CN105273087A - NGF-Fc融合蛋白及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种NGF-Fc融合蛋白及其制备方法，本发明通过基因工程手段构建人免疫球蛋白IgG？Fc与神经生长因子(NGF)融合基因的表达载体，转染哺乳动物细胞高表达生产NGF-Fc融合蛋白，然后纯化、鉴定和生物学活性检测。本发明通过构建的表达载体转染哺乳动物细胞可以表达出有生物活性的NGF-Fc融合蛋白，能获得150mg/L乃至更高的表达量，且获得的蛋白稳定性好、半衰期长,可用于制备治疗阿尔兹海默症、糖尿病性周围神经病变、帕金森氏病、面部神经炎、颅脑，脊髓外伤、急性脑血管病，脑萎缩等神经损伤等神经系统疾病，以及化学品毒品所致的周围神经损伤急性脑血管性中枢神经损伤的药物。

Description

NGF-Fc融合蛋白及其制备方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种NGF-Fc融合蛋白及其制备方法，尤其涉及通过构建重组工程细胞株获得高效表达NGF-Fc融合蛋白的方法。

背景技术

据报道，神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF)是神经营养因子中最早被发现、目前研究最为透彻的、具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。研究显示NGF包含α、β、γ三个亚单位，活性区是β亚单位，由两个118个氨基酸组成的单链通过非共价键结合而成的二聚体，与人体NGF的结构具有高度的同源性，生物效应也无明显的种间特异性。

研究公开了人神经生长因子(humannervegrowthfactor,hNGF)是人体中一种对正常神经细胞有营养作用，对损伤神经修复机能有调节作用的生物活性因子，可维持交感神经和感觉神经的生存，促进神经细胞的分化，决定轴突的伸展方向。对促进大脑发育、神经系统的生长、损伤神经的再生和功能恢复具有决定性的作用。hNGF是目前唯一可应用于临床的神经系统蛋白因子，据知，已被临床实践用于治疗阿尔兹海默症、糖尿病性周围神经病变、帕金森氏病、面部神经炎以及神经损伤等神经系统疾病。

然而，hNGF在人体中含量甚微，天然来源几乎不可能。尽管鼠源NGF与人类NGF有90％同源性，但对于人体而言属于异源蛋白，会产生免疫原性。随着人类寿命的延长，糖尿病、阿尔兹海默等疾病发病率提高，人源NGF用于临床成为必然。利用基因工程技术的表达人源NGF成为可能，已有研究利用哺乳动物细胞(HelaTet-offcell；CHOcell)、昆虫细胞、大肠杆菌(专利申请号201210278039.0)、哺乳动物[5]等系统表达人β-NGF的报道。

蛋白类药物在临床上有诸多优点，但也存有若干缺点，众所周知，蛋白类药物在胃肠道内易被蛋白酶类水解，仅限于注射给药；血浆半衰期短，需反复注射等。蛋白药物修饰是目前蛋白药物研究重点之一，其中构建融合蛋白是蛋白修饰的重要策略；将目的蛋白与某一半衰期较长、分子量较大蛋白的基因首尾相连，由同一调控序列控制的基因表达产物即融合蛋白。目前应用最广泛的为人血清白蛋白和免疫球蛋白(IgG)的Fc片段，其中IgG是血浆半衰期最长大蛋白质(23天)，可与新的IgG受体结合，避免抗体进入溶酶体被溶解，因而在血浆中有高的稳定性。利用Fc制备融合蛋白已有报道，但其中的融合蛋白物上存在不能增强蛋白稳定性，延长血浆半衰期的缺陷。

鉴于现有技术中存在的上述问题。本申请的发明人拟利用哺乳动物表达系统高表达的NGF-Fc融合蛋白及制备方法，达到提高体内半衰期，延长作用时间的目的。

发明内容

本发明的目的是为克服现有技术存在的缺陷，提供一种NGF-Fc融合蛋白及其制备方法。

本发明利用免疫球蛋白IgG4其片段Fc制备NGF-Fc融合蛋白及在哺乳动物细胞体系成功表达出活性长效蛋白，能明显延长神经生长因子NGF的体内半衰期和稳定性。

本发明中，通过基因工程手段构建人免疫球蛋白IgGFc与神经生长因子(NGF)融合基因的表达载体，转染哺乳动物细胞高表达生产NGF-Fc融合蛋白，然后纯化、鉴定和生物学活性检测，结果表明，本发明通过使用构建的表达载体转染哺乳动物细胞可以表达出有生物活性的NGF-Fc融合蛋白，和获得150mg/L乃至更高的表达量，且蛋白稳定性好、半衰期长的NGF-Fc融合蛋白。

本发明所制得的NGF-Fc融合蛋白可进一步制备用于治疗阿尔兹海默症、糖尿病性周围神经病变、帕金森氏病、面部神经炎、颅脑，脊髓外伤、急性脑血管病，脑萎缩等神经损伤等神经系统疾病，以及化学品毒品所致的周围神经损伤急性脑血管性中枢神经损伤的药物。

本发明首先提供了一种用于哺乳动物表达系统高表达NGF-Fc的基因序列，其包括人神经生长因子(NGF)和人丙种免疫球蛋白(IgG4)的重链恒定区片断(Fc)；

进一步，本发明提供一种NGF-Fc融合蛋白，所述NGF是指人源的，Fc片段来自人的IgG4，所述的Fc序列位于NGF的氨基端；Fc片段与NGF之间的融合为直接融合或通过连街序列(linker)融合；连接序列为GSGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；

进一步，本发明提供NGF-Fc融合蛋白哺乳动物体系高表达制备方法，其包括步骤：

1)人工合成编码人NGF的DNA序列；

2)hNGFDNA序列克隆到含Fc的过度载体上；

3)NGF-Fc真核表达载体的构建及转入哺乳动物细胞；

4)NGF-Fc融合蛋白的表达和纯化；

5)NGF-Fc融合蛋白的活性鉴定；

6)NGF-Fc融合蛋白体内代谢。

本发明中，编码的NGF-Fc融合蛋白的DNA序列如序列1所示附图1a):。

所述的NGF是指人源NGF，具有239氨基酸的人源神经生长因子序列；

所述的Fc片段来自人的IgG4或其亚型，包括铰链区，本发明的一个实施例中，所述Fc片段为含有氨基酸突变的变异型IgG4-Fc；

本发明中，构建了NGF-Fc表达载体，所述的表达载体的构建是通过基因工程手段将NGF-Fc融合基因序列克隆到哺乳动物细胞的真核表达载体上；

通过分子生物学手段进行DNA合成，获得的人源NGF的DNA序列，用预先设计的NheI和BamHI进行酶切纯化,获得由NheI-BamHI粘性端的NGF片断；将过度质粒pUC-Fc进行NheI和BamHI酶切纯化,获得由NheI-BamHI粘性端的DNA载体片断；将NGF片断与载体片断进行连接，转化大肠杆菌，获得阳性克隆并酶切和测序证实无误；

本发明中，NGF-Fc融合基因克隆到具有真核表达元件的载体，如CMV病毒启动子，SV40病毒polyA信号，小鼠四氢叶酸脱氢酶序列IRES-DHFRNeo基因序列；通过瞬时或稳定转染转染哺乳动物细胞，挑选阳性克隆，无血清驯化，细胞上清液通过protein亲和纯化的方法纯化得到融合蛋白NGF-Fc；

本发明中，所采用的NGF-Fc融合蛋白表达盒包括NGF序列、连接序列和Fc序列。

本发明中，所述的真核表达载体能被宿主细胞高效表达。

本发明中，采用SDS-PAGE方法鉴定融合蛋白分子量，分别采用Fc单抗核NGF抗体作为一抗做western-blot进行免疫学鉴定，采用促进鸡胚背根神经节生长方法进行生物学活性鉴定；结果显示，所述的NGF-Fc融合蛋白血浆半衰期比原型NGF明显延长。

本发明通过构建的表达载体转染哺乳动物细胞能获得表达量150mg/L乃至更高的有生物活性的NGF-Fc融合蛋白，且获得的蛋白稳定性好、半衰期比原型NGF明显延长，构建的Fc-融合蛋白能明显提高表达水平和简化纯化步骤，更有利于成药性。可进一步用于制备治疗阿尔兹海默症、糖尿病性周围神经病变、帕金森氏病、面部神经炎、颅脑，脊髓外伤、急性脑血管病，脑萎缩等神经损伤等神经系统疾病，以及化学品毒品所致的周围神经损伤急性脑血管性中枢神经损伤的药物。

附图说明

图1是NGF-Fc融合蛋白哺乳动物表达载体构建图。

图2是NGF-Fc融合蛋白SDS-PAGE鉴定图，

其中，15％SDS-PAGE电泳，银染，1为mark，2，NGF-Fc细胞培养液，3，纯化后NGF-Fc。

图3是NGF-Fc融合蛋白western-blot鉴定图，

其中显示了：3aNGF-Fc和NGF基因工程细胞细胞上清SDS-PAGE分析，

1，对照，2，NGF-Fc，3，4，5，6，7为NGF不同培养时间；

3b，对应的western—blot。

图4是NGF-Fc融合蛋白促进鸡胚背根神经节生长图。

具体实施方式

实施例1制备NGF-Fc融合基因

编码NGF肽段DNA序列制备：人工合成编码NGF肽段DNA序列，DNA序列两端引入NheI和BamHI酶切位点。用NheI和BamHI双酶切体系进行酶切、纯化,获得由NheI-BamHI粘性端的NGF片断，将含编码Fc肽段DNA序列的过度质粒pUC-Fc进行也NheI和BamHI进行双酶切、纯化,获得由NheI-BamHI粘性端的DNA载体片断，将NGF片断与载体片断进行连接，转化大肠杆菌，获得阳性克隆pUc-NGF-Fc，并酶切和测序证实无误。

实施例2制备NGF-Fc融合基因表达载体

pUc-NGF-Fc用NdeI和NotI进行双酶切，凝胶糖回收NGF-Fc片断，表达载体用NdeI和NotI进行双酶切，凝胶糖回收大片段(载体片段)，用T4DNA连接酶连接载体DNA片段和NdeI和NotI片段，连接产物转化大肠杆菌，挑选鉴定获得阳性克隆，酶切鉴定正确。

实施例3NGF-Fc融合蛋白表达与纯化

NGF-Fc融合表达载体转染CHO细胞Lipofectamine介导的CHO细胞转染：培养CHO细胞至40％～60％汇合。制备转染液:A液：用无血清DMEM培养基稀释10μgDNA至100μl；B液:用无血清DMEM培养基稀释15μlLipofectamine至100μl；轻轻混合A、B二液，室温放置15分钟，缓缓加入细胞培养皿中，摇匀，37℃CO2温箱放置24小时，吸除上清,换入完全培养基继续培养，；

阳性细胞的筛选：吸除培养基，换入筛选高表达单克隆细胞株的筛选液((含800μgPmlG418的10％小牛血清的DMEM完全培养基)进行筛选，至细胞大部分死亡后换入筛选维持液(含200μg/mlG418的10％小牛血清的DMEM完全培养基)维持筛选；

NGF-Fc融合蛋白的纯化：收集细胞上清液，离心(12000rpm.10min),取出细胞碎片，上清液上样于已准备好的proteinA柱，洗脱收集NGF-Fc。

实施例4NGF-Fc融合蛋白鉴定：SDS-PAGE和western-blot

收集液进行SDS-PAGE鉴定，结果显示蛋白条带在55-40Kd之间(正确的为47Kd)，表明为Fc和NGF的融合蛋白(如图2所示)；进一步进行western-blot，一抗为NGF抗体，免疫印迹显示有特异性条带(如图3a和图3b所示)。

实施例5NGF-Fc融合蛋白活性实验

促鸡胚背根神经节生长试验：

96孔板涂上鼠尾胶原，在培养孔中加入培养液和鸡血浆，然后放入孵育8—9天的鸡胚背根神经节(每孔2-3个)，再加入NGF-Fc样品，空白对照组则加培养液，最后加入鸡胚浸液，并置于37℃、5％CO₂培育箱中培养36h,结果显示，表达的NGF-Fc融合蛋白可以明显促进鸡胚背根神经节的生长(如图4所示)。

SEQUENCELISTING

<110>复旦大学

<120>NGF-Fc融合蛋白及其制备方法

<160>1

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>1464

<212>DNA

<213>NGF-Fc融合基因

<400>1

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Claims (10)

1.一种NGF-Fc融合蛋白，其特征在于，其包括：人神经生长因子NGF和人丙种免疫球蛋白IgG4的重链恒定区片断Fc；所述NGF-Fc融合蛋白其核苷酸序列如序列1所示。

2.按权利要求1所述的NGF-Fc融合蛋白，其特征在于，所述的Fc序列位于NGF的氨基端。

3.按据权利要求1或2所述的NGF-Fc融合蛋白，其特征在于，所述的Fc片段与NGF之间的融合为直接融合或通过连街序列GSGGGSGGGGSGGGGSGGGGS融合。

4.权利要求1所述的NGF-Fc融合蛋白的制备方法，其特征在于，其包括步骤：

1)人工合成编码人NGF的DNA序列；

2)hNGFDNA序列克隆到含Fc的过度载体上；

3)NGF-Fc真核表达载体的构建及转入哺乳动物细胞；

4)NGF-Fc融合蛋白的表达和纯化；

5)NGF-Fc融合蛋白的活性鉴定；

6)NGF-Fc融合蛋白体内代谢。

5.按权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的NGF-Fc融合蛋白采用的表达盒包括NGF序列、连接序列和Fc序列。

6.按权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的表达载体的构建是通过基因工程手段将NGF-Fc融合基因序列克隆到哺乳动物细胞的真核表达载体上。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的真核表达载体能被宿主细胞高效表达。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征是：能被宿主细胞高效表达的NGF-Fc融合蛋白血浆半衰期明显延长。

9.权利要求1的NGF-Fc融合蛋白在用于制备治疗神经损伤的神经系统疾病，以及化学品毒品所致的周围神经损伤急性脑血管性中枢神经损伤药物中的用途。

10.按权利要求1的用途。其中所述的神经损伤的神经系统疾病是阿尔兹海默症、糖尿病性周围神经病变、帕金森氏病、面部神经炎、颅脑，脊髓外伤、急性脑血管病或脑萎缩。