KR20230160763A - Il-2 단백질 및 cd80 단백질을 포함하는 융합단백질 제제 - Google Patents

Il-2 단백질 및 cd80 단백질을 포함하는 융합단백질 제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 변형된 IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질 이량체의 안정성을 향상시킨 약제학적 제형에 관한 것이다. IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질 이량체는 IL-2에 의해 면역세포를 활성화시킬 수 있을 뿐 아니라, CD80에 의해 Treg 세포를 효과적으로 조절할 수 있다. 본 발명에 따른 제형을 IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질 이량체에 적용할 경우 상기 융합단백질 이량체의 안정성이 현저히 증가할 뿐 아니라, 액상 제형으로 이용 가능하므로 융합단백질 이량체의 상업적 활용성을 높일 수 있다.

Description

IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질 제제{FORMULATIOM OF FUSION PROTEIN COMPRISING IL-2 PROTEIN AND CD80 PROTEIN}
본 발명은 IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질의 안정성을 향상시킨 액상 제형에 관한 것이다.
IL-2는 T 세포 성장 인자로도 불리며, 림프구 생성, 생존 및 항상성에서 중심 역할을 하는 구형의 당단백질이다. IL-2의 단백질 크기는 15.5 kDa 내지 16 kDa이며, 133개 아미노산으로 이루어져 있다. IL-2는 개별적 3개의 서브유닛으로 구성된 IL-2 수용체에 결합함으로써 각종 면역 작용을 매개한다. 또한, IL-2는 활성화된 T 세포 중 특히, CD4+ 헬퍼 T 세포에 의해 주로 합성된다. IL-2는 T 세포의 증식 및 분화를 자극하고, 세포독성 T 림프구의 생성 및 말초혈 림프구의 세포독성 세포 및 림포카인-활성화 살해 세포로의 분화를 유도한다.
또한, IL-2는 B 세포의 증식 및 분화에 관여하며, B 세포에 의한 면역글로불린의 합성을 촉진한다. 뿐만 아니라, IL-2는 자연살해세포의 생성, 증식 및 활성화를 자극한다. 이와 같이, IL-2는 생체 내에서 림프구 개체군을 증대시키고, 상기 면역세포들의 기능을 증진시킬 수 있다. 이러한 효과로 인해 IL-2는 항암제로 이용되고 있다. 현재, 전이성 신세포암 및 악성 흑색종을 갖는 환자에서 IL-2를 이용한 치료가 승인된 바 있다.
그러나, IL-2는 면역세포의 증가 및 활성을 매개할 뿐만 아니라, 면역 관용을 유지하는데 중요하다는 점에서 이중적인 기능을 갖는다. 또한, IL-2는 종양의 성장을 억제하는데 최적이 아닐 수 있는 것으로 보고되었다. 그 이유는 IL-2의 존재 시, 생성된 세포독성 T 림프구에 AICD(activation-induced cell death)가 일어날 수 있고, 면역 반응이 IL-2 의존성 조절 T 세포(Treg)에 의해 억제될 수 있기 때문이다(Imai et al., Cancer Sci 98, 416-423, 2007).
뿐만 아니라, IL-2를 투여받은 환자에게서 심각한 심혈관, 폐, 신장, 간, 위장, 신경, 피부, 혈액 및 전신적인 부작용이 나타난다. 따라서, IL-2의 치료 효능 개선 및 부작용을 최소화하기 위해 다양한 IL-2 돌연변이가 연구되었다(US 5,229,109 B). 그러나, 아직도 IL-2를 약리학적으로 활용하기 위해서는 해소해야 할 문제점이 많이 남아 있다.
한편, CD80은 B7-1로 알려져 있으며, 리간드와 결합하여 공동자극 반응 및 공동억제 반응을 전달하여 면역 조절에 관여하는 막 단백질인 B7 패밀리 중 하나이다. CD80은 T 세포, B 세포, 수지상 세포 및 단핵구의 표면에 발현하는 막관통 단백질이다. CD80은 CD28, CTLA4(CD152) 및 PD-L1에 결합하는 것으로 알려져 있다. CD80, CD86, CTLA4 및 CD28은 공동자극-공동억제 시스템에 관여한다. 예를 들어, CD80은 T 세포의 활성을 조절하고, T 세포의 증식, 분화 및 생존에 관여하는 것으로 알려져 있다.
예를 들어, CD80 및 CD86이 CD28과 상호작용을 하게 되면, 공동자극 신호가 발생하여 T 세포를 활성화시킨다. 결국, CD80은 활성화된 T 세포 표면에 발현된 CTLA4와 결합하고, CTLA4를 상향조절하도록 자극하게 된다. 그 결과, CD80/CD28 상호작용에 의한 면역 반응 작동 전에, CD80은 T 세포의 반응을 억제하게 된다. 이러한 피드백 회로는 면역 반응을 세밀하게 조절하게 한다.
또한, CD80은 CD28이 PD-L1에 결합하는 것과 유사한 친화도로 또 다른 B7 패밀리인 PD-L1과 결합하는 것으로 알려져 있다. PD-L1은 PD-1(programmed death-1) 단백질에 대한 두 개의 리간드 중 하나로 알려져 있으며, PD-L1은 T 세포 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다. CD80과 PD-L1의 결합은 PD-1/PD-L1 상호 작용을 블록킹할 수 있는 또 다른 기전으로 종양에서 T 세포의 반응 억제를 막을 수 있다. 그러나, CD80의 수준이 증가되면 CD28과 결합을 하게 되어 T 세포 반응을 유발할 수 있다. 이와 동시에 CD80은 CTLA4와 결합하여 T 세포 반응을 억제할 수 있다.
CD80 단편, 면역글로불린 Fc 및 IL-2 변이체를 포함하는 융합단백질이 면역세포를 활성화시키며, 동시에 조절 T 세포의 면역세포 조절 활성을 제어하여 암뿐만 아니라 감염성 질환을 효율적으로 치료할 수 있다는 점을 확인하였다(KR10-2201086B1). 이러한 단백질을 암질환 및 감염성 질환 치료에 효율적으로 적용하기 위해서는 투약 및 투여 이점을 제공하는 안정한 고농도 단백질 제형 개발이 필요하다.
US 5229109 B KR 10-2201086 B1
Imai et al., Cancer Sci 98, 416-423, 2007
이에 본 발명자들은 IL-2 단백질과 CD80 단백질을 한 분자 내에 포함하는 신규한 융합단백질 이량체의 안정성이 증가된 제형을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
상기 목적 달성을 위해, 본 발명의 일 측면은, IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질 이량체가 포함된 약제학적 제형을 제공한다.
IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질 이량체는 IL-2에 의해 면역세포를 활성화시킬 수 있을 뿐 아니라, CD80에 의해 Treg 세포를 효과적으로 조절할 수 있다. 이러한 융합단백질 이량체를 임상적으로 사용하기 위하여는 단백질 제제의 안정성이 확보되어야 한다. 본 발명에 따른 약제학적 제형을 IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질 이량체에 적용할 경우 상기 융합단백질 이량체의 안정성이 현저히 증가할 뿐 아니라, 액상 제형으로 이용 가능하므로 융합단백질 이량체의 상업적 활용성을 높일 수 있다.
도 1은 수득한 융합단백질(GI-101)을 SDS-PAGE로 확인한 것이다.
도 2는 흡광도에 따른 융합단백질(GI-101)의 함량을 나타낸 것이다.
도 3은 수득한 융합단백질(GI-101)을 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 분석한 것이다.
IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질을 포함하는 약제학적 제형
본 발명은 일 측면으로, (ⅰ) 3.0 mg/mL 내지 5.0 mg/mL 농도의, IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질 이량체; (ⅱ) 10 mM 내지 30 mM 농도의 버퍼; 및 (ⅲ) 0.155 w/w% 내지 0.185 w/w% 농도의 계면활성제;를 포함하는 약제학적 제형으로서, 상기 제형이 pH 6.5 내지 7.5를 갖는, 약제학적 제형을 제공한다.
이때, 상기 약제학적 제형은 액상 제형일 수 있다.
IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질
본 명세서에서 사용하는 용어, "IL-2" 또는 "인터루킨-2"는 달리 언급되지 않는 한, 포유동물, 예를 들어, 영장류(예, 인간) 및 설치류(예, 마우스 및 래트)를 포함하여 임의의 척추동물 공급원으로부터 수득한 임의의 야생형 IL-2를 의미한다. 상기 IL-2는 동물 세포에서 수득된 것일 수도 있으나, IL-2를 생산할 수 있는 재조합 세포로부터 수득된 것도 포함한다. 또한, 상기 IL-2는 야생형 IL-2 또는 이의 변이체일 수 있다.
본 명세서에서는 IL-2 혹은 이의 변이체를 총칭하여 "IL-2 단백질" 혹은 "IL-2 폴리펩티드"의 용어로 표현하기도 한다. IL-2, IL-2 단백질, IL-2 폴리펩티드, 및 IL-2 변이체는 예를 들어 IL-2 수용체(receptor)에 특이적으로 결합한다. 이 특이적인 결합은 당업자에게 알려진 방법을 통해 확인할 수 있다.
상기 IL-2의 일 구체예는 서열번호 35 또는 서열번호 36의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 이때, 상기 IL-2는 성숙된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 성숙된 IL-2는 신호서열을 포함하지 않는 것일 수 있으며, 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 이때, 상기 IL-2는 야생형 IL-2의 N-말단 또는 C-말단의 일부가 결실된(truncated) 단편을 포함할 수 있다.
또한, 상기 IL-2의 단편은 서열번호 35 또는 서열번호 36의 아미노산 서열을 가지는 단백질의 N 말단으로부터 연속적으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개 또는 25개의 아미노산이 결실된 형태일 수 있다. 또한 상기 IL-2의 단편은 서열번호 35 또는 서열번호 36의 아미노산 서열을 가지는 단백질의 C 말단으로부터 연속적으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개 또는 25개의 아미노산이 결실된 형태일 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "IL-2 변이체"는 전장(full-length) IL-2 또는 상술한 IL-2의 단편의 아미노산 일부가 치환된 형태를 의미한다. 즉, IL-2 변이체는 야생형 IL-2 또는 이의 단편과 다른 아미노산 서열을 가질 수 있다. 그러나, 상기 IL-2 변이체는 야생형 IL-2와 동등하거나 유사한 활성을 가질 수 있다. 여기에서, "IL-2 활성"은 예를 들어 IL-2 수용체에 특이적으로 결합하는 것을 의미할 수 있으며, 이 특이적 결합은 당업자에게 알려진 방법을 통해 측정할 수 있다.
구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 야생형 IL-2의 아미노산 일부가 치환된 것일 수 있다. 아미노산 치환에 의한 IL-2 변이체의 일 구체예로는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 42번째, 45번째, 61번째 및 72번째 아미노산 중 적어도 하나가 치환된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 42번째, 45번째, 61번째 또는 72번째 아미노산 중 적어도 어느 하나가 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 뿐만 아니라, IL-2가 서열번호 35의 아미노산 서열의 N 말단의 일 부분이 결실된 형태일 경우, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 상보적으로 대응되는 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 예를 들어, IL-2가 서열번호 35의 아미노산을 서열을 가질 경우에, 상기 IL-2의 변이체는 서열번호 35의 아미노산 서열에서 58번째, 62번째, 65번째, 81번째 또는 92번째 아미노산 중 적어도 어느 하나가 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 이들은 각각 서열번호 10의 아미노산 서열의 38번째, 42번째, 45번째, 61번째 및 72번째 아미노산 잔기에 각각 해당한다. 일 구체예에 따르면, IL-2 활성이 유지되는 한, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 혹은 10개의 아미노산이 치환될 수 있다. 또 다른 구체예에 따르면, 1개에서 5개까지의 아미노산이 치환될 수 있다.
일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 두 군데의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째 및 42번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째 및 45번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 42번째 및 45번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 42번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 42번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 45번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 45번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 61번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다.
나아가, 상기 IL-2 변이체는 세 군데의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 42번째 및 45번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 42번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 42번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 45번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 45번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 61번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 42번째, 45번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 42번째, 45번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 45번째, 61번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다.
또한, 상기 IL-2 변이체는 네 군데의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 42번째, 45번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 42번째, 45번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 45번째, 61번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 42번째, 61번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 42번째, 45번째, 61번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다.
나아가, 상기 IL-2 변이체는 다섯 군데의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 42번째, 45번째, 61번째 및 72번째 아미노산이 모두 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
이때, 상기 치환에 의해 도입되는 "다른 아미노산"은 알라닌(alanine), 아르기닌(arginine), 아스파라긴(Asparagine), 아스파르트산(aspartic acid), 시스테인(cysteine), 글루탐산(glutamic acid), 글루타민(glutamine), 히스티딘(histidine), 이소루신(isoleucine), 루신(leucine), 리신(lysine), 메티오닌(methionine), 페닐알라닌(phenyl alanine), 프롤린(proline), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 트립토판(tryptophan), 티로신(tyrosine) 및 발린(valine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 단, 상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 상기 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째는 아르기닌으로 치환될 수 없으며, 42번째는 페닐알라닌으로 치환될 수 없고, 45번째는 티로신으로 치환될 수 없으며, 61번째는 글루탐산으로 치환될 수 없고, 72번째는 루신으로 치환될 수 없다.
상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째 아미노산인 아르기닌은 아르기닌을 제외한 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째 아미노산인 아르기닌은 알라닌으로 치환(R38A)될 수 있다.
상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 42번째 아미노산인 페닐알라닌은 페닐알라닌을 제외한 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 42번째 아미노산인 페닐알라닌은 알라닌으로 치환(F42A)될 수 있다.
상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 45번째 아미노산인 티로신은 티로신을 제외한 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 45번째 아미노산인 티로신은 알라닌으로 치환(Y45A)될 수 있다.
상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 61번째 아미노산인 글루탐산은 글루탐산을 제외한 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 61번째 아미노산인 글루탐산은 아르기닌으로 치환(E61R)될 수 있다.
상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 72번째 아미노산인 루신은 루신을 제외한 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 72번째 아미노산인 루신은 글리신으로 치환(L72G)될 수 있다.
구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 R38A, F42A, Y45A, E61R 및 L72G로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 치환이 일어난 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A, Y45A, E61R 및 L72G로 구성된 군에서 선택되는 위치에서 두 군데, 세 군데, 네 군데 또는 다섯 군데의 위치에서 아미노산 치환이 일어날 수 있다.
또한, 상기 IL-2 변이체는 두 군데의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 R38A 및 F42A로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A 및 Y45A로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A 및 E61R로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A 및 Y45A로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A 및 E61R로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 E61R 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다.
나아가, 상기 IL-2 변이체는 세 군데의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A 및 Y45A로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A 및 E61R로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, Y45A, E61R로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, Y45A 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A, Y45A 및 E61R로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A, Y45A 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A, E61R 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 Y45A, E61R 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다.
또한, 상기 IL-2 변이체는 네 군데의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A, Y45A 및 E61R로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A, Y45A 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A, E61R 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, Y45A, E61R 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A, Y45A, E61R 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다.
나아가 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A, Y45A, E61R 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다.
바람직하게는, 상기 IL-2 변이체의 일 구체예는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 하기 (a) 내지 (d) 조합 중 선택되는 어느 하나의 조합의 치환이 일어난 것일 수 있다:
(a) R38A/F42A
(b) R38A/F42A/Y45A
(c) R38A/F42A/E61R
(d) R38A/F42A/L72G
이때, IL-2가 서열번호 35의 아미노산 서열을 가질 경우, 서열번호 10과 상보적으로 대응되는 위치에 아미노산 치환을 가질 수 있다. 또한, IL-2가 서열번호 35의 아미노산 서열의 단편인 경우에도, 서열번호 10과 상보적으로 대응되는 위치의 아미노산이 치환될 수 있다.
구체적으로, 상기 IL-2의 변이체는 서열번호 6, 22, 23 또는 24의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
또한, 상기 IL-2 변이체는 생체 내에서 낮은 독성을 가지는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 이때, 상기 생체 내에서 낮은 독성이란, IL-2가 IL-2 수용체의 알파체인(IL-2Rα)과 결합하여 유발되는 부작용일 수 있다. 상기 IL-2와 IL-2Rα 결합에 의한 부작용을 개선시키기 위해서 다양한 IL-2 변이체가 개발되었으며, 이러한 IL-2 변이체는 미국등록특허 제5,229,109호 및 한국등록특허 제10-1667096호에 개시된 것들을 사용할 수 있다. 특히, 본 출원에서 기술되는 IL-2의 변이체는 IL-2 수용체의 알파체인(IL-2Rα)과 결합력이 낮아 생체내 독성이 야생형 IL-2에 비해 낮다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "CD80"은 "B7-1"로도 불리며, 수지상세포, 활성화된 B 세포 및 단핵구에 존재하는 막단백질이다. CD80은 T 세포의 활성화와 생존에 필수적인 공자극 신호를 제공한다. CD80은 T 세포 표면에 존재하는 서로 다른 두 단백질인 CD28 및 CTLA-4에 대한 리간드로 알려져 있다. CD80은 288개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 구체적으로 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 "CD80 단백질"은 전장 CD80 또는 CD80 단편을 의미한다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "CD80 단편"이란, CD80의 절단형을 의미한다. 또한, 상기 CD80 단편은 CD80의 세포외도메인일 수 있다. CD80 단편의 일 구체예로는 CD80의 신호서열인 N-말단으로부터 1번째 내지 34번째의 아미노산이 제외된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 CD80 단편의 일 구체예는 서열번호 11의 35번째 내지 288번째의 아미노산으로 구성된 단백질일 수 있다. 또한, 상기 CD80 단편의 일 구체예는 서열번호 11의 35번째 내지 242번째 아미노산으로 구성된 단백질일 수 있다. 또한, 상기 CD80 단편의 일 구체예는 서열번호 11의 35번째 내지 232번째 아미노산으로 구성된 단백질일 수 있다. 또한, 상기 CD80 단편의 일 구체예는 서열번호 11의 35번째 내지 139번째 아미노산으로 구성된 단백질일 수 있다. 또한, 상기 CD80 단편의 일 구체예는 서열번호 11의 142번째 내지 242번째 아미노산으로 구성된 단백질일 수 있다. 상기 일 실시예로 CD80 단편은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
또한, 상기 IL-2 단백질 및 상기 CD80 단백질은 링커 혹은 캐리어(carrier)에 의해 결합된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 또는 이의 변이체 및 상기 CD80(B7-1) 또는 이의 단편은 링커 혹은 캐리어에 의해 결합된 것일 수 있다. 본 명세서에서 링커와 캐리어는 호환적으로 사용되기도 한다.
상기 링커는 두 개의 단백질을 연결시켜준다. 링커의 일 구체예로는 1개 내지 50개의 아미노산, 알부민 또는 이의 단편, 또는 면역글로불린의 Fc 도메인 등을 포함할 수 있다. 이때, 상기 면역글로불린의 Fc 도메인은 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 2(CH2) 및 중쇄 불변 영역 3(CH3)을 포함하며, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 1(CH1)은 포함하지 않는 단백질을 의미한다. 상기 면역글로불린은 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM 일 수 있으며, 바람직하게는 IgG4일 수 있다. 이때, 야생형 면역글로불린 G4의 Fc 도메인은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
또한, 상기 면역글로불린의 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인뿐만 아니라, Fc 도메인 변이체일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용하는 용어 "Fc 도메인 변이체"는 야생형 Fc 도메인의 당쇄 형태(glycosylation pattern)와 다르거나, 야생형 Fc 도메인에 비해 증가된 당쇄, 야생형 Fc 도메인에 비해 감소한 당쇄, 또는 당쇄가 제거(deglycosylate)된 형태일 수 있다. 또한, 무당쇄(aglycosylated) Fc 도메인도 포함된다. Fc 도메인 혹은 변이체는 배양조건 혹은 호스트의 유전자 조작을 통해 조정된 숫자의 시알산(sialic acid), 퓨코실화(fucosylation), 당화(glycosylation)를 갖도록 한 것일 수 있다.
또한, 화학적 방법, 효소적 방법 및 미생물을 사용한 유전공학적 엔지니어링 방법 등과 같이 통상적인 방법으로 면역글로불린의 Fc 도메인의 당쇄를 변형시킬 수 있다. 또한, 상기 Fc 도메인 변이체는 면역글로불린은 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM의 Fc 영역이 혼합된 형태일 수 있다. 또한, 상기 Fc 도메인 변이체는 상기 Fc 도메인의 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 형태일 수 있다. 상기 Fc 도메인 변이체의 일 구체예로는 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
융합단백질은 Fc 도메인을 링커(혹은 캐리어)로 하여 이의 N-말단과 C-말단에 각각 CD80과 IL-2 단백질이 연결되거나 혹은 IL-2와 CD80이 연결된 구조를 가질 수 있다. Fc 도메인의 N-말단 혹은 C-말단과 CD80 혹은 IL-2의 연결은 임의적으로 링커 펩타이드에 의해 이루어질 수 있다.
구체적으로, 상기 융합단백질은 하기 구조식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)로 이루어진 것일 수 있다:
N'-X-[링커(1)]n-Fc 도메인-[링커(2)]m-Y-C' (Ⅰ)
N'-Y-[링커(1)]n-Fc 도메인-[링커(2)]m-X-C' (Ⅱ)
이때, 상기 구조식 (Ⅰ) 및 (Ⅱ)에 있어서,
상기 N'은 융합단백질의 N-말단이고,
상기 C'는 융합단백질의 C-말단이며,
상기 X는 CD80 단백질이고,
상기 Y는 IL-2 단백질이며,
상기 링커(1) 및 링커(2)는 펩타이드 링커이고,
상기 n 및 m은 각각 독립적으로, O 또는 1이다.
바람직하게는, 상기 융합단백질은 구조식 (Ⅰ)로 이루어진 것일 수 있다. 상기 IL-2 단백질은 상술한 바와 같다. 또한, 상기 CD80 단백질은 상술한 바와 같다. 일 구체예에 따르면, IL-2 단백질은 야생형 IL-2와 비교하여 1 내지 5개의 아미노산이 치환된 IL-2 변이체일 수 있다. CD80 단백질은 야생형 CD80의 N-말단 혹은 C-말단으로부터 연속적으로 약 34개까지의 아미노산 잔기가 결실된(truncated) 단편일 수 있다. 혹은 CD80 단백질은 T-세포 표면 수용체(T cell surface receptors) CTLA-4와 CD28에 결합하는 활성을 갖는 세포외 면역글로불린-유사 도메인일 수 있다.
구체적으로, 상기 융합단백질은 서열번호 9, 26, 28 또는 30의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 또 다른 구체예에 따르면, 융합단백질은 서열번호 9, 26, 28 또는 30의 아미노산 서열에 대해 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 혹은 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이때, 동일성은, 예를 들어, 퍼센트 상동성, NCBI(National Center of Biotechnology Information)의 BlastN software과 같은 상동성 비교 소프트웨어를 통해 결정될 수 있다.
상기 CD80 단백질과 Fc 도메인의 사이에는 펩타이드 링커(1)가 포함될 수 있다. 상기 펩타이드 링커(1)은 5 내지 80개의 연속된 아미노산, 20 내지 60개의 연속된 아미노산, 또는 25 내지 50개의 연속된 아미노산, 또는 30 내지 40개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 구체예로 펩타이드 링커(1)은 30개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 또한, 펩타이드 링커(1)은 적어도 하나의 시스테인을 포함할 수 있다. 구체적으로, 1개, 2개 또는 3개의 시스테인을 포함할 수 있다. 또한, 상기 펩타이드 링커(1)는 면역글로불린의 힌지에서 유래된 것일 수 있다. 일 구체예에서는, 상기 펩타이드 링커(1)이 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있다.
상기 펩타이드 링커(2)는 1 내지 50개의 연속된 아미노산, 또는 3 내지 30개의 연속된 아미노산, 또는 5 내지 15개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 구체예로 상기 펩타이드 링커(2)는 (G4S)n(이때, n은 1 내지 10의 정수) 일 수 있다. 이때, (G4S)n에서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 수 있다. 일 실시예로, 상기 펩타이드 링커(2)가 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 IL-2 단백질 및 상기 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질 두 개가 결합된 이량체를 제공한다. 상기 IL-2 또는 이의 변이체 및 CD80 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질은 상술한 바와 같다.
이때, 이량체를 구성하는 융합단백질 간의 결합은 링커 내에 존재하는 시스테인 간의 이황화 결합에 의해 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이량체를 구성하는 융합단백질은 동일한 것일 수도 있으나, 서로 상이한 융합단백질일 수 있다. 바람직하게는, 상기 이량체는 동형이량체(homodimer)인 것일 수 있다. 상기 이량체를 구성하는 융합단백질의 일 실시예는 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있다.
약제학적 제형
본 발명의 일 측면은, 상기 IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질 이량체를 포함하는 약제학적 제형을 제공한다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "약제학적 제형"은 활성 성분의 생물학적 활성이 명백하게 효과적일 수 있도록 하는 형태로 존재하고, 제형이 투여되는 개체에게 부작용을 유발하는 성분을 함유하지 않는 제제를 의미한다.
상기 용어 "개체"란 사람, 개, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이, 마우스, 토끼, 래트와 같은 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간, 개 또는 고양이일 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "약제학적 제형"은 적합한 수성 용매, 예컨대, 물 또는 수성/유성 혼합물(예를 들어, 물 알코올 혼합물)을 사용하는 약제학적 제형을 의미한다. 상기 제형은 안정성, 예컨대, 화학적 또는 물리적 안정성, 생물학적 활성을 유지할 수 있다.
상기 용어, "안정성"은 일정한 상태를 유지하는 성질을 의미하는 것으로, 일반적으로 생물학적 활성 물질, 예컨대, 단백질, 펩타이드 또는 생물활성 거대분자의 분해, 변성, 응집 또는 언폴딩(unfolding)을 최소화하는 것과 관련이 있다.
한편, 상기 제형은 액체 제형일 수 있다. 액체 제형은 수용액 또는 현탁액이며, 저장 동안 실온, 냉장(예를 들어, 2℃ 내지 8℃) 또는 냉동(예를 들어, -20℃ 또는 -70℃)에서 안정하게 유지될 수 있다.
본 발명의 상기 약제학적 제형은 비경구로 투여될 수 있다. 이때, 비경구는 피하 투여, 정맥 투여, 점막 투여, 근육 투여 등의 방법으로 수행될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 제형은 바람직하게는 정맥 주사로 투여될 수 있다.
상기 약제학적 제형 내의 상기 융합단백질 이량체는 3.0 mg/mL 내지 5.0 mg/mL 농도일 수 있다. 또한, 상기 융합단백질 이량체는 3.0 mg/mL 내지 4.8 mg/mL 농도, 3.0 mg/mL 내지 4.6 mg/mL 농도, 3.0 mg/mL 내지 4.4 mg/mL 농도, 3.0 mg/mL 내지 4.2 mg/mL 농도, 3.2 mg/mL 내지 4.8 mg/mL 농도, 3.2 mg/mL 내지 4.6 mg/mL 농도, 3.2 mg/mL 내지 4.4 mg/mL 농도, 3.2 mg/mL 내지 4.2 mg/mL 농도, 3.4 mg/mL 내지 4.8 mg/mL 농도, 3.4 mg/mL 내지 4.6 mg/mL 농도, 3.4 mg/mL 내지 4.4 mg/mL 농도, 3.4 mg/mL 내지 4.2 mg/mL 농도, 3.6 mg/mL 내지 4.8 mg/mL 농도, 3.6 mg/mL 내지 4.6 mg/mL 농도, 3.6 mg/mL 내지 4.4 mg/mL 농도, 3.6 mg/mL 내지 4.2 mg/mL 농도, 3.8 mg/mL 내지 4.8 mg/mL 농도, 3.8 mg/mL 내지 4.6 mg/mL 농도, 3.8 mg/mL 내지 4.4 mg/mL 농도, 3.8 mg/mL 내지 4.2 mg/mL 농도 또는 3.9 mg/mL 내지 4.1 mg/mL 농도일 수 있다. 구체적으로, 상기 융합단백질 이량체는 4.0 mg/mL 농도일 수 있다.
또한, 상기 버퍼는 히스티딘 버퍼일 수 있다. 이때, 상기 히스티딘은 10 mM 내지 30 mM 농도일 수 있다. 또한, 상기 히스티딘은 10 mM 내지 28 mM 농도, 10 mM 내지 26 mM 농도, 10 mM 내지 24 mM 농도, 10 mM 내지 22 mM 농도, 10 mM 내지 21 mM 농도, 12 mM 내지 28 mM 농도, 12 mM 내지 26 mM 농도, 12 mM 내지 24 mM 농도, 12 mM 내지 22 mM 농도, 12 mM 내지 21 mM 농도, 14 mM 내지 28 mM 농도, 14 mM 내지 26 mM 농도, 14 mM 내지 24 mM 농도, 14 mM 내지 22 mM 농도, 14 mM 내지 21 mM 농도, 16 mM 내지 28 mM 농도, 16 mM 내지 26 mM 농도, 16 mM 내지 24 mM 농도, 16 mM 내지 22 mM 농도, 16 mM 내지 21 mM 농도, 18 mM 내지 28 mM 농도, 18 mM 내지 26 mM 농도, 18 mM 내지 24 mM 농도, 18 mM 내지 22 mM 농도, 18 mM 내지 21 mM 농도, 19 mM 내지 28 mM 농도, 19 mM 내지 26 mM 농도, 19 mM 내지 24 mM 농도, 19 mM 내지 22 mM 농도 또는 19 mM 내지 21 mM 농도일 수 있다. 구체적으로, 상기 히스티딘은 20 mM 농도일 수 있다.
또한, 상기 약제학적 제형은 pH 6.5 내지 7.5일 수 있다. 또한, 상기 약제학적 제형은 pH 6.5 내지 7.3, pH 6.5 내지 7.2, pH 6.5 내지 7.1, pH 6.7 내지 7.3, pH 6.7 내지 7.2, pH 6.7 내지 7.1, pH 6.8 내지 7.3, pH 6.8 내지 7.2, pH 6.8 내지 7.1, pH 6.9 내지 7.3, pH 6.9 내지 7.2 또는 pH 6.9 내지 7.1일 수 있다. 바람직하게, 상기 약제학적 제형은 pH 7.0일 수 있다.
또한, 상기 약제학적 제형의 계면활성제는 폴리소르베이트(예: 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 28, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 65, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 81 및 폴리소르베이트 85); 폴록사머(예: 폴록사머 181, 폴록사머 188 및 폴록사머 407); 폴리에틸렌 글리콜(PEG); 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나를 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 약제학적 제형에는 상기 계면활성제 두 개가 포함될 수 있다.
또한, 상기 계면활성제는 제형 내에 0.065 w/w% 내지 0.2 w/w% 농도로 포함될 수 있다. 또한, 상기 계면활성제는 제형 내에 0.155 w/w% 내지 0.185 w/w% 농도로 포함될 수 있다. 일 구체예로 상기 계면활성제는 폴록사머 188일 수 있다. 이때, 상기 계면활성제는 제형 내에 0.065 w/w% 내지 0.075 w/w% 농도로 포함될 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 계면활성제는 폴리소르베이트 80일 수 있다. 이때, 상기 계면활성제는 제형 내에 약 0.09 w/w% 내지 약 0.11 w/w% 농도로 포함될 수 있다. 바람직하게는 제형 내 폴록사머 188 및 폴리소르베이트 80이 포함될 수 있으며, 각각 0.065 w/w% 내지 0.075 w/w% 농도 및 0.09 w/w% 내지 약 0.11 w/w% 농도로 포함될 수 있다. 구체적으로 제형 내 폴록사머 188 및 폴리소르베이트 80은 각각 0.07 w/w% 및 0.1 w/w% 농도로 포함될 수 있다.
또한, 상기 약제학적 제형은 추가적으로 아미노산을 더 포함할 수 있다. 상기 아미노산은 아르기닌, 히스티딘, 라이신, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 셀로노시스테인, 글라이신, 프롤린, 알라닌, 발린, 이소루신, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
이때, 상기 아미노산은 10 mg/mL 내지 30 mg/mL 농도일 수 있다. 또한, 상기 아미노산은 10 mg/mL 내지 25 mg/mL 농도, 10 mg/mL 내지 20 mg/mL 농도, 10 mg/mL 내지 18 mg/mL 농도, 10 mg/mL 내지 16 mg/mL 농도, 12 mg/mL 내지 25 mg/mL 농도, 12 mg/mL 내지 20 mg/mL 농도, 12 mg/mL 내지 18 mg/mL 농도, 12 mg/mL 내지 16 mg/mL 농도, 14 mg/mL 내지 25 mg/mL 농도, 14 mg/mL 내지 20 mg/mL 농도, 14 mg/mL 내지 18 mg/mL 농도 또는 14 mg/mL 내지 16 mg/mL 농도일 수 있다. 구체적으로, 상기 아미노산은 15 mg/mL 농도일 수 있다.
일 실시예로 상기 아미노산은 아르기닌일 수 있으며, 바람직하게 아르기닌-HCl 일 수 있다. 이때, 상기 아르기닌은 14 mg/mL 내지 16 mg/mL 농도로 포함될 수 있으며, 바람직하게 15 mg/mL 농도로 포함될 수 있다.
또한, 상기 약제학적 제형은 추가적으로 당류를 더 포함할 수 있다. 상기 당류는 수크로오스, 소르비톨, 글리세롤, 트레할로스 및 만니톨로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 이때, 상기 당류는 120 mg/mL 내지 180 mg/mL 농도로 포함될 수 있다. 또한, 상기 당류는 120 mg/mL 내지 170 mg/mL 농도, 120 mg/mL 내지 160 mg/mL 농도, 120 mg/mL 내지 155 mg/mL 농도, 130 mg/mL 내지 170 mg/mL 농도, 130 mg/mL 내지 160 mg/mL 농도, 130 mg/mL 내지 155 mg/mL 농도, 135 mg/mL 내지 170 mg/mL 농도, 135 mg/mL 내지 160 mg/mL 농도, 135 mg/mL 내지 155 mg/mL 농도, 140 mg/mL 내지 170 mg/mL 농도, 140 mg/mL 내지 160 mg/mL 농도, 140 mg/mL 내지 155 mg/mL 농도, 145 mg/mL 내지 170 mg/mL 농도, 145 mg/mL 내지 160 mg/mL 농도 또는 145 mg/mL 내지 155 mg/mL 농도일 수 있다.
상기 당류의 일 구체예는 수크로오스일 수 있으며, 상기 수크로오스는 150 mg/mL 농도일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 약제학적 제형은 (ⅰ) 3.0 mg/mL 내지 5.0 mg/mL 농도의, IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질 이량체; (ⅱ) 10 mM 내지 30 mM 농도의 히스티딘; (ⅲ) 0.065 w/w% 내지 0.075 w/w% 농도의 폴록사머 188; (ⅳ) 0.09 w/w% 내지 0.11 w/w% 농도의 폴리소르베이트 80; (ⅴ) 10 mg/mL 내지 30 mg/mL 농도의 아르기닌; 및 (ⅵ) 120 mg/mL 내지 180 mg/mL 농도의 수크로오스를 포함하며, pH 6.5 내지 7.5를 갖는 약제학적 제형일 수 있다.
상기 약제학적 제형은 바이알, 카트리지, 주사기 및 자동 주사기(autoinjector)로 이루어진 군으로부터 선택된 용기에 보관될 수 있다.
또한, 상기 제형이 보관된 용기는 치료가 필요한 개체에게 투여될 때까지 실온, 2℃ 내지 8℃ 또는 25℃ 내지 40℃로 저장될 수 있다.
상기 개체는 사람, 개, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이, 마우스, 토끼, 래트와 같은 포유 동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다.
상기 제형은 이에 제한되지는 않으나 비경구 투여, 예컨대 피하 투여, 정맥 투여, 점막 투여, 근육 투여, 복강 투여될 수 있다. 바람직하게는 정맥 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. hCD80-Fc-IL-2 변이체(2M)의 제조: GI-101
인간 CD80 단편, Fc 도메인 및 IL-2 변이체를 포함하는 융합단백질 이량체를 생산하기 위하여, 시그널 펩타이드(서열번호 1), CD80 단편(서열번호 2), 링커가 결합된 Ig 힌지(서열번호 3), Fc 도메인(서열번호 4), 링커(서열번호 5) 및 두 개의 아미노산이 치환된 IL-2 변이체(2M)(R38A, F42A)(서열번호 6)를 N-말단으로부터 이 순서대로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 염기서열(서열번호 8)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 ThermoFisher Scientific 사의 Invitrogen GeneArt Gene Synthesis 서비스를 통해 폴리뉴클레오티드를 합성하여 pcDNA3_4 벡터에 적재하였다. 또한, 상기 벡터를 CHO 세포(Expi-CHOTM)에 도입하여 서열번호 9의 융합단백질을 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃, 125 RPM, CO2 8%의 농도인 환경에서 7일 배양 후 배양액을 수거하여 융합단백질을 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질을 "GI-101"로 명명하였다.
정제는 MabSelect SuRe protein A resin이 포함된 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.4의 조건에서 융합단백질을 결합시켰다. 그 후, 100 mM NaCl, pH 3의 100 mM의 아세트산으로 용출하였다. pH 9의 20%의 1M Tris-HCl을 수거용 튜브에 넣은 후, 융합단백질 이량체를 수거하였다. 수거된 융합단백질 이량체를 16시간 동안 PBS 버퍼로 투석하여 바꾸어 주었다.
그 후, TSKgel G3000SWXL column(TOSOH Bioscience)을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 이용하여 시간에 따른 280 nm 파장에서의 흡광도를 측정하여 고농도 융합단백질 이량체를 확보하였다. 이때, 분리 정제된 융합단백질 이량체를 reduced(R) 또는 non-reduced(NR) 조건하에서 SDS-PAGE를 실행하고, 코마시블루(coomassie blue)로 염색하여 그 순도를 확인하였다(도 1). NanoDrop을 사용하여 검출시 2.78 ㎎/㎖의 농도로 융합단백질 이량체가 포함된 것을 확인하였다(도 2). 또한, 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과는 도 3에 나타낸 바와 같다.
실시예 1. 최적 버퍼/pH 조건 평가
CD80 단백질 및 IL-2 단백질의 융합단백질 이량체(GI-101)를 포함하는 액상 제제에 대하여 최적의 버퍼/pH를 결정하기 위해 총 8종의 버퍼/pH를 스크리닝하였다. 최적 버퍼/pH를 선정하기 위해 안정성 시험(40℃, 2주)을 수행하였다.
버퍼/pH 스크리닝 샘플을 40℃에서 2주 동안 보관한 다음, SEC(Size Exclusion Chromatography)을 이용하여 샘플을 분석하였다. GI-101 단백질의 크기 배제 프로파일을 확인하기 위해 HPLC(Waters, e2695 and Thermo scientific, Ultimate 3000)를 사용하여 SEC을 수행하였다. 214 nm에서 크로마토그램을 사용하여 모노머(monomer)의 %면적을 계산하였다.
제형 개발 동안 SEC 프로파일은 %모노머를 최대화하는 것을 목표로 하였다. 버퍼/pH 스크리닝을 위한 안정성 시험 결과는 표 1에 요약하였다. 히스티딘 버퍼, pH 7.0을 포함하는 샘플 #6이 다른 샘플보다 적은 변화를 나타냈다.
No. 구분 SEC (%모노머) 변화율 (%) *
1 구연산염 버퍼, pH 4.5 0.00 -100
2 구연산염 버퍼, pH 5.0 0.00 -100
3 히스티딘 버퍼, pH 5.5 0.00 -100
4 히스티딘 버퍼, pH 6.0 10.60 -88.52
5 히스티딘 버퍼, pH 6.5 6.48 -92.95
6 히스티딘 버퍼, pH 7.0 36.91 -60.15
7 인산염 버퍼, pH 7.0 8.46 -90.76
8 인산염 버퍼, pH 7.5 0.00 -100
*변화율 = (40℃, 2주 보관 후 데이터 - 초기 데이터)/초기 데이터 × 100
안정성 시험 데이터를 기초로 pH 7.0의 히스티딘 버퍼를 GI-101에 대한 버퍼로 결정하였다.
구성 농도
히스티딘 버퍼, pH 7.0 20 mM
실시예 2. 부형제(excipient) 스크리닝 시험
실시예 2.1. 부형제 스크리닝
GI-101을 포함하는 액상 제제에 대한 부형제를 결정하기 위해 실시예 1에서 선정한 버퍼/pH(히스티딘 버퍼, pH 7.0) 조건하에서 부형제 스크리닝 시험을 수행하였다.
8가지 상이한 부형제[폴리소르베이트 80(Polysorbate 80), 폴록사머 188(Poloxamer 188), 아르기닌-HCl(L-Arginine Monohydrochloride), L-메티오닌(L-Methionine), D-만니톨(D-Mannitol), 소르비톨(Sorbitol), 수크로오스(Sucrose) 및 D-(+)-트레할로스 2수화물(D-(+)- Trehalose Dihydrate)]에 대하여 5가지 다른 테스트 조건에서 수행하여 얻은 Tm & Tagg, SEC 및 육안 입자 테스트 결과를 통계적으로 분석하여 부형제로 폴록사머 188, 아르기닌-HCl 및 수크로오스를 선택하였다.
부형제 종류 계면활성제 아미노산 당류
선정 폴록사머 188 아르기닌-HCl 수크로오스
실시예 2.2. 부형제 최적 농도 스크리닝
실시예 2.1.에 따라 폴록사머 188, 아르기닌-HCl 및 수크로오스가 GI-101을 포함하는 액상 제제에 대한 부형제로 선택되었다.
3개 부형제 조합에 대한 최적 농도를 찾기 위해 각 부형제의 농도를 달리하여 16가지 조건에서 스크리닝 시험을 수행하였다.
실시예 2.2.1. 열 안정성 시험(40℃, 2주)
16가지 부형제 스크리닝 시험 샘플을 40℃에서 2주 동안 보관한 다음, 단백질 농도(A280) 및 SEC 시험을 통해 샘플을 분석하였다. 그 결과는 표 4에 기재하였다.
No. A280 SEC
단백질 농도
(mg/mL) 		변화율 (%) 모노머 (%) 변화율 (%)
1 8.38 1.3% 42.86 -54.4%
2 8.45 -0.2% 67.26 -28.3%
3 8.69 4.8% 14.42 -84.6%
4 8.37 0.2% 63.08 -32.6%
5 8.33 -1.9% 63.37 -32.5%
6 8.45 1.7% 42.86 -53.9%
7 8.74 4.8% 14.97 -84.1%
8 8.46 1.2% 38.19 -59.2%
9 8.46 1.3% 64.98 -30.6%
10 8.35 -1.1% 81.92 -12.5%
11 8.44 0.2% 81.28 -12.8%
12 8.45 0.5% 61.95 -33.6%
13 8.49 0.1% 65.6 -30.0%
14 8.43 0.8% 65.26 -30.3%
15 8.45 1.4% 39.29 -58.1%
16 8.41 0.5% 80.12 -14.4%
실시예 2.2.2. RSM 및 모의실험 결과
각 부형제의 최적 농도를 결정하기 위해 RSM(Response surface model)을 사용하였다. 예측 프로파일러에서 각 부형제의 농도를 조정하여 최적의 반응을 찾을 수 있었다. 예측 프로파일러에 의해 예측된 결과에서 수크로오스의 농도는 실험의 최대값인 150 mg/mL가 최적인 것으로 설정되었다. 따라서, 아르기닌-HCl 및 폴록사머 188 농도만을 시뮬레이션하여 설정하였다. 예측된 각 부형제의 최적 농도 범위는 표 5에 기재하였다.
부형제 범위
폴록사머 188 0.05 내지 0.075 w/w%
아르기닌-HCl 10 내지 20 mg/mL
수크로오스 150 mg/mL
실시예 2.3. 최종 안정성 시험(4주)
표 5의 각 부형제에 대한 최적 농도 범위를 기초로 표 6의 최종 제형 후보를 도출하였다. 표 6의 제형 후보에 대하여 최종 4주 안정성 시험을 실시하였다.
부형제 폴록사머 188 아르기닌-HCl 수크로오스
최적 조건 0.07 w/w% 15 mg/mL 150 mg/mL
목표 범위 0.065 내지 0.075 w/w% 14 내지 16 mg/mL 140 내지 160 mg/mL
총 5가지의 상이한 조건으로 제형 후보의 안정성을 시험하였다. 샘플 준비 직후 방출 시험(t=0)을 수행하고 후보 샘플을 5℃(장기 조건), -70℃(장기 제2 조건), 25℃(가속 조건) 및 40℃(가혹 조건)에서 각각 4주 동안 보관하였다. 특히, 40℃ 안정성 시험(가혹 조건)의 경우, 변화 추이를 확인하기 위해 2주 시점에 추가로 샘플을 채취하였다. 각 조건에서 4주 동안 보관한 후 SEC, 단백질 농도(A280) 및 pH 시험을 통해 샘플을 분석하였다. GI-101 제형 후보에 대한 최종 안정성 시험 결과는 표 7에 기재하였다.
시험 조건 단백질 농도 (mg/mL) pH SEC (%모노머)
장기 조건 (5℃, 4주) 8.01 7.11 94.50
장기 제2 조건 (-70℃, 4주) 8.01 7.08 94.30
가속 조건 (25℃, 4주) 8.05 7.11 94.90
가혹 조건 (40℃, 2주) 8.15 7.15 78.13
가혹 조건 (40℃, 4주) 8.12 7.05 65.00
안정성 시험 결과, 제형 후보는 -70℃, 5℃ 및 25℃ 조건에서 안정적인 상태를 나타냈다. 이러한 결과를 GI-101에 대한 최종 제형은 GI-101 8 mg/mL, 히스티딘 버퍼 (pH 7.0) 20 mM, 폴록사머 188 0.07 w/w%, 아르기닌-HCl 15 mg/mL 및 수크로오스 150 mg/mL로 결정하였다.
물질 목표 농도 범위
GI-101 8 mg/mL 7.2 내지 8.8 mg/mL
버퍼 히스티딘 버퍼: 20 mM N/A
pH pH 7.0 pH 6.8 내지 7.2
계면활성제 폴록사머 188: 0.07 w/w% 0.065 내지 0.075 w/w%
아미노산 아르기닌-HCl: 15 mg/mL 14 내지 16 mg/mL
당류 수크로오스: 150 mg/mL 140 내지 160 mg/mL
실시예 3. 폴리소르베이트 80 첨가 시험
실시예 2.3.에서 결정한 제형 후보를 사용하여 GI-101 원료의약품을 생산하는 과정에서 가시적인 입자가 발견되어 추가적으로 제형을 개발하였다. 가시적인 입자는 원료의약품에 존재하는 실리콘이 물리적 스트레스에 의해 단백질과 결합하여 실리콘-단백질 복합체를 형성하여 나타나는 것으로 확인되었다. 원료의약품 생산 공정에서 실리콘을 제거하거나 물리적인 스트레스를 완화하는 데 한계가 있기 때문에 실리콘-단백질 복합체의 형성을 억제하는 새로운 제형을 개발하여 문제점을 해결하고자 하였다. 폴록사머 188이 실리콘-단백질 복합체의 형성을 억제하는 데 비효율적인 계면활성제라는 점이 보고된 바 있어, 이를 바탕으로 계면활성제로 폴리소르베이트 80(PS80)을 추가하는 실험을 수행하였다.
구체적으로 GI-101 DS(GI-101 4 mg/mL, 히스티딘 버퍼(pH 7.0) 20 mM, 폴록사머 188 0.07 w/w%, 아르기닌-HCl 15 mg/mL 및 수크로오스 150 mg/mL)에 폴리소르베이트 80을 농도별(0 w/w%, 0.02 w/w%, 0.04 w/w%, 0.06 w/w%, 0.08 w/w%, 0.1 w/w%)로 첨가하여 시험을 수행하였다. GI-101의 농도는 장기 안정성을 높이기 위해 4 mg/mL로 조정하였다.
실시예 3.1. 육안 입자 관찰
조건별로 각 3개 튜브를 시험하였고, 3개 중 하나에서만 입자가 관찰된 경우에도 O('입자 관찰')으로 표시하였다(표 9).
조건 GI-101 DS + 0 w/w% PS80 GI-101 DS + 0.02 w/w% PS80 GI-101 DS + 0.04 w/w% PS80 GI-101 DS + 0.06 w/w% PS80 GI-101 DS + 0.08 w/w% PS80 GI-101 DS + 0.1 w/w% PS80 8 mg/mL GI-101 w/o PS80
방출 시점
(0 Time)		 X X X X X X X
물리적 스트레스
(지속적)		 O 시험안함 시험안함 시험안함 시험안함 시험안함 O
1주 물리적
스트레스		 X X X X X X 시험안함
5℃ 보관 X X X X X X 시험안함
25℃ 보관 X X X X X X 시험안함
2주 물리적
스트레스		 X X X X X X 시험안함
5℃ 보관 X X X X X X 시험안함
25℃ 보관 X X X X X X 시험안함
3주 물리적
스트레스		 O X O X X X 시험안함
5℃ 보관 O X O X X X 시험안함
25℃ 보관 O O O O X X 시험안함
4주 물리적
스트레스		 시험안함 시험안함 시험안함 시험안함 X X 시험안함
5℃ 보관 시험안함 시험안함 시험안함 시험안함 X X 시험안함
25℃ 보관 시험안함 시험안함 시험안함 시험안함 X X 시험안함
0.08 w/w% 이상의 PS80을 첨가한 샘플에서는 4주까지 입자가 관찰되지 않았다. 3주차에 입자가 관찰된 샘플의 경우에는 4주차 실험을 수행하지 않았다.
실시예 3.2. 품질 영향에 대한 평가
폴리소르베이트 80(PS80) 첨가에 따른 품질 영향을 조사하기 위해 0.1 w/w% PS80을 첨가한 샘플의 단백질 농도, 전하 변이 및 순도를 측정하였다. 0.1 w/w% PS80을 첨가한 샘플을 최대 4주 동안 관찰한 결과, 품질이 유지되는 것을 확인하였다. 표 10에 각 조건에 대한 측정 결과를 표시하였다.
분석 도구 단위 GI-101 DS + 0.1 w/w% PS80 GI-101 DS + 0.1 w/w% PS80 GI-101 DS + 0.1 w/w% PS80 GI-101 DS + 0.1 w/w% PS80
0T 물리적
스트레스 		5℃, 4주 25℃, 4주
A280 (단백질양) mg/mL 4.23 4.22 4.21 4.23
icIEF Peak 1 - Information only Area % 11.88
(pI: 5.32)		 11.21
(pI: 5.31)		 11.19
(pI: 5.32)		 12.11
(pI: 5.32)
Peak 2 - Information only Area % 23.99
(pI: 5.48)		 25.21
(pI: 5.50)		 24.53
(pI: 5.50)		 26.77
(pI: 5.48)
Peak 3 - Information only Area % 64.13 (pI: 5.62) 63.58
(pI: 5.63)		 64.28
(pI: 5.60)		 61.13
(pI: 5.60)
SE-HPLC HMWS % 1.43 1.66 1.63 1.39
Monomer % 98.2 97.96 97.97 97.9
LMWS % 0.37 0.38 0.4 0.71
고농도의 PS80 첨가가 가시적인 입자를 감소시키는데 효과적이라는 점을 고려하여 PS80의 농도를 0.1 w/w%로 결정하였다. 이러한 결과를 종합하여 GI-101에 대한 최종 제형 조건은 아래 표 11과 같이 결정되었다.
물질 목표 농도 범위
GI-101 4 mg/mL 3.6 내지 4.4 mg/mL
버퍼 히스티딘 버퍼: 20 mM N/A
pH pH 7.0 pH 6.8 내지 7.2
계면활성제 폴록사머 188: 0.07 w/w% 0.065 내지 0.075 w/w%
폴리소르베이트 80: 0.1 w/w% 0.09 내지 0.11 w/w%
아미노산 아르기닌-HCl: 15 mg/mL 14 내지 16 mg/mL
당류 수크로오스: 150 mg/mL 140 내지 160 mg/mL

Claims (24)

  1. (ⅰ) 3.0 mg/mL 내지 5.0 mg/mL 농도의, IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질 이량체;
    (ⅱ) 10 mM 내지 30 mM 농도의 버퍼; 및
    (ⅲ) 0.155 w/w% 내지 0.185 w/w% 농도의 계면활성제;
    를 포함하는 약제학적 제형으로서, 상기 제형이 pH 6.5 내지 7.5를 갖는, 약제학적 제형.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 융합단백질 이량체는 3.6 mg/mL 내지 4.4 mg/mL 농도인 것인, 약제학적 제형.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 버퍼는 히스티딘인 것인, 약제학적 제형.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 히스티딘은 20 mM 농도인 것인, 약제학적 제형.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 제형이 pH 6.8 내지 7.2를 갖는 것인, 약제학적 제형.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 제형이 pH 7.0를 갖는 것인, 약제학적 제형.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 28, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 65, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 81, 폴리소르베이트 85, 폴록사머 181, 폴록사머 188, 폴록사머 407 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 이루어진 군에서 선택되는 두 개인 것인, 약제학적 제형.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 계면활성제는 폴록사머 188 및 폴리소르베이트 80인 것인, 약제학적 제형.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 폴록사머 188는 0.065 w/w% 내지 0.075 w/w% 농도이며,
    상기 폴리소르베이트 80은 0.09 w/w% 내지 0.11 w/w% 농도인 것인, 약제학적 제형.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 약제학적 제형은 추가적으로 아미노산을 더 포함하는 것인, 약제학적 제형.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 아미노산은 아르기닌, 히스티딘, 라이신, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 셀로노시스테인, 글라이신, 프롤린, 알라닌, 발린, 이소루신, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 약제학적 제형.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 아미노산은 아르기닌인 것인, 약제학적 제형.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 아미노산은 10 mg/mL 내지 30 mg/mL 농도인 것인, 약제학적 제형.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 아미노산은 14 mg/mL 내지 16 mg/mL 농도인 것인, 약제학적 제형.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 아미노산은 15 mg/mL 농도인, 약제학적 제형.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 약제학적 제형은 추가적으로 당류를 더 포함하는 것인, 약제학적 제형.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 당류는 수크로오스, 소르비톨, 글리세롤, 트레할로스 및 만니톨로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 약제학적 제형.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 당류는 120 mg/mL 내지 180 mg/mL 농도인 것인, 약제학적 제형.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 당류는 140 mg/mL 내지 160 mg/mL 농도인 것인, 약제학적 제형.
  20. 제17항에 있어서,
    상기 당류는 수크로오스인 것인, 약제학적 제형.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 수크로오스는 150 mg/mL 농도인 것인, 약제학적 제형.
  22. (ⅰ) 3.0 mg/mL 내지 5.0 mg/mL 농도의, IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질 이량체;
    (ⅱ) 10 mM 내지 30 mM 농도의 히스티딘;
    (ⅲ) 0.065 w/w% 내지 0.075 w/w% 농도의 폴록사머 188;
    (ⅳ) 0.09 w/w% 내지 0.11 w/w% 농도의 폴리소르베이트 80;
    (ⅴ) 10 mg/mL 내지 30 mg/mL 농도의 아르기닌; 및
    (ⅵ) 120 mg/mL 내지 180 mg/mL 농도의 수크로오스를 포함하는 약제학적 제형으로서, 상기 제형이 pH 6.5 내지 7.5를 갖는, 약제학적 제형.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 제형은 정맥 투여를 위한 것인, 약제학적 제형.
  24. 제22항에 있어서,
    상기 제형은 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료를 위한 것인, 약제학적 제형.
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