KR102682118B1 - Ccl3 변이체를 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

Ccl3 변이체를 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생체 내 지속성, 단백질 안정성 및 약리활성이 개선된 CCL3 변이체를 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로는 야생형 CCL3α 또는 CCL3β의 N-말단 아미노산이 결실되고, 특정 위치의 아미노산이 야생형 CCL3α 또는 CCL3β 중 동일 위치의 아미노산과 달리 치환된 CCL3 변이체와 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질 및 이의 림프구 감소증, 암 치료 또는 감염 치료제 용도에 관한 것이다.

Description

CCL3 변이체를 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도 {Fusion Protein Comprising CCL3 Variants And Use Thereof}
본 발명은 생체 내 지속성, 단백질 안정성 및 약리활성이 개선된 CCL3 변이체를 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로는 야생형 CCL3α 또는 CCL3β의 N-말단 아미노산이 결실되고, 특정 위치의 아미노산이 야생형 CCL3α 또는 CCL3β 중 동일 위치의 아미노산과 달리 치환된 CCL3 변이체와 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질 및 이의 림프구 감소증, 암 치료 또는 감염 치료제 용도에 관한 것이다.
케모카인은 화학주기성을 나타내는 사이토카인으로서 다양한 면역세포에서 분비되며, 면역세포에서 발현되는 케모카인 수용체와 결합하여 면역세포의 생체 내 이동성을 촉진시키는 작용을 한다. 이 중에서 CCL3 (CC type ligand 3)는 마크로파지를 비롯한 면역세포에서 분비되어 CCR1/CCR5 (CC type receptor)를 발현하는 수지상세포, T 세포, 모노사이트, 뉴트로필 등의 면역세포 이동성에 관여하는 것으로 알려진 케모카인이다 (Cytokine & Growth Factor Reviews (2002) 13:455-481).
CCL3는 MIP-1α (Macrophage inflammatory protein-1α)로 알려져 있으며, 마우스의 경우 한 가지 아형만이 존재하지만, 인간의 경우 두 가지 아형이 존재한다 (Cytokine & Growth Factor Reviews (2002) 13:455-481). 따라서, 마우스와 상동성이 있는 것은 α 형태 (LD78α 혹은 CCL3α, 이하 CCL3α)이고, 진화의 과정 중 유전자의 변이에 따라 생성된 β 형태 (LD78β 혹은 CCL3β, 이하 CCL3β)를 포함한다.
종래 CCL3는 마우스의 골수 내 미성숙 혈액 줄기 세포의 분열 및 분화를 억제시키고, 혈중 내 면역세포의 농도를 증가시킬 수 있음이 알려져 있다 (Nat Rev Immunol.(2006) 6(2):159-64). 이를 통해 다양한 항암제에서 나타나는 림프구 감소증 (Lymphopenia)의 치료를 위한 치료제 타겟으로 사용된 바 있다 (Exp. Hematol. (1999) 27:195-202, Cytokine & Growth Factor Reviews (2002) 13:455-481). 또한, 혈중 수지상 세포의 농도를 증가시키는 효과도 가지므로, 종양 특이적 항원을 혈액으로 노출시킬 수 있는 치료법과 병용으로 사용시 새로운 면역항암제로서의 잠재성을 가질 수 있음이 알려져 있다 (Clin Cancer Res. (2008) 14(4):1159-1166, European Journal of Cancer (1998) 34(7):1023-1029).
한편, CCL3는 반감기가 매우 짧으며 고농도에서 침전되므로 생물치료제로서 직접 사용하기에 적합하지 않다. CCL3의 생체 내 반감기는 인간에서 정맥 투여 시 약 1.7시간 이내로 짧기 때문에 CCL3를 항암제나 림프구 감소증 치료제로 개발한다면 매일 투여를 해야 하는 단점이 있다 (European Journal of Cancer (1998) 34(7):1023-1029). 또한, 0.1 mg/mL의 저농도에서도 고분자 물질 형성에 의한 침전이 형성되는 단점이 있다 (Blood. (1995) 86(12):4400-4408).
이에, CCL3를 의약품 또는 면역항암제로 개발하기 위해, 야생형 CCL3의 일부 아미노산을 치환 또는 제거하여 CCL3 변이체를 제작하거나, 및/또는 CCL3에 고분자 또는 추가 단백질을 융합시켜 융합 단백질을 제작하는 것을 고려할 수 있다. 고분자 또는 추가 단백질 융합에 의해 그 반감기가 증가될 수 있다고 알려져 있다. 예를 들어, 인간 알부민에 활성 단백질을 결합시키거나, 폴리에틸렌글리콜 (PEG)에 결합될 수 있다. 다만, 인간 알부민 결합에 의해서는 체류 시간이 약간 증가될 뿐이고, PEG 결합시 입체 장애로 인해 수용체 결합 친화력을 감소시킬 수 있다는 문제점이 있다.
이를 고려하여, 최근에는 면역글로불린 (Ig)을 사용한 융합 단백질을 통해 생체 내 반감기를 증가시키기 위한 연구 및 개발이 시도되고 있다. 인간 Ig (hIg)는 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE와 같은 다양한 부류 (class)를 포함하고, 인간 IgG는 인간 IgG1 (hIgG1), 인간 IgG2 (hIgG2), 인간 IgG3 (hIgG3), 및 인간 IgG4 (hIgG4)로 알려진 다양한 아형 (subtypes)으로 더 분류될 수 있다.
또한, 면역글로불린은 네 개의 폴리펩타이드 사슬이 포함되는데, 두 개의 중쇄 (heavy chains) 및 두 개의 경쇄 (light chains)가 사량체 (tetramer)를 형성하기 위해 이황화 결합 (disulfide bonds)을 통해 연결되어 있다. 각 사슬은 가변 영역 (variable region) 및 불변 영역 (constant region)을 포함하며, 중쇄 불변영역은 아이소타입 (isotypes)에 따라 셋 (CH1, CH2 및 CH3) 또는 네 부위 (CH1, CH2, CH3 및 CH4)로 추가 분류되고, 힌지 (hinge), CH2, CH3 및/또는 CH4 도메인을 포함한다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 야생형 CCL3α 또는 CCL3β의 N-말단 아미노산이 결실되고, 특정 위치의 아미노산이 야생형 CCL3α 또는 CCL3β 중 동일 위치의 아미노산과 달리 치환된 CCL3 변이체와 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질의 경우, 생체 내 반감기를 증가시키고, 안정성이 개선되며, 약효 향상 효과를 나타낼 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
상기와 같은 문제를 해결하기 위하여, 본 발명의 목적은 야생형 CCL3에서 일부 아미노산이 치환 및 결실된 CCL3 변이체와 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 또한, 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 또한, 상기 융합 단백질의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 또한, 상기 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 더욱이, 야생형 CCL3β에서 일부 아미노산이 치환 및 결실된 CCL3β 변이체를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음의 변이를 포함하는 CCL3 변이체와 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 제공한다: (1) 야생형 CCL3의 N 말단으로부터 하나 또는 두 개의 아미노산이 결실; 및 (2) 야생형 CCL3의 N 말단으로부터 27번 아스파르트산이 알라닌으로 치환.
본 발명은 또한, 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 융합 단백질의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 더욱이, 다음의 변이를 포함하는 CCL3β (CC type ligand 3β) 변이체를 제공한다: (1) 야생형 CCL3β의 N 말단으로부터 하나 또는 두 개의 아미노산이 결실; 및 (2) 야생형 CCL3β의 N 말단으로부터 27번 아스파르트산이 알라닌으로 치환.
본 발명에 따른 CCL3 변이체를 포함하는 융합 단백질은 CCL3의 활성 감소가 최소화되면서도, 면역원성 위험성이 적고, 안정성 문제가 없으면서도 체내 반감기가 증가하여 목적하는 약물 동태 프로필을 나타냄으로써, 체내 지속성, 단백질의 물성 및 약리학적 효능이 개선될 수 있음을 확인하였다. 상기 CCL3 변이체를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물은 림프구 감소증, 암 또는 감염 치료제로 이용할 수 있다.
도 1은 THP-1 세포주를 사용하여 CCL3 변이체 융합 단백질 CCL3B-H05, CCL3B-H40의 시험관 내 화학주기 활성을 측정한 그래프이다.
도 2는 THP-1 세포주를 사용하여 CCL3와 CCL3 변이체 융합 단백질 CCL3A-H05, CCL3B-H05의 시험관 내 화학주기 활성을 측정한 그래프이다.
도 3은 융합 단백질의 CCR1 수용체에 대한 반응성을 평가하기 위해, CCR1이 발현되어 있는 세포주를 이용하여 CCL3와 CCL3 변이체 융합 단백질 CCL3A-H05 및 CCL3B-H05의 시험관 내 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 마우스에 CCL3 변이체 융합 단백질 CCL3B-H05를 3mg/kg 및 10mg/kg 용량별로 정맥 주사한 후 144시간까지의 혈액 샘플 내 CCL3B-H05의 혈중 농도를 측정하여 약물 동태 파라미터를 산출한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 CCL3 변이체 융합 단백질 CCL3B-H05의 마우스 간암에 대한 종양 성장 억제 효능 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 실험예 4에서의 약물 처치 스케줄을 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
일반적인 단백질의 반감기 증가를 위한 여러 지속형 기술 중 Fc 융합 기술은 체내 반감기가 증가하면서 독성이나 면역반응 유발과 같은 부작용 우려가 적다는 점에서 가장 많이 활용되고 있다. Fc 융합 CCL3 및/또는 이의 변이체를 지속형 치료용 약물로 개발하기 위해서는 다음과 같은 여러 조건을 충족해야 한다.
첫째, 융합에 의한 시험관 내 활성 감소가 적어야 한다. 일반적으로 케모카인처럼 작은 단백질의 경우 크기가 상대적으로 큰 Fc와 융합시킬 경우 융합 위치 및 링커에 따라 활성이 크게 달라진다고 알려져 있다. 따라서, CCL3 및/또는 이의 변이체와 Fc 융합 단백질의 활성은 융합 여부 또는 위치에 따라 달라질 수 있다.
둘째, 대부분의 바이오의약품의 경우 환자에서 면역원성이 발생할 수 있다는 점을 감안하면, 융합 링커 또는 돌연변이에 의한 면역원성 위험성이 적어야 한다.
셋째, 융합 위치나 돌연변이 도입에 의한 안정성 문제가 없어야 한다.
넷째, 융합한 면역글로불린의 종류 (isotype)에 따라 원치 않는 면역 반응을 야기할 수 있기 때문에, 이에 대한 대안이 필요하다.
이러한 조건을 고려하여, 본 출원의 발명자들은 CCL3의 생리학적 활성 및 물성을 개선시키기 위해 노력하던 중, CCL3의 특정 위치에 돌연변이를 도입, 인위적으로 N-말단 아미노산을 제거하고, 면역글로불린 Fc 영역을 결합시킬 경우, CCL3의 활성을 높이면서 생체 내 노출 정도 및 반감기가 증가하고 약리 효능이 개선되는 것을 확인하였다.
이에 기초하여, 일 관점에서, 본 발명은 다음의 변이를 포함하는 CCL3 (CC type ligand 3) 변이체와 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다: (1) 야생형 CCL3의 N 말단으로부터 하나 또는 두 개의 아미노산이 결실; 및 (2) 야생형 CCL3의 N 말단으로부터 27번 아스파르트산이 알라닌으로 치환.
상기 CCL3는 수지상 세포 및 T 세포, 모노사이트, 뉴트로필 등의 면역세포의 이동성 항상성에 있어서 중요한 역할을 한다고 알려진 케모카인으로, 인간, 마우스, 돼지, 원숭이 등의 포유류에서 유래된 것일 수 있다. 예를 들어, 인간의 경우 두 가지 아형이 존재한다. 마우스와 상동성이 있는 것은 α형태 (이하 CCL3α)이고, 진화의 과정 중 유전자의 변이에 따라 생성된 β형태 (이하 CCL3β)를 포함한다. 구체적으로, 상기 야생형 CCL3은 예를 들어, 서열번호 1로 표시되는 서열을 포함하는 인간 야생형 CCL3α 또는 서열번호 3으로 표시되는 서열을 포함하는 인간 야생형 CCL3β 단백질일 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 CCL3 변이체는 서열번호 1로 표시되는 서열을 포함하는 인간 야생형 CCL3α에서 N-말단으로부터 첫번째 아미노산인 알라닌이 결실되고, N-말단으로부터 27번 아스파르트산이 알라닌으로 치환된 CCL3α 변이체를 포함할 수 있다. 상기 CCL3α 변이체는 예를 들어, 서열번호 2로 표시되는 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 상기 CCL3 변이체는 서열번호 3으로 표시되는 서열을 포함하는 인간 야생형 CCL3β에서 N-말단으로부터 두 개의 아미노산인 알라닌-프롤린 (AP)이 결실되고, N-말단으로부터 27번 아미노산 아스파르트산이 알라닌으로 치환된 CCL3β 변이체를 포함할 수 있다. 상기 CCL3β 변이체는 예를 들어, 서열번호 4로 표시되는 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서의 "Fc 영역"은 면역글로불린의 중쇄와 경쇄의 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 1 (CL1)은 포함하지 않는 단백질을 의미하며, 상기 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 IgD로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 Fc 영역, 이의 단편 또는 이들의 조합을 포함하는 하이브리드 Fc일 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 하이브리드 Fc는 예를 들어, IgD 힌지 영역 및 CH2 N-말단 영역 + IG4 CH2 및 CH3 영역을 포함할 수 있으며, 예를 들어 서열번호 14로 표시되는 서열을 포함할 수 있다. 상기 하이브리드 Fc는 예를 들어, 한국등록특허 제0897938호에 개시된 하이브리드 Fc 형태를 동일하게 차용하여 사용할 수 있고, 본 명세서에 참조로서 도입된다.
또 다른 실시예에서, 상기 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 Fc 영역, 이의 단편 또는 이들의 조합을 포함하는 하이브리드 Fc일 수 있다.
상기 Fc 영역은 면역글로불린을 구성하는 Fc 영역 전체를 포함할 수 있고, 경우에 따라서 이의 단편, 또는 Fc 영역 변이체를 포함할 수 있다. 일부 아미노산이 치환되거나, 서로 다른 종류의 Fc 영역을 조합한 Fc 영역 변이체도 포함될 수 있다. Fc 영역 변이체는 힌지 부위에서 절단되는 것을 예방하기 위해 변형될 수 있다. 또한, 상기 Fc의 힌지 서열은 항체 의존 세포 매개 세포독성 (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity; ADCC)이나 보체 의존 세포독성 (complemant-dependent cytotoxicity; CDC)을 줄이기 위해 아미노산 서열 일부가 치환될 수 있다. 또한, 상기 Fc의 힌지 서열은 Fab 영역의 재배열을 억제하기 위해 아미노산 서열 일부가 치환될 수 있다. 나아가, Fc 영역 C-말단의 라이신 (K)은 제거될 수 있다.
또한, 본 발명의 Fc 단편은 야생형 당쇄, 야생형에 비해 증가된 당쇄, 야생형에 비해 감소한 당쇄, 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 상기 당쇄의 증가, 감소 또는 제거는 화학적 방법, 효소적 방법 및 미생물을 사용한 유전공학적 엔지니어링 방법 등과 같은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 수행될 수 있다.
상기 면역글로불린 Fc 영역은 CCL3 변이체가 Fc 영역의 N 말단 또는 C 말단에 직접 연결된 형태이거나, 링커를 통해 연결된 형태일 수 있다. 상기 면역글로불린 Fc 영역이 CCL3 변이체와 직접 연결된 형태인 경우, 예를 들어 본 발명은 서열번호 2의 CCL3α 변이체 또는 서열번호 4의 CCL3β 변이체가 서열번호 14의 Fc 영역의 N 말단 또는 C 말단에 연결된 형태일 수 있다. CCL3와 Fc의 연결 형태는 CCL3가 Fc 영역의 N 말단에 연결된 형태가 바람직하다.
링커를 통해 연결되는 경우, 상기 링커는 Fc 단편의 N 말단, C 말단 또는 유리기 (free radical)에 연결될 수 있고, CCL3 변이체의 N-말단, C-말단 또는 유리기에 연결될 수 있다. 링커가 펩타이드 링커인 경우, 연결은 임의의 부위에서 일어날 수 있다. 예를 들면, 상기 링커가 상기 면역글로불린의 Fc 영역의 C 말단 및 상기 CCL3 변이체의 N 말단에 연결될 수 있다.
링커 및 Fc가 별개로 발현된 후에 서로 결합될 때, 링커는 당업계에 알려진 가교제일 수 있다. 상기 가교제는, 예를 들어, 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄 (1,1-bis(diazoacetyl)-2-phenylethane), 글루타르알데하이드 (glutaraldehyde), 4-아지도살리실릭산 (4-azidosalicylic acid)과 같은 N-하이드로옥시석신이미드 에스테르 (N-hydroxysuccinimide ester), 3,3'-디사이오비스(석신이미딜프로피오네이트) (3,3'-dithiobis(succinimidylpropionate))와 같은 디석신이미딜에스테르 (disuccinimidyl esters)를 포함하는 이미도에스테르 (imidoesters), 및 비스-N-말레이미도-1,8-옥테인과 같은 이중 기능적 말레이미드 (bifunctional maleimides)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 링커는 펩타이드일 수 있다. 구체적으로, 상기 링커는 10 내지 30개의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드일 수 있다. 하나의 실시예에서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 하기 식 1로 표시되는 링커를 통해 CCL3 변이체와 연결될 수 있다.
(RNT)nGRGG(EEKKK)m (식 1)
상기 식에서 n 및 m은 각각 1 내지 5이다. 상기 식에서 n은 아르기닌-아스파라긴-트레오닌 아미노산의 반복 횟수, m은 글루탐산-글루탐산-라이신-라이신-라이신 아미노산의 반복 횟수를 나타내며, 바람직하게 n 및 m 각각은 1 내지 3일 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 링커는 n 및 m 각각이 1 내지 3일 수 있음을 고려하여, 서열번호 5 내지 13으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 구체적 실시예에서는 RNTGRGGEEKKK (서열번호 5)의 서열을 포함하는 링커를 통해 면역글로불린 Fc 영역이 CCL3 변이체와 연결된 구조를 포함하였다. 실험예에 따르면, 서열번호 5로 표시되는 서열을 포함하는 링커를 통해 면역글로불린 Fc에 결합된 CCL3 변이체 융합 단백질의 화학주기 활성이 우수함을 확인하였다.
상기 융합 단백질은 하나 이상의 CCL3 변이체가 결합한 형태인 이량체 또는 다량체 CCL3 변이체가 면역글로불린의 Fc 영역에 결합한 형태일 수 있다. 또한, CCL3 변이체가 결합된 면역글로불린의 Fc 영역이 두 개 이상 결합된 이량체 또는 다량체 형태일 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 CCL3 변이체를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
상기 CCL3 변이체를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 분리하여 CCL3 변이체를 포함하는 융합 단백질을 재조합적으로 생산할 수 있다. 핵산을 분리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나 또는 추가로 발현시킨다. 이를 바탕으로, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 "핵산"은 DNA (gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다. 본 발명의 CCL3 변이체를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
본 발명의 핵산은 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 실질적인 동일성은 본 발명의 핵산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인 된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 핵산 서열을 의미한다.
상기 CCL3 변이체를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 DNA는 통상적인 과정을 사용하여 용이하게 분리 또는 합성한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 허용 가능한 벡터 성분에는 일반적으로 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 증강인자 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열 중 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다.
상기 벡터에서 CCL3 변이체 포함 융합 단백질을 코딩하는 핵산은 프로모터와 작동적으로 연결되어 있다.
"작동적으로 연결"은 핵산 발현조절서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40프로모터, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터엡스타인바 바이러스 (EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스 (RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
경우에 따라서, 벡터는 그로부터 발현되는 CCL3 변이체 포함 융합 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.
상기 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 언급된 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다. 상기 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 슈도모나스 (Pseudomonas) (예를 들면, 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida)), 프로테우스미라빌리스 (Proteus mirabilis) 및 스타필로코쿠스 (Staphylococcus) (예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스 (Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 이용할 수 있다.
다만, 동물 세포에 대한 관심이 가장 크며, 유용한 숙주 세포주의 예는 COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S, 또는 HT1080일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포에서 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 CCL3 변이체 포함 융합 단백질의 제조방법에 관한 것이다.
상기 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지 중 제한 없이 배양 배지로서 사용할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주 세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
상기 CCL3 변이체 포함 융합 단백질의 회수는 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화 크로마토그래피 등을 이용하여 정제할 수 있다. 추가의 기타 정제 기술 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 CCL3 변이체 포함 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 약학 조성물은 치료 유효량의 CCL3 변이체 포함 융합 단백질 및 제약상 허용되는 담체를 포함할 수 있다. "제약상 (약학적으로) 허용되는 담체"는 제제를 제제화하거나 또는 안정화시키는 것을 돕기 위해서 활성 성분에 추가될 수 있는 물질이고, 환자에게 유의한 해로운 독성 효과를 야기하지 않는다.
상기 담체는 환자를 자극하지 않고 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
제약상 허용되는 담체는 멸균 주사 가능한 용액제 또는 분산액제를 즉각 투여용 (extemporaneous)으로 제조하기 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 제약 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 조성물은 바람직하게는 비경구 주사용으로 제제화된다. 조성물은 용액제, 마이크로에멀젼제, 리포좀제, 또는 높은 약물 농도에 적합한 기타 주문된 구조물로서 제제화될 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이것들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 일부 경우에, 조성물 중에 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 포함시킬 수 있다. 멸균 주사가능한 용액제는 필요한 양의 활성 화합물을 필요에 따라 상기 기재된 성분들 중 1종 또는 이것들의 조합물과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 후에 멸균 마이크로여과를 수행하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액제는 활성 화합물을 기본적인 분산 매질 및 상기 기재된 것들로부터의 기타 필요한 성분을 함유하는 멸균 비히클로 혼입시켜 제조된다. 멸균 주사가능한 용액제를 제조하기 위한 멸균 분말의 경우, 일부 제조 방법은 활성 성분 및 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 이것의 미리 멸균-여과시킨 용액으로부터 생성하는 진공 건조 및 냉동-건조 (동결건조)이다.
또한, 본 발명은 상기 CCL3 변이체 포함 융합 단백질을 포함하는 CCL3-연관 장애를 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이거나, 치료가 필요한 개체에 CCL3 변이체 포함 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하는 CCL3-연관 장애를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
상기 CCL3-연관 장애는 예를 들어, 림프구 감소증, 각종 암, 감염증을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 CCL3 변이체 포함 융합 단백질은 방사선 조사로 유발된 암세포 사멸 반응과 연계하여 면역기능 활성화로 인한 암 조직 및/또는 암 세포 사멸을 유도할 수 있다. 이를 기초로, 하나의 실시예에서, 암 치료 또는 예방을 위한 방사선 치료 병용 또는 보조용 조성물일 수 있다.
상기 방사선은 예를 들어 감마선 또는 X선일 수 있고, 제한되지는 않으나 0.1 내지 50 Gy의 선량으로 조사할 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 10 Gy의 선량으로 조사할 수 있다. 상기 방사선의 조사량은 방사선 부작용에 의한 면역 저하 등을 고려하여 적절한 범위 내에서 조절될 수 있다.
상기 CCL3 변이체 포함 융합 단백질은 어떠한 경로로도 투여될 수 있다. 예를 들어, 직접적으로 (예, 조직 부위에 주입, 이식 또는 국부적으로 투여함으로써, 국소적으로) 또는 시스템적으로 (예, 비경구 또는 경구로) 임의의 적절한 수단에 의하여 동물에게 제공될 수 있다.
정맥 내, 피하, 눈 (ophthalmic), 복강 내, 근육 내, 구강, 직장, 안와 내 (intraorbital), 뇌 내 (intracerebral), 두개 내 (intracranial), 척추 내 (intraspinal), 뇌실 내 (intraventricular), 수막강 내 (intrathecal), 조내 (intracistenal), 캡슐 내 (intracapsular), 비 내 (intranasal) 또는 에어로졸 투여와 같이 비경구적으로 제공되는 경우, 예를 들어 수성 (aqueous) 이거나 생리학적으로 적용가능한 체액 현탁액 또는 용액의 부분을 포함할 수 있다. 이에 따라, 담체 또는 운반체 (vehicle)가 생리학적으로 허용 가능하므로 융합단백질에 첨가하여 환자에게 전달될 수 있다. 따라서, 제제를 위한 체액과 같은 담체로 일반적으로 생리식염수를 포함할 수 있다.
투여 빈도는 사용되는 제제 내의 CCL3 변이체 포함 융합단백질의 약동학적 파라미터에 따라 달라질 것이다. 전형적으로, 임상의는 목적 효과를 달성하는 투여량에 도달할 때까지 투여할 수 있다. 따라서, 단일 용량으로서, 시간 간격을 둔 2회 이상의 용량 (동일한 양의 목적 융합 단백질을 함유하거나 함유하지 않을 수 있음)으로서, 또는 이식 장치 또는 카테터를 통한 연속 주입으로서 투여될 수 있다. 적절한 투여량의 추가의 정밀화는 당업자에 의해 일상적으로 이루어지고, 그들에 의해 일상적으로 수행되는 업무 영역 내에 해당한다.
단위 투여량은 인간에 있어서 0.01 μg/체중kg 내지 100 mg/체중kg이며, 구체적으로, 1 μg/체중kg 내지 30 mg/체중kg이다. 상기 함량이 최적량이긴 하나, 치료대상 질환 및 부작용의 유무에 따라 달라질 수 있으며, 최적의 투여량은 통상적인 실험을 이용하여 결정될 수 있다. 융합 단백질의 투여는 주기적인 급속 주입 (periodic bolus injections)에 의하거나, 외측 공급원 (external reservoir) (예, 정맥주사 보유주머니 (intravenous bag)) 또는 내측 (예, 생체부식성 임플란트 (bioerodable implant))으로부터의 지속적인 정맥 내, 피하, 또는 복막 내 투여에 의할 수 있다.
투여 빈도는 상태의 중증도에 따라 달라진다. 빈도는 1주당 3회 내지 매 1주 또는 2주 마다 1회의 범위일 수 있다.
경우에 따라서, 상기 CCL3 변이체 포함 융합 단백질은 다른 생물학적 활성 분자와 함께 대상 수용체에 투여될 수 있다. 그러나 융합 단백질 및 다른 분자의 최적의 조합, 투여 형태, 정량은 당업계에서 잘 알려진 통상적인 실험을 통하여 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "치료 유효량"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 본 발명에 따른 CCL3 변이체 포함 융합 단백질의 양을 의미한다. 정확한 양은 치료 조성물의 성분 및 물리적 특징, 의도된 환자 집단, 개개의 환자의 고려사항 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 수많은 인자에 따라 달라질 것이고 당업자가 쉽게 결정할 수 있다. 이들 요인들을 완전하게 고려할 때, 부작용 없이 최대의 효과를 얻기에 충분한 최소량을 투여하는 것이 중요하며, 이 복용량은 분야의 전문가에 의하여 용이하게 결정될 수 있다.　
본 발명의 약학 조성물의 복용량은 특별하게 한정되지는 않으나, 환자의 건강 상태 및 체중, 질환의 중증도, 약제의 종류, 투여경로 및 투여시간을 포함한 다양한 요인에 따라 변경한다.　조성물은 하루에 1회량 또는 다회 용량으로 쥐 (rat), 생쥐 (mouse), 가축, 인간 등을 포함하는 포유류 내로 전형적으로 허용된 경로, 예를 들면, 경구로, 직장으로, 정맥으로 (intravenously), 피하로 (subcutaneously), 자궁내로 (intrauterinely) 또는 뇌혈관내로 (intracerebrovascularly) 투여될 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 다음의 변이를 포함하는 CCL3β (CC type ligand 3β) 변이체에 관한 것이다: (1) 야생형 CCL3β의 N 말단으로부터 하나 또는 두 개의 아미노산이 결실; 및 (2) 야생형 CCL3β의 N 말단으로부터 27번 아스파르트산이 알라닌으로 치환.
하나의 실시예에서, 상기 CCL3β 변이체는 예를 들어, 서열번호 4로 표시되는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 CCL3β 변이체는 앞서 설명한 구성을 동일하게 포함하고, 중복되는 구성에 대한 설명은 CCL3β 변이체에 관한 발명에도 동일하게 적용된다.
본 발명에서 사용되는 기술용어 및 과학용어에 있어 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미를 지닌다. 또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.
[실시예]
이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 아이디어와 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정될 수 있음은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.
제조예 1. CCL3 변이체를 포함한 융합 단백질의 제조 및 정제
CCL3-Fc 구조에서 CCL3의 물성, 활성 프로필을 개선시키기 위해 CCL3에 대한 돌연변이 연구를 수행하였다.
구체적으로, CCL3 단백질의 α 형태 (이하 CCL3α)와 β 형태 (이하 CCL3β)의 활성 차이가 Fc 융합 후에도 유지되는지 알아보기 위해 변이체를 고안하였다. 또한 Fc 융합단백질 형태에서 CCL3의 침전 형성 억제를 위해 27번째 아스파르트산을 알라닌으로 치환한 변이체를 고안하였다.
하기 표 1에 CCL3에 도입된 돌연변이의 위치, 서열 정보, 목적 및 각 돌연변이의 기대효과를 정리하였다.
[표 1]
세 가지 구성요소는 N-말단으로부터 C-말단으로 CCL3 변이체, 링커 및 융합 캐리어의 순서로 발현되도록 발현벡터에 아미노산을 코딩하였다. 하기 표 2에 CCL3 변이체 융합 단백질의 기호, CCL3에 도입된 돌연변이 서열, 융합 캐리어 서열, 링커 서열을 정리하였다.
[표 2]

CCL3 변이체 융합 단백질을 생산하기 위하여, 각 CCL3 변이체 융합 단백질의 아미노산 서열을 기초로 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 ㈜바이오니아사 (한국)에 의뢰하여 합성하였다. 각 CCL3 변이체 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 5' 말단과 3' 말단에 각각 NheI 과 NotI 제한효소 서열을 첨가하였고, 5' 말단의 제한효소 서열 뒤에 단백질 번역을 위한 시작 코돈과 발현된 단백질을 세포 밖으로 분비하게 하는 유도서열을 삽입하였다. 각 CCL3 변이체 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 뒤에는 종결코돈을 삽입하였다. NheI과 NotI 두 제한효소 서열을 이용하여 각 CCL3 변이체 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 pTrans-empty 발현벡터에 클로닝하였다. 상기 pTrans-empty 발현벡터는 독일의 CEVEC사에서 입수하였으며, CMV 프로모터, pUC 유래 복제기원, SV40 유래 복제기원, 암피실린 내성 유전자를 가지는 간단한 구조의 발현벡터이다.
제조예 1-2. CCL3 변이체 융합 단백질의 발현을 위한 플라스미드 DNA의 제작
제조예 1-1에서 제작한 각 발현벡터를 대장균에 형질전환하여 발현에 쓰일 다량의 플라스미드 DNA를 얻었다. 각 발현벡터는 세포벽이 약화된 대장균 내에 열쇼크를 통해 형질도입하였으며, LB 플레이트에 도말하여 콜로니를 확보하였다. 확보된 콜로니를 LB 배지에 접종한 후 37℃에서 16시간 배양하여 각 발현벡터를 세포 내에 가지는 대장균을 각각 100 mL씩 확보하였다. 확보된 대장균은 원심분리를 통해 배양배지를 제거한 후 P1, P2, P3 용액 (QIAGEN, Cat# 12963)을 첨가하여 세포벽을 깨고 단백질과 DNA를 분리한 DNA 혼탁액을 확보하였다. Qiagen DNA 정제 칼럼을 이용해 확보한 DNA 혼탁액으로부터 플라스미드 DNA를 정제하였다. 용출된 플라스미드 DNA는 아가로즈 젤 전기영동을 통해 확인하였으며, 나노드롭 기기 (Thermo scientific, Nanodrop Lite)를 이용하여 농도와 순도를 측정한 후 발현에 사용하였다.
제조예 1-3. CAP-T 세포에서 융합 단백질의 발현
제조예 1-2에서 분리한 각 플라스미드 DNA로 인간세포주를 형질전환하였다. PEM 배지 (Life technologies)에서 배양 중인 CAP-T 세포 (CEVEC)에 PEI 용액 (Polyplus, Cat# 101-10N)을 이용하여 각 플라스미드 DNA를 형질도입하였다. DNA와 PEI 용액의 혼합액을 인비트로젠사의 Freestyle293 발현 배지를 이용하여 현탁한 세포에 섞고 37℃에서 5시간 배양 후 PEM 배지를 첨가하였다. 37℃에서 5-7일간 배양 후 원심분리를 통해 세포를 제거하여 CCL3 변이체 융합 단백질이 포함된 상등액을 확보하였다.
제조예 1-4. CCL3 변이체 융합 단백질의 정제
CCL3 변이체 융합 단백질을 포함하는 배양 상등액을 0.2 μm 필터로 이용하여 불순물을 제거한 후, 단백질 A 친화크로마토그래피 칼럼 (GE Healthcare)을 1X PBS (pH 7.4) 완충액으로 평형화하였다. 1X PBS (pH 7.4) 완충액으로 칼럼을 세척한 후 100 mM 글리신 (pH 3.0) 완충액으로 단백질을 용출하였다. 친화크로마토그래피를 통해 얻은 CCL3A-H05 융합 단백질 (서열번호 15)은 하이드록시아파타이트 타입 I (Ceramic Hydroxyapatite type I, 40 μM, Bio-rad), CCL3B-H05 융합 단백질 (서열번호 16) 및 CCL3B-H40 융합 단백질 (서열번호 17)은 하이드록시아파타이트 타입 II (Ceramic Hydroxyapatite type II, 40 μM, Bio-rad) 칼럼을 이용해 정제하였다. 하이드록시아파타이트 칼럼을 20 mM sodium phosphate (pH 7.2) 완충액으로 평형화한 후, 친화크로마토그래피에서 용출된 CCL3 변이체 융합 단백질을 로딩하였다. 구체적으로, 20 mM sodium phosphate (pH 7.2) 완충액으로 칼럼을 세척한 후, 20 mM sodium phosphate (pH 7.2) 완충액을 농도 구배로 흘려준 후 용출된 분획을 분석하였다. 크기 배제 크로마토그래피 (SEC-HPLC) 실험법을 이용하여 각 분획을 분석하여 고순도의 CCL3 변이체 융합 단백질이 존재하는 부분을 모은 다음, 최종 완충액 1X PBS로 4℃에서 밤새 투석하였다. 투석 후 얻어진 단백질 원액을 30,000 분자량 컷오프 원심분리 필터를 사용하여, 3000 rpm, 4℃에서 농축하였다. CCL3 변이체 융합 단백질의 농도는 BCA 정량분석으로 측정하였다.
실험예 1. 융합 단백질의 시험관 내 활성 측정 결과
실험예 1-1. 링커서열에 따른 활성 측정 결과
위 제조예에서 제조된 CCL3 변이체 융합 단백질 CCL3B-H05 (서열번호 16), CCL3B-H40 (서열번호 17)의 시험관 내 활성을 측정하였다.
구체적으로, 융합 단백질의 시험관 내 활성을 평가하기 위해, CCL3의 수용체인 CCR1과 CCR5가 발현되어 있는 THP-1 세포주 (ATCC)를 이용하였다. 활성 평가를 위해, 제조예에서 얻어진 융합 단백질이 포함된 농축물을 분석용 배지 (0.01% BSA in RPMI 1640 Medium)를 이용하여 100 μg/mL 농도에서 2배 계열 희석하여 준비하였고, THP-1 세포주는 분석용 배지로 갈아준 다음 5,000,000 cells/mL로 희석하여 준비하였다. 폴리카보네이트 트랜스웰 시스템 (Costar, Cat# 3422)을 이용하여 아래 웰에는 희석한 융합 단백질 600 μL을 처리하고, 위의 인서트에는 희석한 THP-1 세포주 100 μL를 처리한 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 반응시켰다. 24시간 후 인서트를 제거한 다음 트립판 블루 용액 (Sigma, Cat# T8154-100ML)으로 염색하고 세포계수기 (Invitrogen, Luna cell counter)를 이용하여 이동한 세포 개수를 측정하였다. 활성은 분석용 배지만 처리한 대조군의 세포 수 대비 최다 이동 세포 수의 증가량을 계산하여 비교하였으며, 그 결과를 도 1에 나타냈다.
도 1에서 보는 바와 같이, 링커에 따른 활성 측정 결과, 융합단백질 CCL3B-H05가 CCL3B-H40보다 화학주기 활성이 우수한 것으로 확인되었다.
실험예 1-2. CCL3 변이체에 따른 활성 측정 결과
위 제조예에서 제조된 서열번호 15의 서열을 포함하는 융합단백질 CCL3A-H05, 서열번호 16의 서열을 포함하는 융합단백질 CCL3B-H05의 시험관 내 활성을 측정하였다.
구체적으로, 제조예에서 얻어진 융합 단백질이 포함된 농축물을 실험예 1-1과 동일한 방법으로 융합 단백질의 화학주기성을 측정하였으며, 그 결과는 도 2에 나타내었다.
실험예 1-3. CCL3 변이체에 따른 활성 측정 결과
위 제조예에서 제조된 서열번호 15의 서열을 포함하는 융합단백질 CCL3A-H05, 서열번호 16의 서열을 포함하는 융합단백질 CCL3B-H05의 시험관 내 활성을 측정하였다.
구체적으로, 융합 단백질의 수용체 CCR1에 대한 반응성을 평가하기 위해, CCL3의 수용체인 CCR1이 발현되어 있는 TangoTM CCR1-bla U2OS DA 세포주 및 분석용 키트 (Invitrogen, Cat# K1793)을 이용하였다. 활성 평가를 위해, TangoTM CCR1-bla U2OS DA 세포주를 기본 배지 (FreeStyleTM Expression Medium)로 312,500 cells/mL로 희석하여 준비하고, 384웰 플레이트 (Corning, Cat# 3712)에 32 μL 첨가한 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 16~24시간 보관하였다. 제조예에서 얻어진 융합 단백질이 포함된 농축물을 분석용 배지 (0.5% DMSO in FreeStyleTM Expression Medium)를 이용하여 처리농도보다 5배 높은 CCL3는 10 μM, CCL3A-H05, CCL3B-H05는 25 μM에서 2배 계열 희석하여 준비하였다. 준비한 융합 단백질을 세포가 있는 웰에 8 μL씩 첨가하여 실제 농도가 CCL3는 2 μM, CCL3A-H05, CCL3B-H05는 5 μM에서 2배 계열 희석된 융합 단백질이 처리되도록 하였고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 5시간 반응시켰다. 분석용 키트에 포함되어 있는 용액을 이용하여 6X 기질 혼합액 (6 μL of 1 mM LiveBLAzerTM-FRET B/G (CCF4-AM) Substrate + 60 μL of solution B + 904 μL of Solution C + 30 μL of Solution D)을 제조한 다음, 융합 단백질을 처리한 384웰 플레이트에 8 μL씩 첨가하고 상온에서 2시간 반응시켰다. 마이크로플레이트 리더 (Moluecular devices, Flexstation 3)로 측정하여 반응한 세포와 반응하지 않은 세포의 비율 (Blue/Green Emission ratio)로 계산하였고, 그 결과는 도 3에 나타냈다.
도 3에서 보는 바와 같이, CCL3는 0.63 nM, CCL3A-H05는 16.0 nM, CCL3B-H05는 11.6 nM 수준의 CCR1 수용체 반응성을 확인하였다.
실험예 2. 융합 단백질의 물성 평가
실험예 2-1. 안정성 평가 실험 방법
샘플의 초기 상태에서의 단백질 응집체의 양을 측정하기 위하여, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC-HPLC) 방법을 이용하여 고분자량 응집체의 함량 (%HMW)을 측정하였다.
구체적으로, SEC-HPLC 방법은 토소 (Tosoh) 모델 TSK-GEL G3000SWXL 칼럼을 사용하였다. 완충액 1X PBS를 칼럼에 1 mL/min의 유속으로 흘려주어 평형화시켰다. 제조예 1-4에서 얻어진 CCL3B-H05 단백질 원액을 30,000 분자량 컷오프 원심분리 필터를 사용하여, 3000 rpm, 4℃에서 9.5 mg/mL 이상의 표적 농도로 농축하였다. BCA 정량분석으로 각 샘플의 농도를 측정한 후, 안정성 평가를 위해 시료를 -70℃에서 5주 동안 보관하였다. 고분자량 응집체 비율 (%HMW)를 측정하기 위하여 9.57 mg/mL의 샘플을 1X PBS로 희석하여 1 mg/mL이 되도록 한 후, SEC-HPLC 칼럼에 100 μL를 주입하여 분석하였다.
그 결과, 표 3에서 보는 바와 같이, CCL3B-H05는 %HMW이 낮은 것으로 확인되었고, 이는 D27A 돌연변이가 도입됨에 따라 Fc 융합에 의해 방해 받지 않고 CCL3 변이체 융합 단백질의 물성이 개선되어 %HMW가 큰 폭으로 감소하였다.
[표 3] 9.5 mg/ml 농도에서 CCL3B-H05의 안정성 (%HMW)

표 3에서 보는 바와 같이, 보관 초기 (보관 0일)에서의 %HMW 양은 보관 5주 경과 시점, -70℃ 조건에서 증가하지 않고 유지되는 양상을 나타냈다. 이는 돌연변이에 관계없이, 융합 단백질 CCL3B-H05의 안정성이 유지됨을 나타낸다.
실험예 3. 융합 단백질의 약동역학 측정
실험예 3-1. 약동역학 측정 실험 방법
㈜오리엔트 바이오 (Orient BIO, Korea)에서 구입한 7주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 약물 처리일 전날에 체중의 평균값이 유사하도록 군 분리 (채혈 시간당 n=3)한 후, 샘플을 각각 3 mg/kg, 10 mg/kg 용량을 단회 정맥 투여하였으며, 혈액 샘플은 0.083, 0.5, 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96 및 144시간 차에 수집하였다. 융합 단백질의 혈중 농도를 측정하기 위해, 본 시험에서는 CCL3에 대해 면역 반응성을 갖는 Human CCL3/MIP-1α Quantikine ELISA kit (R&D systems, Cat# SMA00)를 사용하였다. 마우스에 각 융합 단백질을 정맥 주사한 후 144시간까지의 혈액 샘플 내 CCL3B-H05의 혈중 농도를 측정하여 약물 동태 파라미터를 산출하였다.
실험예 3-2. 약동역학 활성 측정 결과
마우스에서 융합 단백질의 정맥 투여 후 시간에 따른 혈중 농도 그래프 (도 4)를 바탕으로 약물 동태 파라미터를 산출하여 하기 표 4에 나타냈다.
[표 4]

약물의 노출 정도를 나타내는 AUC (Area Under the Curve)를 기준으로 융합 단백질의 약동역학 프로파일을 비교 평가하였다.
표 4에서 보는 바와 같이, CCL3B-H05를 3, 10 mg/kg의 용량으로 마우스에 정맥 투여하였을 때 대체적으로 용량에 비례하여 체내노출도가 증가하였으며, 클리어런스 (CL)와 분포용적 (Vdss)은 용량 별로 크게 다르지 않아 3~10 mg/kg의 용량범위에서 linear PK를 보이는 것으로 확인되었다. CCL3B-H05의 반감기 (t1/2)는 3, 10 mg/kg의 용량 별로 각각 20.4 hr, 45.6 hr로 CCL3의 반감기(인간에서 정맥 투여시 1.7hr 이내)에 비해 약 12~27배 증가함을 확인하였다. 일반적으로 마우스에서의 반감기는 인간에서의 반감기보다 더 짧음을 고려하면 마우스에서 CCL3의 반감기에 대한 CCL3B-H05의 반감기 증가폭은 더 클 것으로 예상된다.
실험예 4. 마우스에서 융합 단백질의 활성 평가
실험예 4-1. BNL 1ME A.7R.1 간암 동종 이식 마우스에서 항암 효능 실험 방법
㈜오리엔트 바이오(Orient BIO, Korea)에서 구입한 6주령의 수컷 Balb/c마우스를 1주일의 순화기간을 거쳐 마우스 간암 세포주인 BNL 1ME A.7R.1 (ATCC) 1X107 세포를 오른쪽 뒷다리에 주입하였다. 종양의 체적이 120-150 mm3 가 되는 시점에 종양 체적이 유사하도록 군 분리를 하였으며 각 시험군 및 약물 처치 스케줄은 각각 표 5와 도 6과 같다. 약물 처리 첫날부터 약물의 종양 성장 억제 효능을 관찰하기 위해 3-4일 마다 caliper를 이용하여 종양의 체적을 측정하였다 (종양의 체적 = 장축 X (단축)2/ 2).
[표 5]

실험예 4-2. BNL 1ME A.7R.1 간암 동종이식 마우스에서 항암 효능 평가 결과
위 제조예에서 제조된 서열번호 15의 서열을 포함하는 융합단백질 CCL3A-H05, 서열번호 16의 서열을 포함하는 융합단백질 CCL3B-H05의 BNL 1ME A.7R.1마우스 간암에 대한 종양 성장 억제 효능을 확인하였다. 도 5에서 보듯이 방사선 조사 시점으로부터 약 한달 후 6.5 Gy 단일 방사선 조사만 실시한 그룹에 비해 CCL3A-H05 10 mg/kg 병용 처리군에서 약 25%의 종양 성장 억제 효능을 나타내었고, CCL3B-H05 10 mg/kg의 병용 처리군에서 약 72%의 종양 억제 효능을 나타내었다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Yuhan Corporation <120> Fusion Protein Comprising CCL3 Variants And Use Thereof <130> 114 <160> 17 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 70 <212> PRT <213> human CCL3 alpha <400> 1 Ala Ser Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr 1 5 10 15 Ser Arg Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile Ala Asp Tyr Phe Glu Thr Ser 20 25 30 Ser Gln Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Arg Ser Arg 35 40 45 Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp Val Gln Lys Tyr Val Ser 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Ser Ala 65 70 <210> 2 <211> 69 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL3 alpha variant <400> 2 Ser Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ser 1 5 10 15 Arg Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile Ala Ala Tyr Phe Glu Thr Ser Ser 20 25 30 Gln Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Arg Ser Arg Gln 35 40 45 Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp Val Gln Lys Tyr Val Ser Asp 50 55 60 Leu Glu Leu Ser Ala 65 <210> 3 <211> 70 <212> PRT <213> human CCL3 beta <400> 3 Ala Pro Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr 1 5 10 15 Ser Arg Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile Ala Asp Tyr Phe Glu Thr Ser 20 25 30 Ser Gln Cys Ser Lys Pro Ser Val Ile Phe Leu Thr Lys Arg Gly Arg 35 40 45 Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp Val Gln Lys Tyr Val Ser 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Ser Ala 65 70 <210> 4 <211> 68 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL3 beta variant <400> 4 Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ser Arg 1 5 10 15 Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile Ala Ala Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Gln 20 25 30 Cys Ser Lys Pro Ser Val Ile Phe Leu Thr Lys Arg Gly Arg Gln Val 35 40 45 Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp Val Gln Lys Tyr Val Ser Asp Leu 50 55 60 Glu Leu Ser Ala 65 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 5 Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys 1 5 10 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 6 Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Glu Lys Lys 1 5 10 15 Lys <210> 7 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Lys 1 5 10 15 Lys Lys Glu Glu Lys Lys Lys 20 <210> 13 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 13 Arg Asn Thr Arg Asn Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys 1 5 10 15 Lys Lys Glu Glu Lys Lys Lys Glu Glu Lys Lys Lys 20 25 <210> 14 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HyFc <400> 14 Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu 1 5 10 15 Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 20 25 30 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 35 40 45 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 50 55 60 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 65 70 75 80 Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 85 90 95 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 100 105 110 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 115 120 125 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met 130 135 140 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 165 170 175 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 180 185 190 Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val 195 200 205 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 210 215 220 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 225 230 <210> 15 <211> 314 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL3A-H05 <400> 15 Ser Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ser 1 5 10 15 Arg Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile Ala Ala Tyr Phe Glu Thr Ser Ser 20 25 30 Gln Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Arg Ser Arg Gln 35 40 45 Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp Val Gln Lys Tyr Val Ser Asp 50 55 60 Leu Glu Leu Ser Ala Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys 65 70 75 80 Lys Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro 85 90 95 Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro 100 105 110 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 115 120 125 Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 130 135 140 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 145 150 155 160 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 165 170 175 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 180 185 190 Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 195 200 205 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu 210 215 220 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 225 230 235 240 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 245 250 255 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 260 265 270 Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn 275 280 285 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 290 295 300 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 305 310 <210> 16 <211> 313 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL3B-H05 <400> 16 Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ser Arg 1 5 10 15 Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile Ala Ala Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Gln 20 25 30 Cys Ser Lys Pro Ser Val Ile Phe Leu Thr Lys Arg Gly Arg Gln Val 35 40 45 Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp Val Gln Lys Tyr Val Ser Asp Leu 50 55 60 Glu Leu Ser Ala Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys 65 70 75 80 Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu 85 90 95 Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 100 105 110 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 115 120 125 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 130 135 140 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 145 150 155 160 Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 165 170 175 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 180 185 190 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 195 200 205 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met 210 215 220 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 225 230 235 240 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 245 250 255 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 260 265 270 Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val 275 280 285 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 290 295 300 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 305 310 <210> 17 <211> 301 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL3B-H40 <400> 17 Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ser Arg 1 5 10 15 Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile Ala Ala Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Gln 20 25 30 Cys Ser Lys Pro Ser Val Ile Phe Leu Thr Lys Arg Gly Arg Gln Val 35 40 45 Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp Val Gln Lys Tyr Val Ser Asp Leu 50 55 60 Glu Leu Ser Ala Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln 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Leu His Asn 275 280 285 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 290 295 300

Claims (18)

  1. CCL3β (CC type ligand 3 beta)의 변이체가 면역글로불린 Fc 영역에 연결된 융합 단백질로,
    상기 변이체는 (1) 서열번호 3으로 표시되는 서열을 포함하는 야생형 CCL3β에서 N 말단으로부터 두 개의 아미노산 알라닌 및 프롤린이 결실되고,
    (2) 상기 야생형 CCL3β의 N 말단으로부터 27번 아스파르트산이 알라닌으로 치환되어 있으며,
    상기 CCL3β 변이체는 서열번호 5로 표시되는 서열을 포함하는 링커를 통해 면역글로불린 Fc 영역에 연결되고,
    상기 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 14로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 4로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제1항 또는 제4항의 융합 단백질을 코딩하는 핵산.
  11. 제10항의 핵산을 포함하는 벡터.
  12. 제11항의 벡터로 형질전환된 세포.
  13. 다음 단계를 포함하는 융합 단백질의 제조방법:
    (a) 제12항의 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양된 세포에서 융합 단백질을 회수하는 단계.
  14. 제1항 또는 제4항의 융합 단백질을 포함하는 암 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
  15. 삭제
  16. 제14항에 있어서, 방사선 치료 병용 또는 보조용 조성물인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  17. 삭제
  18. 삭제
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