WO2017157325A1 - 神经生长因子融合蛋白、制备方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
神经生长因子融合蛋白、制备方法及其用途，属于生物制药领域。一种神经生长因子融合蛋白，通式为A-B或A-L-B；其中A为神经生长因子，L为连接肽，B为IgG的Fc部分、或IgG的Fc部分的类似物、或IgG的Fc部分的片段。优点是：所述的神经生长因子融合蛋白具有比野生型NGF更高的生物活性，半衰期可延长17倍以上，大大减少了用药频率，药效得到了明显提高。
Description
本发明涉及神经生长因子融合蛋白、制备方法及其用途，属于生物制药领域。
神经生长因子(Nerve Growth Factor，NGF)是意大利科学家Levi-Montlcini于1953年在小鼠肉瘤细胞内发现的第一个神经营养因子，NGF是一种具有神经元营养和促进突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。NGF包含α、β、γ三个亚单位，β亚单位是活性区，由两条单链通过非共价键结合而成。目前，国内外已有多个NGF产品上市，临床上主要用于治疗神经系统发育不良，包括弱视、神经瘤、各种神经损伤及神经系统病变等疾病。
NGF作为一种蛋白类药物，促神经生长活性主要集中在沉降系数为2.5S的β-NGF，分子量为13.5Kd，在代谢过程中易被肾小球滤过导致体内半衰期较短，研究表明，小鼠肌肉注射给予β-NGF药物，T1/2(β)＝2.2h，Tmax＝0.5h，注射频率为一天一次。因NGF注射时存在着注射部位疼痛或注射侧下肢疼痛的不良反应，故减少患者给药次数与频率，有利于缓解患者的不良反应，其中解决途径之一就是开发长效化生物活性高的NGF。
蛋白药物修饰是目前蛋白类药物长效化的研究重点之一，其中构建融合蛋白是蛋白修饰的重要策略。将目的蛋白与某一半衰期较长、分子量较大蛋白的基因首尾相连，由同一调控序列控制的基因表达产物即融合蛋白，但要做到提高蛋白类药物的生物活性的同时延长其半衰期还是一个临床上面临的难题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供了一种神经生长因子融合蛋白，所述融合蛋白与原蛋白相比不仅提高了生物活性，大大延长了半衰期，减少了患者给药次数与频率，从而缓解了患者的不良反应，并且药效得到明显提高。
本发明提供了一种神经生长因子融合蛋白，通式为A-B或A-L-B；其中A为神经生长因子，L为连接肽，B为IgG的Fc部分、或IgG的Fc部分的类似物、
或IgG的Fc部分的片段。
IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白。IgG在所有免疫球蛋白中也是血清半衰期最长的。与其它免疫球蛋白不同，IgG在与Fc受体结合后有效再循环。有四种IgG亚类G1，G2，G3，和G4，每一种都有不同的效应物功能。此处用到的免疫球蛋白的Fc部分具有免疫学领域术语的常用含义。具体地，该术语是指通过从抗体去除两个抗原结合区(Fab片段)而得到的抗体片段。去除Fab片段的一种方法是用木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白。因此，Fc部分是由两条重链的恒定区的几乎相等大小的片段形成的，这两条链是通过非共价相互作用和二硫键而缔合。Fc部分可以包括铰链区并且延伸通过CH2和CH3结构域到达抗体C末端。
根据需要的体内作用，神经生长因子融合蛋白结构通式中的B部分可为任何IgG亚类的Fc部分或其突变体。这样，本发明的神经生长因子融合蛋白可以含有与神经生长因子融合的免疫球蛋白的完整Fc部分、免疫球蛋白Fc部分的片段或其类似物。
因Fc部分序列的引入，有可能对NGF的活性产生影响，也有可能会介导抗体依赖的细胞毒作用和补体依赖的细胞毒作用，因此需要对各种亚类的Fc序列进行筛选或突变，以便获得生物活性高、半衰期长的融合蛋白。
所述神经生长因子融合蛋白通式中的B为IgG1的Fc部分、或IgG1的Fc部分的类似物、或IgG1的Fc部分的片段；优选所述IgG1的Fc部分含有CH2和CH3区，包括铰链区；更优选所述IgG1的Fc部分为SEQ ID No：5所示的氨基酸序列。
优选地，所述神经生长因子融合蛋白的B优选为IgG1的Fc部分的类似物。其中所述Fc部分的类似物包括与ADCC/CDC活性相关位点突变、去糖基化突变等改造。更优选地，所述Fc部分的类似物为SEQ ID No：7所示的氨基酸序列。进一步优选地，所述Fc部分的类似物为SEQ ID No：7所示的氨基酸序列的N端缺少前5个氨基酸的序列。
所述神经生长因子为野生型人神经生长因子。任何人神经生长因子都可以是本发明的神经生长因子融合蛋白的一部分，只要该人神经生长因子本身可以结合人神经生长因子受体并通过人神经生长因子受体诱导信号传递。
所述神经生长因子为人神经生长因子类似物，一般优选具有不超过6个氨基酸突变位点的人神经生长因子。甚至更优选具有不超过5个氨基酸突变位点人神经生长因子，最优选具有不超过4，3或2个氨基酸突变位点的人神经生长因子。
所述人神经生长因子为人神经生长因子衍生物。本发明中“人神经生长因子衍生物”是指具有人神经生长因子或人神经生长因子类似物的氨基酸序列的分子，但在其一个或多个氨基酸侧基、α碳原子、末端氨基或末端羧基还额外具有化学修饰。化学修饰包括，但不限于，添加化学部分，产生新的键，和去除化学部分。氨基酸侧基的修饰包括，但不限于，赖氨酸ε氨基的酰化，精氨酸，组氨酸，或赖氨酸的N烷基化，谷氨酸或天冬氨酸的羧基的烷基化，以及谷氨酰胺或天冬酰胺的脱酰胺。末端氨基的修饰包括，但不限于，脱氨基、N-低级烷基、N-二-低级烷基和N-酰基修饰。末端羧基的修饰包括，但不限于，酰胺、低级烷基酰基、二烷基酰胺和低级烷基酯修饰。低级烷基为C1-C4烷基。此外，可以用化学领域普通技术人员公知的保护基对一个或多个侧基或端基进行保护。氨基酸的α碳可以被单或二甲基化。
许多有活性的人神经生长因子片段、类似物和衍生物是本领域公知的，这些类似物和衍生物的任意一个都可以是本发明的神经生长因子融合蛋白的一部分。此处提供了新的人神经生长因子类似物和本领域公知的人神经生长因子类似物和衍生物的一些例子。
所述人神经生长因子优选为序列表SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：13至SEQ ID No：30中任意一条所示的氨基酸序列。
本发明的人神经生长因子包括一系列可以减轻疼痛副作用甚至无痛的神经生长因子突变体，即重组hNGF。这些神经生长因子突变体，具有序列表SEQ ID No：2、SEQ ID No:13至SEQ ID No:30中任意一条所示的氨基酸序列。
F12E：氨基酸序列为SEQ ID No：2；
K32G：氨基酸序列为SEQ ID No：13；
K32L：氨基酸序列为SEQ ID No：14；
K32Y：氨基酸序列为SEQ ID No：15；
R59L：氨基酸序列为SEQ ID No：16；
R59A：氨基酸序列为SEQ ID No：17；
D65A：氨基酸序列为SEQ ID No：18；
D65G：氨基酸序列为SEQ ID No：19；
K74L：氨基酸序列为SEQ ID No：20；
K88F：氨基酸序列为SEQ ID No：21；
K88L：氨基酸序列为SEQ ID No：22；
K88E：氨基酸序列为SEQ ID No：23；
K88G：氨基酸序列为SEQ ID No：24；
Q96E：氨基酸序列为SEQ ID No：25；
R114V：氨基酸序列为SEQ ID No：26；
R114F：氨基酸序列为SEQ ID No：27；
R114G：氨基酸序列为SEQ ID No：28；
R114L：氨基酸序列为SEQ ID No：29；
F101A：氨基酸序列为SEQ ID No：30。
所述L为富含甘氨酸的肽、或具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n序列的肽，其中n是1，2，3，4，5或6。优选地，添加连接肽(通式中L)以防止潜在的不希望的结构域相互作用而对本发明的神经生长因子融合蛋白的体内功能和稳定性进行优化。尽管这些连接肽可以是任意长度并且由任意氨基酸组合组成，其长度优选不超过防止不希望的结构域相互作用和/或优化生物功能和/或稳定性所必须的长度。连接肽优选富含丝氨酸-甘氨酸，并且其长度优选不超过30个氨基酸。连接肽的长度更优选不超过20个氨基酸，更优选不超过15个氨基酸。优选的连接肽含有序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser的重复。优选有2-6个该序列的重复。甚至更优选有3-4个该序列的重复。最优选的所述连接肽的序列为Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser。即最优选的连接肽L为[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3。
优选地，所述神经生长因子融合蛋白为SEQ ID No：10所示的氨基酸序列。
本发明还包括编码上述描述的神经生长因子融合蛋白的多核苷酸序列。
一种表达载体，含有所述的核苷酸序列。
所述表达载体为DNA载体或病毒载体。
所述DNA载体选自由DNA质粒载体、结合其的脂质体、结合其的分子耦联体和结合其的多聚物所组成的组中；优选地，所述DNA质粒载体为真核细胞表达载体；所述病毒载体选自由腺相关病毒载体、慢病毒载体和腺病毒载体所组成的组中。
一种神经生长因子融合蛋白的制备方法，将上述表达载体转化至宿主细胞，培养所得重组细胞表达得到所述神经生长因子融合蛋白。
含有所述表达载体的宿主细胞。
所述的宿主细胞为哺乳动物细胞。
所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞、人胚肾293细胞、COS细胞或Hela细胞。
一种药物组合物，所述药物组合物含有药学上可接受的赋形剂，以及上述提及的神经生长因子融合蛋白、上述提及的表达载体和上述提及的宿主细胞中的一种或几种。
本发明的药物可以制成注射剂、胶囊、片剂或粉剂等多种形式，上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
所述药物组合物优选为注射剂，所述注射剂包括药学上可接受的赋形剂以及上述提及的神经生长因子融合蛋白。
所述的神经生长因子融合蛋白用于制备治疗神经系统疾病的药物中的用途。所述神经系统疾病指与神经元退化或损伤相关的中枢和/或外周神经系统的疾病。神经系统疾病的具体例子包括但并不限于：Alzheimer病、Parkinson病、Huntington舞蹈病、中风、ALS、外周神经病变和其他特征为神经元坏死或丧失的病症，无论是中枢的、外周的还是运动神经元(motorneuron)，除了治疗因外伤、烧伤、肾衰竭或受伤造成的神经损伤之外。例如，与某些病症相关的外周神经病变如与糖尿病、AIDS或化疗相关的神经病变。
将神经生长因子融合蛋白制备得到治疗神经系统疾病的药物可用于给病人施用。确切的使用剂量将取决于被治疗的疾病，而且可由该领域的技术人员用已知技术确定。另外，如本领域中所知，需要根据年龄、体重、一般健康状况、性
别、饮食、施用时间、药物相互作用和疾病严重程度等情况加以调节，这可由该领域的技术人员通过常规试验而确定。此处提及的病人包括人和其他动物及生物体。因此，这些方法可用于人的治疗和兽用。
本发明的由神经生长因子融合蛋白制备得到治疗神经系统疾病的药物的施用可用多种方法进行，其中包括但并不限于：口服、皮下、静脉、脑内、鼻内、透过皮肤、腹膜内、肌内、肺内、阴道给药、直肠给药和眼内给药等。在某些情况下，比如在处理伤口时，可直接以溶液或喷雾形式施用。
本发明的药物组合物含有所述神经生长因子融合蛋白，它处于适合给病人施用的形式。在优选例子中，药物组合物是水溶性形式，并且可以含有诸如载体、赋形剂、稳定剂、缓冲液、盐分、抗氧化剂、亲水聚合物、氨基酸、碳水化合物、离子或非离子表面活性剂、聚乙二醇或丙二醇等。所述神经生长因子融合蛋白制备的药物也可以用本领域已知的技术以缓释形式植入，或者以微囊形式包埋。所述的神经生长因子融合蛋白用于制备有效减轻体重的药物中的用途。
本发明的优点是：本发明所述的神经生长因子融合蛋白具有比野生型NGF更高的生物活性，半衰期可延长17倍以上，大大减少了用药频率，同时药效得到了明显提高。
以下结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明，并非对本发明的限定，凡依照本发明公开内容所进行的本领域等同替换，均属于本发明保护范围。
图1为实施例2中rhNGF-Fc融合蛋白纯化样品Western Blot显色图
图2为实施例3融合蛋白体外活性检测结果
图3为实施例3融合蛋白体外活性检测结果
图4为实施例4融合蛋白体内半衰期检测结果
下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1.制备融合蛋白表达质粒
(1)rhNGF-Fc1融合蛋白表达质粒构建
合成编码人源β-NGF核苷酸序列SEQ ID No：3，并以其为模板，使用引物F1/R1进行PCR扩增得到5’端含Not Ⅰ酶切位点的NGF片段；合成编码人源IgG1-Fc的核苷酸序列SEQ ID No：8。并以其为模板，使用引物F2/R2进行PCR扩增得到3’端含Age Ⅰ酶切位点的Fc片段；再以NGF片段和Fc片段的PCR产物混合物为模板，使用引物F1/R2进行PCR扩增得到NGF-Fc融合基因片段并回收，再分别对NGF-Fc融合基因片段及质粒pcDNA3.1(购自于英潍捷基(上海)贸易有限公司)进行Age Ⅰ、Not Ⅰ双酶切、回收、连接、转化，得到pcDNA3.1-rhNGF-Fc1表达质粒。
(2)rhNGF-li-Fc1融合蛋白表达质粒构建
合成编码人源β-NGF核苷酸序列SEQ ID No：3，并以其为模板，使用引物F1-2/R1-2进行PCR扩增得到5’端含Not Ⅰ酶切位点的NGF片段；同时合成编码linker(G4S)3的核苷酸序列SEQ ID No：35与人源IgG1-Fc的核苷酸序列SEQ ID No：9的组合序列，并以其为模板，使用引物F2-2/R2-2进行PCR扩增得到3’端含Age Ⅰ酶切位点的Fc片段；再以NGF片段和Fc片段的PCR产物混合物为模板，使用引物F1-2/R2-2进行PCR扩增得到NGF-Fc融合基因片段并回收，再分别对NGF-Fc融合基因片段及质粒pcDNA3.1(购自于英潍捷基(上海)贸易有限公司)进行Age Ⅰ、Not Ⅰ双酶切、回收、连接、转化，得到pcDNA3.1-rhNGF-li-Fc1表达质粒。
(3)rhNGF(F12E)-Fc1融合蛋白表达质粒构建
以融合蛋白表达质粒pcDNA3.1-rhNGF-Fc1为模板，使用突变引物F12E-F/F12E-R进行PCR扩增、回收，经Dpn Ⅰ酶切消化模板后转化，得到pcDNA3.1-rhNGF(F12E)-Fc1表达质粒。
(4)rhNGF-Fc4融合蛋白表达质粒构建
首先，以pcDNA3.1-rhNGF-Fc1融合基因为模板，使用引物1F/1R进行PCR扩增得含NGF序列的载体骨架；合成人源IgG4-Fc核苷酸序列SEQ ID No：12，并以其为模板，使用引物PAA-F/PAA-R进行PCR扩增得到含IgG4-Fc片段；再将两种PCR产物进行无缝连接后转化。
实验结果：
挑取阳性克隆进行测序，结果证实rhNGF-Fc1、rhNGF-li-Fc1、rhNGF(F12E)-Fc1和rhNGF-Fc4融合蛋白表达基因序列无误。
实施例2.融合蛋白表达与纯化
1.CHO细胞表达融合蛋白
悬浮培养的CHO细胞，DMEM培养基洗涤一次后调整细胞密度为2.5×106/ml；每转染300ml细胞需要准备：10ml Opti-RPO(Invitrogen)稀释300μg表达质粒，6ml Opti-PRO稀释1.5ml PEI(1mg/ml),分别配置好后充分混匀，静置5min后将PEI稀释液加入质粒稀释液中，混匀后室温孵育10min，再将PEI-质粒混合
物缓慢加入150ml重悬细胞中，于37℃6％二氧化碳培养箱中105rpm震荡培养4h，补加等体积150ml表达培养基EX-CELL Advanced CHO Fed-batch medium(sigma)，1mM丙戊酸钠(0.5mol/L),32℃6％二氧化碳培养箱中120rpm震荡培养18-24h后补加补料Sheff-CHO Plus ACF(Kerry Sheffield)(50g/L)30ml，4d后收获上清。
2.ProteinA亲和柱纯化融合蛋白
收集细胞培养上清，0.45μm滤膜过滤去除细胞及其碎片，上清液上样于已准备好的ProteinA层析柱，以20mM PB+0.15M NaCl溶液(pH值7.2)去杂后，用50mM柠檬酸缓冲液(pH值3.4)进一步洗脱，收集蛋白样品，立即加2mol/L Tris溶液中和至pH值6.8。
取纯化样品分别进行NGF抗体和Fc抗体Western Blot检测，实验结果如图1所示：其中泳道1/2/3/4分别对应的样品为rhNGF-Fc1、rhNGF-li-Fc1、rhNGF(F12E)-Fc1、rhNGF-Fc4融合蛋白。
实施例3.融合蛋白体外活性检测
详细操作方法按照专利公开号为CN103376248A，专利名称为“神经生长因子活性定量测定方法”中实施例1中的方法进行操作，比活性及摩尔比活性结果见下表。
实验结果如表1、图2及图3所示：
说明rhNGF-Fc1、rhNGF-li-Fc1、rhNGF(F12E)-Fc1融合蛋白的比活性与rhNGF相比基本持平，而rhNGF-Fc4融合蛋白的比活性则降低了。
按分子量换算的摩尔比活性计算，与IgG1-Fc亚型的NGF融合蛋白普遍摩尔比活性高于对应的rhNGF，且也较好于rhNGF-Fc4融合蛋白的摩尔比活性。
表1
实施例4.融合蛋白体内半衰期检测
1.给药采血
将体重约250g的SD雄性大鼠随机分组，每组4只，按照大鼠体重以1ml/kg体积进行肌肉注射给予供试样品，供试品分别为rhNGF、rhNGF-Fc1、rhNGF-li-Fc1、rhNGF(F12E)-Fc1、rhNGF-Fc4，剂量为1.2nmol/kg,并于给药前、给药后不同时间点进行眼眶后静脉采血0.15ml,取出的血液立即置于预装有20ul1％肝素钠的1.5ml EP管中，立即颠倒混匀数次，4000rpm、4℃离心20min，取上清血浆，-80℃冻存。
2.Elisa检测
采用hNGF elisa试剂盒(购自于北京义翘神州科技有限公司，货号：SEK11505)进行血药浓度检测。
3.结果
根据Elisa检测血浆中hNGF浓度结果，经WinNonlin 6.2软件进行非房室模型方法(NCA)拟合计算检测样品的半衰期，分析得到rhNGF、rhNGF-Fc1、rhNGF-li-Fc1、rhNGF(F12E)-Fc1和rhNGF-Fc4蛋白的T1/2分别为1.8h、38.75h、33.83h、32.24h、23.1h，与rhNGF的体内半衰期1.8h相比，融合蛋白rhNGF-Fc1、rhNGF-li-Fc1、rhNGF(F12E)-Fc1体内半衰期明显延长，达到了32小时以上，延长17倍以上；与rhNGF-Fc4的体内半衰期相比，融合蛋白rhNGF-Fc1、rhNGF-li-Fc1、rhNGF(F12E)-Fc1体内半衰期也大大延长了，降低了rhNGF的代谢速率。结果详见表2及图4。
表2
| 供试品 | T1/2(h) |
| rhNGF | 1.8 |
| rhNGF-Fc1 | 38.75 |
| rhNGF-li-Fc1 | 33.83 |
| rhNGF(F12E)-Fc1 | 32.24 |
| rhNGF--Fc4 | 23.1 |
实施例5.融合蛋白药效检测
选取昆明种雄性小鼠，用热板法(54-55℃)测定小鼠痛阈(基础痛阈，以舔后足为观察指征)，淘汰痛阈超过30s的昆明中雄性小鼠，得到符合要求的小鼠。经乙醚麻醉，采用小鼠坐骨神经钳夹法造成神经损伤模型，假手术组只分离
坐骨神经，但不钳夹。
分为三组：假手术组、损伤对照组(生理盐水)、实验组(rhNGF、rhNGF-Fc1、rhNGF-li-Fc1、rhNGF(F12E)-Fc1和rhNGF-Fc4融合蛋白)，每组5只。
手术过程中局部滴加相应浓度的蛋白样品或生理盐水(对照)50μl,缝合皮肤；腹腔注射0.5E+11AU/mol的蛋白样品或生理盐水，分别于术前和术后1、3、5、10d测定每只小鼠的痛阈(小鼠舔后足的潜伏期，即痛阈(s))。
根据疼痛阈值按照下列公式计算出第10d小鼠痛阈增值：
实验结果如下表3所示，根据痛阈数值可以看出坐骨神经损伤第1-3d小鼠的痛阈值明显增加，随时间延长，痛阈逐渐恢复。IgG1-Fc和IgG4-Fc亚型的NGF融合蛋白样品单次给药后第10d痛阈增值明显优于rhNGF组和损伤对照组，且IgG1-Fc亚型的NGF融合蛋白的恢复效果明显优于IgG4-Fc亚型融合蛋白。
表3融合蛋白对小鼠坐骨神经损伤后痛阈变化的影响
Claims (21)
- 一种神经生长因子融合蛋白，其特征在于：通式为A-B或A-L-B；其中A为神经生长因子，L为连接肽，B为IgG的Fc部分、或IgG的Fc部分的类似物、或IgG的Fc部分的片段。
- 根据权利要求1所述的一种神经生长因子融合蛋白，其特征在于：所述神经生长因子融合蛋白通式中的B为IgG1的Fc部分、或IgG1的Fc部分的类似物、或IgG1的Fc部分的片段；优选所述IgG1的Fc部分含有CH2和CH3区，包括铰链区；更优选所述IgG1的Fc部分为SEQ ID No：5所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1或2所述的一种神经生长因子融合蛋白，其特征在于：所述IgG1的Fc部分的类似物，其中所述Fc部分的类似物包括与ADCC/CDC活性相关位点突变、去糖基化突变等改造；更优选地，所述Fc部分的类似物为SEQ ID No：7所示的氨基酸序列；进一步优选地，所述Fc部分的类似物为SEQ ID No：7所示的氨基酸序列的N端缺少前5个氨基酸的序列。
- 根据权利要求1-3任一项所述的一种神经生长因子融合蛋白，其特征在于：所述神经生长因子为野生型人神经生长因子、或人神经生长因子类似物、或人神经生长因子衍生物。
- 根据权利要求4所述的一种神经生长因子融合蛋白，其特征在于：所述人神经生长因子类似物为不超过6个氨基酸突变位点的人神经生长因子，优选具有不超过5个氨基酸突变位点人神经生长因子，最优选具有不超过4，3或2个氨基酸突变位点的人神经生长因子。
- 根据权利要求1-5任一项所述的一种神经生长因子融合蛋白，其特征在于：所述神经生长因子为序列表SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：13至SEQ ID No：30中任意一条所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-6任一项所述的一种神经生长因子融合蛋白，其特征在于：所述L为富含甘氨酸的肽、或具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n序列的肽，其中n是1，2，3，4，5或6，优选n为2-6，更优选n为3-4，最优选n为3。
- 根据权利要求1-7任一项所述的一种神经生长因子融合蛋白，其特征在于：所述L的长度不超过30个氨基酸；优选不超过20个氨基酸，更优选不超过 15个氨基酸。
- 根据权利要求1-8任一项所述的一种神经生长因子融合蛋白，其特征在于：所述神经生长因子融合蛋白为SEQ ID No：10所示的氨基酸序列。
- 编码权利要求1-9中任一项所述的神经生长因子融合蛋白的多核苷酸序列。
- 含有权利要求10所述的核苷酸序列的表达载体。
- 根据权利要求11所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体为DNA载体或病毒载体。
- 根据权利要求12所述的表达载体，其特征在于：所述DNA载体选自由DNA质粒载体、结合其的脂质体、结合其的分子耦联体和结合其的多聚物所组成的组中；优选地，所述DNA质粒载体为真核细胞表达载体；所述病毒载体选自由腺相关病毒载体、慢病毒载体和腺病毒载体所组成的组中。
- 一种神经生长因子融合蛋白的制备方法，其特征在于：将权利要求11-13所述的表达载体转化至宿主细胞，培养所得重组细胞表达得到所述神经生长因子融合蛋白。
- 含有权利要求11-13所述表达载体的宿主细胞。
- 根据权利要求15所述的宿主细胞，其特征在于：所述的宿主细胞为哺乳动物细胞，优选中国仓鼠卵巢细胞、人胚肾293细胞、COS细胞或Hela细胞。
- 一种药物组合物，其特征在于：所述药物组合物含有药学上可接受的赋形剂，以及权利要求1-9所述的神经生长因子融合蛋白、权利要求10所述的多核苷酸序列、或权利要求11-13所述的表达载体、或权利要求15或16所述的宿主细胞中的一种或几种。
- 根据权利要求17所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物为注射剂、胶囊、片剂或粉剂。
- 根据权利要求17所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物为注射剂，包含药学上可接受的赋形剂和神经生长因子融合蛋白。
- 权利要求1-9中任一项所述的神经生长因子融合蛋白用于制备治疗神经系统疾病的药物中的用途。
- 权利要求1-9中任一项所述的神经生长因子融合蛋白用于制备有效减轻体重的药物中的用途。
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