KR102201086B1 - Il-2 단백질 및 cd80 단백질을 포함하는 융합단백질 및 이의 용도 - Google Patents

Il-2 단백질 및 cd80 단백질을 포함하는 융합단백질 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질을 제공한다. 일 구체예인 CD80 단편, 면역글로불린 Fc 및 IL-2 변이체를 포함하는 융합단백질은 자연살해세포와 같은 면역세포를 활성화시킬 수 있으며, 동시에 조절 T 세포의 면역세포 조절 활성을 제어할 수 있다. 따라서, 상기 융합단백질을 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물은 체내의 면역활성을 증가시켜 암뿐만 아니라 감염성 질환에도 효과적으로 활용할 수 있어 산업적 활용 가능성이 높다.

Description

IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질 및 이의 용도{FUSION PROTEIN COMPRISING IL-2 PROTEIN AND CD80 PROTEIN AND USE THEREOF}
본 발명은 IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 암 치료용 및 면역증강 효능을 갖는 신규한 융합단백질에 관한 것이다.
IL-2(Interleukin 2)는 T 세포 성장 인자(T-cell growth factors, TCGF)로도 불리며, 림프구 생성, 생존 및 항상성에서 중심 역할을 하는 구형의 당단백질이다. IL-2의 단백질 크기는 15.5 kDa 내지 16 kDa이며, 133개 아미노산으로 이루어져 있다. IL-2는 개별적 3개의 서브유닛으로 구성된 IL-2 수용체(IL-2 receptor)에 결합함으로써 각종 면역 작용을 매개한다.
또한, IL-2는 활성화된 T 세포 중 특히, CD4+ 헬퍼 T 세포(helper T cell)에 의해 주로 합성된다. IL-2는 T 세포의 증식 및 분화를 자극하고, 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte, CTL)의 생성 및 말초혈 림프구의 세포독성 세포 및 림포카인-활성화 살해 세포(lymphokine activated killer cell, LAK cell)로의 분화를 유도한다.
나아가, IL-2는 B세포의 증식 및 분화에 관여하며, B 세포에 의한 면역글로불린의 합성을 촉진하고, 자연살해세포(natural killer cell, NK cell)의 생성, 증식 및 활성화를 자극한다. 따라서, IL-2는 생체 내에서 림프구 개체군을 증대시키고, 상기 면역세포들의 기능을 증대시킬 수 있으므로, IL-2를 항암제로 이용하고 있다. 현재, 전이성 신세포암 및 악성 흑색종을 갖는 환자에서 IL-2를 이용한 치료가 승인되어 사용되고 있다.
그러나, IL-2는 면역세포의 증가 및 활성을 매개할 뿐만 아니라, 면역 관용(immune tolerance)을 유지하는데 중요하다는 점에서 면역 반응에서 이중적 기능을 갖는다. 또한, IL-2는 종양의 성장을 억제하는데 최적이 아닐 수 있는 것으로 보고되었다. 그 이유는 IL-2의 존재 시, 생성된 세포독성 T 림프구에 AICD(activation-induced cell death)가 일어날 수 있고, 면역 반응이 IL-2 의존성 조절 T 세포(Treg)에 의해 억제될 수 있기 때문이다(Imai et al., Cancer Sci 98, 416-423, 2007).
그뿐 아니라, IL-2를 이용한 면역치료를 받은 환자에게 심각한 심혈관, 폐, 신장, 간, 위장, 신경, 피부, 혈액 및 전신적인 부작용이 나타난다. 따라서, IL-2의 치료 효능 개선 및 부작용을 최소화 하기 위해 다양한 IL-2 돌연변이가 연구된 바 있다(US 5,229,109 B). 그러나, 아직도 IL-2를 약리학적으로 활용하기 위해서는 해소해야 할 문제점이 많이 남아 있는 실정이다.
한편, CD80은 B7-1로 알려져 있으며, 리간드와 결합하여 공동자극 반응(costimulatory responses) 및 공동억제 반응(coinhibitory responses)을 전달하여 면역 조절에 관여하는 막 단백질(membrane-bound proteins) 중 B7 패밀리의 하나이다. CD80은 T 세포, B 세포, 수지상 세포 및 단핵구(monocyte)의 표면에 발현하는 막관통 단백질이다. CD80은 CD28, CTLA4 (CD152) 및 PD-L1에 결합하는 것으로 알려져 있다. CD80, CD86, CTLA4 및 CD28은 공동자극-공동억제 시스템에 관여한다. 예를 들어, T 세포의 활성을 조절하고, 증식, 분화 및 생존에 관여한다.
예를 들어, CD80 및 CD86이 CD28과 상호작용을 하게 되면, 공동자극 신호가 발생하여 T 세포를 활성화시킨다. 결국, CD80은 CTLA4와 결합하고, CTLA4를 상향조절하도록 자극하게 된다. 그 결과, CD80/CD28 상호작용에 의한 면역 반응 작동 전에, CD80은 T 세포의 반응을 억제하게 된다. 이러한 피드백 회로(feedback loop)는 면역 반응을 세밀하게 조절하게 한다.
또한, CD80은 CD28이 PD-L1에 결합하는 것과 유사한 친화도로 또 다른 B7 패밀리인 PD-L1과 결합하는 것으로 알려져 있다. PD-L1은 PD-1(programmed death-1) 단백질에 대한 두 개의 리간드 중 하나로 알려져 있으며, PD-L1은 T 세포 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다. CD80과 PD-L1의 결합은 PD-1/PD-L1 상호 작용을 블록킹할 수 있는 또 다른 기전으로써, 종양에서 T 세포의 반응 억제를 막을 수 있다. 그러나, 이와 동시에 CD80의 수준이 증가되면 CD28과 결합을 하게 되고, CTLA4를 유발하게 되어, T 세포 반응을 유발하거나 억제할 수 있다.
US 5,229,109 B
Imai et al., Cancer Sci 98, 416-423, 2007
이에 본 발명자들은 안전하고 효과적인 IL-2를 개발하기 위해 연구한 결과, IL-2 단백질과 CD80 단백질을 한 분자 내에 포함하는 신규한 융합단백질이 면역세포를 활성화시키고, Treg 세포를 효과적으로 조절할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
상기 목적 달성을 위해, 본 발명의 일 측면은, IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 융합단백질 두 개가 결합된 융합단백질 이량체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 벡터가 도입된 형질전환 세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 융합단백질 또는 상기 융합단백질 이량체를 유효성분으로 포함하는 암 또는 감염성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 암 또는 감염성 질환을 치료하기 위한 상기 융합단백질의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 암 또는 감염성 질환 치료용 약제를 제조하기 위한 상기 융합단백질의 용도를 제공한다.
IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질은 IL-2에 의해 면역세포를 활성화시킬 수 있을 뿐 아니라, CD80에 의해 Treg 세포를 효과적으로 조절할 수 있다. 따라서, 상기 융합단백질은 효율적으로 암세포를 공격할 수 있으므로, 암 또는 감염성 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 융합단백질의 일 실시예를 도식화한 것이다.
도 2는 융합단백질이 서로 다른 두 종류의 면역세포를 조절하는 기작을 도식화한 것이지만, 융합단백질의 작용이 발현되는 기작이 이에 한정되는 것은 아님을 이해해야 한다.
도 3은 융합단백질이 항암 효과를 나타내는 기작을 도식화한 것이다.
도 4는 융합단백질의 구조를 도식화한 것이다. 이때, GI101 및 mGI101은 본원 융합단백질의 일 실시예이며, GI101C1, GI101C2, 및 mGI101C1은 융합단백질의 활성을 비교하기 위한 비교예이다.
도 5는 본원 융합단백질의 다양한 구체예이다. 인간 유래의 단백질과 마우스 유래의 단백질이 혼합하여 융합단백질을 제조할 수 있으며, Fc 이외에도 다양한 링커를 통해 CD80 단백질과 IL-2 단백질이 결합될 수 있다.
도 6은 수득한 융합단백질(GI101)을 SDS-PAGE로 확인한 것이다.
도 7은 흡광도에 따른 융합단백질(GI101)의 함량을 나타낸 것이다.
도 8은 수득한 융합단백질(GI101)을 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 분석한 것이다.
도 9는 수득한 mGI101 융합단백질을 SDS-PAGE로 확인한 것이다.
도 10은 수득한 GI101C1 융합단백질을 SDS-PAGE로 확인한 것이다.
도 11은 수득한 GI101C2 융합단백질을 SDS-PAGE로 확인한 것이다.
도 12는 수득한 mGI101C1 융합단백질을 SDS-PAGE로 확인한 것이다.
도 13은 수득한 GI102-M45 융합단백질을 SDS-PAGE로 확인한 것이다.
도 14는 수득한 GI102-M61 융합단백질을 SDS-PAGE로 확인한 것이다.
도 15는 수득한 GI102-M72 융합단백질을 SDS-PAGE로 확인한 것이다.
도 16은 hCTLA4와 GI101 간의 결합 친화성을 나타낸 것이다.
도 17은 hPD-L1과 GI101 간의 결합 친화성을 나타낸 것이다.
도 18은 hPD-L1과 hPD-1 간의 결합 친화성을 나타낸 것이다.
도 19는 mCTLA4와 mGI101 간의 결합 친화성을 나타낸 것이다.
도 20은 mPD-L1과 mGI101 간의 결합 친화성을 나타낸 것이다.
도 21 및 도 22는 GI-101(hCD80-Fc-hIL-2v)과 CTLA-4 및 PD-L1의 결합력을 확인한 것이다. GI-101(hCD80-Fc-hIL-2v)은 CTLA-4와 PD-L1에 대해 높은 결합력을 가짐을 확인하였다.
도 23은 GI101이 PD-1/PD-L1 결합에 미치는 영향을 확인한 것이다. GI101은 PD-1/PD-L1 결합을 효과적으로 억제 시켰다.
도 24는 GI101과 IL-2Rα 또는 IL-2Rβ 간의 결합 친화성을 확인한 것이다.
도 25는 GI101과 IL-2Rα 간의 결합 친화성을 확인한 것이다.
도 26은 GI101과 IL-2Rβ 간의 결합 친화성을 확인한 것이다.
도 27은 IL-2Rα와 GI102-M45간의 결합 친화성을 나타낸 것이다.
도 28은 IL-2Rα와 GI102-M61간의 결합 친화성을 나타낸 것이다.
도 29는 IL-2Rα와 GI102-M72간의 결합 친화성을 나타낸 것이다.
도 30은 IL-2Rβ와 GI102-M45 간의 결합 친화성을 나타낸 것이다.
도 31은 IL-2Rβ와 GI102-M61 간의 결합 친화성을 나타낸 것이다.
도 32는 IL-2Rβ와 GI102-M72 간의 결합 친화성을 나타낸 것이다.
도 33 및 도 34는 GI101, GI101C1, GI101C2 또는 IL-2를 농도 별로 세포에 처리하고 배양하였을 때의 세포에서 분비하는 IFN-γ 양을 측정한 것이다.
도 35 및 도 36은 GI101, GI101C1, GI101C2 및 IL-2(Proleukin)가 CD8+ T 세포의 증식에 미치는 영향을 확인한 것이다.
도 37은 GI101 및 GI102가 CD8+ T 세포와 CD4+ T 세포의 증식에 미치는 영향을 확인한 것이다. 이때, (A)는 CD8+ T 세포와 CD4+ T 세포의 비율을 나타내며, (B)는 CD8+ T 세포의 증식능력을 나타내고, (C)는 CD4+/FoxP3+ Treg 세포의 비율을 나타낸다.
도 38 및 도 39는 GI101 및 GI101w가 CD8+ T 세포와 NK 세포의 증식에 미치는 영향을 확인한 것이다.
도 40 및 도 41은 GI101이 effector T 세포에 미치는 영향을 확인한 것이다.
도 42는 mGI101 및 mGI102-M61이 마우스의 면역세포에 미치는 영향을 확인한 것이다.
도 43 및 도 44는 GI101이 PD-L1이 과발현된 암세포에 미치는 영향을 확인한 것이다.
도 45 및 도 46은 마우스 유래 대장암세포 식립 마우스에서의 GI101의 종양 억제 효과를 확인한 것이다.
도 47은 마우스 유래 흑색종 식립 마우스에서의 mGI101의 종양 억제 효과를 확인한 것이다.
도 48은 마우스 유래 흑색종 식립 마우스에서의 mGI101의 종양 억제율을 나타낸 것이다.
도 49는 마우스 유래 대장암세포 식립 마우스에서 mGI101의 용량에 따른 종양 억제 효과를 확인한 것이다.
도 50은 mGI101를 투여한 마우스 유래 대장암세포 식립 마우스의 생존율을 분석한 것이다.
도 51은 마우스 유래 대장암세포 식립 마우스에서의 GI101의 종양 억제 효과를 확인한 것이다.
도 52는 마우스 유래 대장암세포 식립 마우스에 hIgG4, 항-PD-1 항체 또는 GI101을 처리한 후, 암 조직 내 CD8+ T 세포, IFN-γ T 세포, CD4+ T 세포 및 Treg 세포를 FACS로 분석한 것이다.
도 53은 마우스 유래 대장암세포 식립 마우스에 hIgG4, 항-PD-1 항체 또는 GI101을 처리한 후, 암 조직 내 CD8+ T 세포, IFN-γ T 세포, CD4+ T 세포 및 Treg 세포를 FACS로 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 54는 마우스 유래 대장암세포 식립 마우스에 hIgG4, 항-PD-1 항체 또는 GI101을 처리한 후, 암 조직 내 대식세포를 FACS로 분석한 것이다.
도 55는 마우스 유래 대장암세포 식립 마우스에 hIgG4, 항-PD-1 항체 또는 GI101을 처리한 후, 암 조직 내 대식세포를 FACS로 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 56은 마우스 유래 대장암세포 식립 마우스에 hIgG4, 항-PD-1 항체 또는 GI101을 처리한 후, 암 조직 내 수지상세포를 FACS로 분석한 것이다.
도 57은 마우스 유래 대장암세포 식립 마우스에 hIgG4, 항-PD-1 항체 또는 GI101을 처리한 후, 암 조직 내 수지상세포를 FACS로 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 58은 마우스 유래 폐암세포 식립 마우스에서의 GI101의 종양 억제 효과를 확인한 것이다.
도 59는 마우스 유래 폐암세포 식립 마우스에 hIgG4, 항-PD-1 항체 또는 GI101을 처리한 후, 암 조직 내 CD8+ T 세포, IFN-γ T 세포, CD4+ T 세포 및 Treg 세포를 FACS로 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 60은 마우스 유래 폐암세포 식립 마우스에 hIgG4, 항-PD-1 항체 또는 GI101을 처리한 후, 암 조직 내 대식세포를 FACS로 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 61은 마우스 유래 폐암세포 식립 마우스에 hIgG4, 항-PD-1 항체 또는 GI101을 처리한 후, 암 조직 내 수지상세포를 FACS로 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 62는 마우스 유래 대장암세포 식립 마우스에서의 mGI102-M61의 종양 억제 효과를 확인한 것이다.
도 63은 mGI102-M61을 투여한 마우스 유래 대장암세포 식립 마우스의 생존율을 분석한 것이다.
도 64는 마우스 유래 대장암세포 식립 마우스에서의 mGI101의 종양 억제 효과를 확인한 것이다.
도 65는 마우스 유래 대장암세포 식립 마우스에서의 mGI101의 종양 억제율을 나타낸 것이다.
도 66은 PBS 또는 GI101을 투여받은 원숭이의 15일 동안의 임상관찰 결과를 나타낸 것이다.
도 67 및 도 68은 PBS 또는 GI101을 투여받은 원숭이의 -1일, 1일, 8일 및 15일째의 체중을 측정한 것이다.
도 69는 PBS 또는 GI101을 투여받은 원숭이의 15일 동안의 섭취량을 나타낸 것이다.
도 70 내지 도 72는 PBS 또는 GI101을 투여받은 원숭이의 -1일, 1일, 8일 및 15일째의 혈액을 분석한 것이다.
도 73 내지 도 79는 PBS 또는 GI101을 투여받은 원숭이의 -1일, 1일, 8일 및 15일째의 임상화학적 분석을 한 것이다.
도 80 및 도 81은 PBS 또는 GI101을 투여받은 원숭이의 -1일, 1일, 8일 및 15일째의 사이토카인을 분석한 것이다.
도 82 내지 도 87은 PBS 또는 GI101을 투여받은 원숭이의 -1일, 1일, 8일 및 15일째의 면역세포를 분석한 것이다.
도 88은 PBS 또는 GI101을 투여받은 원숭이를 16일째에 희생시켜 비장 조직을 병리학적으로 분석한 것이다.
도 89는 CD80 단백질과 IL-2 단백질이 캐리어(carrier) 단백질과 결합된 융합단백질을 나타낸 것이다. 구체적으로, 도 89(A)는 CD80 단백질과 IL-2 단백질이 각각 캐리어 단백질의 N-말단과 C-말단에 결합한 것을 나타낸다. 또한, 도 89(B)는 CD80 단백질과 IL-2 단백질이 각각 캐리어 단백질의 C-말단과 N-말단에 결합한 것을 나타낸다.
IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질
본 발명의 일 측면은, IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질을 제공한다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "IL-2" 또는 "인터루킨-2"는 달리 언급되지 않는 한, 포유동물, 예를 들어, 영장류(예, 인간) 및 설치류(예, 마우스 및 래트)를 포함하여 임의의 척추동물 공급원으로부터 수득한 임의의 야생형 IL-2를 의미한다. 상기 IL-2는 동물 세포에서 수득된 것일 수도 있으나, IL-2를 생산할 수 있는 재조합 세포로부터 수득된 것도 포함한다. 또한, 상기 IL-2는 야생형 IL-2 또는 이의 변이체일 수 있다.
본 명세서에서는 IL-2 혹은 이의 변이체를 총칭하여 "IL-2 단백질" 혹은 "IL-2 폴리펩티드"의 용어로 표현하기도 한다. IL-2, IL-2 단백질, IL-2 폴리펩티드, 및 IL-2 변이체는 예를 들어 IL-2 수용체(receptor)에 특이적으로 결합한다. 이 특이적인 결합은 당업자에게 알려진 방법을 통해 확인할 수 있다.
상기 IL-2의 일 구체예는 서열번호 35 또는 서열번호 36의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 이때, 상기 IL-2는 성숙된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 성숙된 IL-2는 신호서열을 포함하지 않는 것일 수 있으며, 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 이때, 상기 IL-2는 야생형 IL-2의 N-말단 또는 C-말단의 일부가 결실된(truncated) 단편을 포함하는 개념으로 이용될 수 있다.
또한, 상기 IL-2의 단편은 서열번호 35 또는 서열번호 36의 아미노산 서열을 가지는 단백질의 N 말단으로부터 연속적으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개 또는 25개의 아미노산이 결실된 형태일 수 있다. 또한 상기 IL-2의 단편은 서열번호 35 또는 서열번호 36의 아미노산 서열을 가지는 단백질의 C 말단으로부터 연속적으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개 또는 25개의 아미노산이 결실된 형태일 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "IL-2 변이체"는 전장(full-length) IL-2 또는 상술한 IL-2의 단편의 아미노산 일부가 치환된 형태를 의미한다. 즉, IL-2 변이체는 야생형 IL-2 또는 이의 단편과 다른 아미노산 서열을 가질 수 있다. 그러나, 상기 IL-2 변이체는 야생형 IL-2와 동등하거나 유사한 활성을 가질 수 있다. 여기에서, "IL-2 활성"은 예를 들어 IL-2 수용체에 특이적으로 결합하는 것을 의미할 수 있으며, 이 특이적 결합은 당업자에게 알려진 방법을 통해 측정할 수 있다.
구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 야생형 IL-2의 아미노산 일부가 치환된 것일 수 있다. 아미노산 치환에 의한 IL-2 변이체의 일 구체예로는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 42번째, 45번째, 61번째 및 72번째 아미노산 중 적어도 하나가 치환된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 42번째, 45번째, 61번째 또는 72번째 아미노산 중 적어도 어느 하나가 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 뿐만 아니라, IL-2가 서열번호 35의 아미노산 서열의 N 말단의 일 부분이 결실된 형태일 경우, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 상보적으로 대응되는 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 예를 들어, IL-2가 서열번호 35의 아미노산을 서열을 가질 경우에, 상기 IL-2의 변이체는 서열번호 35의 아미노산 서열에서 58번째, 62번째, 65번째, 81번째 또는 92번째 아미노산 중 적어도 어느 하나가 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 이들은 각각 서열번호 10의 아미노산 서열의 38번째, 42번째, 45번째, 61번째 및 72번째 아미노산 잔기에 각각 해당한다. 일 구체예에 따르면, IL-2 활성이 유지되는 한, 한 개, 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개, 여섯 개, 일곱 개, 여덟 개, 아홉 개, 혹은 열 개의 아미노산이 치환될 수 있다. 또다른 구체예에 따르면, 한 개에서 다섯 개까지의 아미노산이 치환될 수 있다.
일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 두 군데의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째 및 42번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째 및 45번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 42번째 및 45번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 42번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 42번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 45번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 45번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 61번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다.
나아가, 상기 IL-2 변이체는 세 군데의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 42번째 및 45번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 42번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 42번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 45번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 45번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 61번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 42번째, 45번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 42번째, 45번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 45번째, 61번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다.
또한, 상기 IL-2 변이체는 네 군데의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 42번재, 45번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 42번재, 45번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 45번째, 61번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 42번재, 61번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 42번재, 45번째, 61번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다.
나아가, 상기 IL-2 변이체는 다섯 군데의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 42번재, 45번째, 61번째 및 72번째 아미노산이 모두 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
이때, 상기 치환에 의해 도입되는 "다른 아미노산"은 알라닌(alanine), 아르기닌(arginine), 아스파라긴(Asparagine), 아스파르트산(aspartic acid), 시스테인(cysteine), 글루탐산(glutamic acid), 글루타민(glutamine), 히스티딘(histidine), 이소루신(isoleucine), 루신(leucine), 리신(lysine), 메티오닌(methionine), 페닐알라닌(phenyl alanine), 프롤린(proline), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 트립토판(tryptophan), 티로신(tyrosine) 및 발린(valine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 단, 상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 상기 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째는 아르기닌으로 치환될 수 없으며, 42번째는 페닐알라닌으로 치환될 수 없고, 45번째는 티로신으로 치환될 수 없으며, 61번째는 글루탐산으로 치환될 수 없고, 72번째는 루신으로 치환될 수 없다.
상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째 아미노산인 아르기닌은 아르기닌을 제외한 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째 아미노산인 아르기닌은 알라닌으로 치환(R38A)될 수 있다.
상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 42번째 아미노산인 페닐알라닌은 페닐알라닌을 제외한 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 42번째 아미노산인 페닐알라닌은 알라닌으로 치환(F42A)될 수 있다.
상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 45번째 아미노산인 티로신은 티로신을 제외한 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 45번째 아미노산인 티로신은 알라닌으로 치환(Y45A)될 수 있다.
상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 61번째 아미노산인 글루탐산은 글루탐산을 제외한 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 61번째 아미노산인 글루탐산은 아르기닌으로 치환(E61A)될 수 있다.
상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 72번째 아미노산인 루신은 루신을 제외한 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 72번째 아미노산인 루신은 글리신으로 치환(L72G)될 수 있다.
구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 R38A, F42A, Y45A, E61R 및 L72G로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 치환이 일어난 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A, Y45A, E61R 및 L72G로 구성된 군에서 선택되는 위치에서 두 군데, 세 군데, 네 군데 또는 다섯 군데의 위치에서 아미노산 치환이 일어날 수 있다.
또한, 상기 IL-2 변이체는 두 군데의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 R38A 및 F42A로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A 및 Y45A로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A 및 E61R로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A 및 Y45A로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A 및 E61R로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 E61R 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다.
나아가, 상기 IL-2 변이체는 세 군데의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A 및 Y45A로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A 및 E61R로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, Y45A, E61R로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, Y45A 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A, Y45A 및 E61R로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A, Y45A 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A, E61R 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 Y45A, E61R 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다.
또한, 상기 IL-2 변이체는 네 군데의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A, Y45A 및 E61R로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A, Y45A 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A, E61R 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, Y45A, E61R 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A, Y45A, E61R 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다.
나아가 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A, Y45A, E61R 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다.
바람직하게는, 상기 IL-2 변이체의 일 구체예는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 하기 (a) 내지 (d) 조합 중 선택되는 어느 하나의 조합의 치환이 일어난 것일 수 있다:
(a) R38A/F42A
(b) R38A/F42A/Y45A
(c) R38A/F42A/E61R
(d) R38A/F42A/L72G
이때, IL-2가 서열번호 35의 아미노산 서열을 가질 경우, 서열번호 10과 상보적으로 대응되는 위치에 아미노산 치환을 가질 수 있다. 또한, IL-2가 서열번호 35의 아미노산 서열의 단편인 경우에도, 서열번호 10과 상보적으로 대응되는 위치의 아미노산이 치환될 수 있다.
구체적으로, 상기 IL-2의 변이체는 서열번호 6, 22, 23 또는 24의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
또한, 상기 IL-2 변이체는 생체 내에서 낮은 독성을 가지는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 이때, 상기 생체 내에서 낮은 독성이란, IL-2가 IL-2 수용체의 알파체인(IL-2Rα)과 결합하여 유발되는 부작용일 수 있다. 상기 IL-2와 IL-2Rα 결합에 의한 부작용을 개선시키기 위해서 다양한 IL-2 변이체가 개발되었으며, 이러한 IL-2 변이체는 미국특허 5,229,109 및 대한민국특허 1667096에 개시된 것들을 사용할 수 있다. 특히, 본 출원에서 기술되는 IL-2의 변이체는 IL-2 수용체의 알파체인(IL-2Rα)과 결합력이 낮아 생체내 독성이 야생형 IL-2에 비해 낮다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "CD80"은 "B7-1"로도 불리며, 수지상세포, 활성화된 B세포 및 단핵구에 존재하는 막단백질이다. CD80은 T 세포의 활성화와 생존에 필수적인 공자극 신호를 제공한다. CD80은 T 세포 표면에 존재하는 서로 다른 두 단백질인 CD28 및 CTLA-4에 대한 리간드로 알려져 있다. CD80은 288개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 구체적으로 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 "CD80 단백질"은 전장 CD80 또는 CD80 단편을 의미한다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "CD80 단편"이란, CD80의 절단형을 의미한다. 또한, 상기 CD80 단편은 CD80의 세포외도메인일 수 있다. CD80 단편의 일 구체예로는 CD80의 신호서열인 N-말단으로부터 1번째 내지 34번째의 아미노산이 제외된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 CD80 단편의 일 구체예는 서열번호 11의 35번째 내지 288번째의 아미노산으로 구성된 단백질일 수 있다. 또한, 상기 CD80 단편의 일 구체예는 서열번호 11의 35번째 내지 242번째 아미노산으로 구성된 단백질일 수 있다. 또한, 상기 CD80 단편의 일 구체예는 서열번호 11의 35번째 내지 232번째 아미노산으로 구성된 단백질일 수 있다. 또한, 또한, 상기 CD80 단편의 일 구체예는 서열번호 11의 35번째 내지 139번째 아미노산으로 구성된 단백질일 수 있다. 또한, 상기 CD80 단편의 일 구체예는 서열번호 11의 142번째 내지 242번째 아미노산으로 구성된 단백질일 수 있다. 상기 일 실시예로 CD80 단편은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
또한, 상기 IL-2 단백질 및 상기 CD80 단백질은 링커 혹은 캐리어(carrier)에 의해 결합된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 또는 이의 변이체 및 상기 CD80(B7-1) 또는 이의 단편은 링커 혹은 캐리어에 의해 결합된 것일 수 있다. 본 명세서에서 링커와 캐리어는 호환적으로 사용되기도 한다.
상기 링커는 두 개의 단백질을 연결시켜준다. 링커의 일 구체예로는 1개 내지 50개의 아미노산, 알부민 또는 이의 단편, 또는 면역글로불린의 Fc 도메인 등을 포함할 수 있다. 이때, 상기 면역글로불린의 Fc 도메인은 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 2(CH2) 및 중쇄 불변 영역 3(CH3)을 포함하며, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 1(CH1)은 포함하지 않는 단백질을 의미한다. 상기 면역글로불린은 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM 일 수 있으며, 바람직하게는 IgG4일 수 있다. 이때, 야생형 면역글로불린 G4의 Fc 도메인은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
또한, 상기 면역글로불린의 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인 뿐만 아니라, Fc 도메인 변이체일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용하는 용어 "Fc 도메인 변이체"는 야생형 Fc 도메인의 당쇄 형태(glycosylation pattern)와 다르거나, 야생형 Fc 도메인에 비해 증가된 당쇄, 야생형 Fc 도메인에 비해 감소한 당쇄, 또는 당쇄가 제거(deglycosylate)된 형태일 수 있다. 또한 무당쇄(aglycosylated) Fc 도메인도 포함된다. Fc 도메인 혹은 변이체는 배양조건 혹은 호스트의 유전자 조작을 통해 조정된 숫자의 시알산(sialic acid), 퓨코실화(fucosylation), 당화(glycosylation)를 갖도록 한 것일 수 있다.
또한, 화학적 방법, 효소적 방법 및 미생물을 사용한 유전공학적 엔지니어링 방법 등과 같이 통상적인 방법으로 면역글로불린의 Fc 도메인의 당쇄를 변형시킬 수 있다. 또한, 상기 Fc 도메인 변이체는 면역글로불린은 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM의 Fc 영역이 혼합된 형태일 수 있다. 또한, 상기 Fc 도메인 변이체는 상기 Fc 도메인의 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 형태일 수 있다. 상기 Fc 도메인 변이체의 일 구체예로는 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
융합단백질은 Fc 도메인을 링커(혹은 캐리어)로 하여 이의 N-말단과 C-말단에 각각 CD80과 IL-2 단백질이 연결되거나 혹은 IL-2와 CD80이 연결된 구조를 가질 수 있다(도 89). Fc 도메인의 N-말단 혹은 C-말단과 CD-80 혹은 IL-2의 연결은 임의적으로 링커 펩타이드에 의해 이루어질 수 있다.
구체적으로, 상기 융합단백질은 하기 구조식(I) 또는 (II)로 이루어진 것일 수 있다:
N'-X-[링커(1)]n-Fc 도메인-[링커(2)]m-Y-C' (I)
N'-Y-[링커(1)]n-Fc 도메인-[링커(2)]m-X-C' (II)
이때, 상기 구조식(I) 및 (II)에 있어서,
상기 N'은 융합단백질의 N-말단이고,
상기 C'는 융합단백질의 C-말단이며,
상기 X는 CD80 단백질이고,
상기 Y는 IL-2 단백질이며,
상기 링커(1) 및 링커(2)는 펩타이드 링커이고,
상기 n 및 m은 각각 독립적으로, O 또는 1이다.
바람직하게는, 상기 융합단백질은 구조식(I)로 이루어진 것일 수 있다. 상기 IL-2 단백질은 상술한 바와 같다. 또한, 상기 CD80 단백질은 상술한 바와 같다. 일 구체예에 따르면, IL-2 단백질은 야생형 IL-2와 비교하여 하나에서 다섯개까지의 아미노산이 치환된 IL-2 변이체일 수 있다. CD80 단백질은 야생형 CD80의 N-말단 혹은 C-말단으로부터 연속적으로 약 34개까지의 아미노산 잔기가 결실된(truncated) 단편일 수 있다. 혹은 CD 단백질은 T-세포 표면 수용체(T cell surface receptors) CTLA-4와 CD28에 결합하는 활성을 갖는 세포외 면역글로불린-유사 도메인일 수 있다.
구체적으로, 상기 융합단백질은 서열번호 9, 26, 28 또는 30의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 또 다른 구체예에 따르면, 융합단백질은 서열번호 9, 26, 28 또는 30의 아미노산 서열에 대해 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 혹은 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이때, 동일성은, 예를 들어, 퍼센트 상동성, NCBI(National Center of Biotechnology Information)의 BlastN software과 같은 상동성 비교 소프트웨어를 통해 결정될 수 있다.
상기 CD80 단백질과 Fc 도메인의 사이에는 펩타이드 링커(1)가 포함될 수 있다. 상기 펩타이드 링커(1)은 5 내지 80개의 연속된 아미노산, 20 내지 60개의 연속된 아미노산, 또는 25 내지 50개의 연속된 아미노산, 또는 30 내지 40개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 구체예로 펩타이드 링커(1)은 30개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 또한, 펩타이드 링커(1)은 적어도 하나의 시스테인을 포함할 수 있다. 구체적으로, 하나, 두 개 또는 세 개의 시스테인을 포함할 수 있다. 또한, 상기 펩타이드 링커(1)는 면역글로불린의 힌지에서 유래된 것일 수 있다. 한 구체예에서는, 상기 펩타이드 링커(1)이 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있다.
상기 펩타이드 링커(2)는 1 내지 50개의 연속된 아미노산, 또는 3 내지 30개의 연속된 아미노산, 또는 5 내지 15개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 구체예로 상기 펩타이드 링커(2)는 (G4S)n(이때, n은 1 내지 10의 정수) 일 수 있다. 이때, (G4S)n에서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 수 있다. 일 실시예로, 상기 펩타이드 링커(2)가 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 IL-2 단백질 및 상기 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질 두 개가 결합된 이량체를 제공한다. 상기 IL-2 또는 이의 변이체 및 CD80 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질은 상술한 바와 같다.
이때, 이량체를 구성하는 융합단백질 간의 결합은 링커 내에 존재하는 시스테인에 의해 이황화 결합에 의해 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이량체를 구성하는 융합단백질은 동일한 것일 수도 있으나, 서로 상이한 융합단백질일 수 있다. 바람직하게는, 상기 이량체는 동형이량체(homodimer)인 것일 수 있다. 상기 이량체를 구성하는 융합단백질의 일 실시예는 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있다.
융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
본 발명의 또 다른 측면은, IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 구체적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8, 25, 27 또는 29의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질은 상술한 바와 같다. 상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 뉴클레오티드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체상의 올리고뉴클레오티드 합성법 등을 들 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 폴리펩티드는 서열번호 8, 25, 27 또는 29와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100%의 동일성을 가지는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 신호서열(signal sequence) 또는 리더 서열(leader sequence)을 코딩하는 핵산을 추가적으로 포함할 수 있다. 여기에서 사용된 용어 "신호서열"은 목적 단백질의 분비를 지시하는 신호펩타이드를 의미한다. 상기 신호펩타이드는 숙주 세포에서 번역된 후에 절단된다. 구체적으로, 상기 신호서열은 ER(endoplasmic reticulum) 막을 관통하는 단백질의 이동을 개시하는 아미노산 서열이다. 일 실시예로, 상기 신호서열은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
신호서열은 당업계에 그 특징이 잘 알려져 있으며, 통상 16 내지 30개의 아미노산 잔기를 포함하나, 그보다 더 많거나 적은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 통상적인 신호 펩타이드는 기본 N-말단 영역, 중심의 소수성 영역, 및 보다 극성인(polar) C-말단 영역의 세 영역으로 구성된다. 중심 소수성 영역은 미성숙 폴리펩타이드가 이동하는 동안 막지질 이중층을 통하여 신호서열을 고정시키는 4 내지 12개의 소수성 잔기를 포함한다.
개시 이후에, 신호서열은 흔히 신호 펩티다아제(signal peptidases)로 알려진 세포 효소에 의하여 ER의 루멘(lumen) 내에서 절단된다. 이때, 상기 신호서열은 tPa(tissue Plasminogen Activation), HSV gDs(signal sequence of Herpes simplex virus glycoprotein D), 또는 성장 호르몬(growth hormone)의 분비신호서열일 수 있다. 바람직하게, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵 세포에서 사용되는 분비 신호서열을 사용할 수 있다. 또한, 상기 신호서열은 야생형 IL-2 및/혹은 CD-80에 포함된 신호서열을 사용하거나, 숙주세포에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 치환하여 사용할 수 있다.
융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 적재된 벡터
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
상기 벡터는 숙주 세포에 도입되어 숙주 세포 유전체 내로 재조합 및 삽입될 수 있다. 또는 상기 벡터는 에피좀으로서 자발적으로 복제될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 수단으로 이해된다. 상기 벡터는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 및 이의 유사체들을 포함한다. 바이러스 벡터의 예로는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 벡터는 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 될 수 있고, 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 등), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110, pTP5 등), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50 등), 파아지 DNA(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP 등), 동물 바이러스 벡터(레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 등), 곤충 바이러스 벡터(배큘로바이러스(baculovirus) 등)이 될 수 있다. 상기 벡터는 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용함이 바람직하다.
본 명세서에서 사용하는 용어, 목적 단백질의 "유전자 발현" 또는 "발현"은, DNA 서열의 전사, mRNA 전사체의 번역 및 융합단백질 생산물 또는 이의 단편의 분비를 의미하는 것으로 이해된다. 유용한 발현 벡터는 RcCMV(Invitrogen, Carlsbad) 또는 이의 변이체일 수 있다. 상기 발현 벡터는 포유류 세포에서 목적 유전자의 연속적인 전사를 촉진하기 위한 인간 CMV(cytomegalovirus) 프로모터, 및 전사 후 RNA의 안정상태 수준을 높이기 위한 우태 성장 인자(bovine growth hormone) 폴리아데닐레이션 신호서열을 포함할 수 있다.
융합단백질을 발현하는 형질전환된 세포
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 벡터가 도입된 형질전환 세포를 제공한다.
상기 형질전환 세포의 숙주세포로서, 원핵세포, 진핵세포, 포유동물, 식물, 곤충, 균류 또는 세포성 기원의 세포를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 상기 원핵세포의 일 예로는 대장균을 사용할 수 있다. 또한, 진핵세포의 일 예로는 효모를 사용할 수 있다. 또한, 상기 포유동물 세포로 CHO 세포, F2N 세포, CSO 세포, BHK 세포, 바우스(Bowes) 흑색종 세포, HeLa 세포, 911 세포, AT1080 세포, A549 세포, HEK 293 세포 또는 HEK293T 세포 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 당업자에게 알려진 포유동물 숙주세포로 사용 가능한 세포는 모두 이용 가능하다.
또한, 숙주세포로 발현벡터를 도입하는 경우, CaCl2 침전법, CaCl2 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다.
전술한 바와 같이, 융합단백질의 치료제로서의 특성을 최적하거나 기타 다른 목적을 위해 호스트 세포가 갖고 있는 당화(glycosylation) 관련 유전자를 당업자에게 알려져 있는 방법을 통해 조작하여 융합단백질의 당쇄 패턴(예를 들어, 시알산, 퓨코실화, 당화)을 조정할 수 있다.
융합단백질 생산 방법
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 형질전환 세포를 배양하는 단계를 포함하는 IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 생산방법은 상기 생산 방법은 i) 상기 형질전환 세포를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 ii) 상기 배양물로부터 융합단백질을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 형질전환 세포를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch 또는 repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.
융합단백질 또는 이의 이량체의 용도
본 발명의 또 다른 측면은, IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질 또는 상기 융합단백질 2개가 결합된 융합단백질 이량체를 유효성분으로 포함하는 암 또는 감염성 질환 치료 또는 예방용, 및/또는 치료효과(efficacy)를 증가시킬 수 있는 약학 조성물을 제공한다.
상기 IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질 또는 상기 융합단백질 2개가 결합된 융합단백질 이량체는 상술한 바와 같다.
상기 암은 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암 및 림프종으로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 또한, 상기 감염성 질환은 B형 간염, C형 간염, 인간 파필로마 바이러스(human papilloma virus: HPV) 감염, 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) 감염, 바이러스성 호흡기 질환 및 인플루엔자로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 암 또는 감염성 질환 치료용 또는 예방용 약학 조성물에서 그 유효성분은 항암 활성을 나타내거나, 감염성 질환에 치료 효과를 나타낼 수 있는 한, 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 20.0 중량% 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 항암 효과 또는 감염성 질환 치료(treatment) 효과를 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, “치료”는 치료학적 처리 및 예방적 처리를 모두 포함하는 의미로 사용될 수 있다. 이때, 예방은 개체의 병리학적 상태 또는 질환을 완화시키거나 감소시키는 의미로 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 용어 “치료”는 인간을 포함한 포유류에서 질환을 치료하기 위한 적용이나 어떠한 형태의 투약을 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 질환 또는 질환의 진행을 억제하거나 늦추는 것을 포함하며; 손상되거나, 결손된 기능을 회복시키거나, 수리하여, 질환을 부분적이거나 완전하게 완화시키거나; 또는 비효율적인 프로세스를 자극하거나; 심각한 질환을 완화하는 의미를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어, “효능(efficacy)”은 1년, 5년, 또는 10년과 같이 일정 기간에 걸쳐 생존 또는 질병이 없는 상태에서 생존(disease-free survival)과 같은 같은 하나 이상의 파라미터에 의해 결정될 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 파라미터는 개체에서 적어도 하나의 종양의 크기가 억제되는 것을 포함할 수 있다.
생체이용률과 같은 약동학적 파라미터(Pharmacokinetic parameters) 및 클리어런스율(clearance rate)과 같은 기본적인 파라미터(underlying parameters)도 효능에 영향을 줄 수 있다. 따라서, “향상된 효능” (예를 들어, 효능의 개선)은 향상된 약동학적 파라미터 및 향상된 효능에 기인할 수 있으며, 시험 동물 또는 인간 대상체에서 클리어런스율 및 종양 성장을 비교하거나, 생존, 재발율 또는 질병이 없는 상태에서 생존과 같은 파라미터를 비교하여 측정될 수 있다.
여기서 "치료학적으로 유효한 양" 또는 "약학적으로 유효한 양"이란 대상 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 화합물 또는 조성물의 양으로서, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 상기 상기 유효량의 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 일 구체예에서 치료학적으로 유효한 양은 암을 치료하는데 효과적인 약물의 양을 의미한다.
이때, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 환자에게 전달하기에 적절한 비-독성 물질이면 어떠한 담체라도 가능하다. 증류수, 알코올, 지방, 왁스 및 비활성 고체가 담체로 포함될 수 있다. 약물학적으로 허용되는 애쥬번트(완충제, 분산제) 또한 약학 조성물에 포함될 수 있다.
구체적으로, 상기 약학 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.
상기 약학 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 약제학적 조성물의 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 구체적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.
상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.01 ug/kg 내지 10 g/kg 범위, 또는 0.01 mg/kg 내지 1 g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본원 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
상기 약학 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물 및 사람이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다. 본원의 약학 조성물은 유효성분 이외에, 항암 활성의 상승·보강을 위하여 이미 안전성이 검증되고 항암 활성 또는 감염성 질환에 치료 효과를 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 암 또는 감염성 질환을 치료하기 위한 IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 암 또는 감염성 질환의 치료효과를 향상(enhance)시키기 위한 IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 암 또는 감염성 질환 치료용 약제를 제조하기 위한 IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질 또는 상기 융합단백질 2개가 결합된 융합단백질 이량체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 감염성 질환을 치료하는 방법, 및/또는 치료효과를 향상시키는 방법을 제공한다.
상기 개체는 암 또는 감염성 질환을 앓고 있는 개체일 수 있다. 또한 상기 개체는 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다. 상기 IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질 또는 상기 융합단백질 2개가 결합된 융합단백질 이량체는 상술한 바와 같다.
상기 융합 단백질 또는 융합단백질 이량체의 투여경로, 투여량 및 투여횟수는 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여방법, 투여량 및 투여횟수는 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 융합 단백질 또는 융합단백질 이량체는 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 융합단백질은 IL-2의 활성으로 인해 자연살해세포와 같은 면역세포를 활성화시킬 수 있다. 따라서, 암 및 감염성 질환에 효과적으로 활용할 수 있다. 특히, 야생형과 비교하여 2개 내지 5개 위치의 아미노산이 치환된 IL-2 변이체, 특히 서열번호 10의 아미노산 서열에서 R38A, F42A, Y45A, E61R 및 L72G로 구성된 군에서 선택되는 위치에서 두 군데, 세 군데, 네 군데 또는 다섯 군데의 위치의 아미노산 치환을 포함하는 IL-2 변이체는 IL-2 수용체의 알파 체인과의 결합력을 낮추어 종래 IL-2가 가지고 있는 약리학적 부작용을 개선된 특성을 보이는 것이 확인되었다. 따라서, 이런 IL-2 변이체는 단독으로 혹은 융합단백질의 형태로 사용할 경우 종래에 알려진 IL-2의 문제점인 혈관(또는 모세관) 누출 증후군(VLS)의 발생을 감소시킬 수 있다.
이하, 본원 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본원 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본원 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
I. 융합단백질 제조
제조예 1. hCD80-Fc-IL-2 변이체(2M)의 제조: GI101
인간 CD80 단편, Fc 도메인 및 IL-2 변이체를 포함하는 융합단백질을 생산하기 위하여, 시그널 펩타이드(서열번호 1), CD80 단편(서열번호 2), Ig 힌지(서열번호 3), Fc 도메인(서열번호 4), 링커(서열번호 5) 및 두 개의 아미노산이 치환된 IL-2 변이체(2M)(R38A, F42A)(서열번호 6)를 N-말단으로부터 이 순서대로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 염기서열(서열번호 8)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 ThermoFisher Scientific 사의 Invitrogen GeneArt Gene Synthesis 서비스를 통해 폴리뉴클레오티드를 합성하여 pcDNA3_4 벡터에 적재하였다. 또한, 상기 벡터를 CHO 세포(Expi-CHOTM)에 도입하여 서열번호 9의 융합단백질을 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃, 125 RPM, CO2 8%의 농도인 환경에서 7일 배양 후 배양액을 수거하여 융합단백질을 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질을 "GI101"로 명명하였다.
정제는 MabSelect SuRe protein A resin이 포함된 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.4의 조건에서 융합단백질을 결합시켰다. 그 후, 100 mM NaCl, pH 3의 100 mM의 아세트산으로 용출하였다. pH 9의 20%의 1M Tris-HCl를 수거용 튜브에 넣은 후, 융합단백질을 수거하였다. 수거된 융합단백질을 16시간 동안 PBS 버퍼로 투석하여 바꾸어 주었다.
그 후, TSKgel G3000SWXL column(TOSOH Bioscience)을 사용하여 크기배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 이용하여 시간에 따른 280 nm 파장에서의 흡광도를 측정하여 고농도 융합단백질을 확보하였다. 이때, 분리 정제된 융합단백질은 reduced(R) 또는 non-reduced(NR) 조건하에서 SDS-PAGE를 실행하고, 코마시블루(coomassie blue)로 염색하여 그 순도를 확인하였다(도 6). NanoDrop을 사용하여 검출시 2.78 ㎎/㎖의 농도로 융합단백질이 포함된 것을 확인하였다(도 7). 또한, 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과는 도 8에 나타난 바와 같다.
제조예 2. mCD80-Fc-IL-2 변이체(2M)의 제조: mGI101
마우스 CD80, Fc 도메인 및 IL-2 변이체를 포함하는 융합단백질을 생산하기 위하여, 시그널 펩타이드(서열번호 1), mCD80(서열번호 13), Ig 힌지(서열번호 3), Fc 도메인(서열번호 4), 링커(서열번호 5) 및 두 개의 아미노산이 치환된 IL-2 변이체(2M)(R38A, F42A)(서열번호 6)를 N-말단으로부터 이 순서대로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 염기서열(서열번호 14)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 ThermoFisher Scientific 사의 Invitrogen GeneArt Gene Synthesis 서비스를 통해 폴리뉴클레오티드 합성하여 pcDNA3_4 벡터에 적재하였다. 또한, 상기 벡터를 CHO 세포(Expi-CHOTM)에 도입하여 서열번호 15의 융합단백질을 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃, 125 RPM, CO2 8%의 농도인 환경에서 7일 배양 후 배양액을 수거하여 융합단백질을 정제하였다. 상기 정제한 융합 단백질을 "mGI101"로 명명하였다.
상기 정제 및 융합단백질 수거는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. 분리 정제된 융합단백질은 reduced(R) 또는 non-reduced(NR) 조건하에서 SDS-PAGE를 실행하고, 코마시블루로 염색하여 그 순도를 확인하였다(도 9). NanoDrop을 사용하여 흡광도 280 nm로 검출시 1.95 ㎎/㎖의 농도로 융합단백질이 포함된 것을 확인하였다.
제조예 3. hCD80-Fc의 제조: GI101C1
인간 CD80 단편 및 Fc 도메인를 포함하는 융합단백질을 생산하기 위하여, 시그널 펩타이드(서열번호 1), CD80 단편(서열번호 2), Ig 힌지(서열번호 3) 및 Fc 도메인(서열번호 4)를 포함하는 융합단백질을 코딩하는 염기서열(서열번호 16)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 ThermoFisher Scientific 사의 Invitrogen GeneArt Gene Synthesis 서비스를 통해 폴리뉴클레오티드 합성하여 pcDNA3_4 벡터에 적재하였다. 또한, 상기 벡터를 CHO 세포(Expi-CHOTM)에 도입하여 서열번호 17의 융합단백질을 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃, 125 RPM, CO2 8%의 농도인 환경에서 7일 배양 후 배양액을 수거하여 융합단백질을 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질을 "GI101C1"으로 명명하였다.
상기 정제 및 융합단백질 수거는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. 분리 정제된 융합단백질은 reduced(R) 또는 non-reduced(NR) 조건하에서 SDS-PAGE를 실행하고, 코마시블루로 염색하여 그 순도를 확인하였다(도 10). NanoDrop을 사용하여 흡광도 280 nm로 검출시 3.61 ㎎/㎖의 농도로 융합단백질이 포함된 것을 확인하였다.
제조예 4. Fc-IL-2 변이체(2M)의 제조: GI101C2
Fc 도메인 및 IL-2 변이체를 포함하는 융합단백질을 생산하기 위하여, 시그널 펩타이드(서열번호 1), Fc 도메인(서열번호 4), 링커(서열번호 5) 및 두 개의 아미노산이 치환된 IL-2 변이체(2M)(R38A, F42A)(서열번호 6)를 포함하는 융합단백질을 코딩하는 염기서열(서열번호 18)을 N-말단으로부터 이 순서대로 포함하는 폴리뉴클레오티드를 ThermoFisher Scientific 사의 Invitrogen GeneArt Gene Synthesis 서비스를 통해 폴리뉴클레오티드 합성하여 pcDNA3_4 벡터에 적재하였다. 또한, 상기 벡터를 CHO 세포(Expi-CHOTM)에 도입하여 서열번호 19의 융합단백질을 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃, 125 RPM, CO2 8%의 농도인 환경에서 7일 배양 후 배양액을 수거하여 융합단백질을 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질을 "GI101C2"으로 명명하였다.
상기 정제 및 융합단백질 수거는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. 분리 정제된 융합단백질은 reduced(R) 또는 non-reduced(NR) 조건하에서 SDS-PAGE를 실행하고, 코마시블루로 염색하여 그 순도를 확인하였다(도 11). NanoDrop을 사용하여 흡광도 280 nm로 검출시 4.79 ㎎/㎖의 농도로 융합단백질이 포함된 것을 확인하였다.
제조예 5. mCD80-Fc의 제조: mGI101C1
마우스 CD80 및 Fc 도메인을 포함하는 융합단백질을 생산하기 위하여, 시그널 펩타이드(서열번호 1), 마우스 CD80(서열번호 13), Ig 힌지(서열번호 3) 및 Fc 도메인(서열번호 4)을 N-말단으로부터 이 순서대로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 염기서열(서열번호 20)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 ThermoFisher Scientific 사의 Invitrogen GeneArt Gene Synthesis 서비스를 통해 폴리뉴클레오티드 합성하여 pcDNA3_4 벡터에 적재하였다. 또한, 상기 벡터를 CHO 세포(Expi-CHOTM)에 도입하여 서열번호 21의 융합단백질을 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃, 125 RPM, CO2 8%의 농도인 환경에서 7일 배양 후 배양액을 수거하여 융합단백질을 정제하였다. 상기 정제한 융합 단백질을 "mGI101C1"으로 명명하였다.
상기 정제 및 융합단백질 수거는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. 분리 정제된 융합단백질은 reduced(R) 또는 non-reduced(NR) 조건하에서 SDS-PAGE를 실행하고, 코마시블루로 염색하여 그 순도를 확인하였다(도 12). NanoDrop을 사용하여 흡광도 280 nm로 검출시 2.49 ㎎/㎖의 농도로 융합단백질이 포함된 것을 확인하였다.
상기 제조예 1 내지 5에서 제작한 융합단백질들을 하기 표 1에 정리하여 나타내었다.
구분 N 말단 링커 C 말단
제조예 1(GI101) hCD80 단편 Fc 도메인 hIL-2m
제조예 2(mGI101) mCD80 단편 Fc 도메인 hIL-2m
제조예 3(GI101C1) CD80 단편 Fc 도메인 -
제조예 4(GI101C2) - Fc 도메인 IL-2m
제조예 5(mGI101C1) mCD80 단편 Fc 도메인 -
제조예 6. CD80-Fc-IL-2의 제조: GI101w
인간 CD80 단편, Fc 도메인 및 인간 IL-2를 포함하는 융합단백질을 생산하기 위하여, 시그널 펩타이드(서열번호 1), CD80 단편(서열번호 2), Ig 힌지(서열번호 3), Fc 도메인(서열번호 4), 링커(서열번호 5) 및 성숙된 인간 IL-2(서열번호 10)를 포함하는 N-말단으로부터 이 순서대로 융합단백질을 코딩하는 염기서열(서열번호 31)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 ThermoFisher Scientific 사의 Invitrogen GeneArt Gene Synthesis 서비스를 통해 폴리뉴클레오티드 합성하여 pcDNA3_4 벡터에 적재하였다. 또한, 상기 벡터를 CHO 세포(Expi-CHOTM)에 도입하여 서열번호 32의 융합단백질을 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃, 125 RPM, CO2 8%의 농도인 환경에서 7일 배양 후 배양액을 수거하여 융합단백질을 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질을 "GI101w"로 명명하였다. 상기 정제 및 융합단백질 수거는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
제조예 7. hCD80-Fc-IL-2 변이체(3M)의 제조: GI102-M45
인간 CD80 단편, Fc 도메인 및 세개의 아미노산이 치환된 IL-2 변이체(3M)(R38A, F42A, Y45A)(GI102-M45)를 포함하는 융합단백질을 생산하기 위하여, 시그널 펩타이드(서열번호 1), CD80 단편(서열번호 2), Ig 힌지(서열번호 3), Fc 도메인(서열번호 4), 링커(서열번호 5) 및 IL-2 변이체(서열번호 22)를 N-말단으로부터 이 순서대로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 염기서열(서열번호 25)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 ThermoFisher Scientific 사의 Invitrogen GeneArt Gene Synthesis 서비스를 통해 폴리뉴클레오티드 합성하여 pcDNA3_4 벡터에 적재하였다. 또한, 상기 벡터를 CHO 세포(Expi-CHOTM)에 도입하여 서열번호 26의 융합단백질을 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃, 125 RPM, CO2 8%의 농도인 환경에서 7일 배양 후 배양액을 수거하여 융합단백질을 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질을 "GI102-M45"로 명명하였다.
상기 정제 및 융합단백질 수거는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. 분리 정제된 융합단백질은 reduced(R) 또는 non-reduced(NR) 조건하에서 SDS-PAGE를 실행하고, 코마시블루로 염색하여 그 순도를 확인하였다(도 13).
제조예 8. hCD80-Fc-IL-2 변이체(3M)의 제조: GI102-M61
인간 CD80 단편, Fc 도메인 및 세개의 아미노산이 치환된 IL-2 변이체(3M) (R38A, F42A, E61R)(GI101-M61)를 포함하는 융합단백질을 생산하기 위하여, 시그널 펩타이드(서열번호 1), CD80 단편(서열번호 2), Ig 힌지(서열번호 3), Fc 도메인(서열번호 4), 링커(서열번호 5) 및 IL-2 변이체(서열번호 23)를 포함하는 융합단백질을 코딩하는 염기서열(서열번호 27)을 N-말단으로부터 이 순서대로 포함하는 폴리뉴클레오티드를 ThermoFisher Scientific 사의 Invitrogen GeneArt Gene Synthesis 서비스를 통해 폴리뉴클레오티드 합성하여 pcDNA3_4 벡터에 적재하였다. 또한, 상기 벡터를 CHO 세포(Expi-CHOTM)에 도입하여 서열번호 28의 융합단백질을 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃, 125 RPM, CO2 8%의 농도인 환경에서 7일 배양 후 배양액을 수거하여 융합단백질을 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질을 "GI102-M61"로 명명하였다.
상기 정제 및 융합단백질 수거는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. 분리 정제된 융합단백질은 reduced(R) 또는 non-reduced(NR) 조건하에서 SDS-PAGE를 실행하고, 코마시블루로 염색하여 그 순도를 확인하였다(도 14).
제조예 9. hCD80-Fc-IL-3M의 제조: GI102-M72
인간 CD80 단편, Fc 도메인 및 세개의 아미노산이 치환된 IL-2 변이체(3M)(R38A, F42A, L72G)(GI102-M72)를 포함하는 융합단백질을 생산하기 위하여, 시그널 펩타이드(서열번호 1), CD80 단편(서열번호 2), Ig 힌지(서열번호 3), Fc 도메인(서열번호 4), 링커(서열번호 5) 및 IL-2 변이체(서열번호 24)를 포함하는 융합단백질을 코딩하는 염기서열(서열번호 29)을 N-말단으로부터 이 순서대로 포함하는 폴리뉴클레오티드를 ThermoFisher Scientific 사의 Invitrogen GeneArt Gene Synthesis 서비스를 통해 폴리뉴클레오티드 합성하여 pcDNA3_4 벡터에 적재하였다. 또한, 상기 벡터를 CHO 세포(Expi-CHOTM)에 도입하여 서열번호 30의 융합단백질을 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃, 125 RPM, CO2 8%의 농도인 환경에서 7일 배양 후 배양액을 수거하여 융합단백질을 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질을 "GI102-M72"로 명명하였다.
상기 정제 및 융합단백질 수거는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. 분리 정제된 융합단백질은 reduced(R) 또는 non-reduced(NR) 조건하에서 SDS-PAGE를 실행하고, 코마시블루로 염색하여 그 순도를 확인하였다(도 15).
제조예 10. mCD80-Fc-IL-3M의 제조: mGI102-M61
마우스 CD80 단편, Fc 도메인 및 세개의 아미노산이 치환된 IL-2 변이체(3M)(R38A, F42A, E61R)(GI102-M61)를 포함하는 융합단백질을 생산하기 위하여, 시그널 펩타이드(서열번호 1), mCD80 단편(서열번호 13), Ig 힌지(서열번호 3), Fc 도메인(서열번호 4), 링커(서열번호 5) 및 IL-2 변이체(서열번호 23)를 포함하는 융합단백질을 코딩하는 염기서열(서열번호 33)을 N-말단으로부터 이 순서대로 포함하는 폴리뉴클레오티드를 ThermoFisher Scientific 사의 Invitrogen GeneArt Gene Synthesis 서비스를 통해 폴리뉴클레오티드 합성하여 pcDNA3_4 벡터에 적재하였다. 또한, 상기 벡터를 CHO 세포(Expi-CHOTM)에 도입하여 서열번호 34의 융합단백질을 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃, 125 RPM, CO2 8%의 농도인 환경에서 7일 배양 후 배양액을 수거하여 융합단백질을 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질을 "mGI102-M61"로 명명하였다.
상기 정제 및 융합단백질 수거는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
II. 융합단백질과 리간드의 결합 친화성 확인
융합단백질과 리간드의 결합 친화성을 확인하기 위해, Octet RED 384를 이용하여 결합 친화성을 측정하였다.
실험예 1. hCTLA-4 및 GI101 간의 결합 친화성 확인
AR2G biosensor(Amine Reactive 2nd gen, ForteBio, Cat: 18-5092)를 Microplate-96-well(GreinerBio-one, Cat:655209)에 증류수를 200 ㎕씩 담고 미리 수화시켰다. AR2G biosensor에 붙일 리간드(CTLA-4, Human CTLA-4/CD152, His tag, Sino Biological, Cat: 11159-H08H)를 10 mM 농도의 아세테이트 버퍼(pH 5, AR2G reagent Kit, ForteBio, Cat: 18-5095)에 5 ㎍/㎖ 농도가 되도록 희석하였다. 또한, 리간드에 붙을 GI101을 1,000 nM, 500 nM, 250 nM, 125 nM 또는 62.5 nM 농도가 되도록 1X AR2G kinetic buffer(AR2G reagent Kit, ForteBio, Cat: 18-5095)에 희석시켰다. Activation buffer는 증류수에 20 mM 농도의 EDC 및 10 mM 농도의 s-NHS(AR2G reagent Kit, ForteBio, Cat: 18-5095)를 혼합하여 제작하였다. Microplate-384-well(GreinerBio-one, Cat: 781209)에 각 시약을 80 ㎕씩 넣고 프로그램을 세팅하였다.
그 결과, hCTLA-4와 GI101 간의 결합 친화성이 도 16에 나타난 바와 같이 측정되었다.
실험예 2. hPD-L1/GI101 및 hPD-L1/PD-1 간의 결합 친화성 확인
Ni-NTA(Nickel charged Tris-NTA, Ni-NTA Biosensors, ForteBio, 18-5101)를 microplate-96-well에 1X Ni-NTA kinetic buffer(10X Kinetics buffer, ForteBio, 18-1042)를 200 ㎕씩 담고 미리 수화시켰다. Ni-NTA Biosensors에 붙일 리간드(Human PD-L1/B7-H1 protein, His-tag, Sino biological, Cat: 10084-H08H)를 1X Ni-NTA kinetic buffer에 5 ㎍/㎖ 농도가 되도록 희석하였다. 리간드에 붙을 GI101을 1,000 nM, 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62.5 nM로 1X Ni-NTA kinetic buffer에 희석하였다. 또한, 리간드에 붙을 인간 PD-1/PDCD1(Human PD-1/PDCD1, Fc Tag, Sino Biological, Cat: 10377-H02H)을 2,000 nM, 1,000 nM, 500 nM, 250 nM 또는 125 nM 농도가 되도록 1X Ni-NTA kinetic buffer에 희석시켰다. 그 후, microplate-384-well에 각 시약을 80 ㎕씩 넣고 프로그램을 세팅하였다.
그 결과, hPD-L1과 GI101 간의 결합 친화성은 도 17에 나타난 바와 같이 측정되었다. 또한, hPD-L1과 hPD-1 간의 결합 친화성은 도 18에 나타난 바와 같이 측정되었다.
실험예 3. mCTLA-4 및 mGI101 간의 결합 친화성 확인
실험예 1과 동일한 방법으로 mCTLA-4 및 mGI101 간의 결합 친화성을 확인하였다. 이때, 사용한 장비는 다음과 같다: Biosensor: AR2G, Ligand: mCTLA-4(Recombinant Mouse CTLA-4 Fc chimera, R&D systems, Cat: 434-CT-200), Analyte: mGI101(500 nM, 250 nM, 125 nM, 62.5 nM, 31.3nM).
그 결과, mCTLA-4 및 mGI101 간의 결합 친화성은 도 19에 나타난 바와 같이 측정되었다.
실험예 4. mPD-L1 및 mGI101 간의 결합 친화성 확인
실험예 1과 동일한 방법으로 mPD-L1 및 mGI101 간의 결합 친화성을 확인하였다. 이때, 사용한 장비는 다음과 같다. Biosensor: AR2G, Ligand: mPD-L1(Recombinant Mouse B7-H1/PD-L1 Fc chimera, R&D systems, Cat: 434-CT-200), Analyte: mGI101(500 nM, 250 nM, 125 nM, 62.5 nM, 31.3 nM).
그 결과, mPD-L1 및 mGI101 간의 결합 친화성은 도 20에 나타난 바와 같이 측정되었다.
실험예 5. GI-101(hCD80-Fc-hIL-2v)의 CTLA-4 및 PD-L1에 대한 결합력 확인
결합 동역학 측정은 30℃ 및 1,000 rpm의 교반을 통한 Octet RED 384 기기(ForteBio, Pall Life Science)를 이용하여 수행하였다. CTLA-4에 대한 결합력 측정은 Amine Reactive 2 generation(AR2G) 바이오센서칩을 사용하여 측정하고, PD-L1에 대한 결합력 측정은 Nickel charged Tris-NTA(Ni-NTA) 바이오센서칩을 사용하여 측정하였다. Human CTLA-4-His Tag(Sino Biological, Cat: 11159-H08H)은 AR2G 바이오센서칩을 400 mM EDC와 100 mM sulfo-NHS의 조합으로 활성시킨 후, 10 mM 아세테이트 완충액(pH5)으로 5 ㎍/㎖㎍/㎖로 희석하여 AR2G 바이오 센서에 300초간 로딩해서 고정시켰다.
그런 다음, 다양한 농도의 GI-101(hCD80-Fc-hIL-2v), GI-101C1(hCD80-Fc), Ipilimumab(Bristol-Myers Squibb) 및 GI-101C2(Fc-hIL-2v)와의 결합을 300초 동안 측정하고 해리 역시도 300초 동안 측정하였다. 반면, Human PD-L1-His tag(Sino biological, Cat: 10084-H08H)은 1XNi-NTA kinetic buffer에 5 ㎍/㎖ 농도로 희석하여 Ni-NTA 바이오센서칩에 600초간 로딩해서 고정시켰다. 그 후, 다양한 농도의 GI-101, GI-101C1, hPD-1-Fc(Sino biological, Cat: 10377-H02H) 및 GI101C2와의 결합을 300초 동안 측정하고 해리 역시도 300초 동안 측정하였다. 결합 동역학 분석은 Pall사에서 제공하는 Octet Data analysis HT software ver 10을 사용하여 하였다. 그 결과는 도 21 및 도 22에 나타내었다.
실험예 6. GI-101(hCD80-Fc-hIL-2v)이 PD-1/PD-L1 결합에 미치는 영향 확인
블로킹 실험은 30℃ 및 1,000 rpm의 교반을 통한 Octet RED 384 기기(ForteBio, Pall Life Science)를 이용하여 수행하였다. Human PD-L1-His tag(Sino biological, Cat: 10084-H08H)은 1XNi-NTA kinetic buffer에 5㎍/㎖ 농도로 희석하여 Ni-NTA 바이오센서칩에 600초 동안 로딩함으로써 고정시켰다. 블로킹 실험을 진행하기 위하여 바이오센서칩에 고정된 hPD-L1과 다양한 농도(300 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12.5 nM 및 0nM)의 GI-101을 600초간 결합시킨 후 경쟁물질인 human PD-1(100 nM)을 600초간 다시 결합시킴으로써 hPD-1이 얼마나 더 결합할 수 있는지 측정하였다. 반대로, 다양한 농도(300 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12.5 nM 및 0 nM)의 hPD-1을 600초간 결합시킨 후, 경쟁물질인 GI-101(100 nM)을 600초간 다시 결합시킴으로써 GI-101이 얼마나 더 결합할 수 있는지도 측정하였다. 블로킹 실험의 분석은 Pall사에서 제공하는 Octet Data analysis HT software ver 10의 epitope binning 메뉴를 이용하여 하였다. 그 결과는 도 23에 나타내었다.
실험예 7. IL-2Rα 또는 IL-2Rβ와 GI101 간의 결합 친화성 확인
IL-2Rα에 대한 결합력 측정은 AR2G biosensor를 사용하여 측정하였고, IL-2Rβ에 대한 결합력 측정은 Ni-NTA biosensors(Nickel charged Tris-NTA, Ni-NTA Biosensors, ForteBio, 18-5101)을 사용하여 측정하였다.
AR2G biosensor에 붙일 리간드(IL-2Rα-His Tag, Acro, Cat: ILA-H52H9)를 를 10 mM 농도의 아세테이트 버퍼(pH 5, AR2G reagent Kit, ForteBio, Cat: 18-5095)에 5 ㎍/㎖ 농도가 되도록 희석하였다. AR2G biosensor를 400 mM 농도의 EDC와 100 mM 농도의 sulfo-NHS를 혼합시켜 제조한 버퍼로 활성화시킨 후, 희석시켜둔 리간드를 AR2G biosensor에 300초 동안 로딩해서 고정시켰다.
한편, Ni-NTA biosensor에 붙일 리간드(IL-2Rβ-His Tag, Acro, Cat: CD2-H5221)를 1X Ni-NTA kinetic buffer에 5 ㎍/㎖ 농도가 되도록 희석하였다. 희석시킨 리간드를 Ni-NTA biosensor에 600초 동안 로딩해서 고정시켰다.
그 후, 리간드에 붙을 다양한 농도의 GI101, GI101w 또는 Proleukin(Novartis, hIL-2)를 300초 동안 로딩한 후, 결합을 측정하고, 해리도 300초 동안 측정하였다. 결합 동역학 분석은 Pall사에서 제공하는 Octet Data analysis HT software ver. 10을 사용하여 하였다. 그 결과를 도 24 내지 도 26에 나타내었다.
그 결과, GI101이 GI101w 및 Proleukin에 비해 IL-2 수용체의 IL-2Rα에 대한 결합력은 낮고, IL-2Rβ에 대한 결합력이 높은 것을 확인하였다.
실험예 8. 융합단백질과 리간드의 결합 친화성 측정
융합단백질과 리간드의 결합 친화성을 확인하기 위해, Octet RED 384를 이용하여 결합 친화성을 측정하였다.
실험예 8.1. IL2 alpha receptor와 GI101-M45, GI101-M61 및 GI101-M72의 결합 친화성 확인
AR2G biosensor(Amine Reactive 2nd gen, ForteBio, Cat: 18-5092)를 microplate 96well(GreinerBio-one, Cat:655209)에 증류수(DW)를 200 ul씩 담고 미리 수화시켰다. Biosensor에 붙일 리간드(Ligand)(Human IL-2 R alpha protein, His Tag, Acro, ILA-H52H9)를 10 mM 아세테이트 pH 5 버퍼(AR2G reagent Kit, ForteBio, Cat: 18-5095)에 5 ㎍/㎖의 농도로 희석하였다. 리간드에 붙을 Analyte(GI101-M45, GI101-M61, GI101-M72)를 각각 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62.5 nM로 1X AR2G kinetic buffer(AR2G reagent Kit, ForteBio, Cat: 18-5095)에 희석하였다. Activation buffer는 DW에 20 mM EDC, 10 mM s-NHS(AR2G reagent Kit, ForteBio, Cat: 18-5095)의 농도로 제작하였다. Microplate 384 well(GreinerBio-one, Cat:781209)에 각 시약을 80 ul씩 넣고 프로그램을 세팅하였다.
그 결과, IL-2 alpha receptor와 GI101-M45간의 결합 친화성은 도 27에 나타낸 바와 같다. 또한, IL-2 alpha receptor와 GI101-M61간의 결합 친화성은 도 28에, IL-2 alpha receptor와 GI101-M72 간의 결합 친화성은 도 29에 나타낸 바와 같다.
실험예 8.2. IL-2Rβ에 대한 GI102-M45, GI102-M61 및 GI102-M72의 결합 친화성 확인
Ni-NTA Biosensors를 microplate-96-well에 1X Ni-NTA kinetic buffer(10X Kinetics buffer, ForteBio, 18-1042)를 200 ㎕씩 담고 미리 수화시켰다. Biosensor에 붙일 리간드(Human IL-2 R beta protein, His-Tag, Acro, CD2-H5221)를 1X Ni-NTA kinetic buffer에 2 ㎍/㎖ 농도가 되도록 희석하였다. 리간드에 붙을 GI102-M45, GI102-M61 또는 GI102-M72를 500 nM, 250 nM, 125 nM 또는 62.5 nM 농도가 되도록 1X Ni-NTA kinetic buffer에 희석시켰다. Microplate-384-well에 각 시약을 80 ㎕씩 넣고 프로그램을 세팅하였다.
그 결과, IL-2Rβ와 GI102-M45 간의 결합 친화성은 도 30에 나타난 바와 같이 측정되었으며, IL-2Rβ와 GI102-M61 간의 결합 친화성은 도 31에 나타난 바와 같이 측정되었다. 또한, IL-2Rβ와 GI102-M72 간의 결합 친화성은 도 32에 나타난 바와 같이 측정되었다.
III. 융합단백질의 면역 활성 확인
실험예 9. 융합단백질에 의한 IFN-γ 생산량 확인
실험예 9.1. CFSE-labeled PBMC의 배양
인간에게서 분리한 PBMC(Peripheral blood mononuclear cells)를 1 μM 농도의 CellTrace CFSE 염료와 37℃에서 20분간 반응을 시켜 CFSE(carboxylfluorescein succinimidyl ester)로 라벨링 시켰다. 세포에 결합하지 않은 CFSE는 염색 반응 용액의 5배 되는 배양 배지와 5분간 반응시킨 후, 1,300 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 제거하였다. CFSE가 라벨링된 PBMC는 배양 배지(RPMI1640 media containing 10% FBS, 10 mM HEPES, 100 U/㎖ penicillin/streptomycin, 1 mM sodium pyruvate, 55 μM 2-mercaptoethanol, 1 mM Non-essential amino acid 및 2 mM L-glutamine)에 재현탁 시킨 후, 96-웰-플레이트에 각 웰 당 1x105 세포수 만큼 넣고, 5 ㎍/㎖의 PHA(Lactin from Phaseolus Vulgaris, red kidney bean, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, cat No. L1668-5MG)와 GI101, GI101C1, GI101C2 또는 IL-2(Aldesleukin; human recombinant IL-2, Novartis)를 처리하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 6일 동안 배양하였다.
이때, GI101, GI101C1, GI101C2 및 IL-2는 1 nM, 10 nM 또는 100 nM 농도로 처리하였다. 세포는 FACS로 분석하였고, ELISA kit(Biolegend, San Diego, CA, USA, cat No.430103)를 이용하여 배양배지에 존재하는 인간 IFN-γ를 측정하였다.
실험예 9.2. FACS 분석
상층액이 제거된 세포 펠릿을 FACS 버퍼(3% FBS, 10 mM EDTA, 1M HEPES, 100 unit/mL Penicillin Streptomycin, 10 ㎍/㎖, 1 mM sodium pyruvate)로 씻어준 뒤, Fc blocker(Biolegend, cat NO. 422302)와 4℃에서 5 분간 반응시켰다. 그 후, APC anti-CD3 Ab(Biolegend, cat NO. 300412)와 PE anti-CD8a Ab(Biolegend, cat NO. 300908)를 처리하고 4℃에서 20 분간 반응시킨 후 FACS buffer로 세척하였다. 세포 펠릿은 FACS 버퍼에 재현탁 시킨 후, BD LSR Fortessa(BD biosciences, San Diego, CA, USA)와 FlowJo Software을 사용하여 분석하였다.
실험예 9.3. Human IFN-γ ELISA
세포를 배양했던 각 샘플들의 상층액에 분비된 인간 IFN-γ의 양은 인간 IFN-γ ELISA kit(Biolegend, cat No.430103)를 사용하여 측정하였다. 간단히 설명하면, 항-인간-IFN-γ 항체를 ELISA 플레이트에 넣고, 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켜 코팅시켰다. 그 후, 1% BSA가 첨가된 PBS 용액으로 상온에서 1시간 동안 블로킹시켰다. 워싱버퍼(0.05% Tween-20 in PBS)로 세척한 후, 표준 용액 및 각각의 샘플들을 적절히 희석하여 넣은 후 실온에서 2시간 반응시켰다.
반응이 끝난 후, 플레이트를 세척하여 2차 항체(detection antibody)를 넣고 상온에서 1시간 반응시켰다. 워싱버퍼로 세척한 후, Avidin-HRP 용액을 넣고 실온에서 30분간 반응시키고, 기질용액을 넣어 상온인 어두운 곳에서 20분간 발색반응을 유도시켰다. 마지막으로 H2SO4을 넣어 발색반응을 중지시켜 Epoch Microplate Spectrophotometer(BioTek instruments, Winooski, VT, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 농도계산을 하였다.
그 결과, GI101로 처리한 세포가 GI101C1, GI101C2 또는 IL-2를 처리한 세포보다 IFN-γ 분비량이 현저하게 증가한 것을 확인하였다(도 33 및 도 34).
실험예 10. GI101이 CD8+ T 세포의 증식에 미치는 영향 확인
인간에서 분리한 PBMC(Peripheral blood mononuclear cells)를 1 uM 농도의 CellTrace CFSE 염료와 37℃에서 20 분간 반응을 시켜 CFSE로 라벨링시켰다. 세포에 결합하지 않은 CFSE는 염색반응 용액의 5배되는 배양 배지와 5 분간 반응시킨 후, 1,300 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 제거하였다. CFSE가 라벨링된 PBMC는 배양배지(RPMI1640 media containing 10% FBS, 10 mM HEPES, 100 U/㎖ penicillin/streptomycin, 1 mM sodium pyruvate, 55 μM 2-mercaptoethanol, 1 mM Non-essential amino acid & 2 mM L-glutamine)에 재현탁 시킨 후, 96-웰-플레이트에 각 웰 당 1x105 세포수 만큼 넣었다.
그 후, 1 ㎍/㎖의 항-CD3ε 항체(Biolegend cat No. L1668-5MG) 및 GI101, GI101C1, GI101C2 또는 Proleukin(Novartis)을 처리하여, 37℃, 5% CO2 배양기에서 6일동안 배양하였다. 이때, GI101, GI101C1, GI101C2 및 IL-2는 100 nM 농도로 세포에 처리하였다. 배양된 세포들은 APC-TCRαβ 항체와 PE-CD8α 항체를 사용한 FACS 분석방법으로 CD8+ T 세포들 중 CFSE로 라벨링 되지 않은 세포들의 비율 정도를 측정함으로써 이 세포들의 증식 정도를 조사하였다.
그 결과, GI101이 in vitro에서 야생형 IL-2인 Proleukin에 유사한 정도의 CD8+ T 세포의 증식을 활성화시키는 것을 확인하였다(도 35 및 도 36).
실험예 11. GI101 및 GI102가 CD8+ T 세포의 증식에 미치는 영향 확인
인간 PBMC를 Allcells(Lot#3014928, USA)에서 구입하였다. 1 M 농도의 CellTrace CFSE 염료를 이용하였으며, 이를 인간 PBMC와 상온에서 20분간 빛을 차단한 조건에서 반응시켰다. 1 uM 농도의 CellTrace CFSE 염료와 37℃에서 20 분간 반응을 시켜 CFSE로 라벨링시켰다. 세포에 결합하지 않은 CFSE는 염색반응 용액의 5배되는 배양 배지와 5 분간 반응시킨 후, 1,300 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 제거하였다. CFSE가 라벨링된 PBMC는 배양배지(RPMI1640 media containing 10% FBS, 10 mM HEPES, 100 U/ml penicillin/streptomycin, 1 mM sodium pyruvate, 55 uM 2-mercaptoethanol, 1 mM Non-essential amino acid 및 2 mM L-glutamine)에 재현탁 시킨 후, 96-웰-플레이트에 각 웰 당 1x105 세포수 만큼 넣었다.
그 후, 1 ㎍/㎖의 항-CD3ε 항체(OKT3, eBioscience, USA) 및 GI101, GI101C1, GI101C2 또는 Proleukin(Novartis)을 CFSE가 라벨링된 PBMC에 처리하여, 37℃, 5% CO2 배양기에서 7일 동안 배양하였다. 이때, GI101, GI101C1, GI101C2 및 IL-2는 10 μM 농도로 세포에 처리하였다.
배양된 세포들은 항-인간 CD4-PE 항체(BioLegend, U.S.A.), 항-인간 CD8-PE/Cy7 항체(BioLegend, USA), 항-인간 FoxP3-APC 항체(BioLegend, U.S.A.)를 사용하여 FACS 분석방법으로 CD8+ T 세포들 중 CFSE로 라벨링 되지 않은 세포들의 비율 정도를 측정함으로써 이 세포들의 증식 정도를 조사하였다.
그 결과, GI101, GI102_M61, GI101C2, Proleukin 처리한 군은 대조군(No stimulus), 항-CD3 항체 단독, GI101C1 처리군에 비해 CD8+ T 세포의 비율을 유의미하게 증가하였다. 또한, 음성대조군(No stimulation)과 항-CD3 항체 단독 처리에 비해 GI101, GI101C2, Proleukin은 CD4+/FoxP3+ Treg 세포의 증식을 유의미하게 증가시키나, GI102와 GI101C1은 CD4+/FoxP3+ Treg 세포의 증식을 유의미하게 증가시키지 않았다(도 37).
실험예 12. GI101 또는 GI101w가 CD8+ T 세포 및 NK 세포의 증식에 미치는 영향 확인
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 구입한 7주령 C57BL/6 마우스를 3 마리씩 3 그룹으로 나누어 PBS, GI101 또는 GI101w를 복강 내로 주사를 하였다. 이 때, GI101와 GI101w는 각각 PBS 200 ㎕에 40.5 ㎍이 되도록 제조하여 복강 내로 주사를 하였다. 주사 5일 후, 각 그룹의 마우스에서 비장을 적출하여 세포를 분리하여 혈구 계수기(hematocytometer)를 사용하여 총 세포의 수를 측정하였다. 비장세포는 APC-CD3ε 항체(Biolegend; 145-2C11), PE-NK1.1 항체(Biolegend; PK136) 및 Pacific blue-CD8α 항체(BD; 53-6.7)로 염색한 FACS 분석방법으로 비장세포 중 CD8+ T 세포와 NK 세포의 비율을 조사하였다. 그래서, 비장에 존재하는 CD8+ T 세포와 NK 세포의 수를 계산하였다.
그 결과, GI101이 GI101w보다 생체 내에서 CD8+ T 세포와 NK 세포를 증식을 활성화 시키는 것을 확인하였다(도 38 및 도 39).
실험예 13. GI101이 T 세포의 기능에 미치는 영향 확인
CTLA-4 blockade bioassay kit(Promega cat No. JA4005)를 사용하여 실험을 진행하였으며, 실험을 간단히 설명하면 아래와 같다. 액체질소에서 보관 중인 CTLA-4 Effector 세포를 37℃ 항온수조에서 3분 동안 녹여, 0.8 ㎖의 CTLA-4 Effector 세포를 예열된 3.2 ㎖ assay buffer(90% RPMI+10% FBS)와 잘 섞어준 후, 96-well white cell culture plate(SPL, cat No. 30196)의 각 웰 당 25 ㎕씩 넣었다. 그리고, 다양한 농도의 GI101을 25 ㎕ 넣었다. 음성 대조군의 경우는 assay buffer를 25 ㎕ 넣었다. 그리고, aAPC/Raji cell을 준비하기 전까지 White plat cell culture plate를 커버를 씌운 뒤 상온에 두었다.
액체질소에서 보관 중인 aAPC/Raji 세포를 37℃ 항온수조에서 3분 동안 녹여 0.8 ㎖의 aAPC/Raji 세포를 예열된 3.2 ㎖ assay buffer와 잘 섞어준 다음 플레이트에 각 웰 당 25 ㎕씩 넣고, 37℃, 5% CO2 배양기에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 상온에서 15분 동안 놔둔 다음 거품이 생기지 않게 주의하여 Bio-Glo reagent를 넣었다. 가장 자리 바깥 웰 중 3 군데에도 Bio-Glo reagent를 넣어 블랭크로 사용하여 백그라운드 신호(background signal)를 보정하였다. 10분간 상온에서 반응시킨 후, Cytation 3(BioTek instruments, Winooski, VT, USA)로 luminescence를 측정하였다. 최종적인 데이터 분석은 RLU(GI101-background)/ RLU(No treatment-background)로 계산하였다.
그 결과, GI101은 effector T 세포에 발현하는 CTLA-4와 결합하여 T 세포의 기능을 억제시키지 않고 오히려 활성화시키는 것을 확인하였다(도 40 및 도 41).
실험예 14. mGI101 및 mGI102가 면역세포에 미치는 영향 확인
오리엔트(한국)에서 구입한 7주령 C57BL/6 마우스를 3 마리씩 3 그룹으로 나누어 PBS, 3 ㎎/㎏, 6 ㎎/㎏, 12 ㎎/㎏의 GI101 또는 3 ㎎/㎏, 6 ㎎/㎏, 12 ㎎/㎏의 mGI102(mGI102-M61)를 정맥 내로 투여하였다. 주사 1일, 3일, 5일, 7일 및 14일째에 각 그룹의 마우스에서 비장조직을 적출하였다. 그 후, 비장조직을 각각의 항체를 이용하여 FACS 분석방법으로 effector CD8+ T 세포, NK 세포, Treg 세포의 수를 계산하고, Treg 세포에 대한 effector CD8+ T 세포와 NK 세포의 비율을 각각 계산하였다. 각각의 세포분석에 사용한 항체의 정보는 아래와 같다:
Effector CD8+ T cell: PB anti-mouse CD3ε antibody (Biolegend, # 155612; KT3.1.1), FITC anti-mouse CD8α antibody (BD, # 553031, 53-6.7), PE/Cy7 anti-mouse CD44 antibody (Biolegend, # 103030; IM7), APC anti-mouse CD122 antibody (Biolegend, # 123214; TM-β1)
NK cell: PB anti-mouse CD3ε antibody (Biolegend, # 155612; KT3.1.1), PE anti-mouse NK-1.1 (Biolegend, # 108708; PK136)
Treg cell: FITC anti-mouse CD3 antibody (Biolegend, # 100204; 17A2), PB anti-mouse CD4 antibody (Biolegend, # 100531; RM4-5), PE anti-mouse CD25 antibody (Biolegend, # 102008; PC61), APC anti-mouse Foxp3 antibody (Invitrogen, # FJK-16s, 17-5773-82).
그 결과, mGI101 또는 mGI102(mGI102-M61)를 투여한 군에서 CD8+ T 세포와 NK세포가 투여 3일 후부터 14일까지의 시점에서 PBS 투여군과 비교하여 유의하게 증가되었다. 또한, mGI102를 투여한 군에서 활성화된 CD8+ T 세포/Treg 세포 및 NK 세포/Treg 세포의 비율이 투여 3일 후부터 7일까지의 시점에서 PBS 투여군과 비교하여 유의하게 증가되었음을 확인하였다(도 42).
IV. 융합단백질의 항암효과 확인
실험예 15. GI101이 PD-L1이 과발현된 암세포에 미치는 영향 확인
PD-L1이 과발현된 NCl-H292 암세포주를 10 ㎍/㎖ Mitomycin C(Sigma)를 포함하는 배양배지에서 3시간 동안 배양한 후, Mitomycin C를 배양배지로 세척하여 제거하였다. 그 후, 5x104 세포수의 Mitomycin C를 처리한 NCl-H292 암세포주를 1x105 세포수의 인간 PBMC와 96-웰-플레이트에 배양하였다. 이때, T 세포의 활성을 위해 5 ㎍/㎖의 PHA(Sigma)를 처리하였다. 또한, 50 nM 농도의 GI101C1와 GI101를 50 nM 농도의 IgG1-Fc(Biolegend) 또는 abatacept(=Orencia; Bristol-Myers Squibb)에 4℃에서 30분 동안 반응시킨 후, NCl-H292 암세포에 처리하였다. 3일 후에 세포 배양액의 상층액을 회수하여 ELISA kit(Biolegend)을 사용하여 IFN-γ의 양을 정량하였다.
양성대조군으로는 Mitomycin C를 처리한 NCl-H292 암세포주가 없는 상태에서 PHA로 자극시킨 인간 PBMC을 사용하였고, 음성대조군으로는 Mitomycin C 처리한 NCl-H292 암세포주가 존재하는 상태에서 PHA로 자극시킨 인간 PBMC을 사용하였다. IFN-γELISA kit를 이용한 실험 방법은 실험예 9.3과 동일한 방법으로 진행하였다.
그 결과, GI101은 PD-L1이 과발현된 암세포주에 의해 억제된 면역반응을 효과적으로 활성화 시켰다. 또한, GI101은 effector T 세포에 발현하는 CTLA-4의 신호전달을 억제 시키는 것을 확인하였다(도 43 및 도 44).
실험예 16. 마우스 유래 대장암세포 식립 마우스에서의 GI101의 항암효과 확인
5x106 세포수/0.05 ㎖의 마우스 유래 CT-26 암세포주를 0.05 ㎖ Matrigel matrix phenol red-free(BD)와 혼합하여 6주령의 암컷 BALB/c 마우스(오리엔트)의 우측 등 부위의 피하에 0.1 ㎖씩 투여하여 이식하였다. 암세포를 이식하고 일정기간 경과 후에 종양의 부피를 측정하여 약 80 mm3 내지 120 mm3에 도달한 개체들을 분리한 후, 0.1 ㎖의 GI101를 정맥투여 하였다. 첫 투여 이후 3일에 한 번씩 총 3번 투여를 진행하고, 음성대조군으로는 PBS를 투여하였다. 항암효과를 확인하기 위해 매일 종양의 크기를 측정하였다.
그 결과, GI101을 처리한 CT-26 암세포주 식립 마우스의 종양의 크기가 음성대조군에 비해 현저하게 감소한 것을 확인하였다(도 45 및 도 46).
실험예 17. 마우스 유래 흑색종 식립 마우스에서의 mGI101의 항암효과 확인
오리엔트 바이오에서 분양 받은 C57BL/6 마우스(암컷, 7주)를 7일의 적응기간을 거친 후에 5x106 세포수의 B16F10 암세포주(ATCC, USA)를 0.05 ㎖ Matrigel matrix phenol red-free(BD)와 혼합하여 마우스의 우측 등 부위의 피하에 0.1 ㎖씩 투여하여 동종이식하였다. 암세포를 이식하고 일정기간 경과 후에 종양의 부피를 측정하여 약 50 mm3 내지 120 mm3에 도달한 개체들을 선별한 후, 선별한 마우스의 종양의 크기 및 체중을 기초로 하여 균등하도록 각 군당 10마리씩 분류하였다.
그 후, 일회용 주사기(31G, 1 ㎖)를 이용하여 음성대조군에는 4 ㎎/㎏ 용량으로 hIgG4를 투여하였으며, 양성대조군으로는 5 ㎎/㎏ 용량의 항-PD-1 항체를 정맥투여하였다. 실험군으로는 1 ㎎/㎏ 또는 4 ㎎/㎏ 용량의 mGI101를 정맥투여 하였다. 추가적으로, 4 ㎎/㎏ 용량의 mGI101 및 5 ㎎/㎏ 용량의 항-PD-1 항체를 정맥투여한 군도 실험군으로 설정하였다. 첫 투여 이후 3일에 한 번씩 총 3번 투여를 진행하였다. 매일 종양의 크기를 측정하였다.
그 결과, 모든 군은 초기 종양의 부피가 90 mm3이었으며, 각 군의 S.E.(standard error)는 5 mm3 내지 6 mm3이었다. 음성대조군은 투여 후 15일까지 종양부피의 변동이 90 mm3에서 1,434 mm3까지 실험기간 동안 증가함이 관찰되었다.
1 ㎎/㎏ 용량의 mGI101 투여군은 음성대조군과 동일한 기간 동안 90 mm3에서 885 mm3까지 실험기간 동안 증가함이 관찰되었으며, 일부 측정시점에서 통계학적으로 유의하게 억제되었음이 관찰되었다(p-value: 0.5: day 11, p-value<0.01: day 7, p-value<0.001: day 3). 4 ㎎/㎏ 용량의 mGI101 투여군은 음성대조군과 동일한 기간동안 90 mm3에서 748 mm3까지 실험기간 동안 증가함이 관찰되었으며, 일부 측정시점 및 실험종료일에 통계학적으로 유의하게 억제되었음이 관찰되었다(p-value: 0.5: day 9, p-value<0.01: day 7 및 11).
또한, 4 ㎎/㎏ 용량의 mIgG 투여군을 기준으로 하여 각 군과 비교하여 종양성장억제율을 분석하였다. 1 ㎎/㎏ 용량의 mGI101 투여군은 음성대조군과 비교하여, 36.5%의 성장억제율이 관찰되었으며, 통계학적인 유의한 차이(p-value: 0.5)는 확인되지 않았다. 4 ㎎/㎏ 용량의 mGI101 투여군은 음성대조군과 비교하여 통계학적으로 유의(p-value: 0.5)한 종양성장억제율이 관찰되었다. 첫 투여 이후 3일에 한 번씩 총 2번 투여를 진행하였다. 매일 종양의 크기를 측정하였다.
이를 통해, C57BL/6 마우스에 동종이식한 흑색종인 B16F10의 종양성장 억제 효능시험에서 mGI101이 용량 의존적으로 종양의 성장 억제하는 효과가 있는 것을 확인하였다(도 47 및 도 48).
실험예 18. 마우스 유래 대장암세포 식립 마우스에서의 mGI101의 항암효과 확인
오리엔트 바이오에서 분양 받은 BALB/c 마우스(암컷, 7주)를 7일의 적응기간을 거친 후에 5x106 세포수의 CT-26 암세포주(ATCC, USA)를 0.05 ㎖ Matrigel matrix phenol red-free(BD)와 혼합하여 마우스의 우측 등 부위의 피하에 0.1 ㎖씩 투여하여 동종이식하였다. 암세포를 이식하고 일정기간 경과 후에 종양의 부피를 측정하여 약 28 mm3에 도달한 개체들을 선별한 후, 선별한 마우스의 종양의 크기 및 체중을 기초로 하여 균등하도록 각 군당 10마리씩 분류하였다. 그 후, 일회용 주사기(31G, 1 ㎖)를 이용하여 음성대조군에는 6 ㎎/㎏ 용량으로 hIgG4를 투여하였다. 실험군으로는 3 ㎎/㎏, 6 ㎎/㎏ 또는 12 ㎎/㎏ 용량의 mGI101을 정맥투여 하였다. 첫 투여 이후 3일에 한 번씩 총 3번 투여를 진행하였다. 매일 종양의 크기를 측정하였다.
그 결과, 6 mg/kg 및 12 mg/kg 용량의 mGI101를 투여한 실험군에서 일부 측정시점 및 시험종료시점에서 음성대조군과 비교하여 유의하게 억제되었음을 확인하였다(도 49). 또한, 생존율을 측정한 결과, 6 mg/kg 용량의 mGI101를 투여한 실험군에서 일부 측정시점 및 시험종료시점에서 음성대조군과 비교하여 유의하게 개선되었음을 확인하였다(도 50).
실험예 19. 마우스 유래 대장암세포 식립 마우스에서의 GI101의 항암효과 확인
실험예 19.1. 종양 억제 효과 확인
오리엔트 바이오에서 분양 받은 BALB/c 마우스(암컷, 7주)를 7일의 적응기간을 거친 후에 5x106 세포수의 CT-26 암세포주(ATCC, USA)를 0.1 ㎖ PBS에 부유하여 마우스의 우측 등 부위의 피하에 투여하여 동종이식하였다. 암세포를 이식하고 일정기간 경과 후에 종양의 부피를 측정하여 약 50 mm3 내지 200 mm3에 도달한 개체들을 선별한 후, 선별한 마우스의 종양의 크기 및 체중을 기초로 하여 균등하도록 각 군당 10마리씩 분류하였다. 그 후, 일회용 주사기(31G, 1 ㎖)를 이용하여 음성대조군에는 약물을 투여하지 않았으며, 양성대조군으로는 5 ㎎/㎏ 용량의 항-PD-1 항체 또는 5 ㎎/㎏ 용량의 항-PD-1 항체와 5㎎/㎏ 용량의 항-CTLA-4 항체를 정맥투여하였다. 실험군으로는 0.1 ㎎/㎏ 또는 1 ㎎/㎏ 용량의 GI101를 정맥투여 하였다. 첫 투여 이후 3일에 한 번씩 총 3번 투여를 진행하였다. 매일 종양의 크기를 측정하였다.
그 결과, CT-26 암세포주 식립 마우스에서 음성대조군에 비해 항-PD-1 항체, 항-PD-1 항체와 항-CTLA-4 항체, 0.1 ㎎/㎏ 또는 1 ㎎/㎏ 용량의 GI101을 투여한 군 모두 유의미하게 종양의 성장을 억제했다. 특히, 항-PD-1 항체 처리군에 비해 0.1 ㎎/㎏ GI101를 투여한 실험군에서 유의미한 종양 억제 효과를 나타냈다(* p < 0.05)(도 51).
실험예 19.2. 암 조직 내 면역세포 분석
상기 실험예 19.1의 각 군의 마우스를 종양의 부피가 평균적으로 200 mm3에 도달하였을 때에 희생시켜, 암 조직을 채취하였다. 그 후, 암 조직 내 면역세포를 분석하기 위해 암조직을 단일 세포 수준으로 분리 후, 다음의 항체를 사용하여 암 조직 내 면역세포에 대한 FACS 분석을 수행하였다. 항체는 구체적으로, Anti-mouse-CD3 (Biolegend, Cat. No. 100320), Anti-mouse-CD4 (Biolegend, Cat. No. 100526), Anti-mouse-CD8 (Biolegend, Cat. No. 100750), Anti-mouse-FoxP3 (eBioscience, Cat. No. 12-5773-82), Anti-mouse-CD25 (Biolegend, Cat. No. 102049), Anti-mouse-CD44 (eBioscience, Cat. No. 61-0441-82), Anti-mouse-PD-1 (Biolegend, Cat. No. 135218), Anti-mouse-IFN-gamma (Biolegend, Cat. No. 505832), Anti-mouse-CD49b (Biolegend, Cat. No. 108906), Anti-mouse-H2 (Invitrogen, Cat. No. A15443), Anti-mouse-CD11c (Biolegend, Cat. No. 117343), Anti-mouse-CD80 (eBioscience, Cat. No. 47-4801-82), Anti-mouse-CD86 (Biolegend, Cat. No. 104729), Anti-mouse-F4/80 (eBioscience, Cat. No. 47-4801-82), 및 Anti-mouse-CD206 (eBioscience, Cat. No. 17-2061-80)을 사용하였다.
그 결과, 0.1 ㎎/㎏의 GI101을 투여한 실험군에서 5 ㎎/㎏ 용량의 항-PD-1 항체를 단독투여한 양성대조군에 비해 CD8+ T 세포가 유의미하게 증가했다(* p < 0.05, 도 52 및 도 53). 나아가, GI101을 투여한 실험군 모두에서 T 세포에서의 IFN-γ의 발현이 음성대조군에 비해 유의미하게 증가했다(* p < 0.05, 도 52 및 도 53). 또한, 0.1 ㎎/㎏의 GI101을 투여한 실험군에서 M1 대식세포가 음성대조군과 항-PD-1 항체를 단독투여한 양성대조군에 비해 증가했다(도 54 및 도 55). 또한, GI101을 투여한 실험군 모두에서 대식세포와 수지상세포의 CD86 발현이 증가했다(*p < 0.05, 도 54 내지 도 57).
실험예 20. 마우스 유래 폐암세포 식립 마우스에서의 GI101의 항암효과 확인
실험예 20.1. 종양 억제 효과 확인
오리엔트 바이오에서 분양 받은 C57BL/6 마우스(암컷, 7주)를 7일의 적응기간을 거친 후에 5x106 세포수의 LLC2 암세포주(ATCC, USA)를 0.1 ㎖ PBS에 부유하여 마우스의 우측 등 부위의 피하에 투여하여 동종이식하였다. 암세포를 이식하고 일정기간 경과 후에 종양의 부피를 측정하여 약 50 mm3 내지 200 mm3에 도달한 개체들을 선별한 후, 선별한 마우스의 종양의 크기 및 체중을 기초로 하여 균등하도록 각 군당 10마리씩 분류하였다. 그 후, 일회용 주사기(31G, 1 ㎖)를 이용하여 음성대조군에는 약물을 투여하지 않았으며, 양성대조군으로는 5 ㎎/㎏ 용량의 항-PD-1 항체 또는 5 ㎎/㎏ 용량의 항-PD-1 항체와 5 ㎎/㎏ 용량의 항-CTLA-4 항체를 정맥투여하였다. 실험군으로는 0.1 ㎎/㎏ 또는 1 ㎎/㎏ 용량의 GI101를 정맥투여 하였다. 첫 투여 이후 3일에 한 번씩 총 3번 투여를 진행하였다. 매일 종양의 크기를 측정하였다.
그 결과, 음성대조군에 비해 실험군 모두에서 유의미한 종양 억제 효과가 나타났다(*p <0.05)(도 58).
실험예 20.2. 암 조직 내 면역세포 분석
상기 실험예 20.1의 각 군의 마우스를 종양의 부피가 평균적으로 200 mm3에 도달하였을 때 희생시켜, 암 조직을 채취하였다. 그 후, 암 조직 내 면역세포를 분석하기 위해 실험예 19.2와 동일한 방법으로 FACS 분석을 수행하였다.
그 결과, 0.1 ㎎/㎏의 GI101을 투여한 실험군에서 항-PD-1 항체를 단독투여한 양성대조군에 비해 CD8+ T 세포가 유의미하게 증가했다(* p < 0.05, 도 59). 나아가, GI101을 투여한 실험군 모두에서 IFN-γ의 발현이 음성대조군에 비해 유의미하게 증가했다(* p < 0.05, 도 59). 또한, GI101을 투여한 실험군 모두에서 대식세포와 수지상세포의 CD86 발현이 증가했다(*p < 0.05, 도 59 내지 도 61).
실험예 21. 마우스 유래 대장암세포 식립 마우스에서의 mGI102-M61의 항암효과 확인
오리엔트 바이오에서 분양 받은 BALB/c 마우스(암컷, 7주)를 7일의 적응기간을 거친 후에 5x106 세포수의 CT-26 암세포주(ATCC, USA)를 0.05 ㎖ Matrigel matrix phenol red-free(BD)와 혼합하여 마우스의 우측 등 부위의 피하에 0.1 ㎖씩 투여하여 동종이식하였다. 암세포를 이식하고 일정기간 경과 후에 종양의 부피를 측정하여 약 28 mm3에 도달한 개체들을 선별한 후, 선별한 마우스의 종양의 크기 및 체중을 기초로 하여 균등하도록 각 군당 10마리씩 분류하였다. 그 후, 일회용 주사기(31G, 1 ㎖)를 이용하여 음성대조군에는 6 ㎎/㎏ 용량으로 hIgG4를 투여하였다. 실험군으로는 3 ㎎/㎏, 6 ㎎/㎏ 또는 12 ㎎/㎏ 용량의 mGI102-M61을 정맥투여 하였다. 첫 투여 이후 3일에 한 번씩 총 3번 투여를 진행하였다. 매일 종양의 크기를 측정하였다.
그 결과, 12 mg/kg 용량의 mGI102-M61을 투여한 실험군에서 일부 측정시점 및 시험종료시점에서 음성대조군과 비교하여 유의하게 억제되었음을 확인하였다(도 62). 또한, 생존율을 측정한 결과, 12 mg/kg 용량의 mGI102-M61을 투여한 실험군에서 일부 측정시점 및 시험종료시점에서 음성대조군과 비교하여 유의하게 개선되었음을 확인하였다(도 63).
실험예 22. 마우스 유래 대장암세포 식립 마우스에서의 mGI101의 항암효과 확인
오리엔트 바이오에서 분양 받은 BALB/c 마우스(암컷, 7주)를 7일의 적응기간을 거친 후에 5x106 세포수의 CT-26 암세포주(ATCC, USA)를 0.05 ㎖ Matrigel matrix phenol red-free(BD)와 혼합하여 마우스의 우측 등 부위의 피하에 0.1 ㎖씩 투여하여 동종이식하였다. 암세포를 이식하고 일정기간 경과 후에 종양의 부피를 측정하여 약 200 mm3 내지 250 mm3에 도달한 개체들을 선별한 후, 선별한 마우스의 종양의 크기 및 체중을 기초로 하여 균등하도록 각 군당 10마리씩 분류하였다.
그 후, 일회용 주사기(31G, 1 ㎖)를 이용하여 음성대조군에는 4 ㎎/㎏ 용량으로 hIgG4를 투여하였다. 실험군으로는 1 ㎎/㎏, 4 ㎎/㎏ 또는 6 ㎎/㎏ 용량의 mGI101를 정맥투여 하였다. 추가적으로, 4.9 mg/kg의 mCD80 또는 2.8 mg/kg의 Fc-IL-2v(GI101C2)를 투여한 군도 대조군으로 설정하였다. 뿐만 아니라, 4.9 mg/kg의 mCD80 및 2.8 mg/kg의 Fc-IL-2v(GI101C2)를 동시에 투여한 군도 대조군으로 설정하였다.
종양의 부피측정에서 6 mg/kg 용량의 mGI101 투여군에서 일부 측정시점 및 시험종료시점에서 음성대조군과 비교하여 유의하게 억제되었음을 확인하였다. mCD80 및 Fc-IL-2v(GI101C2)의 병용투여군과 비교하여 종양성장억제율이 병용투여군과 비교하여 우수한 것으로 나타났다(도 64 및 도 65).
결론적으로, BALB/c 마우스에 동종이식한 BALB/c 마우스 유래 대장암 세포주인 CT-26의 종양성장 억제 효능시험에서 시험물질인 mGI101은 본 시험 조건하에서 mCD80 및 IL-2v 단일제제에 대해 종양억제 효능이 입증되었고, mCD80과 IL-2v의 병용투여군 대비 우수한 항암효능을 확인되었다(도 64 및 도 65). 특히, 6 mg/kg 용량의 mGI101 투여군에서 음성대조군 및 mCD80 및 Fc-IL2v(GI101C2)의 병용투여군과 비교하여 종양의 크기가 유의하게 억제되었다.
V. 융합단백질의 독성 평가
실험예 23. 원숭이를 이용한 GI101의 독성 평가
실험예 23.1. 원숭이 사육 및 약물 투여
본 실험에는 2세 내지 3세 연령의 수컷 필리핀 원숭이(Cynomolgus monkey)로 9마리를 이용하였다. 일본의 "Act on Welfare and Management of Animals"와 Ina Research Inc.의 "Guidance for Animal Care and Use"에 따라 수행되었으며, Ina Research Inc.의 IACUC(the Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 실험 프로토콜에 대한 검토 후, AAALAC International(Accredited Unit No. 001107)에 승인되었다.
실험은 약물 투여 하루 전부터 약물 투여 후 15일까지 진행하였으며, 케이지 주변에서 각각의 원숭이를 관찰하고, 추가적으로 대변 상태도 확인하였다. 약물 투여 하루 전, 약물 투여 후 1일, 8일 및 15일째에 디지털 체중계(LDS-150H, Shimadzu Corporation)를 이용하여 체중을 측정하였다. 또한, 약물 투여 하루 전부터 원숭이를 희생시키기 전까지 음식의 잔량을 측정하였다.
이때, 약물은 GI101을 일회용 주사기(24G)를 충진하여 0.17 ㎖/초의 속도로 정맥경로로 1회씩 총 2회 투여하였다. 1 회/주 간격으로 2회에 걸쳐 5 mg/kg/day 또는 10 mg/kg/day 용량으로 GI101을 투여하였다. 대조군은 PBS(pH 7.4)를 동일하게 투여하였다.
실험예 23.2. 임상관찰, 체중 및 식사량 변화 확인
약물 투여 하루 전부터 약물 투여 후 1일, 8일 및 15일째까지 임상관찰 및 체중과 식사량 변화를 측정한 결과, GI101에 의해 유도되는 독성은 나타나지 않았다(도 66 내지 도 69).
실험예 23.3. 혈액분석
상기 실험예 23.1의 원숭이로부터 약물 투여 하루 전, 약물 투여 후 1일, 8일 및 15일째에 혈액을 채취하였으며, 이때, 혈액은 일회용 주사기(22G)로 대퇴정맥을 통해서 채취하였다. 채취한 혈액은 Automated Hematology System XN-2000(Sysmex Corporation)과 Automated Blood Coagulation Analyzer CA-510(Sysmex Corporation)을 이용하여 하기 표 2에 기재된 항목에 대하여 혈액분석을 진행하였다.
Parameter Abbr. Unit Method Equipment
Complete blood count
Red blood cell count RBC 106/μL DC sheath-flow detection XN-2000
Hemoglobin concentration HGB g/dL SLS-hemoglobin XN-2000
Hematocrit HCT % RBC pulse height detection XN-2000
Mean corpuscular volume MCV fL HCT / RBC(Х104/μL) Х 1000 XN-2000
Mean corpuscular hemoglobin MCH pg HGB / RBC(Х104/μL) Х 1000 XN-2000
Mean corpuscular hemoglobin concentration MCHC g/dL HGB / HCT Х 100 XN-2000
ReticulocytesRatioCount
RET %
RET #
%
109/L		 Flow cytometry XN-2000
Platelet count PLT 103/μL Flow cytometry XN-2000
White blood cell count WBC 103/μL Flow cytometry XN-2000
Differential white blood cells　a)RatioCount

Diff WBC %
Diff WBC #

%
103/μL		 Flow cytometry XN-2000
Coagulation tests
Prothrombin time PT s Light scattering detection CA-510
Activated partial thromboplastin time APTT s Light scattering detection CA-510
a) Neutrophils(NEUT), lymphocytes(LYMPH), monocytes(MONO), eosinophils(EO) and basophils(BASO)
그 결과, 15일차에 5 mg/kg/day 또는 10 mg/kg/day 용량의 GI101을 투여한 군에서 망상적혈구(reticulocytes), 백혈구, 림프구 수치가 증가되었다(도 70 내지 도 72).
실험예 23.4. 임상화학 분석
상기 실험예 23.1의 원숭이로부터 약물 투여 하루 전, 약물 투여 후 1일, 8일 및 15일째에 혈액을 채취하였으며, 이때, 실험예 23.3과 동일한 방법으로 채취하였다. 채취한 혈액은 Clinical Analyzer Model 7180(Hitachi High-Technologies Corporation)을 이용하여 하기 표 3에 기재된 항목에 대하여 임상화학적 분석을 진행하였다.
Parameter Abbr. Unit Method
Aspartate aminotransferase AST U/L JSCC traceable method
Alanine aminotransferase ALT U/L JSCC traceable method
Alkaline phosphatase ALP U/L JSCC traceable method
Lactate dehydrogenase LD U/L JSCC traceable method
Creatine kinase CK U/L JSCC traceable method
Glucose GLU mg/dL Enzymatic(Gluc-DH)
Total bilirubin BIL mg/dL Enzymatic(BOD)
Urea nitrogen UN mg/dL Enzymatic(urease-LEDH)
Creatinine CRE mg/dL Enzymatic
Total cholesterol CHO mg/dL Enzymatic(cholesterol oxidase)
Triglycerides TG mg/dL Enzymatic(GK-GPO with free glycerol elimination)
Phospholipids PL mg/dL Enzymatic(choline oxidase)
Inorganic phosphorus IP mg/dL Enzymatic(maltose phosphorylase)
Calcium CA mg/dL OCPC
Sodium NA mEq/L Ion-selective electrode
Potassium K mEq/L Ion-selective electrode
Chloride CL mEq/L Ion-selective electrode
Total protein TP g/dL Biuret
Albumin ALB g/dL BCG
Albumin-globulin ratio A/G - Calculated
JSCC: Japan Society of Clinical Chemistry
그 결과, 임상화학적 분석에 있어서, GI101에 의해 유도되는 독성은 나타나지 않았다(도 73 내지 도 79).
실험예 21.5. 사이토카인 분석
상기 실험예 23.1의 원숭이로부터 약물 투여 하루 전, 약물 투여 후 1일, 8일 및 15일째에 혈액을 채취하였으며, 이때, 실험예 23.3과 동일한 방법으로 채취하였다. 채취한 혈액은 Bio-Plex 200(Bio-Rad Laboratories, Inc.) 기기와 Non-Human Primate Cytokine Magnetic Bead Panel(EMD Millipore) 분석 키트를 사용하여 TNF-α, IFN-γ IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12를 분석하였다. 그 결과, 사이토카인 분석과 관련하여 GI101에 의해 유도되는 독성은 나타나지 않았다(도 80 및 도 81).
실험예 23.6. 면역세포 분석
상기 실험예 23.1의 원숭이로부터 약물 투여 하루 전, 약물 투여 후 1일, 8일 및 15일째에 혈액을 채취하였으며, 이때, 실험예 23.3과 동일한 방법으로 채취하였다. 채취한 혈액은 Flow cytometer(LSRFortessa X-20, Becton, Dickinson and Company)를 이용하여 아래의 항목들을 분석하였다:
1) Ki67 + CD4: CD45+/CD3+/CD4+/Ki67+
2) Ki67 + CD8: CD45+/CD3+/CD8+/Ki67+
3) Ki67 + Treg: CD45+/CD3+/FoxP3+/Ki67+
4) Ki67 + ICOS + Treg: CD45+/CD3+/FoxP3+/Ki67+/CD278+
5) ICOS + Treg: CD45+/CD3+/FoxP3+/CD278+
6) Ki67 + NK cell: CD45+/CD16 + 및 CD56+/Ki67+.
그 결과, 면역세포 분석에서 GI101를 투여한 군 모두에서 T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, regulatory T 세포, NK세포와 Ki67+ T 세포, Ki67+ CD4+ T 세포, Ki67+ CD8+ T 세포, Ki67+ regulatory T 세포, Ki67+ ICOS+ regulatory T 세포, Ki67+ NK 세포, ICOS+ regulatory T 세포가 15일차에 증가되었다.
구체적으로, 림프구 내에서 T 세포, CD4+ T 세포, regulatory T 세포의 비율이 증가하고, NK세포의 비율이 감소하는 한편, CD8+ T 세포의 비율은 변화하지 않았다. regulatory T 세포의 비율은 3일차에 증가하였고, 8일 및 15일차에는 감소하였으나, 대조군에 대비해서는 여전히 높았다.
또한, 각 면역세포에서 Ki67+인 면역세포의 비율은, Ki67+ T 세포, Ki67+ CD4+ T 세포, Ki67+ CD8+ T 세포, Ki67+ regulatory T 세포, Ki67+ ICOS+ regulatory T 세포, Ki67+ NK 세포, ICOS+ regulatory T 세포 비율이 증가하였다.
나아가, Ki67+ T 세포, Ki67+ CD8+ T 세포, Ki67+ NK 세포의 비율은 3일, 8일 및 15일차에 증가하였고, Ki67+ CD4+ T, Ki67+ regulatory T 세포는 3일 및 8일차에 증가하였으며, Ki67+ ICOS+ regulatory T 세포, ICOS+ regulatory T 세포는 8일차에만 증가하였다(도 82 내지 도 87).
실험예 23.7. 병리학적 분석
16일째에 실험예 23.1의 원숭이들을 희생시켜, 모든 장기와 조직을 10% 포르말린을 이용하여 고정하였다. 단, 고환은 FSA(Formalin-sucrose-acetic acid) 용액을 사용하였으며, 눈과 시신경은 1% Formaldehyde-2.5% glutaraldehyde in phosphate buffer를 사용하여 고정하였다. 하기 표 4에 기재된 항목의 장기와 조직에 대하여 헤마톡실린/에오신 염색을 수행하여 광학현미경 하에서 관찰하였다.
Organ/tissue Fixation Organ weight Specimen preparation
HE-stained Note
Heart O O - Left ventricular papillary muscle, right ventricular wall and areas including the coronary artery and aortic valve
Aorta(thoracic) O -
Sternum O - Decalcified
Sternal bone marrow -
Femurs O(R&L) - Distal articular cartilage and shaft; decalcified
Femoral bone marrow O(R) - Decalcified
Thymus O O O
Spleen O O O
Submandibular lymph nodes O - O
Mesenteric lymph nodes O - O
Trachea O - Decalcified
Bronchi O(R&L) O(R&L separated) - Left anterior and right posterior lobes
Lungs
Tongue O -
Submandibular glands O(R&L) O(R&L combined)
Parotid glands O(R&L) -
Esophagus O -
Stomach O - Cardia, body and pylorus
Duodenum O -
Jejunum O -
Ileum O -
Peyer's patches
Cecum O -
Colon O -
Rectum O -
Liver O O
(with bile-drained gallbladder)		 O Left lateral lobe and right medial lobe including the gallbladder
Gallbladder O
Pancreas O O -
Kidneys O(R&L) O(R&L separated) O(R&L)
Urinary bladder O -
Pituitary O O
Thyroids O(R&L) O(R&L separated)
Parathyroids
Adrenals O(R&L) O(R&L separated)
Testes O(R&L) O(R&L separated)
Epididymides O(R&L) O(R&L separated)
Prostate O O
Seminal vesicles O O -
Brain O O - Cerebrum(frontal, parietal(including basal ganglia and hippocampus) and occipital lobes); cerebellum; pons; and medulla oblongata
Spinal cord(thoracic) O -
Sciatic nerve O(L) -
Eyes O(R&L) -
Optic nerves O(R&L) -
Lacrimal glands O(R&L) -
Skeletal muscle(biceps femoris) O(L) -
Skin(thoracic) O -
Injection site(tail vein) O - Decalcified
Skin of the thoracic or medial femoral region with ID No. O - -
O: conducted -: Not conducted
R&L: Both the right and left organs/tissues were conducted.
L: Either the right or left organ/tissue(usually the left) was conducted.
R: Either the right or left organ/tissue(usually the right) was conducted
그 결과, 5 mg/kg/day 또는 10 mg/kg/day 용량의 GI101을 처리한 군에서 비장의 무게가 증가하였다(도 88). 나머지 조직에서는 유의미한 변화가 관찰되지 않았다. 결론적으로, GI101을 투여한 군에서 약간의 변화들이 관찰되었으나, 독성이 나타나지는 않았다.
VI. GI102의 항암효과 확인
실험예 24. GI102-M45의 항암 효과 확인
실험예 24.1. 마우스 유래 대장암세포 식립 마우스에서의 GI102-M45의 항암효과 확인
5x106 세포수/0.05 ㎖의 마우스 유래 CT-26 암세포주를 0.05 ㎖ Matrigel matrix phenol red-free(BD)와 혼합하여 6주령의 암컷 BALB/c 마우스(오리엔트)의 우측 등 부위의 피하에 0.1 ㎖씩 투여하여 이식한다. 암세포를 이식하고 일정기간 경과 후에 종양의 부피를 측정하여 약 80 mm3 내지 120 mm3에 도달한 개체들을 분리한 후, 0.1 ㎖의 GI102-M45를 정맥투여한다. 첫 투여 이후 3일에 한 번씩 총 3번 투여를 진행하고, 음성대조군으로는 PBS를 투여한다. 항암효과를 확인하기 위해 매일 종양의 크기를 측정한다. 실험예 16과 같은 방법으로 GI102-M45의 활성을 확인한다.
실험예 24.2. 마우스 유래 폐암세포 식립 마우스에서의 GI102-M45의 항암효과 확인
오리엔트 바이오에서 분양 받은 C57BL/6 마우스(암컷, 7주)를 7일의 적응기간을 거친 후에 5x106 세포수의 LLC2 암세포주(ATCC, USA)를 0.1 ㎖ PBS에 부유하여 마우스의 우측 등 부위의 피하에 투여하여 동종이식한다. 암세포를 이식하고 일정기간 경과 후에 종양의 부피를 측정하여 약 50 mm3 내지 200 mm3에 도달한 개체들을 선별한 후, 선별한 마우스의 종양의 크기 및 체중을 기초로 하여 균등하도록 각 군당 10마리씩 분류한다. 그 후, 일회용 주사기(31G, 1 ㎖)를 이용하여 음성대조군에는 약물을 투여하지 않으며, 양성대조군으로는 5 ㎎/㎏ 용량의 항-PD-1 항체 또는 5 ㎎/㎏ 용량의 항-PD-1 항체와 5 ㎎/㎏ 용량의 항-CTLA-4 항체를 정맥투여한다. 실험군으로는 0.1 ㎎/㎏ 또는 1 ㎎/㎏ 용량의 GI102-M45를 정맥투여한다. 첫 투여 이후 3일에 한 번씩 총 3번 투여를 진행한다. 매일 종양의 크기를 측정한다. 실험예 20.1과 같은 방법으로 GI102-M45의 활성을 확인한다.
실험예 25. GI102-M61의 항암 효과 확인
실험예 25.1. 마우스 유래 대장암세포 식립 마우스에서의 GI102-M61의 항암효과 확인
5x106 세포수/0.05 ㎖의 마우스 유래 CT-26 암세포주를 0.05 ㎖ Matrigel matrix phenol red-free(BD)와 혼합하여 6주령의 암컷 BALB/c 마우스(오리엔트)의 우측 등 부위의 피하에 0.1 ㎖씩 투여하여 이식한다. 암세포를 이식하고 일정기간 경과 후에 종양의 부피를 측정하여 약 80 mm3 내지 120 mm3에 도달한 개체들을 분리한 후, 0.1 ㎖의 GI102-M61을 정맥투여한다. 첫 투여 이후 3일에 한 번씩 총 3번 투여를 진행하고, 음성대조군으로는 PBS를 투여한다. 항암효과를 확인하기 위해 매일 종양의 크기를 측정한다. 실험예 16과 같은 방법으로 GI102-M61의 활성을 확인한다.
실험예 25.2. 마우스 유래 폐암세포 식립 마우스에서의 GI102-M61의 항암효과 확인
오리엔트 바이오에서 분양 받은 C57BL/6 마우스(암컷, 7주)를 7일의 적응기간을 거친 후에 5x106 세포수의 LLC2 암세포주(ATCC, USA)를 0.1 ㎖ PBS에 부유하여 마우스의 우측 등 부위의 피하에 투여하여 동종이식한다. 암세포를 이식하고 일정기간 경과 후에 종양의 부피를 측정하여 약 50 mm3 내지 200 mm3에 도달한 개체들을 선별한 후, 선별한 마우스의 종양의 크기 및 체중을 기초로 하여 균등하도록 각 군당 10마리씩 분류한다. 그 후, 일회용 주사기(31G, 1 ㎖)를 이용하여 음성대조군에는 약물을 투여하지 않으며, 양성대조군으로는 5 ㎎/㎏ 용량의 항-PD-1 항체 또는 5 ㎎/㎏ 용량의 항-PD-1 항체와 5 ㎎/㎏ 용량의 항-CTLA-4 항체를 정맥투여한다. 실험군으로는 0.1 ㎎/㎏ 또는 1 ㎎/㎏ 용량의 GI102-M61을 정맥투여한다. 첫 투여 이후 3일에 한 번씩 총 3번 투여를 진행한다. 매일 종양의 크기를 측정한다. 실험예 20.1과 같은 방법으로 GI102-M61의 활성을 확인한다.
실험예 26. GI102-M72의 항암 효과 확인
실험예 26.1. 마우스 유래 대장암세포 식립 마우스에서의 GI102-M72의 항암효과 확인
5x106 세포수/0.05 ㎖의 마우스 유래 CT-26 암세포주를 0.05 ㎖ Matrigel matrix phenol red-free(BD)와 혼합하여 6주령의 암컷 BALB/c 마우스(오리엔트)의 우측 등 부위의 피하에 0.1 ㎖씩 투여하여 이식한다. 암세포를 이식하고 일정기간 경과 후에 종양의 부피를 측정하여 약 80 mm3 내지 120 mm3에 도달한 개체들을 분리한 후, 0.1 ㎖의 GI102-M72를 정맥투여한다. 첫 투여 이후 3일에 한 번씩 총 3번 투여를 진행하고, 음성대조군으로는 PBS를 투여한다. 항암효과를 확인하기 위해 매일 종양의 크기를 측정한다. 실험예 16과 같은 방법으로 GI102-M72의 활성을 확인한다.
실험예 26.2. 마우스 유래 폐암세포 식립 마우스에서의 GI102-M72의 항암효과 확인
오리엔트 바이오에서 분양 받은 C57BL/6 마우스(암컷, 7주)를 7일의 적응기간을 거친 후에 5x106 세포수의 LLC2 암세포주(ATCC, USA)를 0.1 ㎖ PBS에 부유하여 마우스의 우측 등 부위의 피하에 투여하여 동종이식한다. 암세포를 이식하고 일정기간 경과 후에 종양의 부피를 측정하여 약 50 mm3 내지 200 mm3에 도달한 개체들을 선별한 후, 선별한 마우스의 종양의 크기 및 체중을 기초로 하여 균등하도록 각 군당 10마리씩 분류한다. 그 후, 일회용 주사기(31G, 1 ㎖)를 이용하여 음성대조군에는 약물을 투여하지 않으며, 양성대조군으로는 5 ㎎/㎏ 용량의 항-PD-1 항체 또는 5 ㎎/㎏ 용량의 항-PD-1 항체와 5 ㎎/㎏ 용량의 항-CTLA-4 항체를 정맥투여한다. 실험군으로는 0.1 ㎎/㎏ 또는 1 ㎎/㎏ 용량의 GI102-M72를 정맥투여한다. 첫 투여 이후 3일에 한 번씩 총 3번 투여를 진행한다. 매일 종양의 크기를 측정한다. 실험예 20.1과 같은 방법으로 GI102-M72의 활성을 확인한다.
<110> GI Innovation, Inc. <120> FUSION PROTEIN COMPRISING IL-2 PROTEIN AND CD80 PROTEIN AND USE THEREOF <130> FPD201907-0081 <150> KR 10-2018-0110698 <151> 2018-09-17 <150> KR 10-2019-0001867 <151> 2019-01-07 <150> US 62/832013 <151> 2019-04-10 <150> KR 10-2019-0053436 <151> 2019-05-08 <160> 37 <170> KopatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide (TPA) <400> 1 Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala 20 25 <210> 2 <211> 208 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hB7-1:35-242 <400> 2 Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys 1 5 10 15 Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp 20 25 30 Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn 35 40 45 Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn 50 55 60 Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr 65 70 75 80 Glu Cys Val Val 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Phe Pro Pro Lys Pro Lys 245 250 255 Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 260 265 270 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 275 280 285 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 290 295 300 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 305 310 315 320 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 325 330 335 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 340 345 350 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 355 360 365 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 370 375 380 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 385 390 395 400 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 405 410 415 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 420 425 430 Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 435 440 445 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser 450 455 460 Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu 465 470 475 480 Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr 485 490 495 Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu 500 505 510 Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val 515 520 525 Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu 530 535 540 Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr 545 550 555 560 Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe 565 570 575 Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 580 585 590 <210> 31 <211> 1851 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotiedes coding fusion protein (GI101w) <400> 31 atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60 tctccttctc acgctgtgat ccacgtgacc aaagaagtga aagaggtcgc cacactgtcc 120 tgcggccaca acgtttcagt ggaagaactg gcccagacca ggatctactg gcagaaagaa 180 aagaaaatgg tgctgaccat gatgtccggc gacatgaaca tctggcctga gtacaagaac 240 cggaccatct tcgacatcac caacaacctg tccatcgtga ttctggccct gaggccttct 300 gatgagggca cctatgagtg cgtggtgctg aagtacgaga aggacgcctt caagcgcgag 360 cacctggctg aagtgacact gtccgtgaag gccgactttc ccacaccttc catctccgac 420 ttcgagatcc ctacctccaa catccggcgg atcatctgtt ctacctctgg cggctttcct 480 gagcctcacc tgtcttggct ggaaaacggc gaggaactga acgccatcaa caccaccgtg 540 tctcaggacc ccgaaaccga gctgtacgct gtgtcctcca agctggactt caacatgacc 600 accaaccaca gcttcatgtg cctgattaag tacggccacc tgagagtgaa ccagaccttc 660 aactggaaca ccaccaagca agagcacttc cctgacaatg gatctggcgg cggaggttct 720 ggcggaggtg gaagcggagg cggaggatct gctgagtcta agtatggccc tccttgtcct 780 ccatgtcctg ctccagaagc tgctggcgga ccctctgtgt tcctgtttcc tccaaagcct 840 aaggaccagc tcatgatctc tcggacaccc gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct 900 caagaggacc ctgaggtgca gttcaattgg tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc 960 aagaccaagc ctagagagga acagttcaac tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc 1020 gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc 1080 ctgccttcca gcatcgaaaa gaccatctcc aaggctaagg gccagcctag ggaaccccag 1140 gtttacaccc tgcctccaag ccaagaggaa atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc 1200 ctggtcaagg gcttctaccc ttccgacatt gccgtggaat gggagtccaa tggccagcct 1260 gagaacaact acaagaccac acctcctgtg ctggactccg acggctcctt ctttctgtac 1320 tctcgcctga ccgtggacaa gtctagatgg caagagggca acgtgttctc ctgctctgtg 1380 ctgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc cagaagtccc tgtctctgtc tcttggaggt 1440 ggtggcggtt ctgcccctac cagctcctct accaagaaaa cccagctcca gttggagcat 1500 ctgctgctgg acctccagat gattctgaac gggatcaaca actataagaa ccccaagctg 1560 acccgcatgc tgacctttaa gttctacatg cccaagaagg ccaccgagct gaagcacctc 1620 cagtgcctgg aagaagaact gaagcccctg gaagaggtgc tgaatctggc ccagtccaag 1680 aacttccacc tgaggccacg ggacctgatc agcaacatca acgtgatcgt gctggaactg 1740 aagggctccg agacaacctt tatgtgcgag tacgccgacg agacagccac catcgtggaa 1800 tttctgaacc ggtggatcac cttctgccag agcatcatct ccacactgac c 1851 <210> 32 <211> 592 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein (GI101w) <400> 32 Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys 1 5 10 15 Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp 20 25 30 Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn 35 40 45 Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn 50 55 60 Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr 65 70 75 80 Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His 85 90 95 Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser 100 105 110 Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys 115 120 125 Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn 130 135 140 Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu 145 150 155 160 Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr 165 170 175 Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn 180 185 190 Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn 195 200 205 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 210 215 220 Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 225 230 235 240 Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 245 250 255 Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 260 265 270 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 275 280 285 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 290 295 300 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 305 310 315 320 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 325 330 335 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 340 345 350 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 355 360 365 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 370 375 380 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 385 390 395 400 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 405 410 415 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 420 425 430 Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 435 440 445 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser 450 455 460 Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu 465 470 475 480 Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr 485 490 495 Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu 500 505 510 Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val 515 520 525 Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu 530 535 540 Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr 545 550 555 560 Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe 565 570 575 Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 580 585 590 <210> 33 <211> 1848 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotiedes coding fusion protein (mGI102-M61) <400> 33 atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60 tctccttctc acgctgtgga cgagcagctc tccaagtccg tgaaggataa ggtcctgctg 120 ccttgccggt acaactctcc tcacgaggac gagtctgagg accggatcta ctggcagaaa 180 cacgacaagg tggtgctgtc cgtgatcgcc ggaaagctga aagtgtggcc tgagtacaag 240 aacaggaccc tgtacgacaa caccacctac agcctgatca tcctgggcct cgtgctgagc 300 gatagaggca cctattcttg cgtggtgcag aagaaagagc ggggcaccta cgaagtgaag 360 cacctggctc tggtcaagct gtccatcaag gccgacttca gcacccctaa catcaccgag 420 tctggcaacc cttccgccga caccaagaga atcacctgtt tcgcctctgg cggcttccct 480 aagcctcggt tctcttggct ggaaaacggc agagagctgc ccggcatcaa taccaccatt 540 tctcaggacc cagagtccga gctgtacacc atctccagcc agctcgactt taacaccacc 600 agaaaccaca ccatcaagtg cctgattaag tacggcgacg cccacgtgtc cgaggacttt 660 acttgggaga aacctcctga ggaccctcct gactctggat ctggcggcgg aggttctggc 720 ggaggtggaa gcggaggcgg aggatctgct gagtctaagt atggccctcc ttgtcctcca 780 tgtcctgctc cagaagctgc tggcggaccc tctgtgttcc tgtttcctcc aaagcctaag 840 gaccagctca tgatctctcg gacccctgaa gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtctcaa 900 gaggaccctg aggtgcagtt caattggtac gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag 960 accaagccta gagaggaaca gttcaactcc acctatagag tggtgtccgt gctgaccgtg 1020 ctgcaccagg attggctgaa cggcaaagag tacaagtgca aggtgtccaa caagggcctg 1080 ccttccagca tcgaaaagac catcagcaag gctaagggcc agcctaggga accccaggtt 1140 tacaccctgc ctccaagcca agaggaaatg accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg 1200 gtcaagggct tctacccttc cgacattgcc gtggaatggg agtccaatgg ccagcctgag 1260 aacaactaca agaccacacc tcctgtgctg gactccgacg gctccttctt tctgtactct 1320 cgcctgaccg tggacaagtc taggtggcaa gagggcaacg tgttctcctg ctctgtgctg 1380 cacgaggctc tgcacaacca ctacacccag aagtccctgt ctctgtctct tggaggtggt 1440 ggcggttctg cccctacctc cagctctacc aagaaaaccc agctccagtt ggagcatctg 1500 ctgctggacc tccagatgat cctgaatggc atcaacaatt acaagaaccc caagctgacc 1560 gccatgctga ccgctaagtt ctacatgccc aagaaggcca ccgagctgaa gcacttgcag 1620 tgcctggaaa gggaactgaa gcccctggaa gaagtgctga atctggccca gtccaagaac 1680 ttccacctga ggcctaggga cctgatctcc aacatcaacg tgatcgtgct ggaactgaaa 1740 ggctccgaga caaccttcat gtgcgagtac gccgacgaga cagccaccat cgtggaattt 1800 ctgaaccggt ggatcacctt ctgccagagc atcatctcca cactgacc 1848 <210> 34 <211> 616 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein (mGI102-M61) <400> 34 Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Val Asp Glu Gln Leu Ser Lys 20 25 30 Ser Val Lys Asp Lys Val Leu Leu Pro Cys Arg Tyr Asn Ser Pro His 35 40 45 Glu Asp Glu Ser Glu Asp Arg Ile Tyr Trp Gln Lys His Asp Lys Val 50 55 60 Val Leu Ser Val Ile Ala Gly Lys Leu Lys Val Trp Pro Glu Tyr Lys 65 70 75 80 Asn Arg Thr Leu Tyr Asp Asn Thr Thr Tyr Ser Leu Ile Ile Leu Gly 85 90 95 Leu Val Leu Ser Asp Arg Gly Thr Tyr Ser Cys Val Val Gln Lys Lys 100 105 110 Glu Arg Gly Thr Tyr Glu Val Lys His Leu Ala Leu Val Lys Leu Ser 115 120 125 Ile Lys Ala Asp Phe Ser Thr Pro Asn Ile Thr Glu Ser Gly Asn Pro 130 135 140 Ser Ala Asp Thr Lys Arg Ile Thr Cys Phe Ala Ser Gly Gly Phe Pro 145 150 155 160 Lys Pro Arg Phe Ser Trp Leu Glu Asn Gly Arg Glu Leu Pro Gly Ile 165 170 175 Asn Thr Thr Ile Ser Gln Asp Pro Glu Ser Glu Leu Tyr Thr Ile Ser 180 185 190 Ser Gln Leu Asp Phe Asn Thr Thr Arg Asn His Thr Ile Lys Cys Leu 195 200 205 Ile Lys Tyr Gly Asp Ala His Val Ser Glu Asp Phe Thr Trp Glu Lys 210 215 220 Pro Pro Glu Asp Pro Pro Asp Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 225 230 235 240 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 245 250 255 Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val 260 265 270 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr 275 280 285 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 290 295 300 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 305 310 315 320 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 325 330 335 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 340 345 350 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 355 360 365 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 370 375 380 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 385 390 395 400 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 405 410 415 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 420 425 430 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 435 440 445 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu 450 455 460 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly 465 470 475 480 Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln 485 490 495 Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn 500 505 510 Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr 515 520 525 Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Arg 530 535 540 Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn 545 550 555 560 Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val 565 570 575 Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp 580 585 590 Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys 595 600 605 Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 610 615 <210> 35 <211> 153 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> wild type hIL-2 <400> 35 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe 50 55 60 Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 65 70 75 80 Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 85 90 95 Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 100 105 110 Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 115 120 125 Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 130 135 140 Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 145 150 <210> 36 <211> 158 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-2 with signal sequence <400> 36 Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr 20 25 30 Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met 35 40 45 Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met 50 55 60 Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His 65 70 75 80 Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn 85 90 95 Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser 100 105 110 Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe 115 120 125 Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn 130 135 140 Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 145 150 155 <210> 37 <211> 474 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence coding IL-2 with signal sequence <400> 37 atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60 tctccttctc acgctgcccc taccagctcc tctaccaaga aaacccagct ccagttggag 120 catctgctgc tggacctcca gatgattctg aacgggatca acaactataa gaaccccaag 180 ctgacccgca tgctgacctt taagttctac atgcccaaga aggccaccga gctgaagcac 240 ctccagtgcc tggaagaaga actgaagccc ctggaagagg tgctgaatct ggcccagtcc 300 aagaacttcc acctgaggcc acgggacctg atcagcaaca tcaacgtgat cgtgctggaa 360 ctgaagggct ccgagacaac ctttatgtgc gagtacgccg acgagacagc caccatcgtg 420 gaatttctga accggtggat caccttctgc cagagcatca tctccacact gacc 474

Claims (30)

  1. IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질로서, 상기 융합단백질은 하기 구조식(I) 또는 (II)로 이루어진 것인, 융합단백질:
    N'-X-[링커(1)]n-Fc 도메인-[링커(2)]m-Y-C' (I)
    N'-Y-[링커(1)]n-Fc 도메인-[링커(2)]m-X-C' (II)
    이때, 상기 구조식(I) 및 (II)에 있어서,
    상기 N'은 융합단백질의 N-말단이고,
    상기 C'는 융합단백질의 C-말단이며,
    상기 X는 CD80 단백질이고,
    상기 Y는 IL-2 단백질이며,
    상기 링커(1) 및 링커(2)는 펩타이드 링커이고,
    상기 n 및 m은 각각 독립적으로, O 또는 1이다.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 IL-2 단백질은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 것인, 융합단백질.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 IL-2 단백질은 IL-2 변이체인 것인, 융합단백질.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 42번째, 45번째, 61번째 및 72번째 위치의 아미노산 중 적어도 하나가 치환된 것인, 융합단백질.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 R38A, F42A, Y45A, E61R 및 L72G로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 치환이 일어난 것인, 융합단백질.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 하기 (a) 내지 (d) 조합 중 선택되는 어느 하나의 조합의 치환이 일어난 것인, 융합단백질:
    (a) R38A/F42A
    (b) R38A/F42A/Y45A
    (c) R38A/F42A/E61R
    (d) R38A/F42A/L72G.
  8. 제4항에 있어서,
    상기 IL-2 변이체는 서열번호 6, 22, 23 또는 24의 아미노산 서열을 갖는 것인, 융합단백질.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 CD80은 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 것인, 융합단백질.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 CD80 단백질은 CD80의 단편인 것인, 융합단백질.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 CD80의 단편은 서열번호 11의 아미노산 서열 중 35번째 내지 242번째의 아미노산으로 이루어진 것인, 융합단백질.
  12. 삭제
  13. 제1항에 있어서,
    상기 Fc 도메인은 야생형 또는 변이체인 것인, 융합단백질.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 Fc 도메인은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 것인, 융합단백질.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 Fc 도메인의 변이체는 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 것인, 융합단백질.
  16. 삭제
  17. 제1항에 있어서,
    상기 링커(1)이 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커인 것인, 융합단백질.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 링커(2)가 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커인 것인, 융합단백질.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 융합단백질은 구조식(I)로 이루어진 것인, 융합단백질.
  20. 제1항에 있어서,
    상기 융합단백질은 서열번호 9, 26, 28 또는 30의 아미노산 서열에 대해 85% 혹은 그 이상의 서열동일성을 갖는 것인, 융합단백질.
  21. 제1항, 제3항 내지 제11항, 제13항 내지 제15항, 및 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항의 융합단백질 두 개가 결합된 융합단백질 이량체.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 융합단백질 이량체는 동형이량체(homodimer)인 것인, 융합단백질 이량체.
  23. 제1항, 제3항 내지 제11항, 제13항 내지 제15항, 및 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항의 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8, 25, 27 또는 29의 염기서열에 대해 85% 혹은 그 이상의 서열동일성을 갖는 것인, 폴리뉴클레오티드.
  25. 제23항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  26. 제25항의 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  27. 제1항, 제3항 내지 제11항, 제13항 내지 제15항, 및 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항의 융합단백질; 또는 제21항 또는 제22항의 융합단백질 이량체;를 유효성분으로 포함하는 암 또는 감염성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 약학 조성물이 약제학적으로 허용가능한 담체를 더 포함하는 것인, 약학 조성물.
  29. 제27항에 있어서,
    상기 암은 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암 및 림프종으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.
  30. 제27항에 있어서,
    상기 감염성 질환은 B형 간염, C형 간염, 인간 파필로마 바이러스 감염, 사이토메갈로바이러스 감염, 바이러스성 호흡기 질환 및 인플루엔자로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.
KR1020190113659A 2018-09-17 2019-09-16 Il-2 단백질 및 cd80 단백질을 포함하는 융합단백질 및 이의 용도 KR102201086B1 (ko)

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