ES2966133T3 - Proteína de fusión que comprende el factor de crecimiento nervioso y método de preparación y uso de la misma - Google Patents
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Abstract
La presente invención se relaciona con el campo de los productos biofarmacéuticos y proporciona una proteína de fusión que comprende un factor de crecimiento nervioso (NGF) y un método de preparación y uso del mismo. La proteína de fusión tiene una fórmula general representada por AB o ALB, en la que A es un factor de crecimiento nervioso, L es un péptido conector y B es un resto Fc de IgG, o un análogo del resto Fc de IgG, o un fragmento de la fracción Fc de IgG. La proteína de fusión de la presente invención tiene las siguientes ventajas sobre un NGF de tipo salvaje: mayor actividad biológica, una vida media más de 17 veces más larga, frecuencia de administración muy reducida y eficacia significativamente mayor. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Proteína de fusión que comprende el factor de crecimiento nervioso y método de preparación y uso de la misma
CAMPO TÉCNICO
La descripción se refiere a una proteína de fusión del factor de crecimiento nervioso, a un método de preparación y uso de la misma, y pertenece al campo de la biofarmacéutica.
ANTECEDENTES
El factor de crecimiento nervioso (NGF) es el primer factor neurotrófico descubierto en células de sarcoma de ratón por el científico italiano Levi-Montlcini en 1953. El NGF es un regulador del crecimiento neuronal que tiene una doble función biológica de nutrición neuronal y promoción del crecimiento de neuritas, que desempeña un importante papel regulador en el desarrollo, diferenciación, crecimiento, regeneración y expresión de propiedades funcionales de neuronas centrales y periféricas. El NGF incluye tres subunidades a, p y<y>. La subunidad p es una región activa que se forma combinando dos cadenas simples mediante un enlace no covalente. En la actualidad, se han comercializado varios productos de NGF en el país y en el extranjero, y se utilizan principalmente para el tratamiento de la displasia del sistema nervioso, incluida ambliopía, neuroma, diversas lesiones nerviosas y enfermedades del sistema nervioso.
Como fármaco proteico, la actividad del NGF que promueve el crecimiento nervioso se encuentra principalmente en un p-NGF que tiene un coeficiente de sedimentación de 2,5 S, un peso molecular de 13,5 kD y se filtra fácilmente por el glomérulo durante el metabolismo, lo que da como resultado una vida media corta¡n vivo.Los estudios han demostrado que a los ratones se les administró por vía intramuscular el fármaco p-NGF, T 1/2 (p) = 2,2 h, Tmáx = 0,5 h, y la frecuencia de inyección fue una vez al día. Debido a las reacciones adversas de dolor en el lugar de la inyección o en la extremidad inferior en el lado de la inyección durante una inyección de NGF, la reducción en el número y la frecuencia de la administración al paciente es buena para aliviar las reacciones adversas del paciente. Una de las soluciones es desarrollar un NGF de acción prolongada y alta actividad biológica.
La modificación de fármacos proteicos es uno de los focos de investigación de acción prolongada de los fármacos proteicos actuales, en donde la construcción de proteínas de fusión es una estrategia importante para la modificación de proteínas. Un gen de la proteína diana está unido de extremo a extremo con un gen de una determinada proteína que tiene una vida media más larga y un mayor peso molecular, y el producto de expresión génica (es decir, la proteína de fusión) está controlado por la misma secuencia reguladora, pero sigue siendo un problema clínicamente difícil aumentar la actividad biológica del fármaco proteico al tiempo que se prolonga su vida media.
El documento CN 105273087 A1 describe una proteína de fusión NGF-Fc, la producción de dicha proteína en células de mamífero a partir de un vector de expresión y el uso de la proteína de fusión para el tratamiento de diversas enfermedades neurológicas. La proteína de fusión NGF-Fc comprende el segmento CH Fc del factor de crecimiento del nervio humano NGF y la esfaeroproteína inmune gamma IgG4 de las personas. La combinación entre el fragmento Fc y el NGF se fusiona directamente o se fusiona conectando la secuencia de calles (enlazador) GSGGGSGGGGSGGGGSGGGGS.
Fukui, Y et al. describen que el factor de crecimiento nervioso y su receptor de baja afinidad, p75NTR, eran mediadores del dolor (Fukui, Y et al. "Low-affinity NGF receptor (p75 neurotrophin receptor) inhibitory antibody reduces pain behaviour and CGRP expression in DRG in mouse sciatic nerve crush model", JOURNAL OF ORTHOPEDIC RESEARCH, ORTHOPEDIC SOCIETY, EE.UU., vol. 28, n.° 3, 1 de marzo de 2010 (01-03-2010), páginas 279-283).
El documento US 7 452 863 B1 describe numerosas variantes de NGF que pueden usarse en el tratamiento de trastornos neurológicos. Dichas variantes incluyen variantes en la posición F12 que aumentan la unión y/o bioactividad de NGF y variantes en las posiciones F12, K74, K88 y R114 que dan como resultado una disminución o eliminación de la unión al receptor p75.
Ryden, M_ et al. describen la generación de mutantes del factor de crecimiento nervioso que tienen una afinidad de unión reducida por el receptor p75. Uno de los mutantes tiene una mutación en la posición K74 (Ryden, M_ et al. "A second determinant of binding to p75 neurotrophin receptor revealed by alanine scanning mutagenesis of a conserved loop in nerve growth factor", Journal of Biological Chemistry, 26 de diciembre de 1997 (26-12-1997), páginas 33085 33091).
La BASE DE DATOS NCBI GenBank (11 de diciembre de 2011 NIRANJANA, K.R.P.) describe la secuencia del dominio Fc de IgG1 humana.
El documento CN 1 698 883 A describe el uso de factor de crecimiento nervioso para la preparación de un medicamento eficaz para reducir el peso corporal.
COMPENDIO
Para resolver los problemas anteriores, un objeto de la presente solicitud es proporcionar una proteína de fusión del factor de crecimiento nervioso. En comparación con una proteína original, la proteína de fusión no sólo tiene una actividad biológica mejorada, una vida media muy prolongada y reduce el número y la frecuencia de administración a los pacientes, aliviando así las reacciones adversas del paciente, sino que también ha mejorado significativamente la eficacia.
La presente solicitud proporciona una proteína de fusión del factor de crecimiento nervioso, representada por una fórmula general A-B o A-L-B, en la que A es un factor de crecimiento nervioso, L es un péptido conector y B es un resto Fc de IgG1, y en donde el factor de crecimiento nervioso es un factor de crecimiento nervioso humano.
La IgG es una inmunoglobulina que tiene el mayor contenido en suero. La IgG también es una inmunoglobulina que tiene la vida media en suero más larga entre todas las inmunoglobulinas. A diferencia de otras inmunoglobulinas, la IgG puede reciclarse eficazmente después de unirse a un receptor Fc. Hay cuatro subclases de IgG, es decir, G1, G2, G3 y G4, cada una con diferentes funciones efectoras. La fracción Fc de una inmunoglobulina utilizada en la presente memoria tiene el significado común de los términos en el campo de la inmunología. Específicamente, la expresión "resto Fc de una inmunoglobulina" se refiere a un fragmento de anticuerpo obtenido eliminando dos regiones de unión a antígeno (fragmentos Fab) de un anticuerpo. Un método para eliminar fragmentos Fab es digerir la inmunoglobulina con papaína. Por tanto, el resto Fc está formado por fragmentos que tienen casi el mismo tamaño de las regiones constantes de dos cadenas pesadas, en donde las dos cadenas pesadas están asociadas mediante interacciones no covalentes y un enlace disulfuro. El resto Fc incluye una región bisagra y se extiende a través de los dominios CH2 y CH3 hasta el extremo C del anticuerpo.
Según el efecto deseadoin vivo,el resto B en la fórmula general de la proteína de fusión del factor de crecimiento nervioso es un resto Fc de IgG1 o un mutante de la misma.
Debido a la introducción de una secuencia del resto Fc, puede afectar la actividad del NGF y también puede mediar en la citotoxicidad dependiente de anticuerpos y la citotoxicidad dependiente del complemento. Por lo tanto, para obtener una proteína de fusión que tenga una alta actividad biológica y una vida media larga, es necesario seleccionar o mutar las secuencias de Fc de varias subclases.
B en la fórmula general de la proteína de fusión del factor de crecimiento nervioso es un resto Fc de IgG1, preferiblemente, el resto Fc de IgG1 incluye regiones CH2 y CH3, incluyendo una región bisagra; y más preferiblemente, el resto Fc de IgG1 tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 5. Preferiblemente, B en la proteína de fusión del factor de crecimiento nervioso es preferiblemente un mutante del resto Fc de IgG1. El análogo del resto Fc incluye una genomodificación, y la genomodificación puede ser una mutación de sitio asociada con actividad de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC)/citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), o una mutación de desglucosilación. Más preferiblemente, el análogo del resto Fc tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 7. Más preferiblemente, el análogo del resto Fc tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 7 con los primeros 5 aminoácidos eliminados en el extremo N.
El factor de crecimiento nervioso es un factor de crecimiento nervioso humano de tipo sin mutaciones. Cualquier factor de crecimiento nervioso humano puede ser parte de la proteína de fusión del factor de crecimiento nervioso humano de la presente solicitud, siempre que el propio factor de crecimiento nervioso humano pueda unirse al receptor del factor de crecimiento nervioso humano e induzca una transmisión de señales a través del factor de crecimiento nervioso humano. receptor.
Preferiblemente, el factor de crecimiento nervioso es un factor de crecimiento nervioso humano de tipo sin mutaciones, o el factor de crecimiento nervioso humano que comprende F 12E, K32G, K32L, K32Y, R59L, r 59A, D65A, D65G, K74L, K88F, K88L, K88E, K88G, Q96E., R114V, R114F, R114G, R114L o F101A hacen referencia a la posición de aminoácido establecida en un factor de crecimiento nervioso humano de tipo sin mutaciones.
El factor de crecimiento nervioso es un análogo de un factor de crecimiento nervioso humano y, en general, preferiblemente un factor de crecimiento nervioso humano que tiene no más de 6 sitios de mutación de aminoácidos, incluso más preferiblemente, un factor de crecimiento nervioso humano que tiene no más de 5 sitios de mutación de aminoácidos y, más preferiblemente, un factor de crecimiento nervioso humano que tiene no más de 4, 3 o 2 sitios de mutación de aminoácidos.
El factor de crecimiento nervioso humano es un derivado de un factor de crecimiento nervioso humano. El término "un derivado de un factor de crecimiento nervioso humano" en la presente memoria se refiere a una molécula que tiene una secuencia de aminoácidos de un factor de crecimiento nervioso humano o un análogo del factor de crecimiento nervioso humano, pero que también tiene una modificación química adicional en uno o más de grupos laterales de aminoácidos, átomos de carbono alfa, grupos amino terminales o grupos carboxilo terminales. Las modificaciones químicas incluyen, pero sin que ello pretenda ser limitante, añadir restos químicos, crear nuevos enlaces y eliminar restos químicos. La modificación en los grupos laterales de aminoácidos incluye, pero sin que ello pretenda ser limitante, una acilación de un grupo amino épsilon de lisina, una N-alquilación de arginina, histidina o lisina, una alquilación de carboxilo de ácido glutámico o ácido aspártico, y una desaminación de glutamina o asparagina. La modificación en los grupos amino terminales incluye, pero sin que ello pretenda ser limitante, desaminación, modificaciones de N-alquilo inferior, N-di-alquilo inferior y N-acilo. La modificación en los grupos carboxilo terminales incluye, pero sin que ello pretenda ser limitante, modificaciones de amida, alquilacilo inferior, dialquilamida y éster de alquilo inferior. El grupo alquilo inferior es un grupo alquilo C1-C4. Además, uno o más grupos laterales o grupos terminales pueden estar protegidos por un grupo protector conocido por un experto en el campo de la química. Un carbono alfa de un aminoácido puede estar mono o dimetilado.
Muchos fragmentos activos, análogos y derivados del factor de crecimiento nervioso humano se conocen bien en la técnica, y cualquiera de estos análogos y derivados puede ser parte de la proteína de fusión del factor de crecimiento nervioso de la presente solicitud. En la presente memoria se proporcionan algunos ejemplos de nuevos análogos del factor de crecimiento nervioso humano, así como análogos y derivados del factor de crecimiento nervioso humano bien conocidos en la técnica.
El factor de crecimiento nervioso humano tiene preferiblemente una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 13 a Se Q ID No: 30 en el listado de secuencias.
El factor de crecimiento nervioso humano de la presente solicitud incluye una serie de mutantes del factor de crecimiento nervioso (es decir, hNGF recombinantes), que son capaces de aliviar efectos secundarios tales como el dolor e incluso son indoloros. Estos mutantes del factor de crecimiento nervioso tienen una secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID No: 2 y SEQ ID No: 13 a SEQ ID No: 30 en el listado de secuencias, respectivamente.
F12E: tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2;
K32G: tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 13;
K32L: tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 14;
K32Y: tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 15;
R59L: tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 16;
R59A: tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 17;
D65A: tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 18;
D65G: tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 19;
K74L: tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 20;
K88F: tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 21;
K88L: tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 22;
K88E: tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 23;
K88G: tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 24;
Q96E: tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 25;
R114V: tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 26;
R114F: tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 27;
R114G: tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 28;
R114L: tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 29; y
F101A: tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 30.
L es un péptido rico en glicina o un péptido que tiene una secuencia [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n, en la que n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6, preferiblemente n es 2-6, más preferiblemente n es 3-4, y lo más preferiblemente n es 3. Preferiblemente, la función y estabilidadin vivode la proteína de fusión del factor de crecimiento nervioso de la presente solicitud se optimiza mediante la adición de un péptido conector (L en la fórmula general) para prevenir posibles interacciones de dominio no deseadas. Aunque estos péptidos conectores pueden tener cualquier longitud y consistir en cualquier combinación de aminoácidos, sus longitudes preferiblemente no exceden la longitud necesaria para evitar interacciones de dominio no deseadas y/u optimizar la función biológica y/o la estabilidad. El péptido conector preferiblemente no tiene más de 30 aminoácidos de longitud. El péptido conector tiene más preferiblemente no más de 20 aminoácidos de longitud, y más preferiblemente no más de 15 aminoácidos de longitud. Preferiblemente, la proteína de fusión del factor de crecimiento nervioso tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 10.
La presente solicitud también abarca una secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína de fusión del factor de crecimiento nervioso mencionada anteriormente.
Un vector de expresión incluye la secuencia de nucleótidos mencionada anteriormente.
El vector de expresión es un vector de ADN o un vector viral.
El vector de ADN se selecciona del grupo que consiste en un vector plasmídico de ADN, un liposoma unido al mismo, un conjugado molecular unido al mismo y un polímero unido al mismo; y, preferiblemente, el vector plasmídico de ADN es un vector de expresión eucariótico; y el vector viral se selecciona del grupo que consiste en un vector de virus adenoasociado, un vector lentiviral y un vector adenoviral.
Un método para preparar una proteína de fusión del factor de crecimiento nervioso incluye: transformar el vector de expresión mencionado anteriormente en una célula huésped y cultivar una célula recombinante resultante para expresar el vector de expresión, de modo que se obtenga la proteína de fusión del factor de crecimiento nervioso.
Una célula huésped incluye el vector de expresión y, preferiblemente, la célula huésped es una célula de mamífero, preferiblemente una célula de ovario de hámster chino, una célula de riñón embrionario humano 293, una célula COS o una célula Hela.
Se proporciona una composición farmacéutica, que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y una o más de las proteínas de fusión del factor de crecimiento nervioso mencionadas anteriormente, la secuencia de polinucleótidos mencionada anteriormente, el vector de expresión mencionado anteriormente y la célula huésped mencionada anteriormente; preferiblemente, la composición farmacéutica es una inyección, una cápsula, un comprimido o un polvo; y más preferiblemente, la composición farmacéutica es una inyección que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y una proteína de fusión del factor de crecimiento nervioso.
El medicamento de la presente solicitud se puede preparar en diversas formas, tales como una inyección, una cápsula, un comprimido o un polvo, y el medicamento que tiene las diversas formas de dosificación anteriores se puede preparar según un método convencional en el campo de la farmacia.
La composición farmacéutica es preferiblemente una inyección que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y la proteína de fusión del factor de crecimiento nervioso mencionada anteriormente.
Se proporciona el uso de la proteína de fusión del factor de crecimiento nervioso en la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad del sistema nervioso. La enfermedad del sistema nervioso se refiere a una enfermedad asociada con degeneración neuronal o lesión en el sistema nervioso central y/o periférico. Los ejemplos específicos de enfermedades del sistema nervioso incluyen, pero sin que ello pretenda ser limitante, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, accidente cerebrovascular, ELA, neuropatía periférica y otros trastornos caracterizados por necrosis o pérdida de neurona, independientemente de la neurona central, la neurona periférica o la neurona motora, excepto el tratamiento de daño a los nervios causado por traumatismos, quemaduras, insuficiencia renal o lesión. Por ejemplo, la neuropatía periférica asociada con ciertas afecciones es tal como una neuropatía asociada con diabetes, SIDA o quimioterapia.
Se puede administrar a un paciente el medicamento para tratar una enfermedad del sistema nervioso preparado mediante una proteína de fusión del factor de crecimiento nervioso. La dosis exacta dependerá de la enfermedad a tratar y puede ser determinada por un experto en la materia utilizando técnicas conocidas. Además, como se sabe en la técnica, es necesario realizar un ajuste en función de la edad, el peso, la salud general, el sexo, la dieta, el momento de la administración, la interacción farmacológica y la gravedad de la enfermedad, y puede ser determinado por un experto en la materia a través de la experimentación rutinaria. El paciente mencionado en la presente memoria incluye seres humanos y otros animales y organismos. Por lo tanto, estos métodos pueden usarse para tratar a seres humanos y ganado.
La administración del medicamento para tratar una enfermedad del sistema nervioso preparado por la proteína de fusión del factor de crecimiento nervioso de la presente solicitud se puede llevar a cabo mediante diversos métodos, incluidos, pero sin que ello pretenda ser limitante, administración oral, subcutánea, intravenosa, intracerebral, intranasal, transdérmica, intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar, vaginal, rectal e intraocular. En algunas circunstancias, tal como en el tratamiento de una herida, se puede aplicar directamente en forma de solución o aerosol.
La composición farmacéutica de la presente solicitud incluye la proteína de fusión del factor de crecimiento nervioso en una forma adecuada para su administración a un paciente. En un ejemplo preferido, la composición farmacéutica está en una forma soluble en agua y puede incluir, por ejemplo, un vehículo, un excipiente, un estabilizador, un tampón, una sal, un antioxidante, un polímero hidrófilo, un aminoácido, un carbohidrato., un tensioactivo iónico o no iónico, polietilenglicol, propilenglicol o similares. El medicamento preparado por la proteína de fusión del factor de crecimiento nervioso también puede implantarse en una forma de liberación sostenida mediante técnicas conocidas en la técnica o incrustarse en una forma de microcápsula.
Se proporciona la proteína de fusión del factor de crecimiento nervioso mencionada anteriormente para su uso en la preparación de un medicamento para reducir eficazmente el peso.
La presente solicitud tiene las siguientes ventajas: en comparación con el NGF de tipo sin mutaciones, la proteína de fusión del factor de crecimiento nervioso de la presente solicitud tiene una mayor actividad biológica, la vida media se puede extender 17 veces o más, reduciendo así en gran medida la frecuencia de administración, y mientras tanto la eficacia aumenta significativamente.
La presente solicitud se describirá con más detalle a continuación junto con dibujos y ejemplos específicos, que no pretenden limitar el alcance de la presente solicitud. Todas las sustituciones equivalentes en la técnica según la presente solicitud entran dentro del alcance de la presente solicitud.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Fig. 1 es un mapa en desarrollo en color de la transferencia de Western de una muestra purificada de la proteína de fusión rhNGF-Fc del Ejemplo 2.
La Fig. 2 es un resultado de la detección de la actividadin vitrode la proteína de fusión del Ejemplo 3. La Fig. 3 es un resultado de la detección de la actividadin vitrode la proteína de fusión del Ejemplo 3. La Fig. 4 es un resultado de la detección de la vida mediain vivode la proteína de fusión del Ejemplo 4.DESCRIPCIÓN DETALLADA
Los ejemplos descritos a continuación junto con los dibujos son ilustrativos y pretenden ilustrar la presente solicitud, pero no deben interpretarse como limitantes de la presente solicitud. Las técnicas o condiciones no especificadas en los ejemplos se realizan según técnicas o condiciones descritas en la bibliografía técnica o según las especificaciones del producto. Todos los reactivos o instrumentos que no especifica el fabricante son productos comunes disponibles comercialmente.
Ejemplo 1: Preparación del plásmido de expresión de la proteína de fusión
(1) Construcción del plásmido de expresión de la proteína de fusión rhNGF-Fc1.
Se sintetizó una secuencia de nucleótidos SEQ ID No: 3 que codifica p-NGF humano y se amplificó como plantilla mediante PCR usando cebadores F1/R1 para obtener un fragmento de NGF que incluye un sitio de enzima de restricción Not I en el extremo 5'. Se sintetizó una secuencia de nucleótidos SEQ ID No: 8 que codifica IgG1-Fc humana y se amplificó como plantilla mediante PCR usando cebadores F2/R2 para obtener un fragmento Fc que incluye el sitio de la enzima de restricción Age I en el extremo 3'. Los productos de PCR del fragmento NGF y del fragmento Fc se mezclaron y amplificaron como moldes mediante PCR usando cebadores F1/R2 para obtener un fragmento del gen de fusión NGF-Fc y recuperar el fragmento del gen de fusión NGF-Fc. Luego, el fragmento del gen de fusión NGF-Fc y el plásmido pcDNA3.1 (adquirido de Invitrogen (Shanghai) Trading Co., Ltd.) se sometieron respectivamente a doble digestión con Age I y Not I, recuperación, ligación y transformación para obtener un plásmido de expresión de pcDNA3.1-rhNGF-Fcl.
F1: ATTTCGGCCGCGCCACCATGACCATGTTG (SEQ ID No: 31).
R1:
GAGTTTGTCACAAGATTTGGGCTCGGCTCTTCTCAGCCTTCCTGCTG (SEQ ID No: 32).
F2:
CAGCAGGAAGGCTGTGAGAAGAGCCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTC (SEQ ID No: 33).
R2:
GATTGTCGATCATTACTAACCGGTTCATTTACCCGGGGACAGG (SEQ ID No: 34).
(2) Construcción del plásmido de expresión de la proteína de fusión rhNGF-li-Fc1
Se sintetizó una secuencia de nucleótidos SEQ ID No: 3 que codifica p-NGF humano y se amplificó como plantilla mediante PCR usando cebadores F1-2/R1-2 para obtener un fragmento de NGF que incluye un sitio de enzima de restricción Not I en el extremo 5'. Se sintetizó una secuencia combinada de una secuencia de nucleótidos SEQ ID No: 35 que codifica un conector (G4S)3 y una secuencia de nucleótidos SEQ ID No: 9 que codifica IgG1-Fc humana y se amplificó como plantilla mediante<p>C<r>usando cebadores F2-2/R2-2 para obtener un fragmento Fc que incluye el sitio de la enzima de restricción Age I en el extremo 3'. Los productos de PCR del fragmento de NGF y del fragmento Fc se mezclaron y amplificaron como moldes mediante PCR usando los cebadores F1-2/R2-2 para obtener un fragmento del gen de fusión NGF-Fc y recuperar el fragmento del gen de fusión NGF-Fc. Luego, el fragmento del gen de fusión NGF-Fc y un plásmido pcDNA3.1 (adquirido de Invitrogen (Shanghai) Trading Co., Ltd.) se sometieron respectivamente a doble digestión con Age I y Not I, recuperación, ligación y transformación para obtener un plásmido de expresión de pcDNA3.1-rhNGF-li-Fc1.
F1-2:
GCCCTCTAGACTCGAGCGGCCGCGCCACCATGACCATGTTGTTCTACACTC (SEQ ID No: 36).
R1-2:
CGCCGGAGCCGCCACCGCCGGCTCTTCCAAGCCTTCCTG (SEQ ID No: 37).
F2-2:
CAGGAAGGCTGTGAGAAGAGCCGGGCGGTGGCGGCTCCGGCG (SEQ ID No: 38).
R2-2:
GATTGTCGATCATTACTAACCGGTTCATTTACCCGGGGACAGGGAGAGGC (SEQ ID No: 39).
(3) Construcción del plásmido de expresión de la proteína de fusión rhNGF(F12E)-Fc1
El plásmido de expresión de la proteína de fusión pcDNA3.1-rhNGF-Fc1 se amplificó como molde mediante PCR usando cebadores mutantes F12E-F/F12E-R, se recuperó, se digirió con una enzima de restricción Dpn I y luego se transformó, para obtener un plásmido de expresión de pcDNA3.1-rhNGF(F12E)-Fc1.
F12E-F: TT CCACAGGGGCGAAGAGT CGGT GT GT GACAGT (SEQ ID No: 40).
F12E-R: ACT GT CACACACCGACT CTTCGCCCCT GT GGAA (SEQ ID No: 41).
(4) Construcción del plásmido de expresión de la proteína rhNGF-Fc4.
En primer lugar, el gen de fusión pcDNA3.1-rhNGF-Fc1 se amplificó como plantilla mediante PCR utilizando los cebadores 1F/1R para obtener un esqueleto de vector que contenía la secuencia de NGF. Se sintetizó una secuencia de nucleótidos de IgG4-Fc humana SEQ ID No: 12 y se amplificó como plantilla mediante PCR usando cebadores PAA-F/PAA-R para obtener un fragmento que contiene IgG4-Fc. Luego, los dos productos de PCR se vincularon perfectamente y luego se transformaron.
1F: GTCTCTGGGTAAATAAACCGGTTAGTAATGATC (SEQ ID No: 42)
1R: GACCATATTTGGACTCGGCTCTTCTCACAGC (SEQ ID No: 43).
PAA-F:
CTGCCCAGCACCTGAGGCTGCGGGGGGACCATCAGTCTTC (SEQ ID No: 44).
PAA-R:
GAAGACTGATGGTCCCCCCGCAGCCTCAGGTGCTGGGCAG (SEQ ID No: 45).
Resultados experimentales:
Se recogieron clones positivos para la secuenciación y el resultado confirmó que las secuencias génicas expresadas por las proteínas de fusión rhNGF-Fc1, rhNGF-li-Fc1, rhNGF(F12E)-Fc1 y rhNGF-Fc4 eran correctas.
Ejemplo 2: Expresión y purificación de proteína de fusión
1. Célula CHO que expresa la proteína de fusión.
Las células CHO cultivadas se suspendieron y se ajustaron a una densidad celular de 2,5 x 106 /ml después de lavar una vez con medio DMEM. Cada 300 ml de células para transfección requirió las siguientes etapas: 300 |jg de plásmido de expresión se diluyeron con 10 ml de Opti-RPO (Invitrogen), 1,5 ml de PEI se diluyeron con 6 ml de Opti-PRO (1 mg/ml), después de la dilución se mezclaron por completo, respectivamente, y se dejaron durante 5 min. Luego se añadió dilución de PEI a la dilución de plásmido, se mezcló y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego se añadió lentamente la mezcla de PEI-plásmido a 150 ml de células resuspendidas y se incubó con agitación en una incubadora de dióxido de carbono al 6% a 37°C y 105 rpm durante 4 h. Se añadió un volumen igual de 150 ml de medio de expresión EX-CELL Advanced CHO Fed-batch (sigma) y valproato de sodio 1 mM (0,5 mol/l), y se incubó con agitación en una incubadora de dióxido de carbono al 6% a 32°C y 120 rpm durante 18-24 h. Se añadieron 30 ml de suplemento Sheff-CHO Plus ACF (Kerry Sheffield) (50 g/l) y el sobrenadante se recogió después de 4 días. 2. Purificación de proteína de fusión mediante columna de afinidad de proteína A
El sobrenadante se recogió del cultivo celular y las células y los fragmentos se eliminaron mediante filtración a través de un filtro de 0,45 jm . El sobrenadante se cargó en una columna de Proteína A preparada, se purificó con solución de PB 20 mM NaCl 0,15 M (pH 7,2), se eluyó adicionalmente con tampón citrato 50 mM (pH 3,4) y la muestra de proteína se recogió y se neutralizó inmediatamente a un pH de 6,8 añadiendo una solución de Tris de 2 mol/l.
Las muestras purificadas se sometieron a detecciones por transferencia Western de anticuerpo NGF y anticuerpo Fc. Los resultados se muestran en la Fig. 1, en donde las muestras correspondientes a los carriles 1 a 4 son las proteínas de fusión rhNGF-Fc1, rhNGF-li-Fc1, rhNGF(F12E)-Fc1 y rhNGF-Fc4, respectivamente.
Ejemplo 3: Detección de la actividadin vitrode la proteína de fusión
El método de operación detallada se realizó según el método del Ejemplo 1 de una patente titulada "Method for Quantitatively Measuring Nerve Growth Factor Activity" con un número de publicación CN103376248A, y los resultados de actividad específica y actividad específica molar se muestran en la siguiente tabla.
Los resultados experimentales se muestran en la Tabla 1, Fig. 2 y Fig. 3.
La actividad específica de las proteínas de fusión rhNGF-Fc1, rhNGF-li-Fc1, rhNGF(F12E)-Fc1 fue básicamente la misma que la de rhNGF, mientras que la actividad específica de la proteína de fusión rhNGF-Fc4 disminuyó.
Según el cálculo de la actividad específica molar convertida en peso molecular, la actividad específica molar de la proteína de fusión NGF del subtipo IgG 1-Fc fue mayor que la del correspondiente rhNGF, y también fue mejor que la actividad específica molar de la proteína de fusión rhNGF-Fc4.
Tabla 1
Ejemplo 4: Detección de la vida mediain vivode la proteína de fusión
1. Administración y extracción de sangre.
Se dividieron aleatoriamente en grupos (4 ratas por grupo) ratas macho SD que pesaban aproximadamente 250 g y las muestras de prueba se administraron por vía intramuscular en una dosis de 1 ml/kg según el peso corporal de las ratas. Las muestras de prueba fueron rhNGF, rhNGF-Fc1, rhNGF-li-Fc1, rhNGF (F12E)-Fc1 y rhNGF-Fc4, respectivamente, y la dosis fue de 1,2 nmol/kg. Se extrajeron 0,15 ml de sangre de la vena orbitaria posterior en diferentes momentos antes y después de la administración. La sangre extraída se puso inmediatamente en un tubo EP de 1,5 ml precargado con 20 ul de heparina sódica al 1%, y la mezcla se invirtió y se mezcló inmediatamente varias veces, seguido de una centrifugación a 4000 rpm y 4°C durante 20 min. El plasma sobrenadante se recogió y se congeló a -80°C.
2. Detección por Elisa
La concentración del fármaco en el plasma se detectó utilizando el kit de Elisa de hNGF (adquirido en Beijing sinobiological Co., Ltd., número de artículo: SEK11505).
3. Resultados
Según los resultados de la concentración de hNGF en el plasma mediante detección por Elisa, la vida media de la muestra de prueba se calculó mediante el método del modelo no compartimental (NCA) con el software WinNonlin 6.2. El T1/2 obtenido de las proteínas rhNGF, rhNGF-Fc1, rhNGF-li-Fc1, rhNGF(F12E)-Fc1 y rhNGF-Fc4 fue de 1,8 h, 38,75 h, 33,83 h, 32,24 h y 23,1 h, respectivamente. En comparación con la vida mediain vivodel rhNGF de 1,8 h, la vida mediain vivode las proteínas de fusión rhNGF-Fc1, rhNGF-li-Fc1 y rhNGF(F12E)-Fc1 se prolongó significativamente, alcanzando así 32 horas o más y prolongándose en más de 17 veces. En comparación con la vida mediain vivode rhNGF-Fc4, la vida mediain vivode las proteínas de fusión rhNGF-Fc1, rhNGF-li-Fc1 y rhNGF(F12E)-Fc1 se prolongó considerablemente, reduciendo así la tasa metabólica de rhNGF. Los resultados se muestran en la Tabla 2 y la Fig. 4.
Tabla 2
Ejemplo 5: Detección de la eficacia de la proteína de fusión
Se seleccionaron ratones Kunming macho y se determinó el umbral de dolor (umbral de dolor basal, tomando las patas traseras lamidas como indicación de observación) mediante el método de la placa caliente (54-55°C), y ratones Kunming macho con un umbral de dolor de más de 30 s se excluyeron para obtener ratones elegibles. Se anestesió al ratón con éter y luego se estableció un modelo de ratón de lesión del nervio ciático utilizando un método de pinzamiento del nervio, mientras que al grupo de operación simulada solo se le separó el nervio ciático, pero sin una pinza.
Los ratones se dividieron en tres grupos: un grupo de operación simulada, un grupo de control de lesiones (solución salina normal) y un grupo experimental (proteínas de fusión rhNGF, rhNGF-Fc1, rhNGF-li-Fc1, rhNGF(F12E)-Fc1 y rhNGF-Fc4), en donde cada grupo incluye 5 ratones.
Durante la operación, se añadieron gota a gota 50 pl de muestra de proteína que tenía la concentración correspondiente o solución salina normal (control), y se suturó la piel; se inyectaron por vía intraperitoneal 0,5E+ 11 UA/mol de muestra de proteína o solución salina normal a los ratones, y se determinó el umbral de dolor de cada ratón (la latencia de lamer las patas traseras del ratón, es decir, el(los) umbral(es) de dolor) antes de la cirugía y el día 1, día 3, día 5 y día 10 después de la cirugía, respectivamente.
Según el umbral de dolor, el aumento del umbral de dolor del ratón el día 10 se calculó según la siguiente fórmula:
Aumento en el umbral de dolor(%)
Umbral de dolor el día10después de la lesión — Umbral de dolor antes de la lesión Umbral de dolor antes de la lesión
Los resultados experimentales se muestran en la Tabla 3 a continuación. Como se puede ver en el valor del umbral de dolor, el umbral de dolor del ratón lesionado en el nervio ciático aumentó significativamente del día 1 al día 3, y el umbral de dolor se recuperó gradualmente con el tiempo. El aumento en el umbral del dolor de la muestra de proteína de fusión NGF de los subtipos IgG1-Fc e IgG4-Fc el día 10 después de una administración de dosis única fue significativamente mejor que los del grupo rhNGF y el grupo de control de lesiones, y el efecto de recuperación de la proteína de fusión<n>G<f>del subtipo IgG1-Fc fue significativamente mejor que el de la proteína de fusión del subtipo IgG4-Fc.
Tabla 3: Efecto de la proteína de fusión sobre los cambios en el umbral del dolor
en ratones después de una lesión del nervio ciático
Claims (15)
1. Una proteína de fusión del factor de crecimiento nervioso, representada por una fórmula general A-B o A-L-B, en donde A es un factor de crecimiento nervioso, L es un péptido conector y B es un resto Fc de IgG1, y en donde el factor de crecimiento nervioso es un factor de crecimiento nervioso humano.
2. La proteína de fusión del factor de crecimiento nervioso según la reivindicación 1, en donde el resto Fc de IgG1 tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 7, o una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 7 con los primeros 5 aminoácidos eliminados en el extremo N.
3. La proteína de fusión del factor de crecimiento nervioso según la reivindicación 1 o 2, en donde el factor de crecimiento nervioso humano es un factor de crecimiento nervioso humano de tipo sin mutaciones, o el factor de crecimiento nervioso humano que comprende F12E, K32G, K32L, K32Y, R59L, R59A, D65A, D65G, K74L, K88F, K88L, K88E, K88G, Q96E, R114V, R114F, R114G, R114L o F101A hacen referencia a la posición de aminoácido establecida en un factor de crecimiento nervioso humano de tipo sin mutaciones.
4. La proteína de fusión del factor de crecimiento nervioso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el factor de crecimiento nervioso humano es un factor de crecimiento nervioso humano de tipo sin mutaciones, o el factor de crecimiento nervioso humano que comprende F12E en referencia a la posición de aminoácido expuesta en un factor de crecimiento nervioso humano de tipo sin mutaciones.
5. La proteína de fusión del factor de crecimiento nervioso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el factor de crecimiento nervioso humano tiene una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2 y SEQ ID No: 13 a SEQ ID No: 30 en el listado de secuencias.
6. La proteína de fusión del factor de crecimiento nervioso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde L es un péptido rico en glicina o un péptido que tiene una secuencia [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n, en donde n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6, preferiblemente n es 2-6, más preferiblemente n es 3-4 y lo más preferiblemente n es 3.
7. La proteína de fusión del factor de crecimiento nervioso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde L no tiene más de 30 aminoácidos de longitud; preferiblemente no más de 20 aminoácidos de longitud, y más preferiblemente no más de 15 aminoácidos de longitud.
8. La proteína de fusión del factor de crecimiento nervioso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la proteína de fusión del factor de crecimiento nervioso tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 10.
9. Una secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína de fusión del factor de crecimiento nervioso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. Un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos según la reivindicación 9; preferiblemente, el vector de expresión es un vector de ADN o un vector viral; y más preferiblemente, el vector de ADN se selecciona del grupo que consiste en un vector plasmídico de ADN, un liposoma unido al mismo y un polímero unido al mismo; y preferiblemente, el vector plasmídico de ADN es un vector de expresión eucariótico; y el vector viral se selecciona del grupo que consiste en un vector de virus adenoasociado, un vector lentiviral y un vector adenoviral.
11. Un método para preparar una proteína de fusión del factor de crecimiento nervioso, que comprende: transformar el vector de expresión según la reivindicación 10 en una célula huésped, y cultivar una célula recombinante resultante para expresar el vector de expresión, para obtener la proteína de fusión del factor de crecimiento nervioso.
12. Una célula huésped que comprende el vector de expresión según la reivindicación 10; y preferiblemente, la célula huésped es una célula de mamífero, preferiblemente una célula de ovario de hámster chino, una célula de riñón embrionario humano 293, una célula COS o una célula Hela.
13. Una composición farmacéutica, que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable, y una o más de las proteínas de fusión del factor de crecimiento nervioso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, la secuencia de polinucleótidos según la reivindicación 9, el vector de expresión según la reivindicación 10 y la célula huésped según la reivindicación 12; preferiblemente, la composición farmacéutica es una inyección, una cápsula, un comprimido o un polvo; y más preferiblemente, la composición farmacéutica es una inyección que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y una proteína de fusión del factor de crecimiento nervioso.
14. La proteína de fusión del factor de crecimiento nervioso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en el tratamiento de una enfermedad del sistema nervioso, en donde la enfermedad del sistema nervioso se selecciona de enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, accidente cerebrovascular, ELA, neuropatía periférica y una neuropatía asociada con diabetes, SIDA o quimioterapia.
15. La proteína de fusión del factor de crecimiento nervioso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en una reducción eficaz de peso.
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