下では、生成した細胞傷害性Ｔ細胞の活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）が起こることがあり、免疫応答がＩＬ－２依存性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）によって阻害されることがあるというのがその理由である（Ｉｍａｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ ９８、４１６～４２３頁、２００７年）。
一方、ＬＡＧ－３は、ＰＤ－１の機序と類似の機序を有することが知られている。ＬＡＧ－３は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞で発現される免疫チェックポイント阻害物質であり、ＣＤ４の構造と類似の構造を有する。しかしながら、ＬＡＧ－３は、Ｄ１ドメイン内にさらなる３０個のアミノ酸を有し、よって、ＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）との高い親和性を有することが知られている。
したがって、本発明者らは、免疫細胞の活性を増強する新規の組合せを有する融合タンパク質を開発するための研究を行った。結果として、本発明者らは、抗ＬＡＧ－３抗体とＩＬ－２バリアントとを含む融合タンパク質が免疫細胞を効果的に制御することを確認した。この結果に基づき、本発明者らは、該融合タンパク質が抗がん剤として有効であることを確認し、これによって本発明を完成させた。
上記の目的を達成するために、本発明の一態様では、ＬＡＧ－３に特異的に結合する抗体とＩＬ－２タンパク質又はそのバリアントとを含む融合タンパク質が提供される。
本発明の別の態様では、該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、該発現ベクターが導入された形質転換細胞とが提供される。
本発明のさらに別の態様では、該形質転換細胞を培養するステップと、融合タンパク質を収集するステップとを含む、融合タンパク質を調製する方法が提供される。
本発明のまた別の態様では、該融合タンパク質及びその医学的使用が提供される。
本発明のさらにまた別の態様では、がんを治療又は予防するための該融合タンパク質の使用が提供される。
本発明のさらにまた別の態様では、該融合タンパク質を対象に投与するステップを含む、がんを治療又は予防するための方法が提供される。
本発明のさらにまた別の態様では、がんの治療又は予防のための医薬の製造のための該融合タンパク質の使用が提供される。
本発明による抗ＬＡＧ－３抗体とＩＬ－２バリアントとを含む融合タンパク質は、ＬＡＧ－３に関連した機序を制御するだけでなく、ＩＬ－２と同じか又は類似の機能を有しうる。すなわち、該融合タンパク質は、ＬＡＧ－３とＭＨＣＩＩとの結合を制御するだけでなく、免疫細胞を活性化することができる。したがって、該融合タンパク質は、抗がん剤として使用することができる。
一実施形態としての、抗ｈＬＡＧ－３抗体－ｈＩｇＧ４ Ｆｃ－ｈＩＬ－２ｖ２融合タンパク質（ＧＩ－１０４Ｅ１）の構造を示す図である。 一実施形態としての、抗ｈＬＡＧ－３抗体－ｈＩｇＧ４ Ｆｃ－ｈＩＬ－２ｖ３融合タンパク質（ＧＩ－１０４Ｅ２）の構造を示す図である。 ＧＩ－１０４Ｅ１を産生させ、次いでＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認した図である。 ＧＩ－１０４Ｅ２を産生させ、次いでＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認した図である。 ＧＩ－１０４Ｅ１を産生させ、次いでウェスタンブロットによって確認した図である。 ＧＩ－１０４Ｅ２を産生させ、次いでウェスタンブロットによって確認した図である。 融合タンパク質の作用の機序、及びＧＩ－１０４Ｅ１又はＧＩ－１０４Ｅ２の実験方法を示す図である。 ＧＩ－１０４Ｅ１が、ＬＡＧ－３に結合し、ＬＡＧ－３－ＭＨＣＩＩ介在シグナル伝達を阻害するかどうかを、ＬＡＧ－３遮断アッセイによって検証するグラフである。 ＧＩ－１０４Ｅ２が、ＬＡＧ－３に結合し、ＬＡＧ－３－ＭＨＣＩＩ－介在シグナル伝達を阻害するかどうかを、ＬＡＧ－３遮断アッセイによって検証するグラフである。 ＣＴ２６がん細胞を皮下移植したマウスに、ビヒクル（ＰＢＳ）、抗ＬＡＧ－３抗体、Ｆｃ－ＩＬ－２ｖ２、抗ＬＡＧ－３抗体とＦｃ－ＩＬ－２ｖ２との組合せ、及び抗ＬＡＧ－３抗体とＩＬ－２ｖ２とを含む融合タンパク質（ＧＩ－１０４Ｅ１）をそれぞれ週１回３週間投与することによって観察された、腫瘍体積を示すグラフである。 ＣＴ２６がん細胞を皮下移植したマウスに、ビヒクル（ＰＢＳ）、抗ＬＡＧ－３抗体、Ｆｃ－ＩＬ－２ｖ２、抗ＬＡＧ－３抗体とＦｃ－ＩＬ－２ｖ２との組合せ、及び抗－ＬＡＧ－３とＩＬ－２ｖ２とを含む融合タンパク質（ＧＩ－１０４Ｅ１）をそれぞれ投与した後の、対象の腫瘍体積を示すグラフである。 ＣＴ２６がん細胞を皮下移植したマウスに、ビヒクル（ＰＢＳ）を投与した群の、対象の腫瘍体積を示すグラフである。 ＣＴ２６がん細胞を皮下移植したマウスに、抗ＬＡＧ－３抗体を投与した群の、対象の腫瘍体積を示すグラフである。 ＣＴ２６がん細胞を皮下移植したマウスに、Ｆｃ－ＩＬ－２ｖ２を投与した群の、対象の腫瘍体積を示すグラフである。 ＣＴ２６がん細胞を皮下移植したマウスに、抗ＬＡＧ－３抗体とＦｃ－ＩＬ－２ｖ２とを同時投与した群の、対象の腫瘍体積を示すグラフである。 ＣＴ２６がん細胞を皮下移植したマウスに、抗ＬＡＧ－３とＩＬ－２ｖ２とを含む融合タンパク質（ＧＩ－１０４Ｅ１）を投与した群の、対象の腫瘍体積を示すグラフである。 ＣＴ２６がん細胞を皮下移植したマウスに、ビヒクル（ＰＢＳ）、抗ＬＡＧ－３抗体、Ｆｃ－ＩＬ－２ｖ２、抗ＬＡＧ－３抗体とＦｃ－ＩＬ－２ｖ２との組合せ、及び抗ＬＡＧ－３とＩＬ－２ｖ２とを含む融合タンパク質（ＧＩ－１０４Ｅ１）をそれぞれ週１回３週間及び初回投与の３２日後に投与した後の、ビヒクル（ＰＢＳ）投与群の平均腫瘍体積成長を基準として３０％以上、５０％以上、及び８０％以上の腫瘍成長阻害を有する、各群の対象数を示すグラフである。 ＣＴ２６がん細胞を皮下移植したマウスに、ビヒクル（ＰＢＳ）、抗ＬＡＧ－３抗体、Ｆｃ－ＩＬ－２ｖ２、抗ＬＡＧ－３抗体とＦｃ－ＩＬ－２ｖ２との組合せ、及び抗ＬＡＧ－３とＩＬ－２ｖ２とを含む融合タンパク質（ＧＩ－１０４Ｅ１）をそれぞれ週１回３週間投与することによって観察された、生存率を示すグラフである。 ＣＴ２６がん細胞を皮下移植したマウスに、ビヒクル（ＰＢＳ）、抗ＬＡＧ－３抗体、Ｆｃ－ＩＬ－２ｖ３、抗ＬＡＧ－３抗体とＦｃ－ＩＬ－２ｖ３との組合せ、及び抗ＬＡＧ－３とＩＬ－２ｖ３とを含む融合タンパク質（ＧＩ－１０４Ｅ２）をそれぞれ週１回３週間投与することによって観察された、腫瘍体積を示すグラフである。 ＣＴ２６がん細胞を皮下移植したマウスに、ビヒクル（ＰＢＳ）、抗ＬＡＧ－３抗体、Ｆｃ－ＩＬ－２ｖ３、抗ＬＡＧ－３抗体とＦｃ－ＩＬ－２ｖ３との組合せ、抗ＬＡＧ－３とＩＬ－２ｖ３とを含む融合タンパク質（ＧＩ－１０４Ｅ２）をそれぞれ投与した後の、各投与群の対象の腫瘍体積を示すグラフである。 ＣＴ２６がん細胞を皮下移植したマウスに、ビヒクル（ＰＢＳ）を投与した群の、対象の腫瘍体積を示すグラフである。 ＣＴ２６がん細胞を皮下移植したマウスに、抗ＬＡＧ－３抗体を投与した群の、対象の腫瘍体積を示すグラフである。 ＣＴ２６がん細胞を皮下移植したマウスに、Ｆｃ－ＩＬ－２ｖ３を投与した群の、対象の腫瘍体積を示すグラフである。 ＣＴ２６がん細胞を皮下移植したマウスに、抗ＬＡＧ－３抗体とＦｃ－ＩＬ－２ｖ３とを同時投与した群の、対象の腫瘍体積を示すグラフである。 ＣＴ２６がん細胞を皮下移植したマウスに、抗ＬＡＧ－３とＩＬ－２ｖ３とを含む融合タンパク質（ＧＩ－１０４Ｅ２）を投与した群の、対象の腫瘍体積を示すグラフである。 ＣＴ２６がん細胞を皮下移植したマウスに、ビヒクル（ＰＢＳ）、抗ＬＡＧ－３抗体、Ｆｃ－ＩＬ－２ｖ３、抗ＬＡＧ－３抗体とＦｃ－ＩＬ－２ｖ３との組合せ、及び抗ＬＡＧ－３とＩＬ－２ｖ３とを含む融合タンパク質（ＧＩ－１０４Ｅ２）をそれぞれ週１回３週間及び初回投与の３２日後に投与した後の、ビヒクル（ＰＢＳ）投与群の平均腫瘍体積成長を基準として３０％以上、５０％以上、及び８０％以上の腫瘍成長阻害を有する、各群の対象数を示すグラフである。 ＣＴ２６がん細胞を皮下移植したマウスに、ビヒクル（ＰＢＳ）、抗ＬＡＧ－３抗体、Ｆｃ－ＩＬ－２ｖ３、抗ＬＡＧ－３抗体とＦｃ－ＩＬ－２ｖ３との組合せ、及び抗ＬＡＧ－３とＩＬ－２ｖ３とを含む融合タンパク質（ＧＩ－１０４Ｅ２）をそれぞれ週１回３週間投与することによって観察された、生存率を示すグラフである。
〔発明を実施するための最良の形態〕
抗ＬＡＧ－３抗体とＩＬ－２とを含む融合タンパク質
本発明の一態様では、ＬＡＧ－３に特異的に結合する抗体とＩＬ－２タンパク質とを含む融合タンパク質が提供される。
この場合、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＬ－２タンパク質が抗ＬＡＧ－３抗体に連結された形態であってもよい。一実施形態では、融合タンパク質は、１つ又は２つのＩＬ－２タンパク質若しくはこれらのバリアントを含有していてもよい。この場合、抗ＬＡＧ－３抗体とＩＬ－２とは、リンカーを介して相互に結合されていてもよい。
本明細書において使用される場合、「ＬＡＧ－３」という用語は、ＣＤ２２３又はリンパ球活性化遺伝子３を指す。このタンパク質は、ＬＡＧ－３遺伝子によってコードされている。ＬＡＧ－３は、ＰＤ－１の機序と類似の機序を有することが知られている。さらに、ＬＡＧ－３は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞で発現される免疫チェックポイント阻害物質であり、ＣＤ４の構造と類似の構造を有する。しかしながら、ＬＡＧ－３は、Ｄ１ドメイン内にさらなる３０個のアミノ酸を有し、よってＭＨＣクラスＩＩとの高い親和性を有する。そのような構造的特徴のため、ＬＡＧ－３はＴ細胞活性化を阻害することも知られている。
本発明における抗ＬＡＧ－３抗体は、ＬＡＧ－３に特異的に結合する抗体であってもよい。さらに、抗体の断片が、ＬＡＧ－３に特異的に結合することができる抗原結合ドメインを含有する限りは、抗体の断片をどんな形態で使用してもよい。この場合、抗ＬＡＧ－３抗体の重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３のアミノ酸配列を含有していてもよい。さらに、抗ＬＡＧ－３抗体の軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７のアミノ酸配列を含有していてもよい。
一実施形態では、ＬＡＧ－３に特異的に結合する抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸配列を含有する軽鎖可変領域とを含んでいてもよい。
本明細書において使用される場合、「ＩＬ－２」又は「インターロイキン－２」という用語は、別段の記載がない限り、例えば霊長類（ヒト等）及びげっ歯類（マウス及びラット等）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源から得たあらゆる野生型ＩＬ－２を指す。ＩＬ－２は、動物細胞から得てもよく、ＩＬ－２を産生することができる組換え細胞から得たＩＬ－２も含まれる。さらに、ＩＬ－２は、野生型ＩＬ－２又はそのバリアントであってもよい。
本明細書では、ＩＬ－２又はそのバリアントは、用語「ＩＬ－２タンパク質」又は「ＩＬ－２ポリペプチド」はひとまとめに表されてもよい。ＩＬ－２、ＩＬ－２タンパク質、ＩＬ－２ポリペプチド、及びＩＬ－２バリアントは、例えばＩＬ－２受容体に特異的に結合する。この特異的結合は、当業者に既知の方法によって同定することができる。
ＩＬ－２は、成熟型であってもよい。具体的には、成熟ＩＬ－２は、シグナル配列を含有することはなく、野生型ＩＬ－２のＮ末端又はＣ末端の一部分がトランケートされている野生型ＩＬ－２の断片を含有していてもよい。この場合、ＩＬ－２は、配列番号２２のアミノ酸配列を有していてもよい。
本明細書において使用される場合、「ＩＬ－２バリアント」という用語は、全長ＩＬ－２又はＩＬ－２の上記の断片の、アミノ酸の一部が置換されている形態を指す。すなわち、ＩＬ－２バリアントは、野生型ＩＬ－２又はその断片と異なるアミノ酸配列を有していてもよい。ただし、ＩＬ－２バリアントは、野生型ＩＬ－２と等しい又は類似の活性を有しうる。この場合、「ＩＬ－２活性」は、例えば、ＩＬ－２受容体への特異的結合を指していてもよく、特異的結合は、当業者に既知の方法によって測定することができるものである。
具体的には、ＩＬ－２バリアントは、野生型ＩＬ－２のアミノ酸の一部の置換によって得てもよい。アミノ酸置換によって得られるＩＬ－２バリアントの実施形態は、配列番号２２のアミノ酸配列の３８番目、４２番目、４５番目、６１番目、及び７２番目のアミノ酸のうちの少なくとも１つの置換によって得てもよい。
具体的には、ＩＬ－２バリアントは、別のアミノ酸での、配列番号２２のアミノ酸配列の３８番目、４２番目、４５番目、６１番目、又は７２番目のアミノ酸のうちの少なくとも１つの置換によって得てもよい。一実施形態によれば、そのようなＩＬ－２バリアントがＩＬ－２活性を維持する限りは、１つ、２つ、又は３つのアミノ酸が置換されていてもよい。
一実施形態では、ＩＬ－２バリアントは、２つのアミノ酸が置換された形態であってもよい。具体的には、ＩＬ－２バリアントは、配列番号２２のアミノ酸配列の３８番目及び４２番目のアミノ酸の置換によって得てもよい。さらに、一実施形態では、ＩＬ－２バリアントは、配列番号２２のアミノ酸配列の３８番目及び４５番目のアミノ酸の置換によって得てもよい。さらに、一実施形態では、ＩＬ－２バリアントは、配列番号２２のアミノ酸配列の３８番目及び６１番目のアミノ酸の置換によって得てもよい。さらに、一実施形態では、ＩＬ－２バリアントは、配列番号２２のアミノ酸配列の３８番目及び７２番目のアミノ酸の置換によって得てもよい。さらに、一実施形態では、ＩＬ－２バリアントは、配列番号２２のアミノ酸配列の４２番目及び４５番目のアミノ酸の置換によって得てもよい。さらに、一実施形態では、ＩＬ－２バリアントは、配列番号２２のアミノ酸配列の４２番目及び６１番目のアミノ酸の置換によって得てもよい。さらに、一実施形態では、ＩＬ－２バリアントは、配列番号２２のアミノ酸配列の４２番目及び７２番目のアミノ酸の置換によって得てもよい。さらに、一実施形態では、ＩＬ－２バリアントは、配列番号２２のアミノ酸配列の４５番目及び６１番目のアミノ酸の置換によって得てもよい。さらに、一実施形態では、ＩＬ－２バリアントは、配列番号２２のアミノ酸配列の４５番目及び７２番目のアミノ酸の置換によって得てもよい。さらに、一実施形態では、ＩＬ－２バリアントは、配列番号２２のアミノ酸配列中の６１番目及び７２番目のアミノ酸の置換によって得てもよい。
さらに、ＩＬ－２バリアントは、３つのアミノ酸が置換されている形態であってもよい。具体的には、ＩＬ－２バリアントは、配列番号２２のアミノ酸配列の３８番目、４２番目、及び４５番目のアミノ酸の置換によって得てもよい。さらに、一実施形態では、ＩＬ－２バリアントは、配列番号２２のアミノ酸配列の３８番目、４２番目、及び６１番目のアミノ酸の置換によって得てもよい。さらに、一実施形態では、ＩＬ－２バリアントは、配列番号２２のアミノ酸配列の３８番目、４２番目、及び７２番目のアミノ酸の置換によって得てもよい。さらに、一実施形態では、ＩＬ－２バリアントは、配列番号２２のアミノ酸配列の３８番目、４５番目、及び６１番目のアミノ酸の置換によって得てもよい。さらに、一実施形態では、ＩＬ－２バリアントは、配列番号２２のアミノ酸配列の３８番目、４５番目、及び７２番目のアミノ酸の置換によって得てもよい。一実施形態では、ＩＬ－２バリアントは、配列番号２２のアミノ酸配列の３８番目、６１番目、及び７２番目のアミノ酸の置換によって得てもよい。さらに、一実施形態では、ＩＬ－２バリアントは、配列番号２２のアミノ酸配列の４２番目、４５番目、及び６１番目のアミノ酸の置換によって得てもよい。さらに、一実施形態では、ＩＬ－２バリアントは、配列番号２２のアミノ酸配列の４２番目、４５番目、及び７２番目のアミノ酸の置換によって得てもよい。さらに、一実施形態では、ＩＬ－２バリアントは、配列番号２２のアミノ酸配列の４５番目、６１番目、及び７２番目のアミノ酸の置換によって得てもよい。
この場合、置換によって導入される「別のアミノ酸」は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンからなる群から選択されるいずれのアミノ酸であってもよい。ただし、ＩＬ－２バリアントのアミノ酸置換に関して、配列番号２２のアミノ酸配列では、３８番目のアミノ酸はアルギニンで置換することができず、４２番目のアミノ酸はフェニルアラニンで置換することができず、４５番目のアミノ酸はチロシンで置換することができず、６１番目のアミノ酸はグルタミン酸で置換することができず、７２番目のアミノ酸はロイシンで置換することができない。
ＩＬ－２バリアントのアミノ酸置換に関して、配列番号２２のアミノ酸配列では、３８番目のアミノ酸アルギニンは、アルギニン以外のアミノ酸で置換されていてもよい。好ましくは、ＩＬ－２バリアントのアミノ酸置換に関して、配列番号２２のアミノ酸配列では、３８番目のアミノ酸アルギニンは、アラニンで置換されうる（Ｒ３８Ａ）。
ＩＬ－２バリアントのアミノ酸置換に関して、配列番号２２のアミノ酸配列では、４２番目のアミノ酸フェニルアラニンは、フェニルアラニン以外のアミノ酸で置換されていてもよい。好ましくは、ＩＬ－２バリアントのアミノ酸置換に関して、配列番号２２のアミノ酸配列では、４２番目のアミノ酸フェニルアラニンは、アラニンで置換されうる（Ｆ４２Ａ）。
ＩＬ－２バリアントのアミノ酸置換に関して、配列番号２２のアミノ酸配列では、４５番目のアミノ酸チロシンは、チロシン以外のアミノ酸で置換されていてもよい。好ましくは、ＩＬ－２バリアントのアミノ酸置換に関して、配列番号２２のアミノ酸配列では、４５番目のアミノ酸チロシンは、アラニンで置換されうる（Ｙ４５Ａ）。
ＩＬ－２バリアントのアミノ酸置換に関して、配列番号２２のアミノ酸配列では、６１番目のアミノ酸グルタミン酸は、グルタミン酸以外のアミノ酸で置換されていてもよい。好ましくは、ＩＬ－２バリアントのアミノ酸置換に関して、配列番号２２のアミノ酸配列では、６１番目のアミノ酸グルタミン酸は、アルギニンで置換されうる（Ｅ６１Ｒ）。
ＩＬ－２バリアントのアミノ酸置換に関して、配列番号２２のアミノ酸配列では、７２番目のアミノ酸ロイシンは、ロイシン以外のアミノ酸で置換されていてもよい。好ましくは、ＩＬ－２バリアントのアミノ酸置換に関して、配列番号２２のアミノ酸配列では、７２番目のアミノ酸ロイシンは、グリシンで置換されうる（Ｌ７２Ｇ）。
具体的には、ＩＬ－２バリアントは、配列番号２２のアミノ酸配列では、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒ、及びＬ７２Ｇからなる群から選択される少なくとも１つの置換によって得てもよい。好ましくは、ＩＬ－２バリアントは、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒ、及びＬ７２Ｇからなる群から選択される位置のうち２つ又は３つの位置においてアミノ酸置換を有しうる。
ＩＬ－２バリアントは、２つのアミノ酸が置換されている形態であってもよい。具体的には、ＩＬ－２バリアントは、置換Ｒ３８Ａ及びＦ４２Ａによって得てもよい。さらに、一実施形態では、ＩＬ－２バリアントは、置換Ｒ３８Ａ及びＹ４５Ａによって得てもよい。さらに、一実施形態では、ＩＬ－２バリアントは、置換Ｒ３８Ａ及びＥ６１Ｒによって得てもよい。さらに、一実施形態では、ＩＬ－２バリアントは、置換Ｒ３８Ａ及びＬ７２Ｇによって得てもよい。さらに、一実施形態では、ＩＬ－２バリアントは、置換Ｆ４２Ａ及びＹ４５Ａによって得てもよい。さらに、一実施形態では、ＩＬ－２バリアントは、置換Ｆ４２Ａ及びＥ６１Ｒによって得てもよい。さらに、一実施形態では、ＩＬ－２バリアントは、置換Ｆ４２Ａ及びＬ７２Ｇによって得てもよい。さらに、一実施形態では、ＩＬ－２バリアントは、置換Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇによって得てもよい。
さらに、ＩＬ－２バリアントは、３つのアミノ酸が置換されている形態であってもよい。具体的には、ＩＬ－２バリアントは、置換Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、及びＹ４５Ａによって得てもよい。さらに、一実施形態では、ＩＬ－２バリアントは、置換Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、及びＥ６１Ｒによって得てもよい。さらに、一実施形態では、ＩＬ－２バリアントは、置換Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、及びＬ７２Ｇによって得てもよい。さらに、一実施形態では、ＩＬ－２バリアントは、置換Ｒ３８Ａ、Ｙ４５Ａ、及びＥ６１Ｒによって得てもよい。さらに、一実施形態では、ＩＬ－２バリアントは、置換Ｒ３８Ａ、Ｙ４５Ａ、及びＬ７２Ｇによって得てもよい。さらに、一実施形態では、ＩＬ－２バリアントは、置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、及びＥ６１Ｒによって得てもよい。さらに、一実施形態では、ＩＬ－２バリアントは、置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、及びＬ７２Ｇによって得てもよい。さらに、一実施形態では、ＩＬ－２バリアントは、置換Ｆ４２Ａ、Ｅ６１Ｒ、及びＬ７２Ｇによって得てもよい。さらに、一実施形態では、ＩＬ－２バリアントは、置換Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒ、及びＬ７２Ｇによって得てもよい。
一実施形態では、ＩＬ－２バリアントは、配列番号２０又は配列番号２１のアミノ酸配列を有していてもよい。
さらに、ＩＬ－２バリアントは、インビボでの低い毒性を有することを特徴としていてもよい。この場合、インビボでの低い毒性とは、ＩＬ－２がＩＬ－２受容体α鎖（ＩＬ－２Ｒα）に結合することによって引き起こされる副作用でありうる。ＩＬ－２がＩＬ－２Ｒαに結合することによって引き起こされる副作用を改善するための様々なＩＬ－２バリアントが開発されており、そのようなＩＬ－２バリアントは、米国特許第５，２２９，１０９号及び韓国特許第１０－１６６７０９６号で開示されているものであってもよい。特に、本出願に記載したＩＬ－２バリアントは、ＩＬ－２受容体アルファ鎖（ＩＬ－２Ｒα）に対する結合能が低く、よって野生型ＩＬ－２と比べてより低いインビボでの毒性を有する。
融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃ領域を含んでいてもよい。この場合、免疫グロブリンのＦｃドメインは、免疫グロブリンの重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び重鎖定常領域３（ＣＨ３）を含む。免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＭであってもよく、好ましくはＩｇＧ４でありうる。
さらに、免疫グロブリンのＦｃドメインは、野生型Ｆｃドメインのみならず、Ｆｃドメインバリアントであってもよい。さらに、本明細書において使用される場合、「Ｆｃドメインバリアント」という用語は、グリコシル化パターンに関して、野生型Ｆｃドメインと比べて高いグリコシル化を有するか若しくは野生型Ｆｃドメインと比べて低いグリコシル化を有する野生型Ｆドメインと異なる形態、又は脱グリコシル化させた形態を指していてもよい。さらに、グリコシル化されていないＦｃドメインが、Ｆｃドメインバリアントに包含される。Ｆｃドメイン又はそのバリアントは、宿主の培養条件又は遺伝子操作によって調整した数のシアル酸、フコシル化、又はグリコシル化を有するように構成されていてもよい。
さらに、免疫グロブリンのＦｃドメインのグリコシル化は、化学的方法、酵素的方法、及び微生物を使用する遺伝子操作方法等の定法によって改変してもよい。さらに、Ｆｃドメインバリアントは、免疫グロブリン、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＭのそれぞれのＦｃ領域の混合形態であってもよい。さらに、Ｆｃドメインバリアントは、Ｆｃドメインの幾つかのアミノ酸が他のアミノ酸で置換された形態であってもよい。
一実施形態では、Ｆｃドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を有していてもよい。
本発明による融合タンパク質は、抗ＬＡＧ－３抗体の軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域（ＣＬ１）を包含する融合タンパク質と、抗ＬＡＧ－３抗体の重鎖可変領域及び重鎖定常領域（ＣＨ１）と、Ｆｃドメインと、並びにＩＬ－２タンパク質とを含有していてもよい。この場合、少なくとも１つのＩＬ－２タンパク質が、抗ＬＡＧ－３抗体に含有されていてもよい。一実施形態では、融合タンパク質は、２つのＩＬ－２タンパク質を含有する。さらに、一実施形態では、ＩＬ－２タンパク質は、抗ＬＡＧ－３抗体のＣ末端に連結された形態であってもよい。
具体的には、ＦｃドメインとＩＬ－２タンパク質とを含有する融合タンパク質は、構造式（１）によって表される２つの融合タンパク質が連結した二量体であってもよい。
Ｎ’－Ｘ－［リンカー（１）］ｏ－Ｆｃ領域断片又はそのバリアント－［リンカー（２）］ｐ－Ｙ－Ｃ’（１）
この場合、構造式（１）中、
Ｎ’は、融合タンパク質のＮ末端であり、
Ｃ’は、融合タンパク質のＣ末端であり、
Ｘは、抗ＬＡＧ－３抗体又はその断片であり、
Ｙは、ＩＬ－２タンパク質であり、
リンカー（１）及びリンカー（２）は、ペプチドリンカーであり、
ｏ及びｐは、それぞれ独立的に０又は１である。
この場合、抗ＬＡＧ－３抗体及びＩＬ－２タンパク質は、上記の通りである。さらに、融合タンパク質では、ＩＬ－２又はそのバリアントは、抗ＬＡＧ－３抗体のＣ末端に連結されたＦｃ領域に連結されていてもよい。この場合、ＩＬ－２又はそのバリアントとＦｃ領域とは、リンカーによって連結されていてもよい。
ペプチドリンカー（１）は、１～５０個の連続するアミノ酸、３～３０個の連続するアミノ酸、又は５～１５個のアミノ酸からなっていてもよい。一実施形態では、ペプチドリンカー（１）は、１２個のアミノ酸からなっていてもよい。さらに、ペプチドリンカー（１）は、少なくとも１つのシステインを含有していてもよい。具体的には、ペプチドリンカー（１）は、１つ、２つ、又は３つのシステインを含有しうる。さらに、ペプチドリンカー（１）は、免疫グロブリンのヒンジ由来であってもよい。一実施形態では、ペプチドリンカー（１）は、配列番号１３のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーであってもよい。
ペプチドリンカー（２）は、１～３０個の連続するアミノ酸、２～２０個の連続するアミノ酸、又は２～１０個のアミノ酸からなっていてもよい。一実施形態では、ペプチドリンカー（２）は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎは１～１０の整数である）であってもよい。この場合、（Ｇ４Ｓ）では、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０でありうる。一実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１９のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーであってもよい。
さらに、構造式（１）によって表される融合タンパク質は、構造式（１－１）及び構造式（１－２）によって表されるタンパク質を包含していてもよい。
Ｎ’－Ｘ’－［リンカー（１）］ｏ－Ｆｃ領域断片又はそのバリアント－［リンカー（２）］ｐ－Ｙ－Ｃ’（１－１）
Ｎ’－Ｘ’’－Ｃ’（１－２）
この場合、構造式（１－１）及び（１－２）中、
Ｎ’は、融合タンパク質のＮ末端であり、
Ｃ’は、融合タンパク質のＣ末端であり、
Ｘ’は、抗ＬＡＧ－３抗体の重鎖領域であり、重鎖可変領域及びＣＨ１を包含しており、
Ｘ’’は、抗ＬＡＧ－３抗体の軽鎖領域であり、軽鎖可変領域及びＣＬを包含しており、
Ｙは、ＩＬ－２タンパク質であり、
リンカー（１）及びリンカー（２）は、ペプチドリンカーであり、
ｏ及びｐは、それぞれ独立的に０又は１である。
さらに、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、上記の通りである。
融合タンパク質を構成する領域の各々のアミノ酸配列は、下記の表１及び２に示した通りである。具体的には、表１に、抗ｈＬＡＧ－３（１Ｅ０９）ＶＬ－カッパ＋ＣＬのアミノ酸配列を示す。表２には、抗ｈＬＡＧ－３（１Ｅ０９）ＶＨ＋ＣＨ１、ｈＩｇＧ４Ｆｃ、及びｈＩＬ－２ｖ２／ｈＩＬ－２ｖ３のアミノ酸配列を示す。
Figure 2023531876000002
Figure 2023531876000003
Figure 2023531876000004
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
本発明の別の態様では、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。
この場合、ポリヌクレオチドは、構造式（１－１）及び構造式（１－２）によって表される融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有していてもよい。
具体的には、ポリヌクレオチドのうち重鎖領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１７又は配列番号２３のヌクレオチド配列を含有していてもよい。さらに、軽鎖領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１８を含有していてもよい。
ポリヌクレオチドが同じポリペプチドをコードするのであれば、１つ又は複数のヌクレオチドが、置換、欠失、挿入、又はこれらの組合せによって変更されていてもよい。ヌクレオチド配列を化学合成によって調製する場合、Ｅｎｇｅｌｓ及びＵｈｌｍａｎｎ（Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．、３７：７３～１２７頁、１９８８年）に記載の合成法等の当技術分野で公知の合成法を使用してもよい。そのような方法には、トリエステル法、ホスフィット法、ホスホラミダイト法、及びＨ－ホスホネート法、ＰＣＲ及びその他のオートプライマー法、固体支持体上でのオリゴヌクレオチド合成法等が挙げられる。
一実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、配列番号１７、１８、又は２３に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約１００％の同一性を有する核酸配列を含有していてもよい。
ポリヌクレオチドは、シグナル配列又はリーダー配列をコードする核酸をさらに含有していてもよい。本明細書において使用される場合、「シグナル配列」という用語は、目的タンパク質の分泌を誘導するシグナルペプチドを指す。シグナルペプチドは、宿主細胞において翻訳され、次いで切断される。具体的には、シグナル配列は、小胞体（ＥＲ）膜を横切るタンパク質の移動を開始するアミノ酸配列である。
シグナル配列の特徴は、当技術分野において公知である。そのようなシグナル配列は、典型的には、１６～３０個のアミノ酸残基を含有し、そのようなアミノ酸残基より多数又は少数のアミノ酸残基を含有していてもよい。典型的なシグナルペプチドは、３つの領域、すなわち、塩基性のＮ末端領域、中央の疎水性領域、及びより極性の大きいＣ末端領域から構成されている。中央の疎水性領域は、未成熟ポリペプチドが膜脂質二重層を移動する間シグナル配列を固定化させる、４～１２個の疎水性残基を含む。
開始後、シグナル配列は、シグナルペプチダーゼとして公知の細胞酵素によってＥＲの内腔において切断される。この場合、シグナル配列は、ｔＰａ（組織プラスミノーゲン活性化）、ＨＳＶ ｇＤ（単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ）、ＩｇＧシグナル配列、又は成長ホルモンの分泌シグナル配列であってもよい。好ましくは、哺乳動物等を含む高等真核細胞において使用される分泌シグナル配列が使用されうる。さらに、野生型ＩＬ－２に含有されるシグナル配列を使用してもよく、又は宿主細胞において発現頻度の高いコドンで置換されたシグナル配列を使用してもよい。その一実施形態としては、１４．１８抗体の軽鎖シグナル配列（Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ １９８９． １２５：１９１～２０２頁）、ＭＯＰＣ１４１抗体の重鎖シグナル配列（Ｓａｋａｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８０． ２８６：６７６～６８３頁）、及び当技術分野において既知のその他のシグナル配列（例えば、Ｗａｔｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８４． １２：５１４５～５１６４頁を参照されたい）が挙げられる。
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを保有するベクター
本発明のさらに別の態様では、ポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。
この場合、重鎖領域をコードするポリヌクレオチドと軽鎖領域をコードするポリヌクレオチドとは、異なるベクターに含有されていてもよい。別法として、重鎖領域をコードするポリヌクレオチドと軽鎖領域をコードするポリヌクレオチドとは、１つのベクターに含有されていてもよい。
ポリヌクレオチドは、上記の通りである。この場合、重鎖領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１７又は２３のヌクレオチド配列を含有していてもよく、軽鎖領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１８のヌクレオチド配列を含有していてもよい。一実施形態では、重鎖領域をコードするポリヌクレオチド及び軽鎖領域をコードするポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号１７及び配列番号１８のヌクレオチド配列を含有していてもよい。一実施形態では、重鎖領域をコードするポリヌクレオチド及び軽鎖領域をコードするポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号２３及び配列番号１８のヌクレオチド配列を含有していてもよい。この場合、ベクターは、重鎖及び軽鎖のポリヌクレオチドの組合せのそれぞれのポリヌクレオチドを含有する２つのベクターであってもよく、又は重鎖及び軽鎖のポリヌクレオチドの組合せの両方のポリヌクレオチドを含有するバイシストロニックなベクターであってもよい。
ベクターは、宿主細胞に導入されて、宿主細胞のゲノムと組み換えられ、宿主細胞のゲノムに挿入されていてもよい。別法として、ベクターは、エピソームとして自律的に複製されるポリヌクレオチド配列を含有する核酸手段として理解される。この場合、ベクターは、ポリヌクレオチドが宿主細胞において発現されうるように適切なプロモーターに作動可能に連結されうる。ベクターとしては、線状核酸、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＲＮＡベクター、ウイルスベクター、ミニ染色体、及びこれらのアナログが挙げられる。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
具体的には、ベクターとしては、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等、及び商業的に開発されたプラスミド（ｐＵＣ１８、ｐＢＡＤ、ｐＩＤＴＳＡＭＲＴ－ＡＭＰ等）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来プラスミド（ｐＹＧ６０１ＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９等）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来プラスミド（ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来プラスミド（ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）、ファージＤＮＡ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）、動物ウイルスベクター（レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス等）、昆虫ウイルスベクター（バキュロウイルス等）が挙げられる。ベクターは宿主細胞によってタンパク質の異なる発現レベル及び改変を示すため、目的に最も適した宿主細胞を選択し、使用することが好ましい。
本明細書において使用される場合、目的タンパク質の「遺伝子発現」又は「発現」という用語は、ＤＮＡ配列の転写、ｍＲＮＡ転写物の翻訳、及び融合タンパク質産物又はこれらの断片の分泌を意味すると理解される。有用な発現ベクターの１つは、ＲｃＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ）又はそのバリアントでありうる。発現ベクターは、哺乳動物細胞中の標的遺伝子の連続的な転写を促進するためのヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、及び転写後のＲＮＡの定常状態レベルを高めるためのウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列をさらに含有していてもよい。
融合タンパク質を発現する形質転換細胞
本発明のまた別の態様では、ベクターが導入される形質転換細胞が提供される。
形質転換細胞用の宿主細胞としては、原核細胞、真核細胞、及び哺乳動物、植物、昆虫、真菌、又は細菌起源の細胞を挙げることができるが、これらに限定されない。原核細胞の一例としては、大腸菌が使用されうる。さらに、真核細胞の一例としては、酵母が使用されうる。さらに、哺乳動物細胞では、ＣＨＯ細胞、Ｆ２Ｎ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｂｏｗｅｓ黒色腫細胞、Ｈｅｌａ細胞、９１１細胞、ＡＴ１０８０細胞、Ａ５４９細胞、ＳＰ２／０細胞、ヒトリンパ芽球腫、ＮＳＯ細胞、ＨＴ－１０８０細胞、ＰＥＲＣ．６細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞等が使用されうる。ただし、哺乳動物細胞はこれらに限定されず、哺乳動物宿主細胞として使用可能であることが当業者に知られているあらゆる細胞が使用されうる。
さらに、宿主細胞への発現ベクターの導入には、ＣａＣｌ２沈殿、ＣａＣｌ２沈殿においてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の還元剤を使用することによって効率を高めたＨａｎａｈａｎ法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム沈殿、原形質体融合、炭化ケイ素繊維を使用した撹拌、アグロバクテリウム形質転換法、ＰＥＧ、デキストラン硫酸、リポフェクタミンを使用した形質転換、及び乾燥／阻害による形質転換（ｄｒｙ／ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）等を使用してもよい。さらに、手段としての感染を使用して、ウイルス粒子を使用して、目的物を細胞内に送達してもよい。さらに、ベクターを宿主細胞に導入し、遺伝子銃（ｇｅｎｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）等を使用してもよい。
上記のように、治療薬として融合タンパク質の特性を最適化するために、又はその他の目的のために、当業者に既知の方法によって、宿主細胞が持つグリコシル化関連遺伝子を操作することによって、融合タンパク質のグリコシル化パターン（例えば、シアル酸、フコシル化、及びグリコシル化）を調整してもよい。
融合タンパク質を調製する方法
本発明のさらにまた別の態様では、抗ＬＡＧ－３抗体とＩＬ－２又はそのバリアントとを含む融合タンパク質を調製する方法であって、形質転換細胞を培養するステップと、培養培地から前記融合タンパク質を収集するステップとを含む方法が提供される。
本明細書において使用される場合、「培養する」という用語は、適切に制御された環境条件下で微生物を人為的に増殖させる方法を指す。
形質転換細胞の培養は、当技術分野で公知の方法を使用して行ってもよい。具体的には、本発明の融合タンパク質が発現によって産生されうる限りは、培養は特に限定されない。具体的には、培養は、バッチプロセスにおいて行ってもよく、又は流加若しくは反復流加プロセスにおいて連続的に行ってもよい。
さらに、培養質から融合タンパク質の収集は、当技術分野で既知の方法によって実施してもよい。具体的には、収集方法は、本発明によって産生された融合タンパク質を収集できる限りは特に制限されない。好ましくは、収集方法は、遠心分離、濾過、抽出、噴霧、乾燥、蒸発、沈殿、結晶化、電気泳動、分別溶解（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ、疎水性、及びサイズ排除）等の方法でありうる。
融合タンパク質の使用
本発明のさらにまた別の態様では、融合タンパク質を含むがんを治療又は予防するための医薬組成物が提供される。
本明細書において使用される場合、「がん」という用語は、正常組織細胞が、生物体の生命事象又は周囲の組織状態にかかわらず、何らかの理由で無限に増殖し、急速に発達し続ける疾患として分類される。本発明におけるがんは、胃がん、肝臓がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、膵臓がん、子宮頸がん、甲状腺がん、喉頭がん、急性骨髄性白血病、脳腫瘍、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、頭頸部がん、唾液腺がん、及びリンパ腫等の人体の多様ながんからなる群から選択されるいずれか１つのがんであってもよいが、上記の種類だけに限定されない。さらに、本発明では、がんは、放射線に耐性のあるがんであってもよいが、これらに限定されない。
本明細書において使用される場合、「予防」という用語は、医薬組成物の投与によってがんの発現を阻害するか又はがんの発症を遅らせる何らかの作用を指す。本明細書において使用される場合、「治療」という用語は、医薬組成物の投与によってがんの症状を改善するか又は有益に変える何らかの作用を指す。
医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含んでいてもよい。薬学的に許容される担体は、患者への送達に好適な非毒性物質である限りは、いかなる担体であってもよい。蒸留水、アルコール、脂肪、ワックス、及び不活性固形物を、担体として含有されていてもよい。薬学的に許容されるアジュバント（緩衝剤又は分散剤）もまた、医薬組成物中に含有されていてもよい。
具体的には、薬学的に許容される担体を含むことによって、当技術分野で既知の定法を使用して、医薬組成物は、投与経路に応じた非経口製剤として調製されうる。この場合、「薬学的に許容される」という用語は、担体の毒性が、活性成分の活性を阻害することなく、適用（処方）される予定の対象が適応できる程度以下であることを意味する。
医薬組成物は、非経口製剤として調製される場合、当技術分野において公知の方法に従って、好適な担体とともに、注射剤、経皮吸収型貼付剤、経鼻吸入剤、又は座薬の製剤として作製されてもよい。注射剤として作製される場合、無菌水、エタノール、グリセロール若しくはプロピレングリコール等のポリオール、又はこれらの混合物が、好適な担体として使用でき、好ましくは、リンガー溶液、又はトリエタノールアミン若しくは注射用無菌水及び５％デキストロースを含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）等の、等張液が使用されうる。医薬組成物の製剤化は、当技術分野では既知であり、詳細にはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１９版、１９９５年）等を参照にすることができる。本文書は、本明細書の一部とみなす。
一方、本発明の医薬組成物は、医薬として有効な量で投与される。本明細書において使用される場合、「投与」という用語は、適切な方法によって所定の物質を対象に導入することを指し、医薬組成物の投与経路は、医薬組成物が標的組織に到達することができる限りは、いかなる一般的経路によるものであってもよい。投与は、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、局所投与、鼻腔内投与、又は直腸内投与であってもよいが、これらに限定されない。
「対象」という用語は、ヒト、ラット、マウス、家畜等を含むすべての動物を指す。好ましくは、対象は、ヒトを含む哺乳動物でありうる。
「薬学的に有効な量」という用語は、医学的処置に適用可能な妥当なベネフィット・リスク比によって疾患を治療するのに十分であり、且つ副作用を引き起こさない量を指し、薬学的に有効な量のレベルは、患者の性別、年齢、体重、及び健康状態、疾患の種類及び重症度、薬物の活性、薬物に対する感受性、投与方法、投与時間、投与経路、排出速度、治療期間、組み合わせて又は同時に使用される薬物を包含する因子、並びに医療分野において公知であるその他の因子に応じて、当業者が容易に決定することができる。１日量は、０．０１μｇ／ｋｇ～１０ｇ／ｋｇの範囲、又は０．０１ｍｇ／ｋｇ～１ｇ／ｋｇの範囲であってもよい。投与は、１日１回又は１日数回実施してもよい。そのような用量は、いかなる態様でも本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきものではない。
本発明のさらにまた別の態様では、がんを治療又は予防するための融合タンパク質の使用が提供される。この場合、融合タンパク質、がん、治療、及び予防とは、上記の通りである。
本発明のさらにまた別の態様では、対象に融合タンパク質を投与するステップを含む、がんを治療又は予防するための方法が提供される。この場合、融合タンパク質、投与、がん、治療、及び予防は、上記の通りである。対象は、哺乳動物、好ましくはヒトでありうる。さらに、対象は、がんを患う患者、又はがんにかかりうる対象であってもよい。
融合タンパク質又は融合タンパク質二量体の投与経路、用量、及び投与頻度は、患者の状態及び副作用の有無に応じて様々であってもよく、よって、融合タンパク質又は融合タンパク質二量体は、様々な方法及び量で対象に投与してもよい。最適な投与方法、用量、及び投与頻度は、当業者が適切な範囲内で選択することができる。さらに、融合タンパク質又は融合タンパク質二量体は、治療される予定の疾患に対して治療効果が既知であるその他の薬物又は生理学的に活性のある物質と組み合わせて投与されてもよく、又はその他の薬物との混合製剤の形態で製剤化されてもよい。
〔本発明を実施するための形態〕
以下では、本発明を下記の実施例によってさらに詳しく説明する。これらの実施例は、本発明を例証するためだけのものであり、当業者には、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されると解釈されるものではないことが明らかとなろう。
Ｉ． 融合タンパク質の調製
調製例１． 抗ｈＬＡＧ－３抗体－ｈＩｇＧ４ Ｆｃ－ｈＩＬ－２ｖ２融合タンパク質：ＧＩ－１０４Ｅ１の調製
抗ｈＬＡＧ－３抗体とｈＩＬ－２ｖ２とを含む融合タンパク質を作製するために、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔのＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎサービスによって、ポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３＿４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。具体的には、ポリヌクレオチド（配列番号１８）は、Ｎ末端から抗ｈＬＡＧ－３ＶＬ（抗ｈＬＡＧ－３（１Ｅ０９）ＶＬ－カッパ＋ＣＬ）をこの順序で含有する融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号１６）を含有し、ポリヌクレオチド（配列番号１７）は、Ｎ末端から抗ｈＬＡＧ－３ＶＨ（抗ｈＬＡＧ－３（１Ｅ０９）ＶＨ＋ＣＨ１）、Ｆｃドメイン（Ｆ０２（ｈＩｇＧ４Ｆｃ））、リンカー（Ｇ４Ｓリンカー）、及びヒトＩＬ－２ｖ２をこの順序で含有する融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号２７）を含有する。このベクターをＣＨＯ細胞（ＨＤ ＣＨＯ－Ｓ）に導入した。ベクターを導入した後、３７℃及び８％ＣＯ２濃度において、無血清ＨＤ ＣＨＯ－Ｓ（商標）発現培地で１４日間培養を行った。次いで、培養液を採取し、マブセレクトシュア（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ）（商標）ＬＸを含むアフィニティクロマトグラフィー（アフィニティ精製カラム）を使用して融合タンパク質を精製した。
単離、精製した融合タンパク質を、還元（Ｒ）又は非還元（ＮＲ）条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットにかけ、ＨＰＬＣ解析によってその分子量及び純度の確認を行った（図３及び５）。その濃度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって測定し、融合タンパク質が０．６９ｍｇ／ｍｌの濃度で含有されていることが確認された。
調製例２． 対照抗体（抗ｈＬＡＧ－３抗体及びα－ＬＡＧ－３）の調製
対照としての抗ｈＬＡＧ－３抗体を作製するために、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔのＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎサービスによって、ポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３＿４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。具体的には、ポリヌクレオチド（配列番号１８）は、Ｎ末端から抗ｈＬＡＧ－３ＶＬ（抗ｈＬＡＧ－３（１Ｅ０９）ＶＬ－カッパ＋ＣＬ）をこの順序で含有する融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号１６）を含有し、ポリヌクレオチド（配列番号２９）は、Ｎ末端から抗ｈＬＡＧ－３ＶＨ（抗ｈＬＡＧ－３（１Ｅ０９）ＶＨ＋ＣＨ１）及びＦｃドメイン（Ｆ０２（ｈＩｇＧ４Ｆｃ））をこの順序で含有する融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号１５）を含有する。このベクターをＣＨＯ細胞（ＨＤ ＣＨＯ－Ｓ）に導入した。ベクターを導入した後、３７℃及び８％ＣＯ２濃度において、無血清ＨＤ ＣＨＯ－Ｓ（商標）発現培地で１４日間培養を行った。次いで、培養液を採取し、マブセレクトシュア（商標）ＬＸを含むアフィニティクロマトグラフィー（アフィニティ精製カラム）を使用して融合タンパク質を精製した。
調製例３． ｈＩｇＧ４ Ｆｃ－ｈＩＬ－２ｖ２：Ｆｃ－ＩＬ－２ｖ２の調製
ＦｃドメインとＩＬ－２バリアントとを含む融合タンパク質二量体を作製するために、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓサービスによってポリヌクレオチドを合成した。具体的には、ポリヌクレオチド（配列番号２５）は、Ｎ末端からＦｃドメイン（配列番号１４）、リンカー（配列番号１９）、及び２つのアミノ酸置換を有するＩＬ－２バリアント（２Ｍ）（Ｒ３８Ａ及びＦ４２Ａ）（配列番号２０）をこの順序で含有する融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号１１）を含有する。このポリヌクレオチドを、ｐｃＤＮＡ３＿４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。さらに、配列番号１１の融合タンパク質を発現させるように、ベクターをＣＨＯ細胞（ＥＸＰＩ－ＣＨＯ（商標））に導入した。ベクターを導入した後、３７℃、１２５ＲＰＭ、及び８％ＣＯ２濃度の環境において、７日間、培養を行った。次いで、培養液を採取し、培養液から融合タンパク質を精製した。
調製例４． ｈＩｇＧ４ Ｆｃ－ｈＩＬ－２ｖ３：Ｆｃ－ＩＬ－２ｖ３の調製
ＦｃドメインとＩＬ－２バリアントとを含む融合タンパク質を作製するために、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓサービスによってポリヌクレオチドを合成した。具体的には、ポリヌクレオチド（配列番号２６）は、Ｎ末端からＦｃドメイン（配列番号１４）、リンカー（配列番号１９）、及び３つのアミノ酸置換を有するＩＬ－２バリアント（３Ｍ）（Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、及びＥ６１Ｒ）（配列番号２１）をこの順序で含有する融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号２４）を含有する。このポリヌクレオチドを、ｐｃＤＮＡ３＿４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。さらに、配列番号２４の融合タンパク質を発現させるように、ベクターをＣＨＯ細胞（Ｅｘｐｉ－ＣＨＯ（商標））に導入した。ベクターを導入した後、３７℃、１２５ＲＰＭ、及び８％ＣＯ２濃度の環境において、７日間培養を行った。次いで、培養液を採取し、培養液から融合タンパク質を精製した。
調製例５． 抗ｈＬＡＧ－３抗体－ｈＩｇＧ４ Ｆｃ－ｈＩＬ－２ｖ３融合タンパク質：ＧＩ－１０４Ｅ２の調製
抗ＬＡＧ－３抗体とｈＩＬ－２ｖ３とを含む融合タンパク質を作製するために、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔのＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎサービスによって、ポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３＿４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。具体的には、ポリヌクレオチド（配列番号１８）は、Ｎ末端から抗ｈＬＡＧ－３ＶＬ（抗ｈＬＡＧ－３（１Ｅ０９）ＶＬ－カッパ＋ＣＬ）をこの順序で含有する融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号１６）を含有し；ポリヌクレオチド（配列番号２３）は、Ｎ末端から抗ｈＬＡＧ－３ＶＨ（抗ｈＬＡＧ－３（１Ｅ０９）ＶＨ＋ＣＨ１）、Ｆｃドメイン（Ｆ０２（ｈＩｇＧ４Ｆｃ））、リンカー（Ｇ４Ｓリンカー）、及びヒトＩＬ－２ｖ３をこの順序で含有する融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号２８）を含有する。このベクターをＣＨＯ細胞（ＨＤ ＣＨＯ－Ｓ）に導入した。ベクターを導入した後、３７℃及び８％ＣＯ２濃度において、無血清ＨＤ ＣＨＯ－Ｓ（商標）発現培地で１４日間培養を行った。次いで、培養液を採取し、マブセレクトシュア（商標）ＬＸを含むアフィニティクロマトグラフィー（アフィニティ精製カラム）を使用して、融合タンパク質を精製した。
単離、精製した融合タンパク質を、還元（Ｒ）又は非還元（ＮＲ）条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットにかけ、ＨＰＬＣ解析によってその分子量及び純度の確認を行った（図４及び６）。その濃度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって測定し、融合タンパク質が０．５１ｍｇ／ｍｌの濃度で含有されていることが確認された。
ＩＩ． 融合タンパク質の免疫活性の同定
実験例１． ＬＡＧ－３遮断アッセイによる融合タンパク質のＴ細胞活性化の機能の同定
実験例１．１． Ｔ細胞の機能に対するＧＩ－１０４Ｅ１の効果の同定
ＬＡＧ－３は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞において発現される免疫チェックポイント阻害物質であり、ＣＤ４の構造と類似の構造を有する。しかしながら、ＬＡＧ－３は、Ｄ１ドメイン内にさらなる３０個のアミノ酸を有し、よって、ＭＨＣクラスＩＩとの高い親和性を有する。そのような構造的特徴のため、ＬＡＧ－３は、Ｔ細胞活性化を阻害することが知られている。
本実験では、ＬＡＧ－３遮断バイオアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＪＡ１１１５）を使用して、融合タンパク質のＴ細胞活性化機能の評価を試みた。具体的には、液体窒素中で保存していたＭＨＣＩＩ ＡＰＣ細胞の１つのバイアルを、３７℃の恒温槽で２分間解凍し、次いで、ＴＣＲ活性化抗原を含む１４．５ｍｌの細胞回復培地（９０％ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）に加え、これを十分に混合した。ＭＨＣＩＩ ＡＰＣ懸濁液を、９６ウェル白色細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号３９１７）の各ウェルにウェルあたり１００μｌを加え、３７℃及び５％ＣＯ２のインキュベーター内で２４時間培養した。
２４時間培養したＭＨＣＩＩ ＡＰＣ細胞を含有する９６ウェル白色細胞培養プレートを取り出し、プレート中の培養培地を除去した。次いで、４０μｌのＧＩ－１０４Ｅ１及び陽性対照としての１Ｅ０９（レラトリマブ（Ｒｅｌａｔｌｉｍａｂ）サロゲート）を、ウェルごとに様々な濃度で処理し、陰性対照として４０μｌのアッセイ緩衝液を加えた。次いで、白色細胞培養プレートにふたをし、ＬＡＧ－３エフェクター細胞が用意できるまで室温に置いた。
液体窒素中で保存していたＬＡＧ－３エフェクター細胞の１つのバイアルを、３７℃の恒温槽で２分間解凍し、次いで、７ｍｌのアッセイ緩衝液（９０％ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）に加え、これを十分に混合した。この混合懸濁液４０μｌを、室温で保管していた９６ウェル白色細胞培養プレートの各ウェルに加え、３７℃及び５％ＣＯ２のインキュベーター内で５時間反応させた。反応が完了した後、この反応物を、室温に１０分間静置し、次いで、気泡ができないように注意しながら、８０μｌのＢｉｏ－Ｇｌｏ試薬を各ウェルに加えた。Ｂｉｏ－Ｇｌｏ試薬はまた、最外のウェルのうちの２つにも加え、これらのウェルを、バックグラウンドシグナルを補正するためのブランクとして使用した。室温で１０分間、反応を進行させ、次いで、グロマックス（ＧＩｏＭａｘ）（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を使用して発光を測定した。
結果として、ＧＩ－１０４Ｅ１が、エフェクターＴ細胞内で発現されたＬＡＧ－３に結合しＬＡＧ－３の機能を阻害することによってＴ細胞機能を活性化することができたことが確認された（図８）。
実験例１．２． Ｔ細胞機能に対するＧＩ－１０４Ｅ２の効果の同定
実験例１．１と同じ方法でＧＩ－１０４Ｅ２に対するＬＡＧ－３遮断アッセイを実施した結果、ＧＩ－１０４Ｅ２が、エフェクターＴ細胞において発現されたＬＡＧ－３に結合しＬＡＧ－３の機能を阻害することによってＴ細胞機能を活性化することができたことが確認された（図９）。
実験例２． 融合タンパク質の抗がん効果の同定
実験例２．１． マウス由来結腸直腸がん細胞移植マウスにおけるＧＩ－１０４Ｅ１の抗がん効果の同定
Ｏｒｉｅｎｔ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．から得たＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、７週齢）は、７日間の順化期間をとった。次いで、５×１０６個細胞のＣＴ２６がん細胞株（ＡＴＣＣ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を１ｍｌのＰＢＳで希釈し、この希釈物をマウスの右背側部に対象あたり１００μｌ皮下投与することによって、同種移植を実施した。がん細胞移植後、一定期間、腫瘍体積を測定し、約５０ｍｍ３～１２０ｍｍ３に達した対象を選択し、次いで、選択したマウスを、腫瘍の大きさ及び体重に基づき各々８匹のマウスを含む群に均等に分けた。その後、試験群を表３に示したように構成し、試験物質を腹腔内投与した。初回投与後、週１回、合計３回の投与を行った。移植した腫瘍の大きさについて、全例の腫瘍体積を、週２回、４週間測定した。
Figure 2023531876000005
測定結果を、各群の平均及び標準偏差（ＳＤ）値を使用したグラフとして示した。さらに、ビヒクルと比較した腫瘍体積の減少の統計的有意性（＃ｐ≦０．０５、＃＃＃＃ｐ≦０．０００１）、及びＧＩ－１０４Ｅ１投与群と比較した腫瘍体積の差異の統計的有意性（＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１）を、二元配置分散分析及びＤｕｎｎｅｔｔ Ｔ３検定を使用して解析した。
結果として、ＣＴ２６がん細胞株移植マウスでは、ＧＩ－１０４Ｅ１を３ｍｇ／ｋｇの用量で投与した群は、陰性対照と比較して、観察の中間時及び実験の終了時において、腫瘍成長の有意な阻害を示した（＃ｐ≦０．０５、＃＃＃＃ｐ≦０．０００１、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ））。さらに、ＧＩ－１０４Ｅ１のモル数と等しいモル数の抗ＬＡＧ－３抗体又はＦｃ－ＩＬ－２ｖ２の投与と比較しても、ＧＩ－１０４Ｅ１投与は、有意に腫瘍の成長を阻害した。特に、ＧＩ－１０４Ｅ１は、抗ＬＡＧ－３抗体とＦｃ－ＩＬ－２ｖ２とを同時投与した実験群と比較しても、観察の中間時及び実験の終了時において、有意な腫瘍阻害効果を示した（＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ））（図１０～１６）。
試験の終了時に腫瘍成長率の変化を観察した際、５０％以上の腫瘍成長率の低下を示していた対象数は、陰性対照では１匹であり、抗ＬＡＧ－３抗体を投与した群では１匹であり、Ｆｃ－ＩＬ－２ｖ２を投与した群では０匹であり、抗ＬＡＧ－３抗体とＦｃ－ＩＬ－２ｖ２とを同時投与した群では０匹であった。一方、ＧＩ－１０４Ｅ１を投与した実験群の場合、５０％以上の腫瘍成長率の低下は７匹の対象で観察され、８０％以上の腫瘍成長率の低下を示していた対象数は５匹であったことが確認された（図１７）。
さらに、ＧＩ－１０４Ｅ１を投与した実験群並びにその他の実験対照及び陰性対照を投与した実験群の生存率を、実験対象の死亡又は対象における２，０００ｍｍ３の腫瘍体積の発生に基づいて解析し、実験群間の生存率の差異の統計的有意性をＭａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定によって解析した。結果として、ＧＩ－１０４Ｅ１を投与した実験群は、その他の実験対照及び陰性対照を投与した実験群と比較して高い生存率を示し、実験群間の生存率のそのような差異は統計的に有意であったことが確認された（＊＊＊＊ｐ≦０．０００１）（図１８）。
実験例２．２． マウス由来結腸直腸がん細胞移植マウスにおけるＧＩ－１０４Ｅ２の抗がん効果の同定
Ｏｒｉｅｎｔ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．から得たＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、７週齢）は、７日間の順化期間をとった。５×１０６個細胞のＣＴ２６がん細胞株（ＡＴＣＣ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を１ｍｌのＰＢＳで希釈し、この希釈物をマウスの右背側部に対象あたり１００μｌ皮下投与することによって、同種移植を実施した。がん細胞移植後、一定期間、腫瘍体積を測定し、約５０ｍｍ３～１２０ｍｍ３に達した対象を選択し、次いで、選択したマウスを、腫瘍の大きさ及び体重に基づき各々３匹のマウスを含む群に均等に分けた。その後、試験群を表４に示したように構成し、試験物質を腹腔内投与した。初回投与後、週１回、合計３回の投与を行った。移植した腫瘍の大きさについて、全例の腫瘍体積を、週２回、４週間測定した。
Figure 2023531876000006
結果として、ＣＴ２６がん細胞株移植マウスでは、ＧＩ－１０４Ｅ２を６ｍｇ／ｋｇの用量で投与した群は、陰性対照と比較して、観察の中間時及び実験の終了時において、腫瘍成長の阻害を示した。さらに、６ｍｇ／ｋｇのＧＩ－１０４Ｅ２のモル数と等しいモル数の抗ＬＡＧ－３抗体又はＦｃ－ＩＬ－２ｖ３の投与と比較しても、ＧＩ－１０４Ｅ２投与群は、優れた腫瘍成長阻害効果を示した。特に、ＧＩ－１０４Ｅ２は、抗ＬＡＧ－３抗体とＦｃ－ＩＬ－２ｖ３とを同時投与した実験群と比較しても、観察の中間時及び実験の終了時において優れた腫瘍阻害効果を示した（図１９～２５）。
さらに、試験の終了時に腫瘍成長率の変化を観察した際、５０％以上の腫瘍成長率の低下を示していた対象数は、陰性対照では１匹であり、抗ＬＡＧ－３抗体を投与した群では０匹であり、Ｆｃ－ＩＬ－２ｖ３を投与した群では１匹であり、抗ＬＡＧ－３抗体とＦｃ－ＩＬ－２ｖ３とを同時投与した群では１匹であった。一方、ＧＩ－１０４Ｅ２を投与した実験群の場合、５０％以上の腫瘍成長率の低下は全対象で観察され、８０％以上の腫瘍成長率の低下を示していた対象数は１匹であったことが確認された（図２６）。
ＧＩ－１０４Ｅ２を投与した実験群並びにその他の実験対照及び陰性対照を投与した実験群の生存率を、実験対象の死亡又は対象における２，０００ｍｍ３の腫瘍体積の発生に基づいて解析した。結果として、ＧＩ－１０４Ｅ２を投与した実験群が、その他の実験対照及び陰性対照を投与した実験群と比較して高い生存率を示したことが確認された（図２７）。

Claims (18)

  1. ＬＡＧ－３に特異的に結合する抗体と、
    ＩＬ－２タンパク質と
    を含む融合タンパク質。
  2. 前記ＬＡＧ－３に特異的に結合する抗体が、
    配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
    配列番号５のＬＣＤＲ１、配列番号６のＬＣＤＲ２、及び配列番号７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と
    を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. ＬＡＧ－３に特異的に結合する前記抗体が、
    配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
    配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と
    を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  4. 前記融合タンパク質が、２つのＩＬ－２タンパク質を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  5. 前記ＩＬ－２タンパク質が、ＩＬ－２バリアントである、請求項１に記載の融合タンパク質。
  6. 前記ＩＬ－２バリアントが、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒ、Ｌ７２Ｇ、及びこれらの組合せからなる群から選択された位置において置換されている、請求項５に記載の融合タンパク質。
  7. 前記ＩＬ－２バリアントが、配列番号２０又は配列番号２１のアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の融合タンパク質。
  8. ＬＡＧ－３に特異的に結合する前記抗体と前記ＩＬ－２タンパク質とが、リンカーを介して相互に結合している、請求項１に記載の融合タンパク質。
  9. 前記リンカーが、ペプチドリンカーである、請求項８に記載の融合タンパク質。
  10. 請求項１～９のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
  11. 請求項１０に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
  12. 請求項１１に記載の発現ベクターが導入された、形質転換細胞。
  13. 請求項１２に記載の形質転換細胞を培養するステップと、
    培養培地から融合タンパク質を収集するステップと
    を含む、融合タンパク質を調製する方法。
  14. 請求項１～９のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、がんを治療又は予防するための医薬組成物。
  15. 前記がんが、胃がん、肝臓がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、膵臓がん、子宮頸がん、甲状腺がん、喉頭がん、急性骨髄性白血病、脳腫瘍、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、頭頸部がん、唾液腺がん、及びリンパ腫からなる群から選択されたがんである、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. がんを治療又は予防するための、請求項１～９のいずれか一項に記載の融合タンパク質の使用。
  17. がんの治療又は予防のための医薬の製造のための、請求項１～９のいずれか一項に記載の融合タンパク質の使用。
  18. 請求項１～９のいずれか一項に記載の融合タンパク質を対象に投与するステップを含む、がんを治療又は予防するための方法。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102402276B1 (ko) * 2019-11-15 2022-05-26 주식회사 제넥신 변형된 인터루킨-7 및 tgf 베타 수용체 ii를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도
CN114874324B (zh) * 2022-05-13 2023-02-03 苏州旭光科星抗体生物科技有限公司 一种检测可溶性lag-3蛋白含量的酶联免疫检测试剂盒及应用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5229109A (en) 1992-04-14 1993-07-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Low toxicity interleukin-2 analogues for use in immunotherapy
PE20181077A1 (es) 2011-02-10 2018-07-05 Roche Glycart Ag Polipeptidos interleuquina-2-mutantes
EP3471753A1 (en) * 2016-06-20 2019-04-24 Kymab Limited Anti-pd-l1 and il-2 cytokines
HUE059885T2 (hu) * 2017-04-03 2023-01-28 Hoffmann La Roche Anti-PD-1 antitest immunkonjugátumai mutáns il-2-vel vagy il-15-tel
WO2020113403A1 (en) * 2018-12-04 2020-06-11 Beijing Percans Oncology Co. Ltd. Cytokine fusion proteins
US11359000B2 (en) * 2018-03-28 2022-06-14 Bristol-Myers Squibb Company Interleukin-2/Interleukin-2 receptor alpha fusion proteins and methods of use
JP7366056B2 (ja) * 2018-04-18 2023-10-20 ゼンコア インコーポレイテッド ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲＡ Ｆｃ融合タンパク質およびＬＡＧ－３抗原結合ドメインを含む、ＬＡＧ－３を標的とするヘテロ二量体融合タンパク質
KR102250234B1 (ko) * 2018-06-29 2021-05-10 주식회사 와이바이오로직스 Lag-3에 특이적으로 결합하는 단클론항체 및 이의 용도
KR102201086B1 (ko) * 2018-09-17 2021-01-11 (주)지아이이노베이션 Il-2 단백질 및 cd80 단백질을 포함하는 융합단백질 및 이의 용도
TW202043259A (zh) * 2019-01-07 2020-12-01 美商英伊布里克斯公司 包含經修飾il-2多肽之多肽及其用途
US20220235133A1 (en) * 2019-06-24 2022-07-28 Nanjing GenScript Biotech Co., Ltd. Monoclonal antibody-cytokine fusion protein dimer and application thereof
IL293978A (en) * 2019-12-20 2022-08-01 Regeneron Pharma New il2 agonists and methods of using them

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