CN114829384B - 长效神经生长因子多肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及长效神经生长因子(NGF)多肽，从N端到C端包含NGF部分和Fc部分，及其制备方法和用途。

Description

长效神经生长因子多肽及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年11月19日提交的国际专利申请No.PCT/CN2020/129925的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
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技术领域
本发明涉及长效神经生长因子(NGF)多肽，从N端到C端包含NGF部分和Fc部分，及其制备方法和用途。
发明背景
神经营养因子是一个高度同源的生长因子家族，在脊椎动物神经系统的发育和成熟阶段对神经元的存活和维持至关重要。神经营养因子的产生受限可导致外周神经系统(PNS)或中枢神经系统(CNS)神经元的变性或死亡。
神经生长因子(NGF)是神经营养因子家族中首个被发现的成员，由意大利科学家Levi-Montlcini于1953年在小鼠肉瘤细胞中首次发现。NGF是一种神经生长调节剂，具有为神经元提供营养和促进神经突生长的双重生物学功能，在中枢和外周神经元的发育、分化、生长、再生和功能表达过程中发挥重要的调节作用。NGF包含α、β和γ三个亚基。β亚基是一个活性区域，由两条单链通过非共价键结合而成。
对NGF的研究已经数十载。然而，市面上的NGF产品非常少，其中大部分产品主要应用于眼科疾病的治疗，包括角膜溃疡、视神经挫伤和视损伤。其根本原因在于实际应用中存在的限制和问题。
与其它蛋白相似，NGF的生物活性取决于其二级和三级结构，因此，在制备、纯化、储存和给药过程中保持其生物活性尤为重要。
此外，在治疗过程中，NGF可能引起一些患者产生无法忍受的痛疼，这也在一定程度上限制了它的使用。根据疼痛的神经生理机制可将其分为两类：感觉性疼痛和神经性疼痛。前者由伤害性刺激直接引起，与组织损伤或炎症反应有关，也称为炎症性疼痛。后者是由体感神经系统损伤或疾病直接引起的慢性疼痛。NGF通过影响炎症介质的释放、离子通道的开放和促进神经纤维的生长引起疼痛，参与疼痛的病理生理过程；并通过调节离子通道和分子信号传导参与疼痛的发展。一些学者推测NGF可能也通过促进致痛物质的表达引起疼痛，并且可能会在机体损伤后改变神经元的出芽和再生。研究表明NGF不会引起人类痛觉过敏的最大施用剂量为0.03μg/kg(Petty et al.,Ann Neurol.1994；36(2):244-246)。然而，如此低的剂量限制了NGF的应用，也限制了其适应症的扩展，如用于中枢神经系统。
作为一种蛋白类药物，NGF促进神经生长的活性部分主要在于β-NGF。β-NGF的沉降系数为2.5S，分子量为13.5KDa，且在代谢过程中容易被肾小球过滤掉，导致其在体内的半衰期短。研究表明小鼠肌肉注射β-NGF药物的T1/2(β)＝2.2h，Tmax＝0.5h，且注射频率为一天一次。由于在NGF注射期间，注射部位或注射侧下肢出现的不良疼痛反应，最好能减少施用的总次数和频率。
本文提及的所有出版物、专利、专利申请和已公开的专利申请所披露的内容，全部以引用方式并入本文。
发明概述
本发明一方面涉及一种长效神经生长因子(NGF)多肽，从N端到C端包含NGF部分和Fc部分，所述NGF部分包含SEQ ID NOs:1-4中的任一氨基酸序列(如SEQ ID NOs:1-3中的任一氨基酸序列)，且所述Fc部分来自IgG1 Fc或IgG4 Fc。
在一些实施例中，如上所述任一种长效NFG多肽，NGF部分通过肽接头与Fc部分融合。在一些实施例中，肽接头包含SEQ ID NOs:68-99中的任一氨基酸序列，如SEQ ID NOs:68-72或SEQ ID NO:68或69中的任一氨基酸序列。在一些实施例中，肽接头包含氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO:70)，其中n为1、2、3、4、5或6中的任何一个。
在一些实施例中，如上所述任一种长效NGF多肽，Fc部分来自包含氨基酸序列SEQID NO:7或8的IgG1 Fc。在一些实施例中，Fc部分在相对于SEQ ID NO:8的位置上包含突变，所述位置选自E233、L234、L235、G236、G237、N297、A327、A330和P331中的一个或多个。在一些实施例中，Fc部分相对于SEQ ID NO:8包含突变，所述突变选自E233P、L234V、L234A、L235A、L235E、G236del、G237A、N297A、A327G、A330S和P331S中的一个或多个。在一些实施例中，Fc部分进一步缺失SEQ ID NO:7或8的前5个氨基酸。在一些实施例中，Fc部分相对于SEQID NO:8包含L234A、L235A和P331S突变。在一些实施例中，Fc部分包含氨基酸序列SEQ IDNO:11或12。在一些实施例中，长效NGF多肽包含SEQ ID NOs:62-64中的任一氨基酸序列。在一些实施例中，Fc部分相对于SEQ ID NO:8包含E233P、L234V、L235A、G236del、A327G、A330S和P331S突变。在一些实施例中，Fc部分包含氨基酸序列SEQ ID NO:15或16。在一些实施例中，长效NGF多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:66。在一些实施例中，Fc部分相对于SEQ IDNO:8包含L234A、L235E、G237A、A330S和P331S突变。在一些实施例中，Fc部分包含氨基酸序列SEQ ID NO:13或14。在一些实施例中，长效NGF多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:65。在一些实施例中，Fc部分相对于SEQ ID NO:8包含N297A突变。在一些实施例中，Fc部分包含氨基酸序列SEQ ID NO:9或10。在一些实施例中，长效NGF多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:61。
在一些实施例中，如上所述任一种长效NGF多肽，Fc部分来自包含氨基酸序列SEQID NO:17的IgG4 Fc。在一些实施例中，Fc部分在相对于SEQ ID NO:17的位置上包含突变，所述位置选自S228、F234和L235中的一个或多个。在一些实施例中，Fc部分相对于SEQ IDNO:17包含突变，所述突变选自S228P、F234A和L235A中的一个或多个。在一些实施例中，Fc部分包含氨基酸序列SEQ ID NO:18。在一些实施例中，长效NGF多肽包含氨基酸序列SEQ IDNO:67。
在一些实施例中，如上所述任一种长效NGF多肽，当通过静脉注射、肌肉注射或皮下注射给个体(例如，人类)时，长效NGF多肽的半衰期至少为10小时(例如，至少为11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90或100小时中的任何一个)。
在一些实施例中，如上所述任一种长效NGF多肽，与包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的NGF部分的NGF多肽相比，长效NGF多肽引起更少的疼痛(例如，至少减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的疼痛)。
同时涉及编码本文所述任何长效NGF多肽的分离核酸、包含所述核酸的载体、包含所述核酸或载体的宿主细胞(例如，CHO细胞、HEK 293细胞、Hela细胞或COS细胞)、组合物(例如，药物组合物)、试剂盒以及包含本文所述任何长效NGF多肽的制品。还涉及使用本文所述任何长效NGF多肽或包含其的药物组合物用于个体(例如，人类)治疗NGF相关疾病(例如，神经系统疾病或非神经系统疾病)的方法。
附图说明
图1A-1F所示分别为人类野生型IgG1 Fc IGHG1*05和IgG1 Fc自然变体IGHG1*03(图1A)、修饰的IgG1 Fc M1-5和IGHG1*03(图1B)、修饰的IgG1 Fc M3-5和IGHG1*03(图1C)、修饰的IgG1 Fc M5-5和IGHG1*03(图1D)、修饰的IgG1 Fc M7和IGHG1*03(图1E)以及修饰的IgG4 Fc和人类野生型IgG4 Fc(图1F)的序列比对图。
图2所示为包含信号肽(SP)、前导肽和成熟NGF的preproNGF结构。在主要裂解位点的Furin裂解负责将proNGF加工为成熟NGF。
图3A-3M所示为尺寸排阻色谱法(SEC)测量各成熟NGF-Fc融合蛋白在40℃稳定性加速试验中不同时间点的聚集体百分比、片段含量百分比和单体含量百分比。
图4A-4M所示为应用十二烷基硫酸钠毛细管电泳(CE-SDS)方法测定各成熟NGF-Fc融合蛋白在40℃稳定性加速试验中不同时间点的检测结果。
图5A-5B所示为各NGF-Fc融合蛋白处理下，TF-1细胞的增殖活性结果。鼠NGF、NGF突变体118aa(mNGF118)和重组人NGF(rhNGF)作为对照。
图6A-6D所示为各NGF-Fc融合蛋白对大鼠体内颈上神经节(SCG)生长的生物活性结果。鼠NGF和mNGF118作为对照。PBS作为阴性对照。
图7A所示为血浆中2-118-L3Fc10-M3-5、2-118-L3G4-BM和对照组mNGF118(无Fc融合的β-NGF118aa突变体)的药代动力学(PK)曲线。图7B所示为肌肉注射剂量为235μg/kg时它们的体内半衰期。
图8所示为NGF(NGF或mNGF118)或NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3Fc10-M3-5或2-118-L3G4-BM)处理下，糖尿病小鼠的伤口愈合率。PBS处理作为阴性对照。
图9A-9B所示分别为NGF(鼠NGF或mNGF118)或NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3Fc10-M3-5或2-118-L3G4-BM)处理下，人卵巢颗粒细胞(KGN)的增殖率和分泌的雌激素浓度。图9C所示为NGF(/>鼠NGF或mNGF118)或NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3Fc10-M3-5或2-118-L3G4-BM)处理下，大鼠卵巢早衰动物疾病模型中各级卵泡的数量。
图10A和10B所示为NGF(鼠NGF或mNGF118)、NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3Fc10-M3-5或2-118-L3G4-BM)或作为阴性对照的0.9％氯化钠溶液处理下，神经营养性角膜炎动物模型的角膜荧光素钠染色评分(图10A)和平均角膜神经长度(图10B)。
本发明的详细描述
本发明涉及长效NGF多肽，从N端到C端包含NGF部分和Fc部分。术语“长效NGF多肽”、“长效NGF-Fc融合蛋白”和“长效NGF构建体”可互换使用。
NGF在中枢和外周神经元的发育、分化、生长、再生和功能性表达过程中发挥重要的调节作用。NGF已被用于治疗神经系统发育异常，包括弱视、神经瘤、各种神经损伤及神经系统疾病。然而，其引起疼痛、体内半衰期短、为避免痛敏的低剂量限制和频繁给药等副作用限制了NGF的广泛应用。将蛋白类药物与半衰期更长和/或分子量更大的部分融合是使某些蛋白类药物具有长效活性的一种策略。然而，如何在延长蛋白类药物半衰期的同时提高或维持其生物活性仍是临床上的一道难题。
本文所述的长效NGF多肽具有以下一种或多种优越效果：1)它们在体外和体内都具有高度的生物活性(例如，促进颈上神经节生长)，甚至优于现有的NGF-Fc融合蛋白或NGF药物；2)它们在体内的半衰期很长，不仅比无融合部分的NGF蛋白长得多，而且显著长于现有的NGF-Fc融合蛋白，从而减少了给药频率和总给药次数，为患者提供了方便并减少了成本；3)它们可以减少如疼痛等副作用，甚至达到无痛，从而增加了患者耐受的剂量，并为扩大适应症范围和适用于中枢神经系统提供了可能性；4)它们降低或最小化抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，从而避免在治疗期间产生不期望的免疫反应；5)它们具有优异的热稳定性(例如，高熔解温度(Tm)和/或高聚集起始温度(Tagg))；6)它们在加速应力(例如，加热)下具有优异的稳定性，如较少的或没有片段化、聚集体形成和/或聚集体增量，从而保持药性；以及7)它们在体内治疗NGF相关疾病方面非常有效，例如，神经系统疾病，如糖尿病神经性病变、阿尔茨海默症和神经营养性角膜炎，非神经系统疾病，如卵巢早衰和生精障碍(例如，少精子症、弱精子症、少弱精子症)，与无Fc融合的NGF部分相比，具有与之相当甚至更好的治疗效果。
因此，本发明一方面涉及长效NGF多肽，从N端到C端包含NGF部分和Fc部分，所述NGF部分包含SEQ ID NOs:1-4中的任一氨基酸序列，且所述Fc部分来自IgG1 Fc或IgG4 Fc。
同时涉及编码所述长效NGF多肽的分离的核酸、包含所述核酸的载体、包含所述核酸或载体的宿主细胞、生产所述长效NGF多肽的方法、药物组合物和包含所述长效NGF多肽的生产制品，以及使用所述长效NGF多肽或药物组合物治疗疾病(例如，与神经元变性或损伤有关的神经系统疾病，如糖尿病神经性病变、阿尔茨海默症和神经营养性角膜炎，非神经系统疾病，如卵巢早衰和生精障碍)的方法。
定义
除非上下文另有明确说明，实施本发明将采用本领域技术范围内的病毒学、免疫学、微生物学、分子生物学和重组DNA技术的常规方法，许多所述方法将在下文详述以供说明。所述技术在文献中有充分解释。参见Current Protocols in Molecular Biology orCurrent Protocols in Immunology,John Wiley&Sons,New York,N.Y.(2009)；Ausubelet al.,Short Protocols in Molecular Biology,3rd ed.,John Wiley&Sons,1995；Sambrook and Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd Edition,2001)；Maniatis et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982)；DNA Cloning:APractical Approach,vol.I&II(D.Glover,ed.)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait,ed.,1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames&S.Higgins,eds.,1985)；Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins,eds.,1984)；Animal CellCulture(R.Freshney,ed.,1986)；Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)和其它相似参考资料。
如本文所用，“治理(treatment)”或“治疗(treating)”是一种为获得有益或期望的结果的方法，包括临床结果。鉴于本申请的目的，所述有益或期望的临床结果包括但不限于下列一种或多种：缓解由疾病引起的一种或多种症状、减少疾病范围、稳定疾病(例如，预防或延缓疾病恶化)、预防或延缓疾病传播、预防或延缓疾病复发、延缓或减缓疾病发展、改善疾病状态、缓解疾病(部分或全部)、减少治疗疾病所需的一种或多种其它药物的剂量、延缓疾病发展、提高生存质量和/或延长生存期。同时，“治疗”还包括减少疾病的病理结果。本发明的方法考虑了这些治疗的任何一个或多个方面。例如，如果一个或多个与该疾病相关的症状得到缓解或消除，包括但不限于减少该疾病引起的症状，提高该疾病患者的生活质量，减少治疗疾病所需的其它药物的剂量，和/或延长个体的生存期，则认为该患者被成功“治疗”。
术语“预防(prevent)”和类似的词语，如“预防(prevented)”、“预防(preventing)”等表示预防、抑制或降低疾病或病症复发可能性的方法。它还指延缓疾病或病症的复发或延缓疾病或病症的复发。如本文所用，“预防”和类似词语还包括在疾病或病症复发之前降低疾病或病症的强度、影响、症状和/或负担。
如本文所用，“延缓”疾病的发展表示推迟、阻碍、减缓、减慢、稳定和/或推迟疾病的发展。根据疾病史和/或接受治疗的个体不同，延缓的时间可能不同。一种“延缓”疾病发展的方法是指与不使用该方法相比，在给定时间范围内降低疾病发展概率和/或在给定时间范围内降低疾病程度的方法。这种比较通常基于临床研究，使用统计上显著的个体数。
如本文所用，术语“有效量”是指足以治疗特定紊乱、病症或疾病的药物剂量或药物组合物剂量，如改善、减轻、减弱和/或延缓一个或多个症状。在一些实施例中，有效量是足以延缓疾病发展的量。在一些实施例中，有效量是足以预防或延缓疾病复发的量。有效量可在一次或多次施用中给药。在一些实施例中，药物或组合物的有效量可能：(i)支持神经元存活；(ii)促进神经突生长；(iii)增强神经化学分化；(iv)促进胰腺β细胞增殖；(v)诱导先天性和/或获得性免疫；(vi)预防或延缓疾病的发生和/或复发；和/或(vii)在一定程度上缓解与该疾病相关的一个或多个症状。
如本文所用，“个体”或“主体”是指哺乳动物，包括但不限于人类、牛、马、猫、狗、啮齿动物或灵长类动物。在一些实施例中，所述个体是指人类。
术语“恒定结构域”是指免疫球蛋白分子的一部分，相对于免疫球蛋白分子中包含抗原结合位点可变结构域的另一部分，恒定结构域具有更保守的氨基酸序列。恒定结构域包含重链的CH1、CH2和CH3结构域(统称为CH)和轻链的CHL(或CL)结构域。根据免疫球蛋白重链(CH)恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可分为不同类别或亚型。有五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，重链分别为α、δ、ε、γ和μ。根据CH序列和功能的相对较小差异，将γ和α进一步划分为亚类，例如，人类表达以下亚类：IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
如本文所用，术语“Fc区”、“片段结晶区”、“Fc结构域”或“Fc部分”用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链Fc区的边界可能不同，但人类IgG重链Fc区通常定义为从Cys226位置的氨基酸残基或从Pro230开始，延伸至其羧基末端。Fc区的C端赖氨酸(根据EU编号系统为447残基)可能被移除，例如，在蛋白质的生产或纯化过程中，或通过重组工程编码蛋白质的核酸而移除。用于本文所述构建体的合适的天然序列Fc区包括人类IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。
如本文所用，术语IgG“亚型”或“亚类”是指通过恒定结构域的化学和抗原特性定义的免疫球蛋白的任何亚类。免疫球蛋白主要分为五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中多个可进一步分为亚类(亚型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。与不同免疫球蛋白类别相对应的的重链恒定结构域分别称为α、γ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型已众所周知，并在Abbas等人的《细胞和分子免疫学》第四版(W.B.Saunders，Co.，2000)中进行了详述。
“Fc受体”或“FcR”描述了与包含Fc的结构(例如，抗体)中的Fc区结合的受体。首选的FcR是人类FcR天然序列。此外，首选的FcR是一种结合IgG抗体(一种γ受体)的FcR，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII等受体亚类，以及这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(一种“激活受体”)和FcγRIIB(一种“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，主要在胞质结构域有所不同。激活受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)(见于M.Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。在Ravetchand Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)；Capel et al.,Immunomethods 4:25-34(1994)和de Haas et al.,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中对FcRs进行了综述。本文中术语“FcR”涵盖其它FcRs，包括那些在未来将被鉴定的FcRs。
术语“Fc受体”或“FcR”也包括新生儿受体FcRn，负责将母体IgG转运给胎儿。Guyeret al.,J.Immunol.117:587(1976)和Kim et al.,J.Immunol.24:249(1994)。测定与FcRn结合的方法已众所周知(参见Ghetie and Ward,Immunol.Today 18:(12):592-8(1997)；Ghetie et al.,Nature Biotechnology 15(7):637-40(1997)；Hinton et al.,J.Biol.Chem.279(8):6213-6(2004)；WO 2004/92219(Hinton et al.))。可以测定人类FcRn高亲和力结合多肽在体内和血清中与FcRn结合的半衰期，例如，在表达人类FcRn的转基因小鼠或转染的人类细胞系中，或在施用具有变体Fc区的多肽的灵长类动物中。WO2004/42072(Presta)详述了增强或减弱与FcRs结合的抗体变体。参见Shield et al.,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。
“抗体效应功能”是指那些由包含Fc的结构(例如，抗体)中的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)引起的生物活性，并随Fc亚型改变。抗体效应功能的示例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体的下调(例如，B细胞受体)和B细胞活化。“减少或最小化”抗体效应功能表示与野生型或未经修饰的包含Fc的结构(例如，抗体)相比，减少至少50％(或者60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)。测定抗体效应功能可由本领域普通技术人员轻而易举地测定和测量。在优选实施例中，补体结合、补体依赖性细胞毒性和抗体依赖性细胞毒性的抗体效应功能会受到影响。在一些实施例中，通过恒定结构域中的突变消除糖基化来消除效应功能，例如，“无效应功能突变”。在一些实施例中，无效应功能突变体是在CH2区的N297A或DANA突变(D265A+N297A)。Shields et al.,J.Biol.Chem.276(9):6591-6604(2001)。另外，导致效应功能降低或消除的其它突变包括：K322A和L234A/L235A(LALA)。另外，可以通过生产技术减少或消除效应功能，如在不进行糖基化的宿主细胞中(例如，大肠杆菌)或导致糖基化模式改变的宿主细胞中表达，所述糖基化模式改变在促进效应功能方面无效或效果较小(例如，Shinkaw et al.,J.Biol.Chem.278(5):3466-3473(2003))。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或ADCC是指一种细胞毒性形式，其中分泌型Ig(或配体-Fc结构)与存在于某些细胞毒性细胞(例如，自然杀伤细胞(NK)、中性粒细胞和巨噬细胞)上的Fc受体(FcRs)结合，使这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原(或携带配体受体)的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞。抗体(或包含Fc的结构)“武装”细胞毒性细胞，且是通过这种机制杀死靶细胞所必需的。介导ADCC的主要细胞，即NK细胞只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)第464页的Table 2中总结了造血细胞Fc的表达。为评估目标分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC试验，如U.S.Pat.No.5,500,362或5,821,337中进行了详述。适用于此类试验的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤细胞(NK)。或者，或额外地，目标分子的ADCC活性也可以在体内进行评估，例如，在动物模型中如在Clynes et al.,PNAS(USA)95:652-656(1998)中所公开的。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在的情况下裂解靶细胞。经典的补体途径的激活是由补体系统第一组分(C1q)与(合适亚类的)包含Fc的结构结合起始的，所述包含Fc的结构通过Fc融合的配体与其同源受体结合。为了评估补体激活，可以进行CDC试验，如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所述。U.S.Pat.No.6,194,551B1和WO99/51642中详述了具有改变的Fc区氨基酸序列从而增加或减少C1q结合能力的抗体变体。这些专利出版物的内容通过引用并入本文。参见Idusogieet al.J.Immunol.164:4178-4184(2000)。
如本文所用，术语“特异性结合”、“特异性识别”或“特异性用于”是指可测量和可再现的相互作用，如配体和受体之间的结合，当存在包括生物分子在内的异质分子群的情况下可确定配体的存在。例如，与受体特异性结合的配体，与结合其它受体相比时，在结合目标受体时具有更大的亲和性、亲和力、更容易和/或持续时间更长。在一些实施例中，通过例如放射免疫分析(RIA)法进行测定，配体与无关受体的结合程度小于配体与目标受体结合程度的10％。在一些实施例中，特异性结合靶受体的配体的平衡解离常数(Kd)≤10-5M、≤10-6M、≤10-7M、≤10-8M、≤10-9M、≤10-10M、≤10-11M或≤10-12M。在一些实施例中，配体特异性结合在不同物种中保守的受体。在一些实施例中，特异性结合可以包括但不要求排他性结合。可利用本领域已知的方法通过实验确定配体的结合特异性。如包括但不限于Western blots、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-、EIA-、BIACORETM-测试和肽扫描。
“结合亲和力”通常指分子(例如，配体)的单个结合位点和其结合搭档(例如，受体)之间的非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，如本文所用，“结合亲和力”指内在结合亲和力，该内在亲和力可以反映结合对成员之间的1:1相互作用。结合亲和力可以采用Kd、Koff、Kon或Ka表示。如本文所用，术语“Koff”是指配体从配体/受体复合物中解离的速率常数，通过动力学选择装置测定，以s-1为单位来表示。如本文所用，术语“Kon”是指配体与受体结合形成配体/受体复合物的结合速率常数，以M-1s-1为单位来表示。如本文所用，术语平衡解离常数“Kd”是指特定配体-受体相互作用时的解离常数，是指在受体溶液中，配体占据所有受体结合位点的一半并且达到平衡时所需的配体浓度，等于Koff/Kon，以M为单位来表示。测定Kd的前提是所有的结合分子均在溶液中。当受体在细胞膜上的情况下，相应的解离速率常数用EC50表示，是Kd的一个很好的近似值。亲和常数Ka，是解离常数Kd的倒数，以M-1为单位来表示。解离常数(Kd)可以作为反映配体与受体亲和力的指标。使用所述方法得到的Kd值，以M(mol/L)为单位来表示。
半抑制浓度(IC50)是对物质(例如，配体)在抑制特定生物或生化功能中有效性的度量。它表示需要多少特定药物或其它物质(抑制剂，例如，配体)能将给定的生物过程抑制一半。数值通常表示为摩尔浓度。IC50与激动剂药物或其它物质(例如，配体)的“EC50”相当。EC50也代表在体内获得最大效应的50％所需的血浆浓度。如本文所用，“IC50”用于表示在体外中和50％的受体生物活性所需配体的有效浓度。可通过生物测量测定IC50或EC50，如通过FACS分析(竞争结合试验)抑制配体结合、基于细胞的细胞因子释放试验或放大发光的均相酶联免疫试验(AlphaLISA)。
如本文所用，“共价键”是指两个原子之间通过共用一个或多个电子形成的稳定键。共价键的示例包括但不限于肽键和二硫键。如本文所用，“肽键”是指氨基酸的羧基与相邻氨基酸的胺基之间形成的共价键。如本文所用，“二硫键”是指两个硫原子之间形成的共价键，如两个Fc片段通过一个或多个二硫键结合。两个片段之间的一个或多个二硫键可能通过连接两个片段中的硫醇基形成。在一些实施例中，两个Fc片段的一个或多个半胱氨酸之间可能形成一个或多个二硫键。氧化两个硫醇基可形成二硫键。在一些实施例中，共价连接是由共价键直接连接而成的。在一些实施例中，共价连接直接由肽键或二硫键连接。
肽或多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”或“同源性”被定义为候选序列中与特定多肽或多肽序列中相同氨基酸残基所占的百分比，在序列比对并引入间隙(如果必要)后以实现序列同一性百分比的最大化，并且不考虑任何保守替换作为序列同一性的一部分。为了确定氨基酸序列同一性百分比，可以通过本领域技术范围内的多种比对方式，例如，使用如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)、或MUSCLE软件等可公开获得的计算机软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
如本文所用，多肽的“C端”是指该多肽的最后一个氨基酸残基，该残基赋予其胺基以与其相邻氨基酸残基的羧基形成肽键。如本文所用，多肽的“N末端”是指该多肽的第一个氨基酸，该残基赋予其羧基以与其相邻氨基酸残基的胺基形成肽键。
“分离的”多肽是指一种已从其生产环境(例如，天然或重组)的组分中鉴定、分离和/或回收的多肽。优选地，所分离的多肽与其生产环境中的所有其它成分没有关联。生产环境的污染成分，如重组转染细胞产生的污染成分，通常会干扰多肽的研究、诊断或治疗，并且可能包括酶、激素和其它蛋白溶质或非蛋白溶质。在一些实施例中，多肽将被纯化至：(1)按重量计算，多肽含量大于95％，如通过Lowry法确定，在一些实施例中，按重量计算，多肽含量大于99％；(2)通过使用旋杯测序仪达到足以获得至少15个N端残基或内部氨基酸序列的程度；或(3)通过SDS-PAGE在非还原性或还原性条件下使用考马斯蓝或优选为银染色达到同质性。分离的多肽包括在重组细胞内的原位多肽，因为多肽天然环境中的至少一个要素是不存在的。然而，通常情况下，一个分离的多肽至少要经过一个纯化步骤。
一种编码一个构建体(如本文所述的NGF多肽)的“分离的”核酸分子为一种从至少含一种杂质的核酸分子中鉴定和分离出来的核酸分子，所述杂质核酸分子通常与生产它的环境有关。优选地，所分离的核酸与其生产环境中的所有成分没有关联。如本文所述的编码多肽的分离的核酸分子是以一种并非它在自然界中发现时的形式或形态存在。因此，分离的核酸分子不同于自然存在于细胞中编码本文所述多肽的核酸。一种分离的核酸包括含有该核酸分子的细胞中所含的核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或与其自然染色体位置不同的染色体位置上。
术语“控制序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作连接编码序列所必需的DNA序列。例如，适合原核生物的控制序列包括启动子、任选的操作序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多聚腺苷酸化信号和增强子。
当核酸与另一个核酸序列建立功能性关系时，所述核酸即为“可操作地连接”。例如，如果前序列或分泌先导物的DNA作为参与多肽分泌的前蛋白表达，则所述DNA可操作连接到多肽的DNA；如果启动子或增强子影响序列的转录，则所述启动子或增强子可操作连接到编码序列；或如果核糖体结合位点处在便于翻译的位置，则所述核糖体结合位点可操作连接到编码序列。一般来说，“可操作连接”意味着连接的DNA序列是连续的，并且，对于分泌先导物，其不仅是连续的并且处于读取阶段(reading phase)。然而，增强子不必是连续的。连接是通过在适宜的限制性位点进行连接来完成的。如果不存在此类位点，则按照常规做法使用合成的寡核苷酸适配体或接头。
如本文所用，术语“载体”是指一种核酸分子能够扩增与其连接的另一核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及被引入已知宿主细胞基因组的载体。某些载体能够指导与之连接的核酸表达。在本文中称此类载体为“表达载体”。
如本文所用，术语“转染”或“转化”或“转导”是指外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是用外源核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原代受试细胞及其子代。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养”可互换使用，指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其中包括原代转化细胞和由此产生的子代，而不考虑传代次数。子代在核酸上可能与母细胞不完全相同，可能含有突变。本文包括在原始转化细胞中筛选或选择与其具有相同功能或生物活性的突变子代。
术语“药物制剂”或“药物组合物”是指一种制剂，所述制剂为使活性成分的生物活性有效的形式，并且不包含对施用所述制剂的受试者具有不可接受毒性的额外成分。这种制剂是无菌的。“无菌”制剂是无菌的或不含任何活的微生物及其孢子。
本文中所述的本发明的实施例应理解为包括“由……组成”和/或“基本上由……组成”的实施例。
本文中提及“约”为一个数值或参数，包含(和描述)针对该数值或参数本身的变体。例如，涉及“约X”的描述包括“X”的描述。
如本文所用，提及“不是”一个数值或参数，通常表示并描述“除了”某一数值或参数之外。例如，该方法不能用于治疗X型癌症，意味着该方法通常用于治疗除X型癌症之外的其它类型。
如本文所用，术语“约X-Y”与“约X到约Y”意思相同。
除非上下文另有明确说明，本文和所述权利要求中所采用的单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数对象。
II.长效NGF多肽
本发明一方面涉及长效NGF多肽，从N端到C端包含NGF部分和Fc部分。在一些实施例中，所涉及的长效NGF多肽从N端到C端包含NGF部分和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)SEQ ID NOs:1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ IDNOs:1-3中的任何一个)，并且所述Fc部分来自IgG1 Fc或IgG4 Fc。在一些实施例中，NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQ ID NO:1。在一些实施例中，当通过静脉注射、肌肉注射或皮下注射给个体(例如，人类)时，长效NGF多肽的半衰期至少为10小时(例如，至少为11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90或100小时中的任何一个)。在一些实施例中，与包含氨基酸序列SEQID NO:4的NGF部分相比，长效NGF多肽引起的疼痛更少(例如，至少减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的疼痛)。
在一些实施例中，NGF部分通过肽接头与Fc部分融合。因此，在一些实施例中，涉及一种长效NGF多肽，从N端到C端包含NGF部分、肽接头(例如，SEQ ID NOs:68-99中的任一个，如SEQ ID NOs:68-72中的任一个)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)SEQ ID NOs:1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs:1-3中的任何一个)，并且所述Fc部分来自IgG1 Fc或IgG4 Fc。在一些实施例中，肽接头包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO:70)，其中n为1、2、3、4、5或6中的任一个。在一些实施例中，肽接头包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQ ID NO:68或69。在一些实施例中，NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQ ID NO:1。在一些实施例中，当通过静脉注射、肌肉注射或皮下注射给个体(例如，人类)时，长效NGF多肽的半衰期至少约为10小时(例如，至少约为11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90或100小时中的任何一个)。在一些实施例中，与包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的NGF部分相比，长效NGF多肽引起的疼痛更少(例如，至少减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的疼痛)。
在一些实施例中，Fc部分来自IgG1 Fc，如人类IgG1 Fc。在一些实施例中，Fc部分为野生型IgG1 Fc(例如，人类IgG1 Fc)或其天然突变体。在一些实施例中，Fc部分来自包含氨基酸序列SEQ ID NO:7或8的IgG1 Fc。因此，在一些实施例中，涉及一种长效NGF多肽，从N端到C端包含NGF部分、可选的肽接头(例如，SEQ ID NOs:68-99中的任一个，如SEQ ID NOs:68-72中的任一个)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)SEQ ID NOs:1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs:1-3中的任何一个)，并且所述Fc部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQ ID NO:7或8。在一些实施例中，涉及一种长效NGF多肽，从N端到C端包含NGF部分、可选的肽接头(例如，SEQ IDNOs:68-99中的任一个，如SEQ ID NOs:68-72中的任一个)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)SEQ ID NOs:1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQID NOs:1-3中的任何一个)，并且所述Fc部分来自包含氨基酸序列SEQ ID NO:7或8(例如，SEQ ID NO:8)的IgG1 Fc。在一些实施例中，Fc部分缺失SEQ ID NO:7或8的前5个氨基酸。在一些实施例中，涉及一种长效NGF多肽，从N端到C端包含NGF部分、可选的肽接头(例如，SEQID NOs:68-99中的任一个，如SEQ ID NOs:68-72中的任一个)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)SEQ ID NOs:1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs:1-3中的任何一个)，所述Fc部分来自包含氨基酸序列SEQ ID NO:7或8(例如，SEQ ID NO:8)的IgG1 Fc，并且所述Fc部分在相对于SEQ ID NO:7或8(例如，SEQ ID NO:8)的位置上包含(或基本上由......组成、或由......组成)突变，所述位置选自E233、L234、L235、G236、G237、N297、A327、A330和P331中的一个或多个。在一些实施例中，涉及一种长效NGF多肽，从N端到C端包含NGF部分、可选的肽接头(例如，SEQ ID NOs:68-99中的任一个，如SEQ ID NOs:68-72中的任一个)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)SEQ ID NOs:1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs:1-3中的任何一个)，所述Fc部分来自包含氨基酸序列SEQ ID NO:7或8(例如，SEQ ID NO:8)的IgG1Fc，并且所述Fc部分相对于SEQ ID NO:7或8(例如，SEQ ID NO:8)包含(或基本上由......组成、或由......组成)突变，所述突变选自E233P、L234V、L234A、L235A、L235E、G236del、G237A、N297A、A327G、A330S和P331S中的一个或多个。在一些实施例中，Fc部分进一步缺失SEQ IDNO:7或8的前5个氨基酸。在一些实施例中，肽接头包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO:70)，并且其中n为1、2、3、4、5或6中的任何一个。在一些实施例中，肽接头包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQ ID NO:68或69。在一些实施例中，NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQ ID NO:1。在一些实施例中，当通过静脉注射、肌肉注射或皮下注射给个体(例如，人类)时，长效NGF多肽的半衰期至少为10小时(例如，至少为11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90或100小时中的任何一个)。在一些实施例中，与包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的NGF部分相比，长效NGF多肽引起的疼痛更少(例如，至少减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的疼痛)。
在一些实施例中，涉及一种长效NGF多肽，从N端到C端包含NGF部分、可选的肽接头(例如，SEQ ID NOs:68-99中的任一个，如SEQ ID NOs:68-72中的任一个)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQ ID NOs:1-4中的任一个(例如，SEQ ID NOs:1-3中的任何一个)，所述Fc部分来自包含氨基酸序列SEQ IDNO:7或8(例如，SEQ ID NO:8)的IgG1 Fc，并且所述Fc部分在相对于SEQ ID NO:7或8(例如，SEQ ID NO:8)的位置上包含(或基本上由......组成、或由......组成)突变，所述位置为L234、L235和P331。在一些实施例中，Fc部分进一步缺失SEQ ID NO:7或8(例如，SEQ ID NO:8)的前5个氨基酸。在一些实施例中，涉及一种长效NGF多肽，从N端到C端包含NGF部分、可选的肽接头(例如，SEQ ID NOs:68-99中的任一个，如SEQ ID NOs:68-72中的任一个)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)SEQ ID NOs:1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs:1-3中的任何一个)，所述Fc部分来自包含氨基酸序列SEQID NO:7或8(例如，SEQ ID NO:8)的IgG1Fc，并且所述Fc部分相对于SEQ ID NO:7或8(例如，SEQ ID NO:8)包含(或基本上由......组成、或由......组成)L234A、L235A和P331S突变。在一些实施例中，涉及一种长效NGF多肽，从N端到C端包含NGF部分、可选的肽接头(例如，SEQ ID NOs:68-99中的任一个，如SEQ ID NOs:68-72中的任一个)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)SEQ ID NOs:1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs:1-3中的任何一个)，所述Fc部分来自包含氨基酸序列SEQ ID NO:7或8(例如，SEQ ID NO:8)的IgG1 Fc，所述Fc部分相对于SEQ ID NO:7或8(例如，SEQ ID NO:8)包含(或基本上由......组成、或由......组成)L234A、L235A和P331S突变，并且所述Fc部分进一步缺失SEQ ID NO:7或8(例如，SEQ ID NO:8)的前5个氨基酸。在一些实施例中，涉及一种长效NGF多肽，从N端到C端包含NGF部分、可选的肽接头(例如，SEQ ID NOs:68-99中的任一个，如SEQ ID NOs:68-72中的任一个)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)SEQ ID NOs:1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs:1-3中的任何一个)，并且所述Fc部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQID NO:11或12。在一些实施例中，肽接头包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO:70)，并且其中n为1、2、3、4、5或6中的任何一个。在一些实施例中，肽接头包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQ ID NO:68或69。在一些实施例中，NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQ ID NO:1。在一些实施例中，涉及一种长效NGF多肽，包含(或基本上由......组成、或由......组成)SEQ ID NOs:62-64中的任一氨基酸序列。在一些实施例中，当通过静脉注射、肌肉注射或皮下注射给个体(例如，人类)时，长效NGF多肽的半衰期至少为10小时(例如，至少为11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90或100小时中的任何一个)。在一些实施例中，与包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的NGF部分相比，长效NGF多肽引起的疼痛更少(例如，至少减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的疼痛)。
在一些实施例中，涉及一种长效NGF多肽，从N端到C端包含NGF部分、可选的肽接头(例如，SEQ ID NOs:68-99中的任一个，如SEQ ID NOs:68-72中的任一个)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)SEQ ID NOs:1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs:1-3中的任何一个)，所述Fc部分来自包含氨基酸序列SEQ ID NO:7或8(例如，SEQ ID NO:8)的IgG1 Fc，并且所述Fc部分在相对于SEQ ID NO:7或8(例如，SEQID NO:8)的位置上包含(或基本上由......组成、或由......组成)突变，所述位置为E233、L234、L235、G236、A327、A330和P331上。在一些实施例中，Fc部分进一步缺失SEQ ID NO:7或8(例如，SEQ ID NO:8)的前5个氨基酸。在一些实施例中，涉及一种长效NGF多肽，从N端到C端包含NGF部分、可选的肽接头(例如，SEQ ID NOs:68-99中的任一个，如SEQ ID NOs:68-72中的任一个)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)SEQID NOs:1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs:1-3中的任何一个)，所述Fc部分来自包含氨基酸序列SEQ ID NO:7或8(例如，
SEQ ID NO:8)的IgG1 Fc，并且所述Fc部分相对于SEQ ID NO:7或8(例如，SEQ IDNO:8)包含(或基本上由......组成、或由......组成)E233P、L234V、L235A、G236del、A327G、A330S和P331S突变。在一些实施例中，涉及一种长效NGF多肽，从N端到C端包含一个NGF部分、一个可选的肽接头(例如，SEQ ID NOs:68-99中的任一个，如SEQ ID NOs:68-72中的任一个)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)SEQ IDNOs:1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs:1-3中的任何一个)，所述Fc部分来自包含氨基酸序列SEQ ID NO:7或8(例如，SEQ ID NO:8)的IgG1 Fc，并且所述Fc部分相对于SEQID NO:7或8(例如，SEQ ID NO:8)包含(或基本上由......组成、或由......组成)E233P、L234V、L235A、G236del、A327G、A330S和P331S突变，并且所述Fc部分进一步缺失SEQ ID NO:7或8(例如，SEQ ID NO:8)的前5个氨基酸。在一些实施例中，涉及一种长效NGF多肽，从N端到C端包含NGF部分、可选的肽接头(例如，SEQ ID NOs:68-99中的任一个，如SEQ ID NOs:68-72中的任一个)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)SEQ ID NOs:1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs:1-3中的任何一个)，并且所述Fc部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQ ID NO:15或16。在一些实施例中，肽接头包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO:70)，并且其中n为1、2、3、4、5或6中的任何一个。在一些实施例中，肽接头包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQ ID NO:68或69。在一些实施例中，NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQ ID NO:1。在一些实施例中，涉及一种长效NGF多肽，包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQ ID NO:66。在一些实施例中，当通过静脉注射、肌肉注射或皮下注射给个体(例如，人类)时，长效NGF多肽的半衰期至少为10小时(例如，至少为11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90或100小时中的任何一个)。在一些实施例中，与包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的NGF部分相比，长效NGF多肽引起的疼痛更少(例如，至少减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的疼痛)。
在一些实施例中，涉及一种长效NGF多肽，从N端到C端包含NGF部分、可选的肽接头(例如，SEQ ID NOs:68-99中的任一个，如SEQ ID NOs:68-72中的任一个)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)SEQ ID NOs:1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs:1-3中的任何一个)，所述Fc部分来自包含氨基酸序列SEQ ID NO:7或8(例如，SEQ ID NO:8)的IgG1 Fc，并且所述Fc部分在相对于SEQ ID NO:7或8(例如，SEQID NO:8)的位置上包含(或基本上由......组成、或由......组成)突变，所述位置为L234、L235、G237、A330和P331。在一些实施例中，Fc部分进一步缺失SEQ ID NO:7或8(例如，SEQID NO:8)的前5个氨基酸。在一些实施例中，涉及一种长效NGF多肽，从N端到C端包含NGF部分、可选的肽接头(例如，SEQ ID NOs:68-99中的任一个，如SEQ ID NOs:68-72中的任一个)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)SEQ ID NOs:1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs:1-3中的任何一个)，所述Fc部分来自包含氨基酸序列SEQ ID NO:7或8(例如，SEQ ID NO:8)的IgG1 Fc，并且所述Fc部分相对于SEQ ID NO:7或8(例如，SEQ ID NO:8)包含(或基本上由......组成、或由......组成)L234A、L235E、G237A、A330S和P331S突变。在一些实施例中，涉及一种长效NGF多肽，从N端到C端包含NGF部分、可选的肽接头(例如，SEQ ID NOs:68-99中的任一个，如SEQ ID NOs:68-72中的任一个)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)SEQ ID NOs:1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs:1-3中的任何一个)，所述Fc部分来自包含氨基酸序列SEQ ID NO:7或8(例如，SEQ ID NO:8)的IgG1 Fc，所述Fc部分相对于SEQ ID NO:7或8(例如，SEQ ID NO:8)包含(或基本上由......组成、或由......组成)L234A、L235E、G237A、A330S和P331S突变，并且所述Fc部分进一步缺失SEQ ID NO:7或8(例如，SEQ ID NO:8)的前5个氨基酸。因此在一些实施例中，涉及一种长效NGF多肽，从N端到C端包含NGF部分、可选的肽接头(例如，SEQ ID NOs:68-99中的任一个，如SEQ ID NOs:68-72中的任一个)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)SEQ ID NOs:1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs:1-3中的任何一个)，并且所述Fc部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQ ID NO:13或14。在一些实施例中，肽接头包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO:70)，并且其中n为1、2、3、4、5或6中的任何一个。在一些实施例中，肽接头包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQ ID NO:68或69。在一些实施例中，NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQ ID NO:1。因此在一些实施例中，涉及一种长效NGF多肽，包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQ ID NO:65。在一些实施例中，当通过静脉注射、肌肉注射或皮下注射给个体(例如，人类)时，长效NGF多肽的半衰期至少为10小时(例如，至少为11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90或100小时中的任何一个)。在一些实施例中，与包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的NGF部分相比，长效NGF多肽引起的疼痛更小(例如，至少减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的疼痛)。
在一些实施例中，涉及一种长效NGF多肽，从N端到C端包含NGF部分、可选的肽接头(例如，SEQ ID NOs:68-99中的任一个，如SEQ ID NOs:68-72中的任一个)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)SEQ ID NOs:1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs:1-3中的任何一个)，所述Fc部分来自包含氨基酸序列SEQ ID NO:7或8(例如，SEQ ID NO:8)的IgG1 Fc，并且所述Fc部分在相对于SEQ ID NO:7或8(例如，SEQID NO:8)的位置N297上包含(或基本上由......组成、或由......组成)一个突变。在一些实施例中，Fc部分进一步缺失SEQ ID NO:7或8(例如，SEQ ID NO:8)的前5个氨基酸。在一些实施例中，涉及一种长效NGF多肽，从N端到C端包含NGF部分、可选的肽接头(例如，SEQ IDNOs:68-99中的任一个，如SEQ ID NOs:68-72中的任一个)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)SEQ ID NOs:1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQID NOs:1-3中的任何一个)，所述Fc部分来自包含氨基酸序列SEQ ID NO:7或8(例如，SEQID NO:8)的IgG1 Fc，并且所述Fc部分相对于SEQ ID NO:7或8(例如，SEQ ID NO:8)包含(或基本上由......组成、或由......组成)一个N297A突变。在一些实施例中，涉及一种长效NGF多肽，从N端到C端包含NGF部分、可选的肽接头(例如，SEQ ID NOs:68-99中的任一个，如SEQ ID NOs:68-72中的任一个)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)SEQ ID NOs:1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs:1-3中的任何一个)，所述Fc部分来自包含氨基酸序列SEQ ID NO:7或8(例如，SEQ ID NO:8)的IgG1 Fc，所述Fc部分相对于SEQ ID NO:7或8(例如，SEQ ID NO:8)包含(或基本上由......组成、或由......组成)一个N297A突变，并且所述Fc部分进一步缺失SEQ ID NO:7或8(例如，SEQ IDNO:8)的前5个氨基酸。因此在一些实施例中，涉及一种长效NGF多肽，从N端到C端包含NGF部分、可选的肽接头(例如，SEQ ID NOs:68-99中的任一个，如SEQ ID NOs:68-72中的任一个)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)SEQ ID NOs:1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs:1-3中的任何一个)，并且所述Fc部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQ ID NO:9或10。在一些实施例中，肽接头包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO:70)，并且其中n为1、2、3、4、5或6中的任何一个。在一些实施例中，肽接头包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQ ID NO:68或69。在一些实施例中，NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQ ID NO:1。在一些实施例中，涉及一种长效NGF多肽，包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQ ID NO:61。在一些实施例中，当通过静脉注射、肌肉注射或皮下注射给个体(例如，人类)时，长效NGF多肽的半衰期至少为10小时(例如，至少为11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90或100小时中的任何一个)。在一些实施例中，与包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的NGF部分相比，长效NGF多肽引起的疼痛更小(例如，至少减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的疼痛)。
在一些实施例中，Fc部分来自IgG4 Fc，如人类IgG4 Fc。在一些实施例中，Fc部分为野生型IgG4 Fc(例如，人类IgG4 Fc)或其天然突变体。在一些实施例中，Fc部分来自包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的IgG4 Fc。因此，在一些实施例中，涉及一种长效NGF多肽，从N端到C端包含NGF部分、可选的肽接头(例如，SEQ ID NOs:68-99中的任一个，如SEQ ID NOs:68-72中的任一个)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)SEQ ID NOs:1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs:1-3中的任何一个)，并且所述Fc部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQ ID NO:17。在一些实施例中，涉及一种长效NGF多肽，从N端到C端包含NGF部分、可选的肽接头(例如，SEQ IDNOs:68-99中的任一个，如SEQ ID NOs:68-72中的任一个)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)SEQ ID NOs:1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQID NOs:1-3中的任何一个)，并且所述Fc部分来自包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的IgG4Fc。在一些实施例中，Fc部分缺失SEQ ID NO:17的前5个氨基酸。在一些实施例中，涉及一种长效NGF多肽，从N端到C端包含NGF部分、可选的肽接头(例如，SEQ ID NOs:68-99中的任一个，如SEQ ID NOs:68-72中的任一个)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)SEQ ID NOs:1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs:1-3中的任何一个)，所述Fc部分来自包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的IgG4 Fc，并且所述Fc部分在相对于SEQ ID NO:17的位置上包含(或基本上由......组成、或由......组成)突变，所述位置选自S228、F234和L235中一个或多个。在一些实施例中，涉及一种长效NGF多肽，从N端到C端包含NGF部分、可选的肽接头(例如，SEQ ID NOs:68-99中的任一个，如SEQ ID NOs:68-72中的任一个)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)SEQID NOs:1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs:1-3中的任何一个)，所述Fc部分来自包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的IgG4 Fc，并且所述Fc部分在相对于SEQ ID NO:17的位置上包含(或基本上由......组成、或由......组成)突变，所述位置为S228、F234和L235。在一些实施例中，涉及一种长效NGF多肽，从N端到C端包含NGF部分、可选的肽接头(例如，SEQID NOs:68-99中的任一个，如SEQ ID NOs:68-72中的任一个)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)SEQ ID NOs:1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs:1-3中的任何一个)，所述Fc部分来自包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的IgG4Fc，并且所述Fc部分相对于SEQ ID NO:17包含(或基本上由......组成、或由......组成)突变，所述突变选自S228P、F234A和L235A中的一个或多个。在一些实施例中，涉及一种长效NGF多肽，从N端到C端包含NGF部分、可选的肽接头(例如，SEQ ID NOs:68-99中的任一个，如SEQ ID NOs:68-72中的任一个)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)SEQ ID NOs:1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs:1-3中的任何一个)，所述Fc部分来自包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的IgG4 Fc，并且所述Fc部分相对于SEQID NO:17包含(或基本上由......组成、或由......组成)S228P、F234A和L235A突变。在一些实施例中，Fc部分进一步缺失SEQ ID NO:17的前5个氨基酸。因此在一些实施例中，涉及一种长效NGF多肽，从N端到C端包含NGF部分、可选的肽接头(例如，SEQ ID NOs:68-99中的任一个，如SEQ ID NOs:68-72中的任一个)和Fc部分，所述NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)SEQ ID NOs:1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs:1-3中的任何一个)，并且所述Fc部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQ ID NO:18。在一些实施例中，肽接头包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO:70)，并且其中n为1、2、3、4、5或6中的任何一个。在一些实施例中，肽接头包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQ ID NO:68或69。在一些实施例中，NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQ ID NO:1。在一些实施例中，涉及一种长效NGF多肽，包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQ ID NO:67。在一些实施例中，当通过静脉注射、肌肉注射或皮下注射给个体(例如，人类)时，长效NGF多肽的半衰期至少为10小时(例如，至少为11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90或100小时中的任何一个)。在一些实施例中，与包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的NGF部分相比，长效NGF多肽引起的疼痛更少(例如，至少减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的疼痛)。
在一些实施例中，涉及一种长效NGF多肽，包含(或基本上由......组成、或由......组成)SEQ ID NOs:34、36、38、40、42、44和46中的任一氨基酸序列。在一些实施例中，涉及一种长效NGF多肽，包含(或基本上由......组成、或由......组成)SEQ ID NOs:34、36、38、40、42、44和46中的任一氨基酸序列，不包括信号肽序列SEQ ID NO:6。在一些实施例中，当通过静脉注射、肌肉注射或皮下注射给个体(例如，人类)时，长效NGF多肽的半衰期至少为10小时(例如，至少为11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90或100小时中的任何一个)。在一些实施例中，与包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的NGF部分相比，长效NGF多肽引起的疼痛更少(例如，至少减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的疼痛)。
NGF部分
在表达时，NGF最初是一个7S、130kDa的由3蛋白-α-NGF、β-NGF和γ-NGF(比例2：1：2)组成的复合物。所述复合物的γ亚基作为一种丝氨酸蛋白酶，切割β亚基的N端，进而将蛋白质激活为功能性NGF。人类NGF基因位于1号染色体短臂上，并且完整的NGF外显子编码241个氨基酸，通常被称为preproNGF前体(SEQ ID NO:50)。
preproNGF前体包含一个信号肽序列(SEQ ID NO:6)、一个前导肽(SEQ ID NO:5)和成熟的NGF序列(β-NGF,SEQ ID NO:4)。preproNGF前体的信号肽在内质网中被切除，形成proNGF前体(223个氨基酸；SEQ ID NO:54)。proNGF前体在内质网中以同源二聚体形式存在，随后转移至高尔基体。在高尔基体中，proNGF前体二聚体在前导肽的3个Furin基序上被Furin切割。位于成熟NGF序列-1和-2位置的Furin基序被Furin切割，形成成熟β-NGF二聚体，每个单体含有118或120个氨基酸。成熟的β-NGF二聚体随后被运送到细胞外。一些未被切割的proNGF前体同样被分泌到细胞外，见于图2中NGF结构。
NGF存在于多种物种中，在雄性小鼠颌下腺、牛精浆、蛇毒、豚鼠前列腺、人胎盘组织等中含量丰富。小鼠NGF与人类NGF的氨基酸序列同源性高达90％。
NGF与原肌球蛋白受体激酶A(TrkA)和低亲和力NGF受体(LNGFR/p75NTR)结合，两者都与神经退行性疾病有关。NGF与TrkA受体结合，促使受体发生同源二聚化，进而引起酪氨酸激酶片段的自磷酸化，激活PI 3-激酶、ras和PLC信号通路。p75NTR受体同样可以与TrkA形成异源二聚体，该异源二聚体对NGF具有更高的亲和力和特异性。另一方面，proNGF与p75NTR和分拣蛋白高亲和力结合，产生一个信号复合物，招募NRAGE和Rac激活JNK信号级联反应，主要驱动细胞凋亡。ProNGF与p75NTR结合也可促进NFκB活化，从而诱导神经元存活。
如本文所用，术语“NGF部分”是指一种NGF分子、一种物种变体、片段、突变体或其衍生物。NGF部分可以是截短版本、翻译后修饰版本、杂交变体、肽模拟物、生物活性片段、缺失变体、替换变体或插入变体，这些变体至少能在一定程度上维持亲代NGF的活性，如与NGF受体结合，通过NGF受体诱导信号传递。本文所述的“亲本的NGF”或“亲本NGF”是指NGF参考序列，NGF部分是由它设计、修饰或衍生出来的。
在一些实施例中，NGF部分为野生型NGF。在一些实施例中，NGF部分为NGF天然变体。在一些实施例中，NGF部分为NGF类似物，如一个NGF包含不超过6个氨基酸(如6、5、4、3、2和1个氨基酸)突变。在一些实施例中，NGF部分为NGF衍生物。如本文所用，术语“NGF衍生物”是指一种具有NGF氨基酸序列或NGF类似物的分子，但在一个或多个氨基酸基团、α碳原子、氨基末端或羧基末端上还具有额外的化学修饰。化学修饰包括但不限于，添加化学基团、生成新化学键和移除化学基团。氨基酸侧基团的修饰包括但不限于赖氨酸的ε氨基酰基化，精氨酸、组氨酸或赖氨酸的N-烷基化，谷氨酸或天冬氨酸的羧基烷基化，谷氨酰胺或天冬酰胺的脱氨。氨基末端的修饰包括但不限于脱氨、N-低烷基，N-二低烷基和N-酰基修饰。羧基末端的修饰包括但不限于酰胺、低烷基酰基、二烷基酰胺和低烷基酯修饰。在一些实施例中，低烷基基团为C1-C4烷基基团。此外，一个或多个侧基或末端基团可以由化学领域的技术人员利用已知的保护基团来保护。氨基酸的α碳可以是单甲基化或二甲基化。在一些实施例中，NGF部分为修饰的NGF，如聚乙二醇化NGF，或共价修饰的NGF，如糖基化NGF。
NGF部分可以来自任何有机体，如哺乳动物，包括但不限于家畜(例如，牛、绵羊、山羊、猫、狗、驴和马)、灵长类动物(例如，人类和非人类灵长类动物，如猴子或黑猩猩)、兔子和啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、沙鼠和仓鼠)。
在一些实施例中，NGF部分为一种人类NGF(hNGF)。在一些实施例中，NGF部分为野生型(wt)hNGF。在一些实施例中，NGF部分为hNGF天然变体。在一些实施例中，NGF部分为hNGF类似物，如hNGF包含不超过6个氨基酸(如6、5、4、3、2或1个氨基酸)突变。在一些实施例中，NGF部分为hNGF衍生物。hNGF的许多活性片段、类似物和衍生物在本领域都是众所周知的，并且这些活性片段、类似物和衍生物中的任一种都可能是本申请中应用的NGF部分。
如本文所述，NGF部分可以是从各种来源分离出的NGF，如从人体组织或从其它来源，或通过重组或合成方法制备。在一些实施例中，NGF部分为重组NGF，如重组hNGF(rhNGF)。在一些实施例中，NGF部分为鼠源NGF，如重组鼠源NGF。
在一些实施例中，NGF部分为全长NGF。在一些实施例中，NGF部分为NGF功能片段，其能够产生全长NGF分子的大部分或全部生物活性，如全长β-NGF的大部分或全部生物活性。在一些实施例中，NGF部分为preproNGF(如人类preproNGF)或其活性片段，即，包含所有信号肽、前导肽和β-NGF的全长或片段。在一些实施例中，NGF部分包含SEQ ID NOs:47-50中的任一氨基酸序列。在一些实施例中，NGF部分为proNGF(如人类proNGF)或其活性片段，即，包含前导肽和β-NGF的全长或片段。在一些实施例中，NGF部分包含SEQ ID NOs:51-54中的任一氨基酸序列。在一些实施例中，NGF部分为成熟NGF或其活性片段，即，包含β-NGF(如人类β-NGF)的全长或活性片段。在一些实施例中，NGF部分包含SEQ ID NOs:1-4中的任一氨基酸序列。在一些实施例中，NGF部分为野生型人类β-NGF(SEQ ID NO:4)。在一些实施例中，NGF部分为最后2个氨基酸被截短的野生型人类β-NGF(SEQ ID NO:3)。在一些实施例中，NGF部分在β-NGF的N端包含一个信号肽，所述信号肽或来自不同分子，或来自相同的NGF分子。在一些实施例中，信号肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:6。在一些实施例中，NGF部分在β-NGF的N端包含一个前导肽。在一些实施例中，前导肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:5。
在一些实施例中，NGF部分为突变体或NGF变体，如能够产生野生型NGF的大部分或全部生物活性的NGF突变体或变体。突变的NGF部分可包括在NGF分子中(例如，成熟β-NGF)的一个或多个氨基酸位点的突变。在一些实施例中，突变的NGF部分包括在NGF中的一个或多个氨基酸位点的氨基酸取代。在一些实施例中，突变的NGF部分包括在NGF中的一个或多个氨基酸位点的氨基酸缺失或插入。在一些实施例中，突变的NGF部分包括在NGF中一个或多个氨基酸的修饰。
在一些实施例中，NGF部分具有一个或多个保守的氨基酸取代。“保守取代”是指应用另一种氨基酸进行取代，所述另一氨基酸与被取代氨基酸带有相同的净电荷和大致相同的大小和形状。当侧链上的碳原子和杂原子总数相差不超过4个时，带有脂肪族或取代脂肪族氨基酸侧链的氨基酸大小大致相同。当其侧链上的分支数相差不超过1个时，氨基酸的形状大致相同。在侧链上具有苯基或取代苯基的氨基酸，可以认为其大小和形状大致相同。除非另有说明，保守取代优选应用天然氨基酸。参见下文“氨基酸取代基”小节。
“氨基酸”在本文中以其最广泛的定义使用，即包括天然存在的氨基酸也包括非天然存在的氨基酸，包括氨基酸的类似物和衍生物。后者包括含有氨基酸部分的分子。根据这一宽泛的定义，本领域的技术人员会发现，本文所述氨基酸包括，例如，形成蛋白质的天然L-氨基酸；D-氨基酸；化学修饰的氨基酸，如氨基酸类似物和衍生物；不形成蛋白质的天然氨基酸，如正亮氨酸、β-丙氨酸、鸟氨酸、GABA等；以及本领域已知的具有氨基酸特征的化学合成的化合物。如本文所用，术语“蛋白质形成”是指可以通过代谢途径合成细胞的肽、多肽或蛋白质的氨基酸。
将包括合成的非天然氨基酸、取代氨基酸或一种或多种D-氨基酸在内的非天然氨基酸插入到本发明的长效NGF多肽(或NGF部分)中可具有多种益处。与含有L-氨基酸的多肽相比，含有D-氨基酸的多肽等在体外和体内表现出更高的稳定性。因此，当需要更好的细胞内稳定性时，如通过加入D-氨基酸进行多肽的构建是特别有用的。特别是D-肽和其类似物对内源性肽酶和蛋白酶活性有抵抗力，从而在需要时提高分子的生物有效性并延长其在体内的寿命。此外，D-肽和其类似物不能被有效加工，这是由于II型主要组织相容性复合体(MHC)呈递给辅助T细胞的过程受限，因此不易在受试者中诱导体液免疫反应。
在一些实施例中，NGF部分为突变体或NGF变体，与野生型NGF相比，所述突变体或NGF变体减少了副作用(例如，疼痛)，或为无痛的。在一些实施例中，NGF部分为突变体或NGF变体，与野生型NGF相比，所述突变体或NGF变体减少了至少5％(例如至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％中的任何一个)的疼痛，如在给药后的一个或多个时间点(例如，全部时间点)减少了至少5％的疼痛。在一些实施例中，NGF部分为突变体或NGF变体，与野生型NGF相比，所述突变体或NGF变体增加了至少5％(例如至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％中的任何一个)的疼痛阈值。例如，在一些实施例中，个体的疼痛阈值约为8，施用野生型NGF后，疼痛阈值降至约6，施用突变体或NGF变体(或本文所述的包含其的长效NGF多肽)后，疼痛阈值保持在8左右，例如，疼痛减少约25％或疼痛阈值增加约25％。在一些实施例中，NGF部分为如专利CN107286233A、WO2017157325和WO2017157326所述的突变体或NGF变体，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施例中，相对于人类野生型β-NGF序列(SEQ ID NO:4)，NGF部分包含相对于人类野生型β-NGF序列(SEQ ID NO:4)的F12E突变。在一些实施例中，NGF部分包含氨基酸序列SEQ IDNO:2。在一些实施例中，相对于人类野生型β-NGF序列(SEQ ID NO:4)，NGF部分包含F12E突变并且最后2个氨基酸被截短。在一些实施例中，NGF部分包含氨基酸序列SEQ ID NO:1(以下也称为“mNGF118”)。
如本文所述，NGF部分或长效NGF多肽的氨基酸序列变体可能是通过在编码蛋白质的核酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备的。所述修饰包括，例如，在NGF部分或长效NGF多肽的氨基酸序列中进行缺失和/或插入和/或取代残基。可以通过缺失、插入和取代的任何组合来获得最终的构建体，只要最终构建体具有所需的特性，例如保留/改进的配体-受体结合、保留/增强的生物活性(例如，促进神经元的生长、维持、增殖和/或存活)、保留/增强半衰期、保留/降低ADCC/CDC，保留/减少致痛活性等。
表A为保守型取代。在表A“取代示例”标题下提供了更多实质性取代，如下文关于氨基酸侧链类别部分进一步详述。氨基酸可以根据常见的侧链性质分类：(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链方向的残基：Gly、Pro；(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。非保守型取代需要将这些类别中的一个成员替换为另一类别的成员。可以将氨基酸取代引入到蛋白质构建体中，并筛选符合上文所述所需活性的产品。
表A氨基酸取代
Fc部分
如本文所述，长效NGF多肽在C端包含一个Fc部分。
在一些实施例中，Fc部分来自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM及其亚类中的任何一种，。在所有免疫球蛋白中，IgG的血清含量最高，半衰期最长。与其它免疫球蛋白不同，在与Fc受体(FcRs)结合后，IgG可有效回收。在一些实施例中，Fc部分来自IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。在一些实施例中，Fc部分来自人类IgG。在一些实施例中，Fc部分包含CH2和CH3。在一些实施例中，Fc部分进一步包含全部或部分铰链区。在一些实施例中，Fc部分来自人类IgG1或人类IgG4。在一些实施例中，Fc部分的两个亚基通过一个或多个(例如，1、2、3、4或更多)二硫键二聚化。在一些实施例中，Fc部分的每个亚基都包含全长Fc序列。在一些实施例中，Fc部分的每个亚基都包含N端截短的Fc序列，如截短的Fc结构域含有较少的N端半胱氨酸，以减少二聚化过程中二硫键的错配。在一些实施例中，Fc部分在N端被截短，例如，缺失完整免疫球蛋白Fc结构域的前1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在一些实施例中，Fc部分包含一个或多个突变，如插入、缺失和/或取代。
我们希望筛选出Fc片段，所述Fc片段能够为长效NGF多肽提供如本文所述的高生物活性、长半衰期和低免疫毒性(例如，ADCC和/或CDC)。
通过Fc结构域，含Fc的蛋白可以激活补体并与Fc受体(FcRs)相互作用。这种固有的免疫球蛋白特性已经被认为是不利的，因为NGF-Fc融合蛋白可能靶向表达Fc受体的细胞，而不是优选的表达NGF受体的细胞，而且进一步考虑到Fc融合蛋白的半衰期长，由于全身毒性，使其难以应用于治疗。因此，在一些实施例中，Fc部分被改造(例如，包含一个或多个氨基酸突变)以改变其与FcR的结合，特别是改变与Fcγ受体(负责ADCC)的结合和/或改变效应功能，如改变抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖型细胞吞噬作用(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。优选地，此类氨基酸突变不会减少与FcRn受体(负责半衰期)的结合。
Fc部分(例如，人类IgG1 Fc)发生突变，以去除一个或多个效应功能，如ADCC、ADCP或CDC，以下称为“无效应”或“几乎无效应”Fc部分。例如，在一些实施例中，Fc部分为一种无效应人类IgG1 Fc，所述人类IgG1 Fc包含一个或多个以下突变(如在每一个Fc亚基中)：L234A、L235E、G237A、A330S和P331S。IgG1 Fc中K322A、L234A和L235A的组合足以完全消除FcγR和C1q的结合(Hezareh et al.,J Virol 75,12161–12168,2001)。MedImmune发现一组三突变L234F/L235E/P331S具有非常相似的效应(Oganesyan et al.,ActaCrystallographica 64,700–704,2008)。在一些实施例中，Fc部分包含IgG1 Fc结构域N297上的糖基化修饰，已知这是最优FcR相互作用所必需的。Fc部分修饰可以是Wang等人提到的任何合适的IgG Fc工程。(“IgG Fc engineering to modulate antibody effectorfunctions,”Protein Cell.2018 Jan；9(1):63–73)，其内容全部通过引用并入本文。
在一些实施例中，如本文所述，长效NGF多肽不具有ADCC和/或CDC，或不具有可检测的ADCC和/或CDC。在一些实施例中，如本文所述，长效NGF多肽与包含相同NGF部分但为野生型或未修饰Fc片段的NGF-Fc构建体相比，ADCC和/或CDC减少了至少5％(如至少为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％中的任何一个)。
糖基化变体
在一些实施例中，通过改变Fc部分或长效NGF多肽来增加或减少构建体的糖基化程度。可以通过改变氨基酸序列在Fc部分中加入或删除糖基化位点，以创建或移除一个或多个糖基化位点。
哺乳动物细胞产生的天然含Fc蛋白通常包含一个分支链的双触角寡糖，所述双触角寡糖通常通过N-键连接到Fc区CH2结构域的Asn297上。参见Wright et al.,TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附着在双触角寡糖结构的“茎”上GlcNAc的岩藻糖。在一些实施例中，可对Fc部分中的寡糖进行修饰以产生某些改良的特性。
在一些实施例中，如本文所述的Fc部分或长效NGF多肽具有碳水化合物结构，该结构缺乏附着(直接或间接)在Fc部分的岩藻糖。例如，在这种Fc部分或长效NGF多肽中的岩藻糖含量可能从1％至80％、从1％至65％、从5％至65％或从20％至40％。如WO 2008/077546所述，岩藻糖的含量通过MALDI-TOF质谱测量连接到Asn297上的糖链内岩藻糖平均含量相对于附着在Asn297(例如，复合、杂交和高甘露糖结构)上的所有糖结构的总和来确定的。Asn297是指位于Fc区297位的天冬酰胺残基(Fc区残基EU编号系统)；然而，由于Fc区的微小序列变化，Asn297也可位于297位的上游或下游约±3个氨基酸，即在294和300位之间。这类岩藻糖基化变体可能具有增强的ADCC功能。参见US Patent Publication Nos.US 2003/0157108(Presta,L.)，US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。与“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺乏”的抗体变体相关的出版物示例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazakiet al.,J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki et al.,Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖基化含Fc蛋白的细胞系的示例包括缺乏蛋白岩藻糖基化功能的Lec13 CHO细胞(Ripka et al.,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；US PatAppl No US 2003/0157108 A1,Presta,L；和WO 2004/056312 A1,Adams et al.,尤其是实施例11)，和基因敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因、FUT8基因敲除的CHO细胞(参见Yamane-Ohnuki et al.,Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.et al.,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。
效应功能变体
在一些实施例中，本申请考虑了一种Fc部分或长效NGF多肽，具有一些但非全部Fc效应功能，使得其成为某种应用的理想候选，在该应用中长效NGF多肽在体内的半衰期很重要，但某些效应功能(如CDC和ADCC)是非必需的或有害的。可以在体外或体内进行细胞毒性试验，以确定CDC和/或ADCC活性的减少/耗尽。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合试验，以确保Fc部分或长效NGF多肽缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞，自然杀伤细胞(NK)，仅表达FcγRIII，然而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)第464页的表2中汇总了FcR在造血细胞上的表达。U.S.Patent No.5,500,362(参见Hellstrom,I.et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I.et al.,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(见于Bruggemann,M.et al.,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))中详述了用于评估目标分子ADCC活性的体外试验的非限制性示例。或者，可采用非放射性检测方法(参见用于流式细胞术的ACTITM非放射性毒性试验(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)和CytoTox 非放射性毒性试验(Promega,Madison,WI))。适用于这种检测的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和NK细胞。此外，也可以在体内评估目标分子的ADCC活性，例如，在如Clynes et al.,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 95:652-656(1998)所公开的动物模型中。也可进行C1q结合试验以确定长效NGF多肽不能与C1q结合并因此缺失CDC活性。参见WO 2006/029879和WO 2005/100402中C1q和C3c结合酶联免疫吸附试验。可以进行CDC试验以评估补体活性(参见Gazzano-Santoroet al.,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.et al.,Blood 101:1045-1052(2003)和Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。可以利用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见Petkova,S.B.et al..,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
效应功能降低的Fc部分包含那些在Fc区第238、265、269、270、297、327和329位中一个或多个残基的取代(U.S.专利No.6,737,056)。这类Fc突变体包括在氨基酸位点265、269、270、297和327中的两个或更多位点上的取代，包括所谓的将265和297残基替换成丙氨酸的“DANA”Fc突变体(US专利No.7,332,581)。详述了增强或减少与FcRs的结合的某些抗体变体(参见U.S.专利No.6,737,056；WO 2004/056312,和Shields et al.,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。在一些实施例中，改造Fc区以改变(即，增加或减少)C1q结合和/或CDC，例如US专利No.6,194,551、WO 99/51642和Idusogie et al.,J.Immunol.164:4 178-4184(2000)中所述的。
在一些实施例中，Fc部分包含一个或多个氨基酸替换，这增加了半衰期和/或增强了与新生儿Fc受体(FcRn)的结合。半衰期增加和与新生儿FcRn结合增强了的抗体负责将母体IgGs转运给胎儿(Guyer et al.,J.Immunol.117:587(1976)和Kim et al.,J.Immunol.24:249(1994))，并在US2005/0014934A1(Hinton等)中进行了详述。那些包含带有一个或多个替换的Fc结构域的抗体因此增加了Fc区与FcRn的结合。这类Fc变体包括那些带有一个或多个Fc区残基替换的变体，例如，Fc区434残基替换(US专利No.7,371,826)。
参见Duncan和Winter,Nature 322:738-40(1988)；U.S.专利No.5,648,260；U.S.专利No.5,624,821；和WO 94/29351关于Fc结构域变体的其它示例。
半胱氨酸工程变体
在一些实施例中，可能需要创建半胱氨酸工程的Fc部分或长效NGF多肽，其中Fc结构域的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在一些实施例中，取代残基出现在Fc部分或长效NGF多肽上易接近的位点。通过将这些残基替换成半胱氨酸，活性硫醇基因此被定位在Fc部分或长效NGF多肽的易接近位点，并可用于将分子与其它部分共轭，如药物部分或接头-药物部分，以创建长效NGF多肽共轭物。在一些实施例中，下列残基中的任一个和多个可能被半胱氨酸取代：重链A118(EU编号系统)和重链Fc结构域S400(EU编号系统)。半胱氨酸工程分子可以按照U.S.Patent No.7,521,541中所述的那样产生。
在一些实施例中，Fc部分来自IgG1 Fc。在一些实施例中，Fc部分来自人类IgG1Fc。在一些实施例中，Fc部分来自野生型IgG1 Fc(IGHG1*05)。在一些实施例中，Fc部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQ ID NO:7。在一些实施例中，Fc部分为IgG1自然变体(例如，IGHG1*03，相对于IGHG1*05包含D239E和L241M双突变)。在一些实施例中，Fc部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQ ID NO:8。在一些实施例中，Fc部分不包含IgG1 Fc的铰链区。在一些实施例中，Fc部分包含从IgG1Fc的N端截短最多5个氨基酸，例如从IgG1 Fc的N端截短第一个、前两个、前三个、前四个或前五个氨基酸。在一些实施例中，Fc部分包含一个或多个无效应突变和/或去糖基化突变。在一些实施例中，Fc部分在相对于SEQ ID NO:7或8的位置上包含(或基本上由......组成、或由......组成)突变，所述位置选自E233、L234、L235、G236、G237、N297、A327、A330和P331中的一个或多个。在一些实施例中，Fc部分相对于SEQ ID NO:7或8包含突变，所述突变选自E233P、L234V、L234A、L235A、L235E、G236del、G237A、N297A、A327G、A330S和P331S中的一个或多个。在一些实施例中，Fc部分进一步缺失SEQ ID NO:7或8的前(N端)5个氨基酸。在一些实施例中，Fc部分在相对于SEQ ID NO:7或8的位置N297上包含(或基本上由......组成、或由......组成)突变。在一些实施例中，Fc部分相对于SEQ ID NO:7或8包含(或基本上由......组成、或由......组成)N297A突变。在一些实施例中，Fc部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQ ID NO:9或10。在一些实施例中，Fc部分在相对于SEQ ID NO:7或8的位置上包含(或基本上由......组成、或由......组成)突变，所述位置为L234、L235和P331。在一些实施例中，Fc部分相对于SEQ ID NO:7或8包含(或基本上由......组成、或由......组成)L234A、L235A和P331S突变。在一些实施例中，Fc部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQ ID NO:11或12。在一些实施例中，Fc部分在相对于SEQ ID NO:7或8的位置上包含(或基本上由......组成、或由......组成)突变，所述位置为L234、L235、G237、A330和P331。在一些实施例中，Fc部分相对于SEQID NO:7或8包含(或基本上由......组成、或由......组成)L234A、L235E、G237A、A330S和P331S突变。在一些实施例中，Fc部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQ ID NO:13或14。在一些实施例中，Fc部分在相对于SEQ ID NO:7或8的位置上包含(或基本上由......组成、或由......组成)突变，所述位置为E233、L234、L235、G236、A327、A330和P331。在一些实施例中，Fc部分相对于SEQ ID NO:7或8包含(或基本上由......组成、或由......组成)E233P、L234V、L235A、G236del、A327G、A330S和P331S突变。在一些实施例中，Fc部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQID NO:15或16。
在一些实施例中，Fc部分来自IgG4 Fc。在一些实施例中，Fc部分来自人类IgG4Fc。在一些实施例中，Fc部分是野生型IgG4 Fc。在一些实施例中，Fc部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQ ID NO:17。在一些实施例中，Fc部分为IgG4自然变体。在一些实施例中，Fc部分不包含IgG4的铰链区。在一些实施例中，Fc部包含从IgG4的N端截短最多5个氨基酸，如从IgG4的N端截短第一个、前两个、前三个、前四个或前五个氨基酸。在一些实施例中，Fc部分包含一个或多个无效应突变和/或去糖基化突变。在一些实施例中，Fc部分在相对于SEQ ID NO:17的位置上包含(或基本上由......组成、或由......组成)突变，所述位置选自S228、F234和L235中的一个或多个。在一些实施例中，Fc部分在相对于SEQ ID NO:17的位置上包含(或基本上由......组成、或由......组成)突变，所述位置为S228、F234和L235。在一些实施例中，Fc部分相对于SEQ ID NO:17包含突变，所述突变选自S228P、F234A和L235A中的一个或多个。在一些实施例中，Fc部分相对于SEQID NO:17包含突变，所述突变选自S228P、F234A和L235A。在一些实施例中，Fc部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQ ID NO:18。在一些实施例中，Fc部分进一步缺失SEQ ID NO:17的前(N端)5个氨基酸。在一些实施例中，Fc部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQ ID NO:19或20。
接头
NGF部分和Fc部分通过一个可选的接头(例如，肽接头、非肽接头)连接。在一些实施例中，该接头为一种柔性接头。在一些实施例中，该接头为一种稳定接头。一般来说，理想的接头不会影响或显著影响本文所述的长效NGF多肽的正确折叠和构象。优选地，该接头赋予了长效NGF多肽灵活性，保留/提高了NGF的生物功能，和/或不显著影响长效NGF多肽在体内的半衰期和/或稳定性。在一些实施例中，接头为稳定接头(例如，不能被蛋白酶，特别是MMP切割)。
在一些实施例中，该接头为肽接头。肽接头可以是任意长度。在一些实施例中，肽接头长度为从1个到10个氨基酸，从3个到18个氨基酸，从1个到20个氨基酸，从10个到20个氨基酸，从21个到30个氨基酸，从1个到30个氨基酸，从10个到30个氨基酸，从1个到50个氨基酸，从5个到40个氨基酸，从12个到18个氨基酸，从4个到25个氨基酸。在一些实施例中，该肽接头长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸中的任何一个。在一些实施例中，该肽接头长度为21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸中的任何一个。在一些实施例中，该肽接头长度为31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸中的任何一个。优选地，如本文所述的长效NGF多肽在体内的功能和稳定性通过添加肽接头来优化，以防止潜在的不期望的结构域的相互作用。在一些实施例中，接头长度不超过防止不期望的结构域相互作用和/或优化生物功能和/或稳定性所必需的长度。在一些实施例中，肽接头的长度最多为30个氨基酸，例如最多20个氨基酸，或最多15个氨基酸。在一些实施例中，接头长度为5个到30个氨基酸，或5个到18个氨基酸。
肽接头可以具有天然存在的序列，也可以具有非天然存在的序列。例如，可以使用来自抗体重链铰链区的序列作为接头。例如，参见WO1996/34103。在一些实施例中，肽接头为人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4铰链。在一些实施例中，肽接头为突变的人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4铰链。在一些实施例中，接头是柔性接头。典型的柔性接头包括但不限于甘氨酸聚合物(G)n(SEQ ID NO:73)、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如，(GS)n(SEQ ID NO:74)、(GGS)n(SEQ ID NO:75)、(GGGS)n(SEQ ID NO:76)、(GGS)n(GGGS)n(SEQ ID NO:77)、(GSGGS)n(SEQ ID NO:78)、(GGSGS)n(SEQ ID NO:79)或(GGGGS)n(SEQ ID NO:70)，其中n为至少是1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和其它本领域已知的柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物为相对非结构化的，并且因此可以作为组分之间的一种中性链。甘氨酸比丙氨酸拥有更多的phi-psi空间，且相比具有更长侧链的残基，受到的限制更少(见于Scheraga,Rev.Computational Chem.11 173-142(1992))。柔性接头的示例包括但不限于GG(SEQ ID NO:86)、GGSG(SEQ ID NO:87)、GGSGG(SEQ ID NO:88)、GSGSG(SEQID NO:89)、GSGGG(SEQ ID NO:90)、GGGSG(SEQ ID NO:91)、GSSSG(SEQ ID NO:92)、GGSGGS(SEQ ID NO:93)、SGGGGS(SEQ ID NO:94)、GGGGS(SEQ ID NO:95)、(GA)n(SEQ ID NO:96,n为至少是1的整数)、GRAGGGGAGGGG(SEQ ID NO:97)、GRAGGG(SEQ ID NO:98)、GSGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:80)、GGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:81)、GGGSGGSGGS(SEQ IDNO:82)、GGSGGSGGSGGSGGG(SEQ ID NO:83)、GGSGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:84)、GGSGGSGGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:85)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:68)、GGGGGGSGGGGSGGGGSA(SEQ ID NO:69)、GSGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:71)、KTGGGSGGGS(SEQ ID NO:72)等。在一些实施例中，接头包含序列ASTKGP(SEQ ID NO:99)。一般来说，本领域技术人员会意识到所设计的长效NGF多肽可以包括全部或部分柔性接头，使得接头可以包括一个柔性接头部分以及一个或多个提供较少柔性结构的部分，以提供一个理想的长效NGF多肽的结构和功能。在一些实施例中，肽接头富含丝氨酸-甘氨酸。在一些实施例中，肽接头包含SEQ ID NOs:68-72中的任一氨基酸序列。在一些实施例中，肽接头包含氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO:70)，所述n为1、2、3、4、5或6中的一个整数，优选地n为2到6中的整数，更优选地n为整数3或4。在一些实施例中，肽接头包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQ ID NO:68或69。
其它关于接头的考虑因素包括对产生的长效NGF多肽的物理或药代动力学性质的影响，例如溶解性、亲脂性、亲水性、疏水性、稳定性(或多或少的稳定性以及计划内的降解)、刚性、柔韧性、免疫原性、NGF部分/NGF受体结合、胶体或脂质体的结合能力等。
结合亲和力
分子(例如，NGF部分或包含NGF部分的NGF多肽)与其结合对象(例如，NGF受体，如TrkA)的结合亲和力可以通过任何本领域已知的合适的配体结合试验或抗体/抗原结合试验来确定，例如，Western blot、酶联免疫吸附试验(ELISA)、Meso Scale Discovery(MSD)电化学发光、基于珠子的多重免疫分析(MIA)、RIA、表面等离子共振(SPR)、ECL、IRMA、EIA、Biacore试验、Octet分析、肽扫描等。例如，通过使用各种标记试剂标记的NGF部分、包含NGF部分的NGF多肽或其受体(例如，TrkA)，或其亚单位来进行简单分析，同样可以使用BiacoreX(Amersham Biosciences)，这是一种非处方的测量试剂盒或类似试剂盒，可根据试剂盒随附的用户手册和实验操作方法来操作。
在一些实施例中，蛋白质微阵列用于大规模分析本文所述的NGF部分或长效NGF多肽与其受体的相互作用、功能和活性。蛋白质微阵列具有与一系列捕获蛋白(例如，NGF受体或其亚单位)结合的支撑表面。随后将荧光标记的探针分子(例如，本文所述的NGF部分或长效NGF多肽)添加到阵列中，并且与结合的捕获蛋白相互作用，释放荧光信号并通过激光扫描仪读取。
结合亲和力也可以使用SPR(Biacore T-200)测量。例如，使用EDC/NHS化学法将抗人类IgG抗体耦合到CM-5传感器芯片表面。然后使用人类TrkA-Fc融合蛋白作为该表面的捕获配体。让本文所述的NGF部分或长效NGF多肽的一系列稀释液与捕获的配体结合，并且可以实时监测NGF与TrkA的结合和解离。解离常数(Kd)和解离速率常数可通过使用BIA评估软件进行动力学分析来确定。
在一些实施例中，本文所述NGF部分或长效NGF多肽与其受体(例如，TrkA)或其亚单位之间结合的Kd为≤10-5M、≤10-6M、≤10-7M、≤10-8M、≤10-9M、≤10-10M、≤10-11M或≤10-12M中的任何一个。在一些实施例中，野生型NGF与其受体(例如，TrkA)或其亚单位之间结合的Kd接近于(例如，等于)或至少约为本文所述NGF部分或长效NGF多肽与相同受体(例如，TrkA)或其亚单位之间结合Kd值的1.5倍(如至少为2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500或1000倍中的任一个)。在一些实施例中，本文所述NGF部分或长效NGF多肽与其受体(例如，P75)或其亚单位之间结合的Kd接近于(例如，等于)或至少约为野生型NGF与相同受体(例如，P75)或其亚单位之间结合的Kd的2倍(如至少约3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500或1000倍中的任一个)。
在一些实施例中，NGF部分包含突变或修饰(例如，翻译后修饰)，并且突变/修饰的NGF部分(或长效NGF多肽)与其受体(例如，TrkA)或其亚单位之间结合的Kd接近于(例如，等于)或至少约为野生型NGF与相同受体(例如，TrkA)之间结合的Kd的2倍(如至少为3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500或1000倍中的任一个)。在一些实施例中，NGF部分包含突变或修饰(例如，翻译后修饰)，野生型NGF与其受体(例如，P75)或其亚单位之间结合的Kd接近于(例如，等于)或至少约为突变/修饰的NGF部分(或长效NGF多肽)与相同受体(例如，P75)之间结合的Kd的2倍(如至少约为3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60中的任何一倍，70、80、90、100、500或1000倍中的任一个)。
生物活性
本文所述的用于确定NGF、NGF部分或长效NGF多肽生物活性的各种方法是本领域已知的。例如，可通过TF-1细胞增殖试验来评估生物活性，如CN103376248A和CN108727486A中所述，其全部内容通过引用并入本文。参见下文实施例4。生物活性也可基于促进新生大鼠颈上神经节(SCG)生长的能力(参见下文实施例5)或促进鸡胚背根神经节生长的能力(参见WO2017157326，其全部内容通过引用并入本文)来确定。生物活性还可以基于是否存在以下情况来确定：i)伤口愈合的改善，如在糖尿病神经性病变动物模型/患者中(例如，参见实施例7)；ii)空间认知、记忆和/或学习能力的改善，如在阿尔茨海默症动物模型/患者中(例如，参见实施例8)；iii)改善了卵巢颗粒样肿瘤细胞系增殖和/或雌激素分泌和/或改善了卵巢早衰动物模型/患者的卵泡减少(例如，参见实施例9)；iv)在生精障碍动物模型/患者中，挽救了精子数量和/或活力的降低和/或对睾丸生精小管萎缩、生精小管生精障碍和/或附睾管细胞碎片具有治疗效果(例如，参见实施例10)；或v)在神经营养性角膜炎动物模型/患者中，恢复受损角膜的完整性(例如，通过荧光素钠染色试验)和/或挽救受损的角膜神经(例如，通过测量角膜神经长度)(例如，参见实施例11)；等。本领域已知的任何合适的试验方案均适用于测试本文所述NGF部分或长效NGF多肽的生物活性。
生物测定的重点是NGF的生物活性，并将其以读数的形式进行使用。在生物测定中，在敏感细胞系(例如，原代细胞培养物或对测试样品有依赖和/或响应的体外适应细胞系)或动物模型/患有NGF相关疾病的人上测试样品的活性，并将该活性(例如，细胞增殖)的结果与标准NGF制剂或对照组(例如，小鼠NGF、mNGF118或已知的长效NGF多肽)对比。NGF生物活性的其它方面包括：(i)支持神经元存活；(ii)促进神经突生长；(iii)增强神经化学分化；(iv)促进胰腺β细胞增殖；(v)诱导先天性和/或获得性免疫；(vi)修复受损的神经细胞和/或预防损伤(例如，神经营养性角膜炎)；(vii)促进卵巢颗粒细胞的增殖和/或雌激素分泌；(viii)促进伤口愈合(例如，在糖尿病神经性病变中)；(ix)改善患有神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默病)的受试者的空间认知、记忆和/或学习能力；(x)治疗和/或预防神经退行性病变；(xi)治疗睾丸生精小管萎缩、生精小管生精障碍和/或附睾管细胞碎片；(xii)挽救精子数量和/或活力的降低，或增加精子数量和/或活力(例如，在生精障碍中)；和/或(xiii)改善卵泡数量和/或功能的降低，或提高卵泡数量和/或功能(例如，在卵巢早衰中)。可以使用体外和/或体内试验来测量所有的这些活性，如神经元存活试验或神经突生长试验。
例如，在TF-1细胞增殖试验中，在96孔板中制备样品(例如，长效NGF多肽)和对照组(例如，载体或鼠NGF)的系列稀释液，然后将TF-1细胞添加到每个孔中，并在37℃、5％CO2的潮湿培养箱中培养。培养几天后(例如，3天)，将MTS溶液添加到细胞悬浮液的每个孔中，在37℃、5％CO2的条件下培养3小时。随后，在分光光度计中测量490nm和650nm下的吸光度，以说明NGF部分或长效NGF多肽如何促进TF-1细胞增殖。可以根据对照样本对数据进行标准化处理。示例方法参见实施例4。
细胞信号试验也可用于测试本文所述的NGF部分或长效NGF多肽的生物活性。各种细胞信号试验试剂盒可商购获得，例如，检测参与信号转导的酶促反应期间产生的分析物，例如ADP、AMP、UDP、GDP和生长因子，或磷酸酶试验，用于量化总的信号蛋白和磷酸化形式的信号蛋白。例如，在将细胞与本文所述的NGF部分或长效NGF多肽共培养后，为了确定特定激酶是否具有活性，将细胞裂解物在放射性磷酸盐存在的条件下暴露于酶的已知底物中。通过电泳分离产物(经过或未经过免疫沉淀)，然后将凝胶暴露于X射线胶片以确定蛋白质是否包含同位素。在一些实施例中，本文所述的NGF部分或长效NGF多肽在细胞上的生物活性通过免疫组织化学测定以定位信号蛋白。例如，可以使用针对信号蛋白本身或处于激活状态的信号蛋白的抗体。这些抗体具有识别表位，包括磷酸盐或其它激活构象。在一些实施例中，可通过将荧光蛋白基因，例如，绿色荧光蛋白(GFP)，整合到编码所研究蛋白质的基因载体中，从而跟踪特定信号蛋白的移动(例如，信号分子的核易位)。在一些实施例中，本文所述NGF部分或长效NGF多肽在细胞上的生物活性通过western blot检测。例如，所有酪氨酸磷酸化蛋白(或其它磷酸化氨基酸，例如丝氨酸或苏氨酸)都可以用抗磷酸化酪氨酸抗体(或抗其它磷酸化氨基酸的抗体)在按时间顺序刺激后获得的细胞裂解液的Western blot中检测。在一些实施例中，本文所述NGF部分或长效NGF多肽在细胞上的生物活性可通过免疫沉淀测定。例如，针对特定信号蛋白或所有酪氨酸磷酸化蛋白的一抗与微珠交联。与本文所述的NGF部分或长效NGF多肽孵育后的细胞在含有蛋白酶抑制剂的缓冲液中裂解，然后与抗体包被的微珠孵育。使用SDS电泳分离蛋白质，然后通过所述的Western blot步骤鉴定蛋白质。在一些实施例中，还可使用谷胱甘肽S-转移酶(GST)结合或“pull-down”分析，以确定蛋白质-蛋白质(例如，信号蛋白)的直接相互作用。
例如，可以测量RAS/ERK1/2信号以反映NGF在促进细胞生长方面的生物活性，例如，通过使用本领域已知的任何合适的方法使ERK1/2磷酸化。例如，测量ERK1/2磷酸化可使用该分子磷酸化状态的特异性抗体(可选地结合流式细胞术分析)。例如，将鸡胚胎背根神经节(DRGs)或TF-1细胞与本文所述的NGF部分或长效NGF多肽在37℃下孵育。孵育后，立即固定细胞以保持磷酸化状态和渗透性。用抗磷酸化ERK1/2的抗体对细胞进行染色，例如，使用Alexa488偶联的抗ERK1/2pT202/pY204(BD Biosciences)，并通过流式细胞术进行分析。PI 3-激酶信号也可以使用本领域已知的任何适当的方法来测量，以反映NGF的生物活性。例如，可以使用对磷酸化S6核糖体蛋白具有特异性的抗体来测量PI 3-激酶信号转导(可选择结合流式细胞术分析)。
本文所述的NGF部分或长效NGF多肽的生物活性也可通过体内或体外实验反映，例如，通过测量指示细胞的增殖，通过测量信号转导的诱导或抑制，通过测量组织体积和/或重量等。
例如，在SCG体内生长试验中，样品(例如，长效NGF多肽)和对照组(例如，PBS或鼠NGF)可通过单次注射或多次注射的方式皮下注射到新生大鼠颈部。注射几天后，处死这些大鼠进行SCG分离。SCG可以称重并记录形态，以研究NGF部分或长效NGF多肽在促进SCG体内生长中的生物活性。示例方法参见实施例5。
在背根神经节生长试验中，可将鸡胚背根神经节(例如，8日龄)添加到含有不同浓度的样品(例如，长效NGF多肽)或对照组(例如，PBS或鼠NGF)的培养基中，并在5％CO2和37℃的饱和湿度培养箱中培养，例如，24小时。监测背根神经节的生长情况，其可以反映NGF部分或长效NGF多肽在促进背根神经节生长中的生物活性。如果实验中包括NGF标准品，也可以计算样品的特定生物活性，以AU/mg表示。待测样品的比活度(AU/mg)＝对照品的比活度(AU/ml)×[样品的预稀释系数×该稀释点下相应对照品的比活度(AU/ml)/对照品的实际比活度(AU/ml)]。示例方法参见WO2017157326的实施例5。
在一些实施例中，本文所述NGF部分(或长效NGF多肽)包含突变或修饰(例如，翻译后修饰)，与野生型NGF(或包含野生型NGF的多肽)相比保留/增强/降低了其生物活性。在一些实施例中，本文所述经突变或修饰的NGF部分或长效NGF多肽与野生型NGF(或包含野生型NGF的多肽)相比，具有相似(例如，相等)或至少为2倍(例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500、1000、5000或10000倍或更多)的生物活性(例如，促进细胞生长)。在一些实施例中，本文所述长效NGF多肽与NGF部分(例如长效NGF多肽的相应NGF部分)相比，具有相似(例如，相等)或至少为1.1倍(例如至少1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100倍或更多)的生物活性。
药代动力学(PK)
药代动力学(PK)是指药物(例如，本文所述的NGF部分或长效NGF多肽)在向受试者施用后的吸收、分布、代谢和排泄。可用于确定临床效用的药代动力学参数包括但不限于血清/血浆浓度、随时间变化的血清/血浆浓度、最大血清/血浆浓度(Cmax)、达到最大浓度的时间(Tmax)、半衰期(t1/2)、给药间隔内浓度-时间曲线下的面积(AUCτ)等。
用于获得药物，例如，本文所述的NGF部分或长效NGF多肽或对照药物(例如， 鼠NGF)的PK曲线的技术是本领域已知的。参见Heller et al.,Annu Rev Anal Chem,11,2018；和Ghandforoush Sattari et al.,J Amino Acids,Article ID 346237,Volume2010。在一些实施例中，在个体的血液、血浆或血清样本中测量如本文所述的NGF部分或长效NGF多肽的PK曲线。在一些实施例中，使用质谱技术(例如，LC-MS/MS或ELISA)测量个体中如本文所述的NGF部分或长效NGF多肽的PK曲线。可通过本领域已知的任何方法在PK曲线上进行PK分析，例如，非室间分析，使用PKSolver V2软件(Zhang Y.et al.,“PKSolver:Anadd-in program for pharmacokinetic and pharmacodynamic data analysis inMicrosoft Excel,”Comput Methods Programs Biomed.2010；99(3):306-1)。示例方法参见实施例6。
“C”表示受试者血浆、血清或任何合适的体液或组织中的药物(例如，NGF部分或长效NGF多肽)浓度，通常表示为每单位体积的质量，例如纳克/毫升。为方便起见，血清或血浆中的药物浓度在本文中称为“血清浓度”或“血浆浓度”。给药后任何时间(例如，NGF部分或长效NGF多肽，例如静脉注射、腹腔注射或皮下注射)的血清/血浆浓度称为Ctime或Ct。给药期间的最大血清/血浆药物浓度被称为Cmax；Cmin是指给药间隔结束时的最小血清/血浆药物浓度；Cave指给药间隔期间的平均浓度。
术语“生物利用度”是指药物(例如，NGF部分或长效NGF多肽)通过体循环，从而进入作用部位的程度或速率。
“AUC”是血清/血浆浓度-时间曲线下的面积，被认为是对生物利用度最可靠的测量方式，如给药间隔内浓度-时间曲线下的面积(AUCτ)，“总暴露”或“一段时间内的总药物暴露”(AUC0-last或AUC0-inf)，给药后t时间的浓度-时间曲线下的面积(AUC0-t)等。
血清/血浆浓度峰值时间(Tmax)是给药(例如，NGF部分或长效NGF多肽)后达到血清/血浆浓度(Cmax)峰值的时间。
半衰期(t1/2)是指在血浆或血清(或其它生物基质)中测得的药物浓度(例如，NGF部分或长效NGF多肽)降至其在特定时间点的浓度或量的一半所需的时间。例如，静脉给药后，由于药物的分布和消除，血浆或血清中的药物浓度下降。在静脉给药后血浆或血清药物浓度随时间变化的曲线中，第一阶段或快速下降阶段被认为主要是由于分布导致，而后期的下降通常较慢，主要是由于消除导致，尽管这两个过程在这两个阶段都会发生。分布被认为是在足够的时间后完成的。一般来讲，消除半衰期由血浆/血清浓度-时间曲线的终末期或消除(主要)阶段决定。参见Michael Schrag和Kelly Regal，“临床前药物开发毒理学综合指南”的“第3章-药代动力学和毒代动力学”，2013。
在一些实施例中，本文所述长效NGF多肽具有至少5小时的半衰期(例如，静脉注射、皮下注射或肌肉注射，如给人类注射)，如至少为6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250或300小时中的任一个，或更长。在一些实施例中，本文所述长效NGF多肽具有5小时至300小时的半衰期(例如，静脉注射，如给人类注射)，例如8小时至100小时、10小时至60小时、15小时至60小时或20小时至58小时中的任何一个。在一些实施例中，本文所述的长效NGF多肽以单次给药的方式给药，如单次静脉注射或输注、单次肌肉注射或单次皮下注射。在一些实施例中，本文所述的长效NGF多肽的循环半衰期约为55小时。
在一些实施例中，NGF部分的半衰期为1小时至2.5小时，如1.5小时至2.4小时。在一些实施例中，本文所述的长效NGF多肽的循环半衰期至少为相应的NGF部分(即，包含长效NGF多肽中包含的NGF部分而无Fc融合)或野生型NGF的循环半衰期的5倍，例如至少约为相应NGF部分或野生型NGF的循环半衰期的6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100倍中的任何一个，或以上。
致痛活性
NGF是公认的疼痛靶点，因为它能导致动物和人类疼痛。尤其在成人中，NGF能促进中枢和外周神经元亚群的健康和存活(Huang和Reichardt,Ann.Rev.Neurosci.24:677-736(2001))。NGF也有助于调节这些神经元的功能特性，并能够对被称为伤害感受器的感觉疼痛受体的敏感性或兴奋性进行强直性控制(Priestley et al.,Can.J.Physiol.Pharmacol.80:495-505(2002)；Bennett,Neuroscientist 7:13-17(2001))。伤害感受器感知并向中枢神经系统传递各种有害的刺激，从而产生疼痛感(伤害感受)。NGF受体位于伤害感受器上。在受伤和炎症组织中NGF的表达增加，并在人的疼痛状态下上调。NGF诱导的伤害感受/疼痛由高亲和力NGF受体trkA(酪氨酸受体激酶A)介导(Sahet al.,Nat.Rev.Drug Disc.2:460-72(2003))。
广义上的“疼痛”是指一种经验现象，对于体验疼痛的个体而言具有高度的主观性，并且受个体心理状态的影响，包括环境和文化背景。“生理上的”疼痛通常与第三方可感知的刺激有关，这种刺激是造成实际或潜在组织损伤的原因。从这个意义上讲，根据国际疼痛研究协会(IASP)的说法，可以认为疼痛是一种“与实际或潜在组织损伤相关的感觉和情感体验，或用此类损伤的术语来描述”。然而，一些疼痛的例子没有可察觉的原因。例如，精神性疼痛，包括在没有任何引起可感知疼痛的证据的情况下，患有心理障碍的人因精神因素或有时会持续出现可感知的疼痛的综合征引起的先前存在的生理疼痛的加剧。
疼痛包括伤害性疼痛、神经病理性/神经源性疼痛、突发性疼痛、痛觉超敏、痛觉过敏、感觉过敏、触物感痛、感觉异常、痛觉过度、幻肢痛、精神性疼痛、痛觉缺失、神经痛、神经炎。其它分类包括恶性疼痛、心绞痛疼痛和/或原发性疼痛、复杂区域疼痛综合征I、复杂区域疼痛综合征II。疼痛的类型和症状不必相互排斥。这些术语的定义与IASP一致。
伤害性疼痛是由外周神经元中的特殊伤害感受器对伤害性刺激作出应答，并将伤害性刺激编码为动作电位而引起的。伤害感受器通常位于Aδ纤维和(多模)C纤维上，是游离的神经末梢，终止于皮肤下方、肌腱、关节和身体器官。背根神经节(DRG)神经元为外周和脊髓之间提供沟通的场所。信号经过脊髓处理，到脑干和丘脑部位，最后到达大脑皮层，在那里它通常(但不总是)引起疼痛感。伤害性疼痛可由多种化学、热、生物(例如，炎症)或机械事件引起，这些事件有可能刺激或损伤身体组织，通常高于伤害感受器中的引起伤害感受活动所需的某种最小强度阈值。
神经病理性疼痛通常是外周或中枢神经系统功能异常导致的，分别引起外周或中枢神经病理性疼痛。IASP将神经性疼痛定义为神经系统原发性病变或功能障碍引发或导致的疼痛。神经病理性疼痛通常涉及神经系统的实际损伤，尤其是在慢性病中。炎性伤害性疼痛通常是组织损伤和由此引起的炎症过程导致的。神经病理性疼痛可在任何可观察到的组织损伤明显愈合后(例如，数月或数年)仍持续存在。
在神经病理性疼痛情况下，受影响区域的感觉信息处理过程可能会变得异常，并且通常不会引起疼痛的无害刺激(例如，热刺激、触摸/压力刺激)可能会导致疼痛(即，痛觉超敏)，或有害刺激可能会引起对正常疼痛刺激的过度疼痛感知(即，痛觉过敏)。此外，正常刺激可能会引起类似于电刺痛或电击或“发麻”的感觉(即，感觉异常)和/或不愉快的感觉(即，感觉障碍)。突发性疼痛是先前存在的慢性疼痛的加重。痛觉过敏是一种疼痛综合征，由对刺激的异常疼痛反应引起。在大多数情况下，刺激是重复的，伴随着疼痛阈值增加，所述疼痛阈值被认为是患者能够识别为疼痛的最小疼痛体验。
神经病理性疼痛的例子包括触觉性痛觉超敏(例如，神经损伤后诱发的)、神经痛(例如，疱疹后(或带状疱疹后)神经痛、三叉神经痛)、反射性交感神经营养不良/烧灼痛(神经创伤)、癌症疼痛(例如，癌症本身或炎症等相关条件引起的疼痛，或由于化疗、手术或放疗等治疗)、假肢痛、嵌压性神经痛(例如，腕管综合征)和神经病变，如外周神经病变(例如，糖尿病、艾滋病、长期饮酒、接触其它毒素(包括许多化疗)、维生素缺乏症，以及其它各种疾病)。神经病理性疼痛包括由于各种原因(例如，外科手术、伤口、带状疱疹、糖尿病性神经病变、腿或手臂截肢、癌症等)导致的神经损伤后神经系统的病理性手术所引起的疼痛。与神经病理性疼痛相关的疾病包括创伤性神经损伤、中风、多发性硬化、脊髓空洞症、脊髓损伤和癌症
引起疼痛的刺激通常会引起炎症反应，而炎症反应本身也会导致疼痛。在一些情况下，疼痛似乎是由伤害性和神经性因素的复杂混合因素引起的。例如，慢性疼痛通常包括炎性伤害性疼痛或神经性疼痛，或两者的混合。最初的神经系统功能障碍或损伤可能触发炎症介质的神经释放和随后的神经病理性炎症。例如，偏头痛可以表现为神经性疼痛和伤害性疼痛的混合。此外，肌筋膜疼痛可能继发于来自肌肉的痛觉输入，但异常的肌肉活动可能是神经系统疾病导致的。
在一些实施例中，本文所述的长效NGF多肽在受试者中减少或没有致痛活性，如与无Fc融合的相应NGF部分相比，与野生型NGF相比，或与本文未描述的其它NGF-Fc融合蛋白相比(以下称为“对照NGF构建体”)。在一些实施例中，疼痛是急性疼痛、短期疼痛、持续性或慢性伤害性疼痛、或持续性或慢性神经病理性疼痛。在一些实施例中，与对照NGF构建体(例如，野生型β-NGF)相比，本文所述长效NGF多肽引起的疼痛至少减少10％，如与对照NGF构建体相比，疼痛至少减少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、80％、90％、95％或100％中的任一个。在一些实施例中，本文所述长效NGF多肽在给受试者施用时不会引起疼痛。
可通过本领域已知的任何方法测量致痛活性，如WO2017157325、WO2017157326和CN108727486A中所述，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施例中，通过痛阈测量疼痛，痛阈越高，疼痛越小。
例如，引起疼痛的活动可以通过要求患者根据一些不同的量表对所经历的疼痛的质量和强度进行评分来测量。口头疼痛量表使用词语来描述无疼痛、轻度疼痛、中度疼痛和重度疼痛的范围，每一级的分数从0到3。或者，可能会要求患者根据数值疼痛量表从0(无疼痛)到10(最严重疼痛)对其疼痛进行评分。在视觉模拟量表(VAS)上，垂直或水平线包含从无痛到可能的最严重疼痛的文字描述，要求患者在代表其当前疼痛水平的点上标记。McGill疼痛指数使患者能够从一系列简短列表中选择最能描述其疼痛的词语来描述疼痛的质量和强度，例如捶击、灼痛、捏痛。使用VAS或数值量表有困难的成年人(例如，FACES面部或非语言患者)可使用其它疼痛量表，例如，行为评定量表。功能性活性评分通过要求患者执行与疼痛区域相关的任务，来反应患者因疼痛而受到阻碍的程度。使用这些类型的量表以改善疼痛评分，例如，与对照NGF构建体相比，疼痛评分的改善潜在地表明测试NGF构建体(例如，本文所述的长效NGF多肽)引起疼痛的副作用减少。
在一些实施例中，可通过热板法(54-55℃)在小鼠上测试本文所述的长效NGF多肽的致痛活性以确定疼痛阈值。简单来说，将符合反应条件的小鼠麻醉，然后采用神经钳夹法建立小鼠坐骨神经损伤模型，而假手术组仅分离坐骨神经，不钳夹坐骨神经。然后将小鼠分为三组：假手术组、损伤对照组(正常生理盐水)和实验组(用本文所述的长效NGF多肽处理，和/或对照NGF，如小鼠β-NGF处理)。每只小鼠的疼痛阈值由舔后脚的潜伏期表示，可在手术前和手术后不同时间点测量。疼痛阈值增加％＝(受伤后第10天的疼痛阈值-受伤前的疼痛阈值)×100％/受伤前的疼痛阈值。
本文所述长效NGF多肽的致痛活性也可在小鼠上进行测试，通过测量机械刺激下小鼠的曲爪反应，以确定疼痛阈值。它可以在短期致痛条件下或长期致痛条件下进行测试。简单来说，向符合反应条件的小鼠皮下注射本文所述的载体或本文所述的长效NGF多肽(或对照NGF，如小鼠β-NGF；可在不同的浓度下)，然后测量注射后在机械刺激下的曲爪反应(例如，在不同时间点)，这反映了治疗后的疼痛阈值。
本文所述的长效NGF多肽的致痛活性也可通过行为试验进行测试。例如，给大鼠关节施用本文所述的载体或长效NGF多肽(或对照NGF，如小鼠β-NGF；可在不同的浓度下)，然后可通过记录给药后(例如，在不同时间点)的抬腿维持时间和抬腿次数来检测样品是否引起疼痛，以计算抬腿总持续时间。较短的抬腿总时间意味着较少的致痛活性。
稳定性
在一些实施例中，本文所述的长效NGF多肽具有优异的稳定性，例如物理稳定性、化学稳定性和/或生物稳定性。在一些实施例中，本文所述的长效NGF多肽具有优异的热稳定性，例如高熔解温度(Tm)和/或高聚集起始温度(Tagg)。在一些实施例中，本文所述长效NGF多肽在加速应力(例如，高温)下具有优异的稳定性，例如较少或没有片段化、聚集体形成和/或聚集体增量。
蛋白质的稳定性，特别是对聚集的敏感性，主要取决于蛋白质分子的构象和胶体稳定性。一般认为，非天然蛋白质聚集的第一步，即最普遍的聚集形式，是分子结构的轻微扰动，例如，蛋白质的部分去折叠，即构象变化。这是由蛋白质的构象稳定性决定的。在第二步中，部分未折叠的分子在扩散和随机布朗运动的驱动下靠近，形成聚集。第二步主要由分子的胶体稳定性决定(参见Chi et al.,Roles of conformational stability andcolloidal stability in the aggregation of recombinant human granulocytecolony stimulating factor.Protein Science,2003May；12(5):903-913)。如本文所用，术语“稳定性”通常是指维持生物活性物质(如蛋白质)的完整性或尽量减少其降解、变性、聚集或去折叠。如本文所用，“改良的稳定性”通常意味着，在已知会导致降解、变性、聚集或去折叠的条件下，与对照组蛋白质(例如，其它NGF-Fc融合蛋白)相比，目标蛋白质(例如，本文所述的长效NGF多肽)保持更佳的稳定性。
差示扫描量热法(DSC)和差示扫描荧光法(DSF)是本领域众所周知的技术，用于预测蛋白质制剂的稳定性。具体而言，这些技术可用于确定给定制剂中蛋白质的去折叠温度(Tm)。将给定制剂中蛋白质的高Tm测量值与可用于长期、稳定储存的更可靠和稳定的蛋白质制剂相关联是本领域的标准做法。
一种“稳定的”蛋白质(或制剂)，例如，本文所述的长效NGF多肽，基本上在制造过程中和/或储存时保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性。本领域有多种用于测量蛋白质稳定性的分析技术，并在Peptide and Protein Drug Delivery,247-301,Vincent Lee Ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)和Jones,A.(1993)Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90。10:29-90中进行了综述。例如，在一个实施例中，蛋白质的稳定性根据溶液中单体蛋白质的百分比确定，其中降解(例如，片段化)和/或聚集蛋白质的百分比较低。
优选地，蛋白质(或制剂)在室温(约30℃)或40℃下稳定至少1个月和/或在约2-8℃下稳定至少6个月，或至少1年或至少2年。此外，该蛋白质(或制剂)优选在冷冻(例如-70℃)和融解后稳定，以下称为“冻/融循环”。
一种蛋白质，例如，本文所述的长效NGF多肽，如果在颜色和/或透明度的目视检查或通过紫外光散射或尺寸排阻色谱法测量时，基本上没有不稳定迹象，例如聚集、沉淀和/或变性，则这种蛋白质在制剂中“保持其物理稳定性”。聚集是单个蛋白质分子或复合物共价或非共价结合形成聚集体的过程。聚集可以进行到形成可见沉淀的程度。
一种蛋白质，例如，本文所述的长效NGF多肽，如果在给定时间内的化学稳定性使得该蛋白质仍然保持其生物活性(例如，如上文“生物活性”小节所述)，则该蛋白质在制剂中“保持其化学稳定性”。化学稳定性可以通过例如检测和量化蛋白质的化学变化形式来评估。化学变化可能涉及尺寸改变(例如，剪切)，可使用尺寸排阻色谱法、SDS-PAGE和/或基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱(MALDI/TOF MS)进行评估。其它类型的化学变化包括电荷变化(例如，由于脱酰胺或氧化而发生的变化)，例如，可通过离子交换色谱法进行评估。
一种蛋白质，例如，本文所述的长效NGF多肽，如果药物制剂中的蛋白质对于其预期目的具有生物活性，则该蛋白质在制剂中“保留其生物活性”。例如，如果制剂中蛋白质的生物活性为在制备制剂时显示的生物活性的30％、20％或10％(在分析误差范围内)内，则该蛋白保留了其生物活性。
本领域技术人员已知，蛋白质(例如，本文所述的长效NGF多肽)的稳定性除制剂的组成外还取决于其它特性。例如，稳定性可能受到温度、压力、湿度、pH值和外部辐射的影响。蛋白质制剂中蛋白质(例如，本文所述的长效NGF多肽)的稳定性可通过多种方法确定。在一些实施例中，通过尺寸排阻色谱法(SEC)确定蛋白质稳定性。SEC根据分析物(例如，蛋白质等大分子)的流体力学尺寸、扩散系数和表面性质来分离分析物。因此，例如，SEC可将本文所述的天然三维构象的长效NGF多肽与处于各种变性状态的蛋白质和/或已降解的蛋白质分离。在SEC中，固定相通常由填充在玻璃或钢柱内致密的三维基质中的惰性颗粒组成。流动相可以是纯水、水性缓冲液、有机溶剂、它们的混合物或其它溶剂。固定相颗粒具有小孔和/或通道，仅允许小于一定尺寸的物质进入。因此，大颗粒被排除在这些孔隙和通道之外，但较小颗粒从流动相中转移。颗粒被固定在固定孔隙中的时间在一定程度上取决于它们能渗透到孔隙中的深度。它们从流动相液流中转移会导致其从色谱柱中洗脱所需的时间更长，因此颗粒之间基于其大小差异而进行分离。参见实施例3所提供的示例方法。
在一些实施例中，SEC与鉴定技术相结合，以鉴定或表征蛋白质(例如，本文所述的长效NGF多肽)或其片段。蛋白质鉴定和表征可通过多种技术完成，包括但不限于色谱技术，例如高效液相色谱(HPLC)、十二烷基硫酸钠毛细管电泳(CE-SDS)、免疫分析、电泳、紫外/可见/红外光谱、拉曼光谱、表面增强拉曼光谱、质谱、气相色谱、静态光散射(SLS)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、圆二色谱(CD)、尿素诱导蛋白质去折叠技术、固有色氨酸荧光、差示扫描量热法和/或ANS蛋白结合。
在一些实施例中，样品制剂(例如，包含本文所述的长效NGF多肽)和对照制剂(例如，包含其它NGF-Fc融合蛋白或标准品)在处理阶段之前可选地进行测定，以确定单体的含量，聚集体和/或片段化蛋白(和/或片段增加百分比，聚集体增加百分比等)，如下文实施例3所述。随后，每种蛋白质制剂都要经历一个处理阶段。例如，每种蛋白质制剂可在特定温度(例如，40℃、25℃或5℃)下储存较长时间(例如，3个月、6个月、12个月或更长)。在一些实施例中，蛋白质制剂经受物理应力测试，例如搅拌应力试验。在一些实施例中，蛋白质制剂经受加速稳定性试验，例如在加速应力下进行处理，包括高温(例如，40℃)、高湿度和/或低pH值等。在一些实施例中，蛋白质制剂经历冷冻和融解循环。在一些实施例中，相同蛋白质制剂的样品接受不同处理，例如，在不同温度下储存一段时间。在处理阶段之后，对蛋白质制剂进行测定，以确定蛋白质单体、聚集体和/或片段的含量(和/或片段增加百分比，聚集体增加百分比等)。在一些实施例中，在连续加热下处理蛋白质制剂以测量熔解温度(Tm)和/或聚集起始温度(Tagg)，例如将温度从约20℃升高到约95℃(例如，以约0.3℃/min的加热速率)。可使用荧光蛋白分析仪，分别在266nm/473nm下通过荧光吸光度和光散射的变化测量Tm和Tagg。Tm越高，热稳定性越高。Tagg越高，表示越不易发生聚集。在一些实施例中，本文所述的长效NGF多肽具有至少50℃的Tm，如至少为51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃或75℃中的任何一个。在一些实施例中，本文所述的长效NGF多肽具有至少50℃的Tagg，例如至少为51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、
67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃或85℃中的任何一个。
稳定性，例如组合物或制剂的物理稳定性，可通过本领域众所周知的方法评估，包括测量样品的表观光衰减(吸光度或光密度)。这种光衰减测量与制剂的浑浊度有关。制剂的浑浊度是溶解在溶液中的蛋白质的固有特性，通常通过比浊法测定，并以比浊法浊度单位(NTU)测量。
浊度，例如，作为溶液中一种或多种成分浓度的函数，例如，蛋白质和/或盐浓度，也被称为制剂的“乳白色”或“乳白色外观”。浊度可以通过使用已知浊度的悬浮液生成的标准曲线来计算。确定药物组合物浑浊度的参考标准可基于欧洲药典标准(欧洲药典，第四版，欧洲委员会药品质量理事会(EDQM)，斯特拉斯堡，法国)。根据欧洲药典标准，澄清溶液定义为浊度小于或等于对照悬浮液。根据欧洲药典标准，该对照悬浮液的浊度约为3。在没有关联或非理想效应的情况下，浊度测量可以检测到瑞利散射，瑞利散射通常随浓度线性变化。用于评估药物蛋白质的物理稳定性的其它方法在本领域是公知的，例如，尺寸排阻色谱法或分析性超速离心法。
在一些实施例中，稳定性指含有本文所述的长效NGF多肽的制剂具有低至检测不到的微粒形成水平。本文所用的短语“低至检测不到的微粒形成水平”是指通过HIAC分析或目视分析确定，含有小于30个微粒/ml、小于20个微粒/ml、小于15个微粒/ml、小于10个微粒/ml、小于5个微粒/ml、小于2粒/ml或小于1粒/ml的样品。在一些实施例中，通过HIAC分析或目视分析未检测到长效NGF多肽制剂中的微粒。
“大量的蛋白质聚集”是指蛋白质制剂中的蛋白质聚集水平显著高于对照蛋白质制剂中的蛋白质聚集水平。对照蛋白质制剂可以是储存期之前或处理之前(例如，在经受不稳定条件之前，例如高温、湿度、pH和/或长期储存之前)的相同蛋白质制剂。对照蛋白质制剂可以是在相同条件下测试的不同蛋白质制剂(例如，其它NGF-Fc融合蛋白质或无Fc融合的NGF部分)。
“基本无蛋白质聚集”是指本发明的蛋白质(或制剂)，其蛋白质聚集的水平或百分比不显著高于对照制剂。例如，该短语指蛋白质(或制剂)聚集水平低于15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％。蛋白质聚集水平可使用本领域已知的标准技术来确定，如本文实施例3中所述。在一些实施例中，本文所述的长效NGF多肽基本上无蛋白质聚集(例如，在加速稳定性试验中)。在一些实施例中，长效NGF多肽最多具有15％的蛋白质聚集，例如最多14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.5％的蛋白质聚集(例如，加速稳定性试验条件下，例如加热)。在一些实施例中，本文所述长效NGF多肽没有蛋白质聚集(例如，在加速稳定性试验条件下，例如加热)。在一些实施例中，长效NGF多肽具有不超过15％的聚集体增加，例如不超过14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的聚集体增加(例如，在加速稳定性试验条件下，例如加速加热)。在一些实施例中，通过SEC测量稳定性。在一些实施例中，通过CE-SDS测量稳定性。
在一些实施例中，稳定性指本文所述的长效NGF多肽片段化减少。本文所用的术语“低至检测不到的片段水平”是指含有等于或大于80％、85％、90％、95％、98％或99％的总蛋白质的样品，例如，在HPSEC确定的单峰中，或在还原毛细管凝胶电泳(rCGE)确定的多峰中(例如，与亚基数量相同的峰)，代表未降解蛋白质或其未降解片段，且不含占总蛋白质的超过5％、超过4％、超过3％、超过2％、超过1％或超过0.5％的其它单峰。本文所用的术语“还原毛细管凝胶电泳”是指在还原条件下的毛细管凝胶电泳，该还原条件足以还原含Fc蛋白质中的二硫键，如本文所述的长效NGF多肽。在一些实施例中，长效NGF多肽具有0％至15％的片段，例如0％至12％的片段(例如，在加速稳定性试验条件下，如加速加热)。在一些实施例中，长效NGF多肽具有不超过30％的片段，例如不超过29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的片段(例如，在加速稳定性试验条件下，如加速加热)。在一些实施例中，长效NGF多肽没有片段(例如，在加速稳定性试验条件下，如加速加热)。在一些实施例中，长效NGF多肽的片段增加不超过30％，如片段增加不超过29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％(例如，在加速稳定性试验条件下，如加速加热)。在一些实施例中，长效NGF多肽具有至少75％的主峰，例如至少76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的主峰(例如，在加速稳定性试验条件下，如加速加热)。在一些实施例中，通过SEC测量稳定性。在一些实施例中，通过CE-SDS测量稳定性。
长效NGF多肽衍生物
在一些实施例中，本文所涉及的长效NGF多肽可被进一步修饰，以包含本领域已知且容易获得的额外的非蛋白部分。适于长效NGF多肽衍生物的非蛋白部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性示例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧环戊烷、聚-1,3,6-三氧戊烷、乙烯/马来酸酐共聚物，聚酰胺酸(均聚物或无规共聚物)、葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯基多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。由于聚乙二醇丙醛在水中的稳定性，其在制造中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量的，并且可以是支链或非支链的。连接到长效NGF多肽的聚合物的数量可能不同，如果连接了多个聚合物，则它们可以是相同或不同的分子。一般来说，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可基于以下考虑来确定，包括但不限于待改进的长效NGF多肽的特定性质或功能，长效NGF多肽衍生物是否会在特定条件下用于治疗等。
在一些实施例中，本文所述的长效NGF多肽进一步包含标签，所述标签选自发色团、荧光团(例如，香豆素、氧杂蒽、菁、芘、硼聚苯并氮杂吲哚、恶嗪及其衍生物)、荧光蛋白(例如GFP、藻胆蛋白及其衍生物)，磷光染料(例如，二氧杂环丁烷、氧杂蒽或碳菁染料、镧系螯合物)、串联染料(例如，菁-藻胆蛋白衍生物和氧杂蒽-藻胆蛋白衍生物)、粒子(例如，金簇、胶体金、微球、量子点)、半抗原、酶(例如，过氧化物酶、磷酸酶、糖苷酶、荧光素酶)和放射性同位素(例如，125I、3H、14C、32P)。
在一些实施例中，长效NGF多肽可被进一步修饰以包含一种或多种生物活性蛋白质、多肽或其片段。如本文所用，“生物活性”或“生物学上的活性”可互换使用，是指在体内显示生物活性以执行特定功能。例如，它可能意味着与特定生物分子结合，如蛋白质、DNA等，然后促进或抑制该生物分子的活性。在一些实施例中，生物活性蛋白质或其片段包括为预防或治疗疾病或症状作为活性药物施用给患者的蛋白质和多肽，以及用于诊断目的的蛋白质和多肽，例如用于诊断试验或体外检测的酶，以及给患者施用以预防疾病的蛋白质和多肽，例如疫苗。在一些实施例中，生物活性蛋白质或其片段具有免疫刺激/免疫调节、膜转运或酶活性。在一些实施例中，生物活性蛋白、多肽或其片段为酶、激素、生长因子、细胞因子或其混合物。在一些实施例中，生物活性蛋白质、多肽或片段可特异性识别目标肽(例如抗原或其它蛋白质)。
在一些实施例中，可包含在本文所述的长效NGF多肽中的生物活性蛋白质或其片段是抗原结合蛋白质(例如，抗体)。在一些实施例中，可包含在如本文所述的长效NGF多肽中的生物活性蛋白质或其片段是抗体模拟物，其是一种使人联想到抗体的包含抗原结合域的小型工程蛋白质，(GGeering和Fussenegger,Trends Biotechnol.,33(2):65-79,2015)。这些分子来自现有的人类支架蛋白，由单一多肽组成。可包含在如本文所述的长效NGF多肽中的抗体模拟物示例可以是但不限于设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin；包含3-5个完全合成的锚蛋白重复序列，两侧为N端和C端帽结构域)，一种亲和力多聚体(avimer；一种高亲和力蛋白质，包含多个A结构域，每个结构域对靶点的亲和力较低)，或一种抗凝素(基于脂质支架，具有四个可接近的环，每个环的序列可以随机)。在一些实施例中，可包含在如本文所述的长效NGF多肽中的生物活性蛋白质或其片段是犰狳重复蛋白(例如，β-连环蛋白、α-导入蛋白、斑珠蛋白、大肠腺瘤性息肉病(APC))，包含犰狳重复单元(特性，重复氨基酸序列的长度约为40个残基)。每个犰狳重复单元由一对形成发夹结构的α螺旋组成。多个重复拷贝形成了所述的α螺线管结构。犰狳重复蛋白能够结合不同类型的肽，依赖于肽主链的恒定结合方式，而不需要特定的保守侧链或与肽的游离N-或C-末端相互作用。通过残基识别肽残基的可能性，再加上重复蛋白的内在模块性，使得犰狳重复蛋白有望成为肽结合通用支架的候选。
III.编码长效NGF多肽的载体
本发明还涉及编码本文所述任何长效NGF多肽的分离核酸，包含编码本文所述任何长效NGF多肽的核酸的载体。还涉及包含编码本文所述任何长效NGF多肽的核酸的分离宿主细胞(例如，CHO细胞、HEK 293细胞、Hela细胞或COS细胞)，或包含编码本文所述任何长效NGF多肽的核酸的载体。在一些实施例中，分离的核酸进一步编码长效NGF多肽N端的信号肽序列(例如，SEQ ID NO:6)。在一些实施例中，分离的核酸进一步编码长效NGF多肽N端的前导肽序列(例如，SEQ ID NO:5)。在一些实施例中，分离的核酸进一步编码信号肽序列(例如，SEQ ID NO:6)，后面是长效NGF多肽N端的前导肽序列(例如，SEQ ID NO:5)。
因此，在一些实施例中，涉及一种编码长效NGF多肽的分离核酸，所述多肽从N端到C端包含NGF部分和Fc部分，其中NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)SEQ ID NOs:1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs:1-3中的任一个)，并且所述Fc部分来自IgG1 Fc或IgG4 Fc。在一些实施例中，涉及一种编码长效NGF多肽的分离核酸，该多肽包含(或基本上由......组成、或由......组成)SEQ ID NOs:61-67中的任一氨基酸序列。在一些实施例中，分离的核酸在5'端进一步包含编码信号肽序列SEQ ID NO:6的核酸序列。在一些实施例中，分离的核酸在5'端进一步包含编码前导肽序列SEQ ID NO:5的核酸序列。在一些实施例中，分离的核酸(从5'到3')进一步包含编码信号肽序列SEQ ID NO:6的核酸序列，随后是位于5'端的编码前导肽序列SEQ ID NO:5的核酸序列。
在一些实施例中，涉及一种编码长效NGF多肽的分离核酸，所述多肽包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQ ID NOs:34、36、38、40、42、44和46中的任一个。在一些实施例中，涉及一种编码长效NGF多肽的分离核酸，所述多肽包含(或基本上由......组成、或由......组成)氨基酸序列SEQ ID NOs:34、36、38、40、42、44和46中的任一个，不包含信号肽序列SEQ ID NOs:6。在一些实施例中，涉及一种分离的核酸，所述核酸包含(或基本上由......组成、或由......组成)核酸序列SEQ ID NOs:33、35、37、39、41、43和45中的任一个。
在一些实施例中，包含编码本文所述任何长效NGF多肽的核酸的载体适于在真核细胞中复制和整合，如哺乳动物细胞(例如，CHO细胞、HEK 293细胞、Hela细胞、COS细胞)。在一些实施例中，载体是一种病毒载体。在一些实施例中，载体是非病毒载体，如pTT5。
已经开发出许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。病毒载体的示例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体及其衍生物。病毒载体技术是本领域公知的，例如，在Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)中，及其它病毒学和分子生物学手册中均对其进行了详述。逆转录病毒为基因传递系统提供了一个方便的平台。可使用本领域已知的技术将异源核酸插入载体并包装在逆转录病毒微粒中。然后，可分离重组病毒并在体外或离体条件下将其输送至工程哺乳动物细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施例中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一些实施例中，使用慢病毒载体。在一些实施例中，使用自失活慢病毒载体。例如，携带构建体蛋白编码序列的自失活慢病毒载体可以用本领域已知的实验方法进行包装。所得的慢病毒载体可用于使用本领域已知的方法转导至哺乳动物细胞。来自逆转录病毒(如慢病毒)的载体是实现长期基因转导的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定地整合并在子代细胞中的繁殖。慢病毒载体也具有低免疫原性，并且可以转导非增殖细胞。
在一些实施例中，载体是非病毒载体。在一些实施例中，载体是pTT5载体。在一些实施例中，载体是转座子，例如睡美人(SB)转座子系统或PiggyBac转座子系统。在一些实施例中，载体是基于聚合物的非病毒载体，包括，例如，聚(乳酸-羟基乙酸共聚物)
(PLGA)和聚乳酸(PLA)、聚(乙烯亚胺)(PEI)和树枝状大分子。在一些实施例中，载体是基于阳离子脂质的非病毒载体，如阳离子脂质体、脂质纳米乳和固体脂质纳米粒(SLN)。在一些实施例中，载体是基于肽的非病毒基因载体，例如聚-L-赖氨酸。适用于基因组编辑的任何已知非病毒载体都可用于将编码长效NGF多肽的核酸引入宿主细胞。参见YinH.et al..,Nature Rev.Genetics(2014)15:521-555；Aronovich EL et al.,“TheSleeping Beauty transposon system:a non-viral vector for gene therapy.”Hum.Mol.Genet.(2011)R1:R14-20和Zhao S.et al.,“PiggyBac transposon vectors:thetools of the human gene editing.”Transl.Lung Cancer Res.(2016)5(1):120-125，通过引用并入本文。在一些实施例中，通过物理方法将编码本文所述长效NGF多肽的任何一个或多个核酸或载体引入宿主细胞(例如，CHO、HEK 293、Hela或COS)，包括但不限于电穿孔、声穿孔、光穿孔、磁转染、水穿孔。
在一些实施例中，载体包含可选择的标记基因或报告基因，用于从载体(例如，慢病毒载体、pTT5载体)转染的宿主细胞群中选择出表达本文所述的长效NGF多肽的细胞。可选择的标记和报告基因都可能被适当的调控序列包围，以使其能够在宿主细胞中表达。例如，载体可包含转录和翻译终止子、起始序列和用于调节核酸序列表达的启动子。
可使用本领域已知的任何分子克隆方法，包括，例如，使用限制性内切酶位点和一个或多个可选择的标记将核酸克隆到载体中。在一些实施例中，核酸可操作地连接到启动子上。，已经探索出多种用于原核细胞或真核细胞(例如，哺乳动物细胞)中进行基因表达的启动子，并且本领域已知的任何启动子都可用于本发明。启动子大致可分为组成型启动子或调控型启动子，如诱导型启动子。
在一些实施例中，编码本文所述的长效NGF多肽的核酸可操作地连接到组成型启动子上。组成型启动子允许异源基因(也称为转基因)在宿主细胞中组成型表达。本文所考虑的启动子示例包括但不限于CMV启动子(CMV)、人类延伸因子-1α(hEF1α)、泛素C启动子(UbiC)、磷酸甘油激酶启动子(PGK)、猿猴病毒40早期启动子(SV40)、鸡β-肌动蛋白启动子与CMV早期增强子(CAGG)偶联，罗氏肉瘤病毒(RSV)启动子、多瘤病毒增强子/单纯疱疹胸苷激酶(MC1)启动子、β肌动蛋白(β-ACT)启动子、“骨髓增生性肉瘤病毒增强子、阴性对照区缺失、d1587rev引物结合位点取代(MND)”启动子。大量研究中已广泛比较了这些组成型启动子在驱动转基因表达方面的效率。在一些实施例中，编码本文所述的长效NGF多肽的核酸可操作地连接到CMV启动子上。
在一些实施例中，编码本文所述的长效NGF多肽的核酸可操作地连接到诱导型启动子。诱导型启动子属于调控型启动子的范畴。诱导型启动子可被一个或多个条件诱导，如物理条件、宿主细胞的微环境或宿主细胞的生理状态、诱导剂(即诱导药剂)或其组合物。在一些实施例中，诱导条件不诱导宿主细胞中内源性基因的表达。在一些实施例中，诱导条件选自：诱导剂、辐射(如电离辐射、光)、温度(如热)、氧化还原状态和宿主细胞的激活状态。在一些实施例中，诱导型启动子可以是NFAT启动子、启动子或NFκB启动子。
IV.制备方法
还涉及制备本文所述任何长效NGF多肽的方法。因此，在一些实施例中，涉及一种制备长效NGF多肽的方法，包括：(a)在可有效表达所编码的长效NGF多肽的条件下，培养包含编码本文所述任何长效NGF多肽的核酸或载体的宿主细胞(例如，CHO细胞、HEK293细胞、Hela细胞或COS细胞)；和(b)从所述宿主细胞获得表达的长效NGF多肽。在一些实施例中，步骤(a)的方法进一步包含产生宿主细胞，所述宿主细胞包含编码本文所述的长效NGF多肽的核酸或载体。本文所述的长效NGF多肽可使用本领域已知或本文所述的任何方法制备。示例方法参见实施例1。
在一些实施例中，本文所述的长效NGF多肽用真核细胞表达，如哺乳动物细胞。在一些实施例中，本文所述的长效NGF多肽用原核细胞表达。当本文所述的长效NGF多肽用原核细胞表达时，所产生的proNGF-(可选接头)-Fc部分不能被加工成前导肽序列。因此，当用于原核细胞表达时，可将编码长效NGF多肽的核酸设计为不含编码前导肽序列的核酸序列(例如，SEQ ID NO:5)。
原核细胞的重组产物
载体构建
可以使用标准重组技术获得编码本申请所述的蛋白质构建体的多核酸序列。可以使用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苷酸。一旦获得编码多肽的序列，将其插入能够在原核宿主中复制和表达异源多核苷酸的重组载体中。本领域中已知且可使用的许多载体都可用于本发明。选择合适的载体主要取决于要插入载体的核酸大小以及载体所转化的特定宿主细胞。每个载体包含各种成分，这取决于该载体的功能(异源多核苷酸的扩增或表达，或两者兼有)及该载体与其所在的特定宿主细胞之间的兼容性。载体组件通常包括但不限于：复制起始位点、选择标记基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入和转录终止序列。
一般来说，质粒载体含有来自于与宿主细胞相容物种的复制子和控制序列，，其与这些宿主细胞一起使用。载体通常携带一个复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。例如，大肠杆菌通常使用pBR322转化，pBR322是一种来源于大肠杆菌的质粒。pBR322包含编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因，并因此提供了识别转化细胞的简单方法。pBR322、其衍生物或其它细菌质粒或噬菌体也可含有或经修饰后含有可被微生物用于表达内源性蛋白质的启动子。Carter et al.,U.S.Pat.No.5,648,237详述了用于表达特定抗体的pBR322衍生物的示例。
此外，包含与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体可作为转化载体与这些宿主细胞一起使用。例如，噬菌体如GEMTM-11可用于制备重组载体，所述重组载体可用于转化易感宿主细胞，如大肠杆菌LE392。
启动子是一段位于顺反子上游(5′)的非翻译调控序列，可调节下游基因表达。原核启动子通常分为两类，诱导型和组成型。诱导型启动子是一种可以响应培养条件改变(例如，营养素的存在或缺乏或温度的变化)，从而启动并提高顺反子转录水平的启动子。
可被潜在宿主细胞识别的许多启动子都是公知的。通过限制性内切酶将启动子从源DNA中移出并将分离的启动子序列插入本申请的载体中，所选启动子可操作地连接到编码多肽的顺反子DNA上。天然启动子序列和许多异源启动子都可用于指导靶基因的扩增和/或表达。在一些实施例中，利用异源启动子，因为与天然靶多肽启动子相比，异源启动子通常允许更大的转录，并且表达靶基因的产量更高。
适用于原核宿主的启动子包括PhoA启动子、-半乳糖苷酶和乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统和杂交启动子，如tac或trc启动子。然而，在细菌中具有功能的其它启动子(如其它已知的细菌或噬菌体启动子)也适用。它们的核酸序列已经公开，从而使技术人员能够使用接头或适配子来提供任何所需的限制位点将它们连接到编码目标轻链和重链的顺反子上(Siebenlist et al.,(1980)Cell 20:269)。
在一些实施例中，重组载体内的每个顺反子都包含一个分泌信号序列组分，该组分直接引导所表达的多肽跨膜转移。一般来说，信号序列可以是载体的组成部分，也可以是插入载体的靶多肽DNA的一部分。为本发明而选择的信号序列应为能被宿主细胞识别和加工(即，被信号肽酶切割)的序列。对于不能识别和加工异源多肽固有信号序列的原核宿主细胞，信号序列被原核信号序列所取代，该原核信号序列选自，例如，碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或热稳定性肠毒素II(STII)先导物、LamP、PhoE、，PelB、OmpA和MBP。
在一些实施例中，生产本申请的蛋白质构建体可发生在宿主细胞的细胞质中，因此不需要在每个顺反子内都存在分泌信号序列。在一些实施例中，多肽组分被表达、折叠和组装以在细胞质内形成蛋白质构建体。某些宿主菌株(例如，大肠杆菌trxB-菌株)提供有利于二硫键形成的细胞质条件，从而允许表达的蛋白质亚基适当折叠和组装。参见Proba和Pullthun,Gene,159:203(1995)。
b)原核宿主细胞
适于表达本申请的蛋白质的原核宿主细胞包括古细菌和真细菌，如革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。可用细菌的示例包括大肠杆菌(例如，大肠杆菌)、杆菌(例如，枯草杆菌)、肠杆菌、假单胞菌(例如，铜绿假单胞菌)、鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、克雷伯菌、变形杆菌、志贺菌、根瘤菌、透明颤菌或副球菌。在一些实施例中，使用革兰氏阴性细胞。在一些实施例中，大肠杆菌细胞作为本发明的宿主。大肠杆菌菌株示例包括菌株W3110(Bachmann,Cellular and Molecular Biology,vol.2(Washington,D.C.:American Society forMicrobiology,1987),pp.1190-1219；ATCC Deposit No.27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110 AfhuA(AtonA)ptr3 lac Iq lacL8 AompT A(nmpc fepE)degP41 kanR的菌株33D3(U.S.Pat.No.5,639,635)。其它菌株及其衍生物，如E.coli 294(ATCC 31446)、E.coliB、E.coli 1776(ATCC 31537)和E.coli RV308(ATCC 31608)也同样适用。这些例子是说明性的，而不是限制性。构建任何上述提及的已知基因型的细菌衍生物的方法在本领域已知，并在例如Bass et al.,Proteins,8:309-314(1990)中进行了详述。考虑到复制子在细菌细胞中的可复制性，通常需要选择合适的细菌。例如，当使用公知的质粒如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410来提供复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌或沙门氏菌适于用作宿主。
通常，宿主细胞应分泌最少量的蛋白水解酶，并需要在细胞培养物中适当加入额外的蛋白酶抑制剂。
c)蛋白生产
用上述表达载体转化宿主细胞，并在经适当改良的传统营养培养基中培养，以诱导启动子、选择转化子或扩增编码所需序列的基因。转化是指将DNA导入原核宿主，使DNA可以作为染色体外的元件或通过染色体整合进行复制。根据所用的宿主细胞，使用适合此类细胞的标准技术进行转化。采用氯化钙的钙处理通常用于含有大量细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法采用聚乙二醇/二甲基亚砜。另一种技术是电穿孔。
用于生产本申请的蛋白质构建体的原核细胞在本领域已知的且适于培养所选宿主细胞的培养基中生长。合适的培养基包括luria broth(LB)和必要的营养补充剂。在一些实施例中，培养基还包含基于表达载体的结构所选择的选择剂，以选择性地允许包含表达载体的原核细胞生长。例如，将氨苄青霉素添加到培养基中，用于表达氨苄青霉素抗性基因的细胞生长。
除碳源、氮源和无机磷酸盐源外，任何必要的补充剂也可单独或作为与其它补充剂或介质(如复合氮源)的混合物以适当的浓度加入。可选地，培养基可包含一种或多种选自谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、硫代甘氨酸、二硫代赤藓糖醇和二硫苏糖醇的还原剂。原核宿主细胞在合适的温度下培养。例如，对于大肠杆菌的生长，优选的温度范围为20℃至39℃，更优选的为25℃至37℃，甚至更优选的为30℃。培养基的pH值可以是5到9之间的任何pH值，主要取决于宿主生物。对于大肠杆菌来说，pH值优选为6.8至7.4，且更优选为7.0。
如果在本申请的表达载体中使用诱导型启动子，则在适合启动子激活的条件下诱导蛋白质表达。在本申请的一方面，PhoA启动子用于控制多肽的转录。因此，转化的宿主细胞在磷酸盐限制培养基中培养以进行诱导。优选地，磷酸盐限制培养基为C.R.A.P培养基(参见Simmons et al.,J.Immunol.Methods(2002),263:133-147)。根据所采用的载体结构，可使用本领域已知的多种其它诱导剂，这在本领域是已知的。
本申请所表达的蛋白质构建体分泌到宿主细胞的周质中并从中回收。蛋白质回收通常涉及破坏微生物，通常通过渗透压休克、超声处理或裂解等方式。一旦细胞被破坏，可通过离心或过滤去除细胞碎片或整个细胞。例如，可通过亲和树脂色谱法进一步纯化蛋白质。或者，蛋白质可以被运输到培养基中并在其中被分离出来。可从培养基中移除细胞，过滤和浓缩培养基上清液以进一步纯化所产生的蛋白质。所表达的多肽可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western blot试验等常用方法进一步分离和鉴定。
或者，通过发酵过程大规模生产蛋白质。各种大规模补料分批发酵程序可用于生产重组蛋白。大规模发酵的容量至少为1000升，最好为1000至100000升。这些发酵罐使用搅拌器叶轮来分配氧气和营养物质，特别是葡萄糖(首选碳/能源)。小规模发酵通常指发酵罐中的发酵，其容量体积不超过100升，范围从1升到100升。
在发酵过程中，通常是细胞在合适的条件下生长至所需密度后开始诱导蛋白质表达，例如，在OD550约为180-220时，此时细胞处于早期静止期。根据所采用的载体结构，可使用本领域已知和上文所述的多种诱导剂。细胞在诱导前可以生长较短的时间。细胞通常诱导约12-50小时，尽管可以使用可能更长或更短的诱导时间。
为了提高本申请的蛋白质构建体的产量和质量，可以改良各种发酵条件。例如，为了提高分泌多肽的正确组装和折叠，可以使用过表达伴侣蛋白的附加载体来共转化宿主原核细胞，如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD或DsbG)或FkpA(具有伴侣活性的肽脯氨酰顺反异构酶)。已证明伴侣蛋白有助于促进细菌宿主细胞中所产生的异源蛋白正确折叠和溶解。Chen et al.,(1999)J Bio Chem 274:19601-19605；Georgiou et al.,U.S.Pat.No.6,083,715；Georgiou et al.,U.S.Pat.No.6,027,888；Bothmann和Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.275:17100-17105；Ramm和Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.275:17106-17113；Arie et al.,(2001)Mol.Microbiol.39:199-210。
为了最大限度地减少表达的异源蛋白质(尤其是蛋白水解敏感的蛋白质)的水解，某些缺乏蛋白水解酶的宿主菌株可用于本发明。例如，宿主细胞菌株可经修饰使得编码已知细菌蛋白酶的基因发生基因突变，如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其组合物。可以使用一些大肠杆菌蛋白酶缺失菌株，在Joly et al.,(1998),supra；Georgiou et al.,U.S.Pat.No.5,264,365；Georgiou et al.,U.S.Pat.No.5,508,192；Hara et al.,Microbial Drug Resistance,2:63-72(1996)中进行了详述。
缺乏蛋白水解酶且用过表达一种或多种伴侣蛋白的质粒转化的大肠杆菌菌株，可在编码本申请所述的蛋白质构建体的表达系统中作为宿主细胞。
d)蛋白纯化
进一步纯化本文所生产的蛋白质构建体，以获得用于进一步分析和使用的基本上均匀的制剂。可采用本领域已知的标准蛋白质纯化方法。以下程序为适用的纯化程序示例：免疫亲和柱或离子交换柱上的分馏、乙醇沉淀、反相液相色谱HPLC、二氧化硅或阳离子交换树脂(如DEAE)色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀和凝胶过滤，例如，葡聚糖凝胶G-75。
在一些实施例中，固定在固相上的蛋白质A被用于蛋白质构建体的免疫亲和纯化，所述蛋白质构建体包含本申请所述的Fc区域。蛋白A为来自金黄色葡萄球菌的42kDa表面蛋白，其与含Fc的结构具有很高的结合亲和力，例如，本文所述的长效NGF多肽。Lindmark etal.,(1983)J.Immunol.Meth.62:1-1。固定蛋白质A的固相优选包含玻璃或二氧化硅表面的柱子，更优选为可控孔径玻璃柱或硅酸柱。在某些应用中，色谱柱涂有试剂，如甘油，以防止污染物的非特异性粘附。然后清洗固相以去除非特异性结合到固相的污染物。最后，通过洗脱从固相中回收目标蛋白构建体。
2.真核细胞的重组产物
对于真核表达，载体组分通常包括但不限于下列一个或多个：信号序列、复制起始点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
信号序列元件
用于真核宿主的载体还可以是一个插入物，该插入物编码信号序列或在成熟蛋白或多肽的N端具有特定裂解位点的其它多肽。选择的异源信号序列优选为由宿主细胞识别和加工(即，被信号肽酶切割)的序列。在哺乳动物细胞表达中，可以获得哺乳动物信号序列以及病毒分泌先导物，例如，单纯疱疹gD信号，都是有用的。该前体区域的DNA在阅读框中与编码本申请的蛋白质构建体的DNA连接。
b)复制起始点
一般来说，哺乳动物表达载体不需要复制起始点元件(SV40起点通常仅因其包含早期启动子而使用)。
c)选择基因元件
表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标记。典型的选择基因编码以下蛋白质：(a)对抗生素或其它毒素具有抗药性的蛋白质，例如，氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素、(b)补体营养缺陷蛋白质或(c)提供复杂培养基无法提供的关键营养素的蛋白质，如编码杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个示例是利用药物来阻止宿主细胞的生长。那些异源基因成功转化的细胞产生一种具有抗药性的蛋白质，从而在选择方案中存活下来。这种优势选择的示例使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
适用于哺乳动物细胞的可选择的标记的另一个示例是，那些能够识别有能力携带编码本申请所述蛋白质构建体核酸的细胞的可选择的标记，，如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和-II，优选为灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
例如，用DHFR选择基因转化的细胞，首先将所有转化子培养在含有甲氨蝶呤(Mtx)的培养基中进行鉴定，甲氨蝶呤是DHFR的竞争性拮抗剂。当使用野生型DHFR时，适用的宿主细胞为缺乏DHFR活性的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如，ATCC CRL-9096)。
或者，用编码多肽的DNA序列、野生型DHFR蛋白和另一选择标记，如氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH)转化或共转化的宿主细胞(尤其是含有内源性DHFR的野生型宿主)，可通过在含有选择标记物的培养基中的细胞生长来选择，所述选择标记物例如氨基糖苷类抗生素，例如，卡那霉素、新霉素或G418。参见U.S.Pat.No.4,965,199。
d)启动子元件
表达和克隆载体通常包含一个启动子，所述启动子被宿主识别，并可操作地连接到编码所需多肽序列的核酸上。几乎所有真核基因都有一个富含AT的区域，位于转录起始点上游约25到30个碱基。在许多基因转录起始点上游70到80个碱基处发现的另一个序列为CNCAAT区域，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核生物的3′端有一个AATAAA序列，该序列可能是编码序列3′端增加多聚A尾的信号。所有这些序列都可以插入到真核表达载体。参见上文“III.编码长效NGF多肽的载体”一节。
哺乳动物宿主细胞载体中的多肽转录受启动子控制，例如，通过从病毒基因组获得的启动子，如多瘤病毒、鸡痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头状瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和最优选的猿猴病毒40(SV40)，来自异源哺乳动物的启动子，例如，肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，来自热休克启动子，前提是此类启动子与宿主细胞系统兼容。
SV40病毒早期和晚期启动子作为SV40限制性片段便于获得，该限制性片段也包含SV40病毒复制起始点。人类巨细胞病毒的即刻早期启动子作为HindIII E限制性片段便于获得。U.S.Pat.No.4,419,446中公开了一种使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。U.S.Pat.No.4,601,978中详述了对该系统的改良。参见Reyes et al.,Nature 297:598-601(1982)，关于在单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子控制下人类干扰素cDNA在小鼠细胞中的表达。或者，可以使用劳斯肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。
e)增强子元件
高等真核生物对编码本申请蛋白质构建体DNA的转录通常通过在载体中插入增强子序列而增加。在哺乳动物基因中已经发现了许多增强子序列(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-甲胎蛋白和胰岛素)。然而，通常使用的是真核细胞病毒的增强子。示例包括复制起始点末端(100-270bp)的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起始点末端的多瘤病毒增强子和腺病毒增强子。参见Yaniv,Nature 297:17-18(1982)，关于激活真核生物启动子的增强元件。增强子可在多肽编码序列的5′或3′处拼接到载体上，但优选位于启动子的5′处。
f)转录终止元件
真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人类或其它多细胞生物的有核细胞)中使用的表达载体也包含转录终止和稳定mRNA所必需的序列。这些序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA的5′端非翻译区获得，偶尔为3′端。这些区域包含核苷酸片段，所述核苷酸片段在编码多肽的mRNA的未翻译部分作为多聚腺苷酸片段被转录。一个合适的转录终止元件为牛生长激素多聚腺苷酸区域。参见WO94/11026和其中所公开的表达载体。
g)宿主细胞的选择和转化
用于克隆或表达本文所述载体中的DNA的合适宿主细胞包括本文所述的高等真核细胞，包括脊椎动物宿主细胞。脊椎动物细胞的培养繁殖(组织培养)已成为常规程序。有用的哺乳动物宿主细胞系示例为SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；来源于猴肾组织的COS成纤维细胞样细胞系；人类胚胎肾系(293或293细胞亚克隆，用于悬浮培养生长，Graham et al.,J.Gen Virol.36:59(1977))；乳仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；小鼠塞尔托力氏细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCC CCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC-ccl2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC-ccl34)；水牛-大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人类肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人类肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TR1细胞(Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC5细胞；FS4细胞和人类肝癌细胞系(Hep G2)。
用上述表达载体或克隆载体转化宿主细胞以产生蛋白质结构，并在经适当改良的常规营养培养基中培养，以诱导启动子、选择转化子或扩增编码所需序列的基因。
h)培养宿主细胞
用于生产本申请的蛋白质构建体的宿主细胞可在多种培养基中培养。商用培养基，如Ham's F10(Sigma)、最小基本培养基((MEM)，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco's修饰的Eagle's Medium((DMEM)，Sigma)适合培养宿主细胞。此外，Ham et al.,Meth.Enz.58:44(1979)、Barnes et al.,Anal.Biochem.102:255(1980)、U.S.Pat.No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655或5,122,469、WO 90/03430、WO 87/00195或U.S.Pat.Re.30,985所述的任何培养基都可用作宿主细胞的培养基。这些培养基中的任何一种都可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPE)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如庆大霉素TM药物)、微量元素(定义为通常最终浓度在微摩尔范围内存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能源。任何其它必要的补充剂也可在本领域技术人员已知的适当浓度下加入。培养条件，如温度、pH等，是那些先前宿主细胞表达所使用过的条件，并且对于普通技术人员来说显而易见。
蛋白纯化
当使用重组技术时，本发明的蛋白质构建体可在细胞内、周质中产生，或直接分泌到培养基中。如果蛋白质构建体在细胞内产生，第一步是通过离心或超滤去除微粒碎片(即宿主细胞或裂解片段)。Carter et al.,Bio/Technology 10:163-167(1992)详述了分离分泌到大肠杆菌周质中的抗体的程序。简而言之，细胞体在醋酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)存在的条件下融解约30分钟。细胞碎片可通过离心去除。当蛋白质构建体分泌到培养基中，此类表达系统的上清液通常首先使用市面上的蛋白质浓缩过滤器进行浓缩，例如，Amicon或Millipore Pellicon超滤装置。蛋白酶抑制剂如PMSF可包含在上述任何步骤中，以抑制蛋白质水解，且可包含抗生素以防止外来污染物的生长。
可以使用例如羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析和亲和色谱法来纯化从细胞中制备的蛋白质组合物，其中亲和色谱法是优选的纯化技术。蛋白质A作为亲和配体的适用性取决于在含Fc蛋白构建体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和亚型。蛋白质A可用于纯化基于含1、2或4重链的人类免疫球蛋白的含Fc蛋白质(Lindmark et al.,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。推荐蛋白质G用于所有小鼠亚型和人类3型(Guss etal.,EMBO J.5:15671575(1986))。连接亲和配体的基质通常是琼脂糖，但也有其它基质。与琼脂糖相比，机械稳定的基质(如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯-二乙烯基)苯)可以实现更快的流速和更短的处理时间。Bakerbond ABXTMresin可用于纯化包含CH3结构域的蛋白质构建体(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)。其它蛋白质纯化技术也同样适用，如离子交换柱分馏、乙醇沉淀、反相液相色谱HPLC、硅胶层析、肝素SEPHAROSETM色谱、阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀，取决于要回收的蛋白质构建体。
在任何初步纯化步骤之后，可以对包含目标蛋白质构建体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用色谱，洗脱缓冲液pH值为约2.5-4.5，优选地，在低盐浓度下进行(例如，从0-0.25M盐)。
V.药物组合物
进一步涉及包含本文所述任何长效NGF多肽的药物组合物，和可选的药学上可接受的载体和/或辅料。因此，在一些实施例中，涉及一种包含长效NGF多肽的药物组合物，所述长效NGF多肽从N端到C端包含NGF部分和Fc部分，所述NGF部分包含SEQ ID NOs:1-4中的任一氨基酸序列，且所述Fc部分来自IgG1 Fc或IgG4 Fc，以及可选的一种药学上可接受的载体。药物组合物可以通过将本文所述的具有所需纯度的长效NGF多肽与可选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980))混合制备，成冻干制剂或水溶液的形式。
可通过将冻干的长效NGF多肽溶解在稀释剂中，使蛋白质均匀分散，从而制备重组制剂。适于在本申请中使用的医药上可接受的(对人体施用安全且无毒)稀释剂示例包括但不限于无菌水、注射用抑菌水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水，林格溶液或葡萄糖溶液，或盐和/或缓冲剂的水溶液。
在一些实施例中，药物组合物包含本文所述的长效NGF多肽的同质群体。同质群体表示长效NGF多肽彼此完全相同，例如，相同的长效NGF多肽结构、相同的NGF部分、相同的接头(如果有)和相同的Fc部分。在一些实施例中，药物组合物中至少70％(如至少为75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任何一个)的长效NGF多肽是同质的。
在一些实施例中，药物组合物基本上由(例如，由......组成)本文所述的长效NGF多肽和可选的药学上可接受的载体组成。在一些实施例中，药物组合物不包含任何proNGF-Fc或PrepoNGF-Fc融合蛋白。在一些实施例中，药物组合物最多包含5％(如最多为4％、3％、2％或1％中的任何一个)的proNGF-Fc或prepoNGF-Fc融合蛋白。在一些实施例中，药物组合物不包含任何宿主细胞(例如CHO)蛋白质。
药物组合物优选为稳定的，其中所含蛋白质在储存时基本上保持其物理和化学稳定性和完整性。本领域有各种用于测量蛋白质稳定性的分析技术，并在Peptide andProtein Drug Delivery,247-301,Vincent Lee Ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)和Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90(1993)中进行了综述。稳定性可以在选定的温度和选定的时间段内进行测量。对于加速筛选，可将制剂在40℃下保存2周至1个月，在此期间测量稳定性。如果制剂在2-8℃下储存，通常制剂应在30℃或40℃下稳定至少1个月，和/或在2-8℃下稳定至少2年。如果制剂在30℃下储存，通常制剂应在30℃下稳定至少2年，和/或在40℃下稳定至少6个月。例如，储存期间的聚集程度可作为蛋白质稳定性的指标。在一些实施例中，本文所述的长效NGF多肽的稳定制剂中可包含少于10％(优选少于5％)的本文所述的长效NGF多肽聚集体。
在一些实施例中，药物组合物具有至少15天的保质期，如至少20天、1个月、2个月、3个月、6个月、1年、2年、3年或更长的保质期，例如，在2-25℃(如2-8℃)下。如本文所用，“保质期”是指当药物制剂在特定储存条件下储存时，例如2-8℃，药物制剂中的活性成分如治疗性蛋白质(例如，本文所述的长效NGF多肽)发生最小降解(例如，不超过5％降解，如不超过4％、3％，或2％降解)的储存期。用于评估蛋白质或制剂稳定性的示例性技术包括尺寸排阻色谱(SEC)-HPLC以检测，例如，聚集、反相液相色谱(RP)-HPLC以检测，例如，蛋白质片段、离子交换HPLC以检测，例如，蛋白质电荷变化、质谱、荧光光谱、圆二色(CD)光谱、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)和拉曼光谱以检测蛋白质构象变化。所有这些技术均可单独或组合使用，以评估药物制剂中蛋白质的降解情况，并确定该制剂的保质期。在一些实施例中，当本发明的药物制剂储存在2-8℃时，在至少15天内(例如，至少20天、1个月、2个月、3个月、6个月、1年、2年、3年或更长的时间)表现出不超过5％(例如，不超过4％、3％、2％或1％)的降解(例如，片段化、聚集或去折叠)。
可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度下对受试者无毒，包括缓冲液、抗氧化剂包括抗坏血酸、蛋氨酸、维生素E、焦亚硫酸钠；防腐剂、等渗剂(如氯化钠)、稳定剂、金属络合物(例如，锌-蛋白质络合物)；螯合剂，如EDTA和/或非离子表面活性剂。
生理上可接受的载体示例包括缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻茶二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，如钠；金属络合物(例如，锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如吐温TM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
缓冲液用于将pH值控制在优化治疗效果的范围内，尤其是在稳定性依赖于pH值的情况下。缓冲液最好以约50mM至约250mM的浓度范围存在。适用于本申请的缓冲液包括有机酸和无机酸及其盐。例如，柠檬酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、草酸盐、乳酸盐、醋酸盐。此外，缓冲液可包括组氨酸和三甲胺盐，如Tris。
添加防腐剂以阻止微生物生长，并且通常在0.2％-1.0％(w/v)范围内存在。例如，添加防腐剂可促进多次使用(多剂量)制剂的生产。适用于本申请的防腐剂包括十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲铵；苯扎氯铵(例如，氯化物、溴化物、碘化物)、苄索氯铵；硫柳汞、苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇、3-戊醇和间甲酚。
张力剂，有时称为“稳定剂”，用于调节或维持组合物中液体的张力。当与大的带电生物分子(如蛋白质)一起使用时，它们通常被称为“稳定剂”，因为它们可以与氨基酸侧链的带电基团相互作用，从而降低分子间和分子内相互作用的可能性。考虑到其它成分的相对含量，张力剂可以以0.1％到25％(按重量计)之间的任何量存在，优选为1％到5％。优选的张力剂包括多元糖醇，优选为三元或高糖醇，如甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇。
其它赋形剂包括以下一种或多种制剂：(1)填充剂、(2)溶解度增强剂、(3)稳定剂和(4)防止变性或粘附在容器壁上的制剂。此类赋形剂包括：多元糖醇(如上所述)；氨基酸，如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌醇、肌醇、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环己醇(如肌醇)、聚乙二醇；含硫还原剂，如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量蛋白质，如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其它免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；单糖(例如，木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖)；双糖(例如，乳糖、麦芽糖、蔗糖)；三糖，如棉子糖；和多糖，如糊精或葡聚糖。
非离子表面活性剂或洗涤剂(也称为“润湿剂”)的存在有助于溶解蛋白质，并保护蛋白质免于搅动引起的聚集，这也允许制剂暴露于剪切表面应力下，而不会导致活性蛋白变性。非离子表面活性剂的存在范围为0.05mg/ml至1.0mg/ml，优选为0.07mg/ml至0.2mg/ml。
合适的非离子表面活性剂包括聚山梨酯(20、40、60、65、80等)、聚草氨酸酯(184、188等)、多元醇、/>聚氧乙烯山梨醇酐单醚(/>-20、/>-80等)、月桂糖醇400、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、单硬脂酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。可使用的阴离子洗涤剂包括十二烷基硫酸钠、磺基琥珀酸二辛酯钠和磺酸二辛酯钠。阳离子洗涤剂包括苯扎氯铵或苄索氯铵。
为了使药物组合物可用于体内给药，它们必须是无菌的。可通过无菌滤膜过滤使药物组合物无菌。所述药物组合物通常放置在具有无菌接入口的容器中，例如，具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉注射溶液袋或小瓶。
可制备缓释制剂。缓释制剂的合适示例包括含有拮抗剂的固体疏水聚合物的半渗透基质，其基质以成形制品的形式，例如，薄膜或微胶囊。缓释基质的示例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯基醇))、聚乳酸(U.S.Pat.No.3,773,919)，L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯共聚物，不可降解乙烯-醋酸乙烯酯，可降解乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的注射微球)和聚-D-(-)-3-羟丁酸。
根据所治疗的特定适应症的需要，本文所述的药物组合物还可以包含不止一种活性化合物，优选为具有互补活性，不会对彼此产生不利影响的化合物。此类分子以适当的数量组合在一起以达到预期目的。
活性成分也可以被包裹在例如，通过凝胶技术或界面聚合制备的微胶囊中，例如，胶体给药系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗乳液中的羟甲基纤维素微胶囊或明胶微胶囊和聚甲基丙烯酸甲酯微胶囊。Remington'sPharmaceutical Sciences公开了这些技术。
在一些实施例中，药物组合物装在一次性使用的小瓶中，如一次性密封小瓶。在一些实施例中，药物组合物装在可多次使用的小瓶中。在一些实施例中，药物组合物散装在容器中。在一些实施例中，药物组合物是冷冻保存的。
VI.疾病的治疗方法
本文所述的长效NGF多肽及其组合物(例如，药物组合物)可用于多种用途，例如诊断、分子检测和治疗。在一些实施例中，涉及了一种治疗个体(例如，人类)疾病(例如，NGF相关疾病，如神经系统疾病)的方法，包括向个体施用有效剂量的本文所述任何长效NGF多肽或其药物组合物。本文所用的术语“NGF相关疾病”是指因NGF受体信号传导受损引起或与之相关的任何疾病或紊乱(如由于NGF数量不足和/或结合亲和力降低)，或需要NGF生物活性进行治疗的疾病或紊乱(如治疗时需要神经元生长、维持、增殖和/或存活的伤害/损伤)。在一些实施例中，长效NGF多肽(或其药物组合物)通过静脉注射、肌肉注射或皮下注射给药。
因此，在一些实施例中，涉及一种治疗个体(例如，人类)疾病(例如，NGF相关疾病，如神经系统疾病(例如，糖尿病神经性病变、阿尔茨海默症或神经营养性角膜炎)或非神经系统疾病(例如，卵巢早衰或生精障碍))的方法，包含向个体施用有效剂量的长效NGF多肽(或其药物组合物)，所述长效NGF多肽从N端到C端包含NGF部分和Fc部分，其中NGF部分包含(或基本上由......组成、或由......组成)SEQ ID NOs:1-4中的任一氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs:1-3中的任一个)，并且其中所述Fc部分来自IgG1 Fc或IgG4 Fc。在一些实施例中，涉及一种治疗个体(例如，人类)疾病(例如，NGF相关疾病，例如神经系统疾病(例如，糖尿病神经性病变、阿尔茨海默症或神经营养性角膜炎)或非神经系统疾病(例如，卵巢早衰或生精障碍))的方法，包含向个体施用有效剂量的长效NGF多肽(或其药物组合物)，所述NGF多肽(或药物组合物)包含(或基本上由......组成、或由......组成)SEQ ID NOs:61-67中的任一氨基酸序列。在一些实施例中，长效NGF多肽(或其药物组合物)通过静脉注射、肌肉注射或皮下注射给药。
本文所述方法适用于治疗神经系统疾病(neurological disease)和非神经系统疾病(non-neurological disease)。
神经系统疾病包括神经系统疾病(nervous system disease)。神经系统疾病是指与中枢和/或外周神经系统的神经元变性或损伤相关的疾病。神经系统疾病的具体示例包括但不限于阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、中风、肌萎缩侧索硬化(ALS)、面神经炎、颅脑或脊髓损伤、急性脑血管病、脑萎缩、外周神经病变和其它以神经元坏死或缺失为特征的疾病，无论是中枢神经元、外周神经元还是运动神经元，除了由外伤、烧伤、肾功能衰竭、损伤或化学品/药物引起的神经损伤，如由化学品或药物引起的急性脑血管中枢神经损伤。神经系统疾病还包括与某些疾病相关的外周神经病变，如与糖尿病、艾滋病或化疗相关的神经病变。在一些实施例中，神经系统疾病选自多发性梗死性痴呆、血管性痴呆、由酒精中毒引起的器质性脑疾病引起的认知障碍、阿尔茨海默病、帕金森病、癫痫、多发性硬化症、亨廷顿舞蹈病、唐氏综合征、神经性耳聋、梅尼埃病、中风、ALS、贝尔氏麻痹、涉及脊髓肌萎缩的疾病、涉及瘫痪的疾病、外周神经病变、创伤所致神经损伤、烧伤所致神经损伤、肾功能障碍所致神经损伤、损伤所致神经损伤、化疗毒副作用所致神经损伤、手术导致的神经损伤、缺血导致的神经损伤、感染导致的神经损伤、代谢疾病导致的神经损伤以及营养缺乏导致的神经损伤。在一些实施例中，神经系统疾病是从糖尿病外周神经病变、毒素诱导外周神经病变、化疗诱导外周神经病变、HIV相关外周神经病变和影响运动神经元的外周神经病变组成的组中选择的外周神经病变。在一些实施例中，神经系统疾病选自新生儿缺氧缺血性脑病、脑瘫、重症肌病、神经性耳聋、喉返神经损伤、创伤性脑损伤、牙神经损伤、脑卒中、唐氏综合征、ALS，多发性硬化、脊髓肌萎缩、弥漫性脑损伤、胸腺发育不良、视神经挫伤、滤泡发育不良、脊髓损伤、青光眼、神经营养性角膜炎、视神经损伤、视神经脊髓炎、视网膜相关疾病、尿失禁、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、痴呆、，高血压脑出血神经功能障碍、脑小血管疾病、急性缺血性中风、角膜内皮营养不良、糖尿病足溃疡、神经源性皮肤溃疡、压疮、神经营养性角膜溃疡、糖尿病角膜溃疡和黄斑裂孔。
非神经系统疾病包括脾脏萎缩、脾挫伤、卵巢储备减少、卵巢早衰(POF)、卵巢过度刺激综合征、卵巢残余综合征、卵巢卵泡发育不良、生精障碍(例如，少精子症(oligozoospermia或oligospermia)、弱精子症、少弱精子症、无精子症、畸形精子症、少弱畸精子症(oligoasthenoteratozoospermia，OAT综合征))、缺血性溃疡、应激性溃疡、类风湿性溃疡、肝纤维化、角膜溃疡、烧伤、口腔溃疡和腿部静脉溃疡。
在一些实施例中，治疗疾病(例如，NGF相关疾病，如神经系统疾病(例如，糖尿病神经性病变、阿尔茨海默症或神经营养性角膜炎)或非神经系统疾病(例如，卵巢早衰或生精障碍))的方法具有以下一种或多种生物活性：(i)支持神经元存活；(ii)促进神经突生长；(iii)增强神经化学分化；(iv)促进胰腺β细胞增殖；(v)诱导先天性和/或获得性免疫；(vi)修复受损的神经细胞(例如，角膜神经)和/或防止损伤(例如，在神经营养性角膜炎中)；(vii)促进卵泡细胞的增殖和/或雌激素分泌；(viii)促进伤口愈合(例如，在糖尿病神经性病变中)；(ix)改善患有神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默病)的受试者的空间认知、记忆和/或学习能力；(x)治疗和/或预防神经退行性病变；(xi)治疗睾丸生精小管萎缩、生精小管生精障碍和/或附睾管细胞碎片；(xii)挽救精子数量和/或活力的降低，或增加精子数量和/或活力(例如，在生精障碍中)；(xiii)预防/逆转卵泡数量和/或功能的降低，或提高卵泡数量和/或功能(例如，在卵巢早衰中)；和/或(xiv)延长患者生存期。在一些实施例中，由本文所述的长效NGF多肽或药物组合物介导的支持神经元存活的方法可实现至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高的神经元存活率。在一些实施例中，由本文所述的长效NGF多肽或药物组合物介导的促进神经突生长的方法可促进至少2倍(包括例如，至少为3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50倍或更多倍)的神经突生长。在一些实施例中，由本文所述的长效NGF多肽或药物组合物介导的增强神经化学分化的方法可增强至少2倍(包括例如，至少为3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50倍或更多倍)的神经化学分化。在一些实施例中，由本文所述的长效NGF多肽或药物组合物介导的促进胰腺β细胞增殖的方法可促进至少2倍(包括例如，至少为3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50倍或更多倍)的胰腺β细胞增殖。在一些实施例中，由本文所述的长效NGF多肽或药物组合物介导的诱导排卵的方法可增强至少2倍(包括例如，至少为3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50倍或更多倍)的排卵。在一些实施例中，由本文所述的长效NGF多肽或药物组合物介导的诱导先天性和/或获得性免疫的方法可诱导至少1.1倍(包括例如，至少1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50倍或更多倍)的先天性和/或获得性免疫。在一些实施例中，由本文所述的长效NGF多肽或药物组合物介导的修复和/或预防神经元损伤的方法可修复和/或预防至少5％(包括例如，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多)的神经元损伤或具有至少1.1倍(包括例如，至少1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50倍或更多倍)的修复和/或预防效果。在一些实施例中，由本文所述的长效NGF多肽或药物组合物介导的促进卵巢颗粒细胞增殖和/或雌激素分泌的方法可促进至少1.1倍(包括例如，至少1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50倍或更多倍)的卵巢颗粒细胞增殖和/或雌激素分泌。在一些实施例中，由本文所述的长效NGF多肽或药物组合物介导的促进伤口愈合的方法可促进至少1.1倍(包括例如，至少1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50倍或更多倍)的伤口愈合。在一些实施例中，由本文所述的长效NGF多肽或药物组合物介导的改善患有神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默症)患者的空间认知、记忆和/或学习能力的方法可改善至少1.1倍(包括例如，至少1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50倍或更多倍)的空间认知、记忆和/或学习能力。在一些实施例中，由本文所述的长效NGF多肽或药物组合物介导的治疗和/或预防神经退行性病变的方法可治疗和/或预防至少5％(包括例如，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多)的神经退行性病变。在一些实施例中，由本文所述的长效NGF多肽或药物组合物介导的治疗睾丸生精小管萎缩、生精小管生精障碍和/或附睾管细胞碎片的方法可治疗至少5％(包括例如，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多)的睾丸生精小管萎缩、生精小管生精障碍和/或附睾管细胞碎片。在一些实施例中，由本文所述的长效NGF多肽或药物组合物介导的挽救精子数量和/或活力的降低的方法可挽救至少5％(包括例如，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多)的精子数量和/或活力的降低。在一些实施例中，由本文所述的长效NGF多肽或药物组合物介导的增加精子数量和/或活力的方法可提高至少5％(包括例如，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％或更多)的精子数量和/或活力。在一些实施例中，由本文所述的长效NGF多肽或药物组合物介导的挽救卵泡数量和/或功能的降低的方法可挽救至少5％(包括例如，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多)的卵泡数量和/或功能的降低。在一些实施例中，由本文所述的长效NGF多肽或药物组合物介导的提高卵泡数量和/或功能的方法可提高至少5％(包括例如，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％或更多)的卵泡数量和/或功能。在一些实施例中，由本文所述长效NGF多肽或药物组合物介导的延长个体(例如，人类)生存期的方法可将个体的生存期延长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24个月或2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更长时间中的任何一个。
本文所述的长效NGF多肽或其药物组合物的给药方式可以以任何方便的方式进行，包括通过注射或输液。给药途径依照已知和公认的方法，如通过单次或多次推注或以适当方式长时间输液。长效NGF多肽或其药物组合物可经口、皮下、静脉、脑内、鼻内、经皮、腹腔内、肌肉内、肺内、阴道、直肠、眼内、局部、经动脉、皮内、节内、空腔内、或髓内、鞘内、脑室内、脑内、脊髓内、鞘内、病灶内或眼内给药。在一些实施例中，全身施用长效NGF多肽或其药物组合物。在一些实施例中，通过输注(如静脉输注)向个体施用长效NGF多肽或其药物组合物。免疫治疗所用的输注技术在本领域已知(参见Rosenberg et al.,New Eng.J.ofMed.319:1676(1988))。在一些实施例中，通过皮内或皮下(即在皮肤下)注射向个体施用长效NGF多肽或其药物组合物。对于皮下注射，可使用注射器注射长效NGF多肽或其药物组合物。然而，还有其它用于长效NGF多肽或其药物组合物给药的装置，如注射装置；注射笔；自动注射器装置、无针装置；和皮下贴片给药系统。在一些实施例中，通过静脉注射施用长效NGF多肽或其药物组合物。在一些实施例中，将长效NGF多肽或其药物组合物直接注射到大脑或脊柱中。在一些实施例中，将长效NGF多肽或其药物组合物局部施用于损伤或伤害部位，如直接施用于伤口组织。在一些实施例中，通过缓释或延长释放技术施用长效NGF多肽或其药物组合物。
本发明的药物组合物的剂量和所需药物浓度可根据特定用途而变化。确定合适的给药剂量或给药途径完全属于普通技术人员的技术范围。动物实验为确定人类治疗的有效剂量提供了可靠的指导。可以依据Mordenti,J.和Chappell,W.“The Use of InterspeciesScaling in Toxicokinetics,”In Toxicokinetics and New Drug Development,Yacobiet al.,Eds,Pergamon Press,New York 1989,pp.42-46中的原则进行有效剂量的种间类推。
当使用长效NGF多肽或其药物组合物在体内给药时，根据给药途径和哺乳动物类型，正常剂量可在0.01μg/kg至10mg/kg哺乳动物体重之间变化。在本申请的范围内，不同的制剂将对不同的治疗和不同的疾病有效，并且旨在治疗特定器官或组织的给药方式可能与针对另一器官或组织的方式不同。此外，剂量可通过一次或多次单独给药或持续输注给药。对于几天或更长时间的重复给药，根据病情，治疗持续到疾病症状达到预期的抑制程度为止。然而，其它剂量方案可能有用。这种治疗的进展很容易通过常规技术和分析进行监测。在一些实施例中，以0.01μg/kg至10mg/kg的剂量施用长效NGF多肽或其药物组合物，如0.01μg/kg至1μg/kg、1μg/kg至100μg/kg、100μg/kg至500μg/kg、500μg/kg至1mg/kg、1mg/kg至10mg/kg或0.01μg/kg至1mg/kg中的任何一种。在一些实施例中，以每个个体(例如，人类)0.01μg至1000μg的剂量施用长效NGF多肽或其药物组合物，如每个个体0.01μg至1μg、1μg至500μg、500μg至1000μg、1μg至300μg、或100μg至1000μg中的任何一种。
在一些实施例中，一次性施用长效NGF多肽或其药物组合物(例如，团注法)。在一些实施例中，多次施用长效NGF多肽或其药物组合物(如2、3、4、5、6或更多次)。如果多次施用，则可通过相同或不同的途径进行，并可在相同部位或其它部位进行。长效NGF多肽或其药物组合物可每日施用一次至每年施用一次。两次给药之间的间隔可以是24小时到一年中的任意时间。间隔也可能是不规则的(例如，随肿瘤进展)。在一些实施例中，给药计划中无中断。特定患者的最佳剂量和治疗方案可以由医学领域的技术人员通过监测患者的疾病体征并相应地进行调整以确定。在一些实施例中，本文所述的长效NGF多肽或其药物组合物每天施用一次(每日施用)、每2天一次、每3天一次、每4天一次、每5天一次、每6天一次、每周一次、每10天一次、每2周一次、每3周一次、每4周一次、每月一次，每2个月一次、每3个月一次、每4个月一次、每5个月一次、每6个月一次、每7个月一次、每8个月一次、每9个月一次或每年一次。在一些实施例中，长效NGF多肽或其药物组合物每3天施用一次。在一些实施例中，长效NGF多肽或其药物组合物每周施用一次。在一些实施例中，长效NGF多肽或其药物组合物每月施用一次。在一些实施例中，长效NGF多肽或其药物组合物每天滴注一次。在一些实施例中，长效NGF多肽或其药物组合物每天滴注3次。在一些实施例中，长效NGF多肽或其药物组合物每天滴注5次。
在一些实施例中，长效NGF多肽或其药物组合物是分剂量给药的，例如2、3、4、5或更多剂量中的任一个。在一些实施例中，分剂量给药超过1周、1个月、2个月、3个月或更长时间。在一些实施例中，剂量被等分。在一些实施例中，分剂量为总剂量的20％、30％和50％。在一些实施例中，连续的分剂量给药之间的间隔为1天、2天、3天、1周、2周、3周、1个月、3个月、6个月或更长。对于几天或更长时间的重复给药，根据病情，治疗持续到疾病症状出现预期的抑制程度为止。然而，其它剂量方案可能有用。这种治疗的进展很容易通过常规技术和分析进行监测。
VII.制品及试剂盒
进一步涉及包含本文所述任何长效NGF多肽的试剂盒、单位剂量和制品。在一些实施例中，涉及包含本文所述的任一种药物组合物的试剂盒，并且优选地提供其使用说明，如用于治疗本文所述的疾病(例如，神经系统疾病)。
本发明的试剂盒包括一个或多个包含本文所述的长效NGF多肽的容器，例如，用于治疗疾病。例如，包含描述施用长效NGF多肽以治疗疾病(如神经系统疾病)的说明书。试剂盒可能进一步包含基于识别个体是否患有疾病和疾病阶段来选择适合治疗的个体(例如，人类)的描述。与长效NGF多肽的使用相关的说明通常包括关于预期治疗的剂量、给药计划和给药途径的信息。容器可以是单位剂量、散装包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。本发明的试剂盒中提供的说明通常是标签或药品说明书上的书面说明(例如，试剂盒中包括的纸张)，但机器可读说明(例如，存储在磁盘或光盘上的说明)也是可以接受的。本申请的试剂盒采用合适的包装。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、罐子、软包装(例如，密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。还考虑与特定装置结合使用的包装，如输液装置如微型泵。试剂盒可具有无菌接入端口(例如，容器可为静脉注射溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。该组合物中的至少一种活性剂是如本文所述的长效NGF多肽。容器可进一步包含第二种医药活性剂。试剂盒可选择性地提供附加组份，如缓冲液和解释信息。一般来说，试剂盒包含一个容器和容器上或与容器相关的标签或药品说明书。
因此，本申请还涉及制品，包括小瓶(如密封小瓶)、瓶、罐、软包装等。该制品包含容器和容器上或与容器相关的标签或药品说明书。合适的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器等。容器可以由多种材料制成，如玻璃或塑料。一般来说，容器容纳的组合物可有效治疗本文所述疾病或紊乱(如神经系统疾病)，并且可具有无菌接入端口(例如，容器可为静脉注射溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。标签或药品说明书表明该组合物用于治疗个体的特定病症。标签或药品说明书进一步包含向个体施用组合物的说明。标签可能会注明重构和/或使用的说明。容纳药物组合物的容器可以是多次使用的小瓶，允许重构制剂重复施用(例如，2-6次施用)。药品说明书是指通常包含在治疗产品商业包装中的说明书，其中包含有关使用此类治疗产品的适应症、用法、剂量、给药、禁忌症和/或警告信息。此外，制品可能进一步包含第二容器，包含药学可接受的缓冲液，如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格溶液和葡萄糖溶液。从商业和用户角度来看，可能进一步包括其它需要的材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
试剂盒或制品包括多个单位剂量的药物组合物和使用说明书，包装数量足以在药房中储存和使用，例如，医院药房和复方药房。
实施例
以下实施例旨在纯粹作为本发明的示例，因此不应被视为以任何方式限制本发明。以下实施例和详述是以说明的方式提供的，而非限制的方式。
实施例1：制备NGF多肽
构建质粒
构建质粒以preproNGF-Fc融合蛋白2-118-L3Fc10-M1-5(SEQ ID NO:34)为例。其它preproNGF-Fc融合蛋白和对照prepro-mNGF118(SEQ ID NO:47)使用相同方法进行质粒构建，其中，对照prepro-mNGF118为带有F12E突变并在β-NGF部分C端截短两个氨基酸(Arg-Ala)的preproNGF。FD-G4Fc(见CN105273087A)和WM-G24Fc(见CN106008722A)构建体作为对照。NGF-1-15M7(rhNGF-Fc1)、NGF-L3Fc10M7-5(rhNGF-Li-Fc1)、2-1-15M7(rhNGF-(F12E)-Fc1)和NGF-4-12PAA(rhNGF-Fc4)的构建如WO2017157325所述。不同NGF多肽的结构见表1，Fc部分的序列比对见图1A-1F。
表1 NGF多肽结构
合成编码各种preproNGF-Fc融合蛋白(例如，“2-118-L3Fc10-M1-5”)或prepro-mNGF118对照的核酸并将其克隆到pSC-T载体中(例如，“pSC-2-118-L3Fc10-M1-5”)(由上海杰瑞生物工程有限公司北京分公司合成和克隆)。分别用带有HindIII和XhoI限制性酶切位点的PCR引物扩增编码各种preproNGF-Fc融合蛋白或prepro-mNGF118对照的核酸，然后将PCR产物亚克隆到内源性真核表达载体pTT5中(例如，“pTT5-2-118-L3Fc10-M1-5”)。
重组蛋白的表达
用携带编码各种preproNGF-Fc融合蛋白(例如，pTT5-2-118-L3Fc10-M1-5)或prepro-mNGF118对照的核酸的真核表达载体pTT5转染293F细胞，37℃、8％CO2、120rpm培养5天。收集包含表达蛋白的上清。
重组蛋白的纯化
表达的NGF-Fc融合蛋白首先通过蛋白A亲和纯化进行粗纯化，然后，基于不同的疏水性，使用HiTrapTM Butyl HP柱(GE Healthcare)进一步将其从宿主蛋白中分离。然后使用Superdex 200凝胶过滤柱(GE Life Sciences)去除残余聚集物，以获得纯化的成熟NGF-Fc融合蛋白。成熟的mNGF118对照首先通过HiTrapTM Butyl HP柱(GE Healthcare)纯化，然后通过Superdex 200凝胶过滤柱(GE Life Sciences)纯化。经SDS-PAGE鉴定，这些蛋白的纯度在90％以上。
实施例2：成熟NGF-Fc融合蛋白的热稳定性研究
用荧光蛋白分析仪UNcle(Uncheed Labs)测量样品加热过程中在266nm/473nm下荧光吸光度和光散射的变化，以分别计算样品的熔解温度(Tm)和聚集起始温度(Tagg)。初始温度设置为20℃，结束温度设置为95℃，加热速率为0.3℃/min。每个样品重复测量3次。结果汇总在表2中。
表2成熟NGF-Fc融合蛋白的平均熔解温度(Tm)和聚集起始温度(Tagg)
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熔解温度(Tm)
如表2所示，在所有包含IgG4衍生Fc片段的成熟NGF-Fc融合蛋白中(FD-G4Fc、WM-G24Fc、NGF-4-12PAA和2-118-L3G4-BM)，甚至在所有测试的成熟NGF-Fc融合蛋白中，2-118-L3G4-BM显示出最高的熔解温度(Tm)，即最佳的热稳定性。
在所有包含IgG1衍生Fc片段的成熟NGF-Fc融合蛋白中，2-118-L3Fc10-M1-5显示出较低的Tm(即，较差的热稳定性)，而其它蛋白则显示出相似的Tm。
聚集起始温度(Tagg)
如表2所示，与包含IgG4衍生Fc片段的成熟NGF-Fc融合蛋白相比，包含IgG1衍生Fc片段的成熟NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3Fc10-M1-5除外)显示出更高的Tagg。这表明包含IgG1衍生Fc片段的成熟NGF-Fc融合蛋白在加热过程中更不易聚集。
在所有包含IgG4衍生Fc片段的成熟NGF-Fc融合蛋白中，2-118-L3G4-BM表现出最高的Tagg，表明其在加热过程中的抗聚集性优于其它IgG4衍生Fc融合构建体。
在所有包含IgG1衍生Fc片段的成熟NGF-Fc融合蛋白中，2-118-L3Fc10-M1-5表现出最低的Tagg(加热过程中抗聚集性最差)，NGF-1-15M7和2-1-15M7表现出相对低的Tagg，而其余IgG1衍生Fc融合构建体显示出高且相似的Tagg。
实施例3：成熟NGF-Fc融合蛋白的加速稳定性试验
成熟NGF-Fc融合蛋白用PBS稀释至终浓度为2mg/ml，并在40℃下孵育。在孵育期的第0天(图中为“0小时”)、第3天、第7天、第9天和第14天分别采样，并储存在-80℃。通过尺寸排阻色谱法(SEC)和十二烷基硫酸钠毛细管电泳(CE-SDS)检测样品的降解和聚集情况。
尺寸排阻色谱法(SEC)检测方法
当分子通过填充在柱中的树脂时，SEC通过分子的不同尺寸将其分离。蛋白质样品在4℃下、10000g离心5分钟。用PBS重悬沉淀。将80-100μl样品转移到384孔板上，在ACQUITY/>H-Class Bio Tunable UV(TUV)检测仪上进行检测，进样体积为20μl，波长为280nm，流速为0.25ml/min，总运行时间为17分钟。流动相缓冲液含有100mM PB(80mM Na2HPO4，20mM NaH2PO4)，300mM NaCl，10％乙腈，pH 7.2。
如表3和图3A-3D所示，在所有包含IgG4衍生Fc片段的成熟NGF-Fc融合蛋白中，2-118-L3G4-BM和FD-G4Fc在聚集体增加和片段生成方面表现出优于WM-G24Fc和NGF-4-12PAA的稳定性。在加速应力过程中，NGF-4-12PAA显示出非常明显的片段化，片段百分比达到49.59％(图3A)，而2-118-L3G4-BM和FD-G4Fc的片段百分比低于2.1％。WM-G24Fc不仅聚集体显著增加(聚集体百分比达到49.15％)，而且在加速应力过程中，也出现了明显的片段化(图3C)。2-118-L3G4-BM和FD-G4Fc的单体百分比均在85％以上，而WM-G24Fc和NGF-4-12PAA的单体百分比随时间推移显著降低。与2-118-L3G4-BM相比，FD-G4Fc在加速应力过程中显示出更多的聚集体形成和片段化，这表明与FD-G4Fc相比，2-118-L3G4-BM具有更好的抗片段化和抗聚集活性。
如表3和图3E-3M所示，在所有包含IgG1衍生Fc片段的成熟NGF-Fc融合蛋白中，2-118-L3Fc10-M3-5、2-118-L3Fc10-M5-5、2-118-L3Fc10-M7-5和NGF-118-L3Fc10-M3-5在加速应力过程中比其它IgG1衍生Fc融合蛋白显示出更佳的稳定性，检测不到的片段形成(0％)和更少的聚集体增量。2-118-L3Fc10-M1-5也表现出比例如NGF-1-15M7、NGF-L3Fc10M7-5和2-1-15M7等IgG1衍生Fc融合蛋白更好或与之相当的稳定性。
表3 SEC测量成熟NGF-Fc融合蛋白在40℃加速稳定性试验中各组分百分比和聚集体增量百分比(第14天样本)
十二烷基硫酸钠毛细管电泳(CE-SDS)检测方法
在毛细管电泳中，根据电泳迁移率在毛细管中分离样品，电泳迁移率随分子的电荷和大小变化。首先，在离心管中混合40μl 1×样品缓冲液和10μl蛋白质样品，以获得50μl蛋白质终浓度为0.4μg/μl的混合液。向混合液中加入1μl重构的25×内标(InternalStandard)，然后加入2.5μl 250mM碘乙酰胺。将整个混合液涡旋并在70℃下培养10分钟，冷却后，充分混合并离心。将50μl处理好的样品上清液转移到96孔板中。将96孔板在1000g下离心10分钟，然后将其置于Maurice系统(ProteinSimple)中根据标准实验方法进行CE-SDS检测。
如表4和图4A-4D所示，在所有包含IgG4衍生Fc片段的成熟NGF-Fc融合蛋白中，在加速应力期间，NGF-4-12PAA和WM-G24Fc显示出非常明显的片段化；2-118-L3G4-BM的片段化程度最低。这与SEC的结果一致。在FD-G4Fc(图4B)的主峰右侧出现聚集体峰，但2-118-L3G4-BM(图4D)未出现聚集体峰。综上所述，与其它IgG4衍生Fc融合蛋白相比，2-118-L3G4-BM在加速应力期间具有更佳的稳定性，这与SEC结果一致。
如表4和图4E-4M所示，在所有包含IgG1衍生Fc片段的成熟NGF-Fc融合蛋白中，2-118-L3Fc10M7-5、NGF-118-L3Fc10-M3-5和2-118-L3Fc10-M3-5，在加速应力期间稳定性最佳，未出现明显的片段峰(见图4I、4J和4M)，第14天样品的片段增量为0％。2-118-L3Fc10-M5-5片段增量较少(第14天，片段增量为5.8％)，也具有较好的稳定性。相比之下，其它包含IgG1衍生Fc片段的NGF-Fc融合蛋白(例如，NGF-L3Fc10M7-5)更容易形成片段。
表4 CE-SDS测量成熟NGF-Fc融合蛋白在40℃加速稳定性试验中片段百分比和片段增量百分比(第14天样本)
根据SEC和CE-SDS结果总结：1)在所有包含IgG4衍生Fc片段的成熟NGF-Fc融合蛋白中，2-118-L3G4-BM显示出比FD-G4Fc更佳的加速稳定性，并且显著优于WM-G24Fc和NGF-4-12PAA的加速稳定性；2)在所有包含IgG1衍生Fc片段的成熟NGF-Fc融合蛋白中，2-118-L3Fc10-M3-5、NGF-118-L3Fc10-M3-5和2-118-L3Fc10M7-5与所有其它构建体相比，显示出最佳的加速稳定性，随后是2-118-L3Fc10M5-5；3)相对而言，与包含IgG4衍生Fc片段的成熟NGF-Fc融合蛋白相比，包含IgG1衍生Fc片段的成熟NGF-Fc融合蛋白，在加速应力条件下，显示出更好的抗聚集特性。
实施例4：评估NGF-Fc融合蛋白生物活性的TF-1细胞增殖试验
利用TF-1细胞增殖试验测试不同NGF-Fc融合蛋白的生物活性。
TF-1细胞是一种因子依赖型人类红细胞白血病细胞系。将TF-1细胞重悬于基本培养基中(RPMI 1640培养基+10％FBS)，以获得含有5.0×104个细胞/ml的悬浮液，备用。制备 鼠NGF(标准对照)标准品溶液，制备各种NGF-Fc融合蛋白的测试溶液以及mNGF118(突变体β-NGF 118aa)和rhNGF(重组人类野生型β-NGF 120个氨基酸，SEQ ID NO:4，如实施例1中所述制备和纯化)对照溶液，使最终的蛋白在预先标记的96孔板中为200U/ml×100μl/孔。然后，将100μl 5.0×104个细胞/ml的TF-1细胞悬浮液加入到含有标准对照(/>鼠NGF)、待测试NGF-Fc融合蛋白或对照溶液的96孔板的每个孔中，在37℃、5％CO2的潮湿培养箱中培养72小时。将CellTiter/>AQueous One Solution CellProliferation Assay(Promega,Cat#G3581)中的20μl分析溶液加入细胞悬浮液的每个孔中，在37℃、5％CO2下培养3小时。使用分光光度计，在490nm和650nm下测量孔板的吸光度。记录数据并与标准NGF对照(/>鼠NGF)进行归一化处理。
如图5A，在所有包含IgG1衍生Fc片段的成熟NGF-Fc融合蛋白(甚至在所有NGF构建体中，包括rhNGF、mNGF118和鼠NGF)，2-118-L3Fc10-M3-5表现出最高的生物活性；在加速稳定性试验中(见实施例3)，2-118-L3Fc10-M3-5在三种最稳定的构建体中(2-118-L3Fc10-M3-5、NGF-118-L3Fc10-M3-5和2-118-L3Fc10M7-5)，也具有最高的生物活性。如图5B所示，所有包含IgG4衍生Fc片段的成熟NGF-Fc融合蛋白，均具有促进TF-1细胞增殖的生物活性，并且2-118-L3G4-BM表现出与标准对照/>鼠NGF相当的生物活性。
实施例5：多种NGF-Fc融合蛋白在大鼠体内的生物活性试验
颈上神经节(SCG)是由大约30000个神经元组成的组织，是对NGF最敏感的组织之一，尤其是在产前和产后发育期间。在TF-1细胞增殖试验中(见实施例4)，包含IgG1-或IgG4-衍生Fc片段的某些NGF-Fc融合蛋白具有非常高的生物活性。将各种NGF-Fc融合蛋白注射到大鼠SCG中，并在注射后不同时间点测量SCG大小，以评估NGF-Fc融合蛋白在体内促进SCG生长的活性。
新生Sprague-Dawley(SD)大鼠颈部皮下注射各种NGF-Fc融合蛋白或NGF对照( 鼠NGF或突变体NGF118)，然后处死大鼠，分离SCG。PBS注射液作为阴性对照。如图6A所示，NGF对照蛋白(/>鼠NGF或突变体NGF118)或PBS在第0天、第1天、第2天和第3天每天注射一次，然后在第4天获得SCG。2-118-L3Fc10-M3-5或2-118-L3G4-BM在第0天以相同剂量单次注射，然后在第4天获得SCG。简而言之，断头后，将大鼠头部固定在手术台上，用棉球吸干血液，首先定位气管和枕骨大孔，然后定位气管斜后侧的颈动脉鞘组织，用微型镊子将其取出，放入含有PBS的培养皿中，然后在解剖显微镜下分离SCG。用纸巾去除分离的SCG表面的多余液体，然后将SCG置于干净的表面皿上测量重量。SCG的形态如图6B所示。记录的数据采用Student t检验进行分析。**表示与PBS处理组相比具有显著差异；n.s.表示与PBS处理组相比“无显著差异”。如图6C所示，在2nM给药剂量下，突变体β-NGF 118aa(mNGF118)、鼠NGF和2-118-L3Fc10-M3-5与PBS阴性对照组相比，对SCG的生长没有显著的促进作用，无统计学上的显著差异。而2-118-L3G4-BM与PBS对照组相比，显著促进SCG生长(**p<0.01)。在5nM给药剂量下，无论NGF对照组(/>鼠NGF或mNGF118)或NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)，与PBS处理组相比，均显著促进体内SCG生长(**p<0.01)，并且4种测试的NGF蛋白之间在促进SCG生长的活性方面没有显著差异(n.s.表示p>0.05)(图6D)。因此，即使在剂量为2nM时，与/>鼠NGF或突变体β-NGF 118aa(mNGF118)相比，单次皮下注射2-118-L3G4-BM在促进体内SCG生长方面也能表现出优异的活性。而在较高剂量(5nM)时，用2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5单次处理，在促进SCG生长方面表现出相似的活性。
实施例6：各种NGF多肽在大鼠体内的药代动力学(PK)研究
我们将各种NGF构建体注射到成年大鼠体内，以检测其PK曲线。
24只雄性SD大鼠(6-8周龄，约250g-300g/只)随机分为3组(每组8只)，分别肌肉注射235μg/kg的2-118-L3Fc10-M3-5、2-118-L3G4-BM或mNGF118(无Fc融合的突变体β-NGF118个氨基酸)。在注射前(0小时)或注射后1小时、4小时、8小时、24小时、48小时、72小时、120小时、168小时、216小时和288小时，分别采集眼眶后静脉血150μl。采血后分离血浆，然后用Human NGF Matched ELISA Antibody Pair Set(Sino Biological,SEK11050)检测NGF含量。在Y轴绘制450nm-630nm下标准品的平均ODs值，在X轴绘制标准品的浓度，以生成标准曲线线性方程，要求R2>0.98。然后根据标准曲线线性方程计算不同样本的血浆浓度。使用GraphPad Prism 5.0绘制样品浓度与时间的半对数图，使用Phoenix WinNonlin 6.2进行PK分析，使用GraphPad Prism 5.0绘制半衰期散点图。
如图7A所示，单次肌肉注射后，与无Fc融合的mNGF118对照组相比，NGF-Fc融合蛋白随着时间的推移显示出更高的血浆浓度；单次肌肉注射后，与2-118-L3Fc10-M3-5相比，2-118-L3G4-BM随着时间的推移显示出相似的血浆浓度。如图7B所示，2-118-L3G4-BM的半衰期(55小时)与2-118-L3Fc10-M3-5的半衰期(55小时)几乎相同，两者都比无Fc融合的mNGF118对照组(半衰期1.75小时)长得多(约31倍)。这些结果进一步解释了为什么单剂量2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5在体内促进SCG生长方面显示出与持续注射无Fc融合的NGF对照组(鼠NGF或mNGF118)相似的活性(见图6D)。
WO2017157325的表2详述了wtNGF120(即“rhNGF”，人类野生型β-NGF 120个氨基酸，SEQ ID NO:4)、NGF-1-15M7(rhNGF-Fc1)、NGF-L3Fc10M7-5(rhNGF-Li-Fc1)、2-1-15M7(rhNGF-(F12E)-Fc1)和NGF-4-12PAA(rhNGF-Fc4)的半衰期，并在表5进行了汇总。本实验中测试的mNGF118的半衰期(1.75小时)与WO2017157325中测试的wtNGF120的半衰期(1.8小时)相似。如表5所示，NGF-1-15M7(rhNGF-Fc1)、NGF-L3Fc10M7-5(rhNGF-Li-Fc1)和2-1-15M7(rhNGF-(F12E)-Fc1)构建体在体内的半衰期比无Fc融合的wtNGF120或mNGF118对照组延长了17倍以上；也比NGF-4-12PAA(rhNGF-Fc4)多1.4倍。这里测试的2-118-L3G4-BM(55小时)的半衰期与2-118-L3Fc10-M3-5(55小时)的半衰期几乎相同，都是无Fc融合的wtNGF120或mNGF118对照组的31倍左右，也比所有先前测试的含有IgG1-或IgG4-衍生Fc片段的成熟NGF-Fc融合蛋白长得多。
表5成熟NGF多肽的半衰期
实施例7：NGF-Fc融合蛋白促进糖尿病神经性病变的伤口愈合
糖尿病神经性病变是糖尿病常见的慢性并发症之一，其患者表现为伤口愈合缓慢，并且在局部会出现不同程度的感染、溃疡和炭疽，甚至有截肢的风险。本实施例阐述了对NGF-Fc融合蛋白在糖尿病神经性病变动物模型中的治疗效果的研究(例如，通过对伤口愈合的评估)。
CD-1小鼠从北京维通利华实验动物技术有限公司获得。采用标准方法构建糖尿病动物模型(例如，参见Graiani G.et al.,Nerve growth factor promotes reparativeangiogenesis and inhibits endothelial apoptosis in cutaneous wounds of Type 1diabetic mice.Diabetologia.2004,47(6):1047-54)。糖尿病诱导4周后，麻醉小鼠，通过一次性皮肤打孔设备在肩胛骨间获得左右各一块全层直径为4mm的皮肤伤口。50μg/ml鼠NGF、mNGF118或NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3Fc10-M3-5或2-118-L3G4-BM)在右侧伤口给药，剂量为20μl/次。等体积的PBS注射液在左侧伤口处给药(作为阴性对照)。PBS、鼠NGF或mNGF118在第0天(小鼠背部打孔后)、第1天、第2天和第3天每天给药一次。2-118-L3Fc10-M3-5或2-118-L3G4-BM在第0天以相同剂量单次给药。在打孔后立即测量伤口面积，记为第0天伤口面积，并在第4天和第7天测量伤口面积并计算伤口愈合率。记录的数据采用Student t检验进行分析，使用GraphPad Prism 8.0.1绘制柱状图。
如图8所示，与第4天相比，所有组在第7天的伤口愈合均得到改善；与PBS阴性对照相比，鼠NGF、mNGF118和NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)均显著促进糖尿病伤口愈合(p<0.01)。具体而言，在第4天PBS处理组的伤口平均面积约为鼠NGF、mNGF118或NGF-Fc融合蛋白处理组的1.3倍。上述结果表明，/>鼠NGF、mNGF118或NGF-Fc融合蛋白均可以有效改善糖尿病小鼠伤口愈合缓慢的缺陷。此外，在第7天时，施用NGF-Fc融合蛋白的糖尿病小鼠伤口愈合率高于/>鼠NGF和mNGF118处理组。这表明NGF-Fc融合蛋白具有优于NGF(例如，/>鼠NGF或mNGF118)的体内治疗效果。
实施例8：NGF-Fc融合蛋白对阿尔茨海默症的治疗效果
阿尔茨海默症是以进行性记忆力减退为主要临床表现的中枢神经系统退行性疾病，多发于老年，发病机制复杂。本实施例阐述了NGF-Fc融合蛋白在体内对AD治疗效果的研究(例如，通过对动物行为学变化的评估)。
采用Wistar大鼠，通过标准方法构建AD动物模型(例如，参见Wenk GL,HarringtonCA,Tucker DA,et al.Basal forebrain neurons and memory:a biochemical,histological and behavioural study of differential vulnerability to ibotenateand quisqualate.Behav Neurosci,1992,106:909-923.)。简而言之，对Wistar大鼠立体定位注射鹅膏蕈氨酸(IBO)。注射IBO 2天后，麻醉AD模型大鼠并取仰卧位。150μg/ml的NGF(鼠NGF或mNGF118实验组)或NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)通过鼻腔给药，总剂量为100μl/次。施用相同体积PBS的AD模型大鼠作为阴性对照。NGF或PBS每天给药1次，连续给药7天。NGF-Fc融合蛋白仅在第1天单次给药。在第7天通过露台水迷宫实验评估大鼠的行为学变化。简而言之，采用Morriss水迷宫装置，实验前需训练大鼠爬上露台，实验当天记录大鼠的寻台时间(潜伏期；从入水到爬上露台所需的时间)及撤掉露台后在120s内跨过原露台位置的次数。记录的数据采用Student t检验进行分析。
如表6所示，与阴性对照组相比，鼠NGF、mNGF118或NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)处理的AD模型大鼠的寻台时间明显缩短(*p<0.05)，穿越平台次数明显增多(*p<0.05)。因此，本文所述的NGF和NGF-Fc融合蛋白均可有效提高AD模型大鼠的空间认知、记忆和学习能力。此外，与NGF(/>鼠NGF或mNGF118)处理的大鼠相比，2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5处理的AD模型大鼠似乎具有更短的寻台时间和更高频率的穿越平台次数。这些数据表明NGF-Fc融合蛋白对于AD具有优异的体内治疗效果。
表6露台水迷宫实验数据统计表
实施例9：NGF-Fc融合蛋白对卵巢早衰的治疗效果
卵巢早衰(POF)是指卵巢功能衰竭所致的40岁前自然闭经，常伴随雌激素水平下降、卵泡生成素水平升高及促性腺激素水平升高，其病因和机理较为复杂。本实施例阐述了通过体外人卵巢颗粒样肿瘤细胞系(KGN)增殖试验和KGN雌激素分泌试验以及POF模型大鼠对NGF-Fc融合蛋白治疗POF的治疗效果的研究。
对于KGN增殖试验，在试验前一天向96孔板中每孔加入100ul的KGN悬液(1×104细胞/mL)。试验前，更换不含血清的DMEM培养基。更换培养基后，实验组孔中分别加入鼠NGF、mNGF118或NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)，使其在培养基中的终浓度为10μg/mL，阴性对照组在更换培养基后不做任何处理。每组4个复孔，48h后，每孔加入10uLCCK-8(日本同仁化学研究所，#CK04)以测定活细胞。孵育1h后，测量450nm处的吸光值，记录的数据采用Student t检验进行分析，使用GraphPad Prism 8.0.1绘制柱状图。
如图9A所示，与PBS阴性对照组相比，NGF(鼠NGF或mNGF118)及NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)均明显促进了KGN增殖(p<0.05)。相对而言，与经NGF处理的KGN相比，经NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)处理的KGN表现出略高的增殖率。
对于KGN雌激素分泌试验，在24孔板中接种1×105细胞/孔(细胞的汇合度约为80％)，随后更换无血清培养基。更换培养基后，实验组孔分别加入鼠NGF、mNGF118或NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)，使其在培养基中的终浓度为10μg/ml。阴性对照组在更换培养基后不做任何处理。每组4个复孔，孵育18h后，洗两遍，使用2.2×10-8M的睾酮(北京索莱宝科技有限公司，#IT0110)和0.01IU/ml的绵羊卵泡刺激素(美国NHPP公司，Ovine FSH)处理24h后，取上清稀释1.6倍，使用R&D Systems生产的雌激素测定试剂盒(KGE014)，测量450nm处的吸光值，并计算分泌的雌激素浓度，记录的数据采用Student t检验进行分析，使用GraphPad Prism 8.0.1绘制柱状图。
如图9B所示，与阴性对照组相比，NGF(鼠NGF或mNGF118)及NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)均明显促进了KGN雌激素分泌(p<0.05)。相对而言，与经NGF处理的KGN相比，经NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)处理的KGN表现出略高的雌激素分泌。
去氧乙烯基环己烯(VCD)可选择性破坏雌鼠卵巢内的原始卵泡和初级卵泡，而对次级卵泡和窦卵泡无影响，从而导致雌鼠POF。为进一步研究NGF-Fc融合蛋白在体内对POF的治疗效果，对SD大鼠连续两周腹腔注射VCD以构建POF大鼠模型(例如，参见Muhammad FSet al.,Effects of 4-vinylcyclohexene diepoxide on peripubertal and adultSprague-Dawley rats:ovarian,clinical,and pathologic outcomes[J].Comp Med,2009,59(1):46-59.)。开始建立模型时即进行NGF给药，记为第1天。采用皮下注射的给药方式，NGF(鼠NGF或mNGF118)或NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)实验组的注射剂量为10μg/kg bw，相同体积的无菌生理盐水作为阴性对照。/>鼠NGF、mNGF118或无菌生理盐水隔天给药一次，NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)每周给药一次。42天后，将所有大鼠安乐死，对卵巢组织固定后进行常规石蜡包埋、切片并进行H&E(苏木精和伊红)染色并对各级卵泡计数。记录的数据采用Student t检验进行分析，使用GraphPad Prism 8.0.1绘制柱状图。
如图9C所示，与阴性对照组相比，鼠NGF、mNGF118和NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)均明显提高了初级卵泡的数量(p<0.05)，说明它们在逆转POF引起的初级卵泡数量减少方面具有优异的效果。与阴性对照组相比，/> 鼠NGF、mNGF118或NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)处理的POF大鼠模型也表现出更高的原始卵泡和次级卵泡数量。
实施例10：NGF-Fc融合蛋白对少弱精子症的治疗效果
少弱精子症主要表现为精子数量减少和/或精子活力下降。精子是由睾丸曲细精管内具有增殖能力的生殖细胞经过一系列分裂分化形成的，热应激可影响增殖细胞分裂、分化和精子形成。本实施例阐述了在小鼠生精障碍模型中NGF-Fc融合蛋白对少弱精子症(少精子症和弱精子症)治疗效果的研究。
本实验采用C57BL/6JSHjh小鼠(购自上海吉辉实验动物饲养有限公司)。对于实验组，采用腹股沟皮下注射的给药方式，分别注射20μg/kg bw/次的NGF(鼠NGF或mNGF118)或60μg/kg bw/次的NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)。正常对照组或生精障碍模型对照组注射等体积0.9％氯化钠注射液。首次给药(NGF、NGF-Fc融合蛋白或氯化钠)当天为第1天。为构建小鼠睾丸热应激所致的生精障碍动物模型，在首次给药4小时后麻醉小鼠，待小鼠睾丸下降到阴囊后，将生精障碍模型对照组、NGF实验组和NGF-Fc融合蛋白实验组小鼠下腹(后肢、尾和阴囊)浸入42℃恒温水浴30分钟，将正常对照组小鼠下腹(后肢、尾和阴囊)浸入25℃恒温水浴30分钟。/>鼠NGF或mNGF118隔天给药一次，2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5每周给药2次。正常对照组或模型对照组注射等体积0.9％氯化钠注射液，隔天给药1次。共计给药5周。在给药后第37天安乐死小鼠，取左侧附睾尾称重并放入37℃预热的M199培养液中，剪碎并放入培养箱中37℃孵育5分钟，吸取精子悬液，用M199培养液按1:6稀释，混匀后，取稀释液，采用TOX IVOS精子分析仪检测精子数和精子活力。记录的数据采用Student t检验进行分析。
如表7所示，生精障碍模型对照组的精子数量和精子活力均显著低于正常对照组，表明动物模型构建成功。与生精障碍模型对照组相比，NGF(鼠NGF或mNGF118)或NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3Fc10-M3-5和2-118-L3G4-BM)实验组小鼠的精子数量和精子活力均显著升高。由此可见，皮下注射NGF或NGF-Fc融合蛋白可有效挽救生精障碍(如弱精子症、少精子症和少弱精子症)中的精子数量减少和精子活力降低。
表7 NGF及NGF-Fc融合蛋白对生精障碍小鼠精子数和精子活力的影响
为进一步研究NGF和NGF-Fc的治疗效果，取上述安乐死小鼠的右侧睾丸和附睾，称重后用10％中性福尔马林固定、包埋、切片并进行H&E染色，以评价其组织病理学病变。如表8所示，NGF(鼠NGF或mNGF118)和NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3Fc10-M3-5和2-118-L3G4-BM)对热应激所致的睾丸生精小管萎缩、生精小管生精障碍及附睾管细胞碎片症状表现出明显的治疗作用。
此外，NGF-Fc融合蛋白表现出与NGF相当甚至更优的治疗效果(精子数量、精子活力、组织病理学)。
表8生精障碍小鼠皮下注射NGF或NGF-Fc融合蛋白的组织病理学统计表(只)
实施例11：NGF-Fc融合蛋白对神经营养性角膜炎的治疗效果
神经营养性角膜炎是一种由角膜上皮愈合障碍引起的变性疾病，主要特征表现为角膜敏感性降低。本实施例阐述了在神经营养性角膜炎大鼠模型中NGF-Fc融合蛋白对神经营养性角膜炎的治疗效果的研究(例如，通过角膜荧光素钠染色试验和角膜神经长度测量)
为构建神经营养性角膜炎动物模型，采用3日龄SD大鼠，单次皮下注射8mg/ml的辣椒素溶液(上海麦克林生化科技有限公司，#C10831884)，剂量为50μl/只。辣椒素注射两周后，60μg/ml的NGF(鼠NGF或mNGF118)或NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3Fc10-M3-5或2-118-L3G4-BM)以滴眼形式双眼给药，每天给药6次，每次间隔约2小时，20μl/眼/次。相同体积的0.9％氯化钠溶液以相同频率施用，作为阴性对照。给药第1天记为D1。连续给药2周，于D15每组给药1次。
随后进行角膜荧光素钠染色以评估NGF-Fc融合蛋白的治疗效果。角膜荧光素钠染色评分可直观展现角膜的完整性和破损程度。完整角膜不会着色，只有出现破损的角膜才会着色，并且评分越高角膜破损程度越高。简而言之，将荧光素钠溶液(3μL，0.5％)滴入动物眼睛染色1.5min。随后每隔约10s使用1.25mL的无菌生理盐水冲洗动物结膜囊，连续3次。每次冲洗完毕后用面纸吸干动物眼周的残余生理盐水。染色后5min，使用裂隙灯(+钴蓝滤光片)观察眼表、拍照并评分。使用改良后的NEI荧光染色分级法为评分标准。具体而言，每个眼角膜分为5个区域(1-中央区、2-上方、3-颞侧、4-鼻侧、5-下方)，每个区域染色评分最高8分。其中0分表示未见着色，1分表示点状着色面积为对应区域面积的1％～25％，2分表示点状着色面积为对应区域面积的26％～50％，3分表示点状着色面积为对应区域面积的51％～75％，4分表示点状着色面积为对应区域面积的76％～100％，若着色区致密和/或可见明显融合，依着色区占对应区域的面积大小进一步给予1、2、3、4分的额外附加分，即着色面积为1％～25％给予1分的附加分、着色面积为26％～50％给予2分的附加分、着色面加为51％～75％给予3分的附加分、着色面积为76％～100％给予4分的附加分。每眼总分最高40分。于第0天(第一次处理前)、第4天、第8天和第14天共测量4次。计算每眼角膜荧光素钠染色总分。记录的数据SPSS13.0进行处理，使用GraphPad Prism 8.0.1绘制柱状图。
如图10A所示，NGF(鼠NGF或mNGF118)或NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)处理的实验组神经营养性角膜炎大鼠模型的角膜荧光素钠染色评分均显著低于阴性对照组(在第4天和第8天时p<0.01；在第14天时p<0.001)，表明NGF(鼠NGF或mNGF118)或NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)可明显恢复损伤角膜的完整性。相对而言，与NGF处理的角膜相比，NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)处理的角膜显示出略低的角膜荧光素钠染色评分。
进一步进行角膜神经计数试验以研究其治疗效果。在第15天，给药1小时后将大鼠安乐死，取右眼眼球，沿角膜缘取下角膜，冲洗，铺平，染色并固定于载玻片上。光学显微镜下(×200倍)观察角膜神经纤维形态，将角膜从中央放射状均分为4瓣，从4瓣角膜上各选取一个清晰且角膜神经最多的视野进行拍照，测量每个视野中角膜神经的长度，以4个视野的角膜神经长度的均值作为最终结果。采用SPSS13.0对数据进行处理，使用GraphPadPrism8.0.1绘制柱状图。
如图10B所示，NGF(鼠NGF或mNGF118)或NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)处理的神经营养性角膜炎大鼠模型的平均角膜神经长度显著长于(p<0.05)阴性对照组。具体而言/>鼠NGF、mNGF118、、2-118-L3G4-BM和2-118-L3Fc10-M3-5)处理的平均角膜神经长度分别约为阴性对照组的1.14倍、1.14倍、1.21倍和1.18倍。上述实验结果表明，NGF(/>鼠NGF或mNGF118)或NGF-Fc融合蛋白(2-118-L3G4-BM或2-118-L3Fc10-M3-5)均可有效改善神经营养性角膜炎对角膜神经所造成的损伤。
序列表
SEQ ID NO:1(突变型人类β-NGF,118aa)
SSSHPIFHRGEESVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVR
SEQ ID NO:2(突变型人类β-NGF,120aa)
SSSHPIFHRGEESVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRA
SEQ ID NO:3(野生型人类β-NGF,118aa)
SSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVR
SEQ ID NO:4(野生型人类β-NGF,120aa)
SSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRA
SEQ ID NO:5(NGF多肽,103aa)
EPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTHRSKR
SEQ ID NO:6(NGF信号肽,18aa)
MSMLFYTLITAFLIGIQA
SEQ ID NO:7(人类野生型IgG1 Fc IGHG1*05)
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:8(人类野生型IgG1 Fc IGHG1*03,自然变体)
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:9(修饰的IgG1 Fc M1[N297A相对于IGHG1*03])
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:10(修饰的IgG1 Fc M1-5[N297A相对于IGHG1*03,N’5aa截断])
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:11(修饰的IgG1 Fc M3[L234A+L235A+P331S相对于IGHG1*03])
EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:12(修饰的IgG1 Fc M3-5[L234A+L235A+P331S相对于IGHG1*03,N’5aa截断])
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:13(修饰的IgG1 Fc M5[L234A+L235E+G237A+A330S+P331S相对于IGHG1*03])
EPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:14(修饰的IgG1 Fc M5-5[L234A+L235E+G237A+A330S+P331S相对于IGHG1*03,N’5aa截断])
DKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:15(修饰的IgG1 Fc M7[E233P+L234V+L235A+G236del+A327G+A330S+P331S相对于IGHG1*03])
EPKSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:16(修饰的IgG1 Fc M7-5[E233P+L234V+L235A+G236del+A327G+A330S+P331S相对于IGHG1*03,N’5aa截短])
DKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:17(人类野生型IgG4 Fc)
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:18(修饰的IgG4 Fc[S228P+F234A+L235A])
ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:19(修饰的IgG4 Fc-FD)SKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:20(修饰的IgG2/4 Fc)
VERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:21(FD-G4Fc核酸序列；信号肽为斜体、前导肽在方框中、β-NGF(野生型118aa)加粗、接头加下划线、修饰的IgG4 Fc为斜体加粗)
SEQ ID NO:22(FD-G4Fc的氨基酸序列；信号肽为斜体、前导肽在方框中、β-NGF(野生型118aa)加粗、接头加下划线、修饰的IgG4 Fc为斜体加粗)
SEQ ID NO:23(WM-G24Fc的核酸序列；信号肽为斜体、前导肽在方框中、β-NGF(野生型118aa)加粗、接头加下划线、修饰的IgG2/4 Fc为斜体加粗)
SEQ ID NO:24(WM-G24Fc的氨基酸序列；信号肽为斜体、前导肽在方框中、β-NGF(野生型118aa)加粗、接头加下划线、修饰的IgG2/4 Fc为斜体加粗)
SEQ ID NO:25(NGF-1-15M7的核酸序列；信号肽为斜体、前导肽在方框中、β-NGF(野生型120aa)加粗、修饰的IgG1 Fc为斜体加粗)
SEQ ID NO:26(NGF-1-15M7的氨基酸序列；信号肽为斜体、前导肽在方框中、β-NGF(野生型120aa)加粗、修饰的IgG1 Fc为斜体加粗)
SEQ ID NO:27(NGF-L3Fc10M7-5的核酸序列；信号肽为斜体、前导肽在方框中、β-NGF(野生型120aa)加粗、接头加下划线、修饰的IgG1 Fc为斜体加粗)
SEQ ID NO:28(NGF-L3Fc10M7-5的氨基酸序列；信号肽为斜体、前导肽在方框中、β-NGF(野生型120aa)加粗、接头加下划线、修饰的IgG1 Fc为斜体加粗)
SEQ ID NO:29(2-1-15M7的核酸序列；信号肽为斜体、前导肽在方框中、β-NGF(突变体120aa)加粗、修饰的IgG1 Fc为斜体加粗)
SEQ ID NO:30(2-1-15M7的氨基酸序列；信号肽为斜体、前导肽在方框中、β-NGF(突变体120aa)加粗、修饰的IgG1 Fc为斜体加粗)
SEQ ID NO:31(NGF-4-12PAA的核酸序列；信号肽为斜体、前导肽在方框中、β-NGF(野生型120aa)加粗、修饰的IgG4 Fc为斜体加粗)
SEQ ID NO:32(NGF-4-12PAA的氨基酸序列；信号肽为斜体、前导肽在方框中、β-NGF(野生型120aa)加粗、修饰的IgG4 Fc为斜体加粗)
SEQ ID NO:33(2-118-L3Fc10-M1-5的核酸序列；信号肽为斜体、前导肽在方框中、β-NGF(突变体118aa)加粗、接头加下划线、修饰的IgG1 Fc为斜体加粗)
/>
SEQ ID NO:34(2-118-L3Fc10-M1-5的氨基酸序列；信号肽为斜体、前导肽在方框中、β-NGF(突变体118aa)加粗、接头加下划线、修饰的IgG1 Fc为斜体加粗)
SEQ ID NO:35(2-118-L3Fc10-M3-5的核酸序列；信号肽为斜体、前导肽在方框中、β-NGF(突变体118aa)加粗、接头加下划线、修饰的IgG1 Fc为斜体加粗)
SEQ ID NO:36(2-118-L3Fc10-M3-5的氨基酸序列；信号肽为斜体、前导肽在方框中、β-NGF(突变体118aa)加粗、接头加下划线、修饰的IgG1 Fc为斜体加粗)
SEQ ID NO:37(NGF-118-L3Fc10-M3-5的核酸序列；信号肽为斜体、前导肽在方框中、β-NGF(野生型118aa)加粗、接头加下划线、修饰的IgG1 Fc为斜体加粗)
/>
SEQ ID NO:38(NGF-118-L3Fc10-M3-5的氨基酸序列；信号肽为斜体、前导肽在方框中、β-NGF(野生型118aa)加粗、接头加下划线、修饰的IgG1 Fc为斜体加粗)
SEQ ID NO:39(2-L3Fc10-M3-5的核酸序列；信号肽为斜体、前导肽在方框中、β-NGF(突变体120aa)加粗、接头加下划线、修饰的IgG1 Fc为斜体加粗)
SEQ ID NO:40(2-L3Fc10-M3-5的氨基酸序列；信号肽为斜体、前导肽在方框中、β-NGF(突变体120aa)加粗、接头加下划线、修饰的IgG1 Fc为斜体加粗)
SEQ ID NO:41(2-118-L3Fc10-M5-5的核酸序列；信号肽为斜体、前导肽在方框中、β-NGF(突变体118aa)加粗、接头加下划线、修饰的IgG1 Fc为斜体加粗)
SEQ ID NO:42(2-118-L3Fc10-M5-5的氨基酸序列；信号肽为斜体、前导肽在方框中、β-NGF(突变体118aa)加粗、接头加下划线、修饰的IgG1 Fc为斜体加粗)
SEQ ID NO:43(2-118-L3Fc10M7-5的核酸序列；信号肽为斜体、前导肽在方框中、β-NGF(突变体118aa)加粗、接头加下划线、修饰的IgG1 Fc为斜体加粗)
SEQ ID NO:44(2-118-L3Fc10M7-5的氨基酸序列；信号肽为斜体、前导肽在方框中、β-NGF(突变体118aa)加粗、接头加下划线、修饰的IgG1 Fc为斜体加粗)
SEQ ID NO:45(2-118-L3G4-BM的核酸序列；信号肽为斜体、前导肽在方框中、β-NGF(突变体118aa)加粗、接头加下划线、修饰的IgG4 Fc为斜体加粗)
SEQ ID NO:46(2-118-L3G4-BM的氨基酸序列；信号肽为斜体、前导肽在方框中、β-NGF(突变体118aa)加粗、接头加下划线、修饰的IgG4 Fc为斜体加粗)
SEQ ID NO:47(突变型人类preproNGF,239aa；信号肽为斜体、前导肽在方框中、β-NGF(突变体118aa)加粗)
SEQ ID NO:48(突变型人类preproNGF,241aa；信号肽为斜体、前导肽在方框中、β-NGF(突变体120aa)加粗)
SEQ ID NO:49(野生型人类preproNGF,239aa；信号肽为斜体、前导肽在方框中、β-NGF(野生型118aa)加粗)
SEQ ID NO:50(野生型人类preproNGF,241aa；信号肽为斜体、前导肽在方框中、β-NGF(野生型120aa)加粗)
SEQ ID NO:51(突变型人类proNGF,221aa；前导肽在方框中、β-NGF(突变体118aa)加粗)
SEQ ID NO:52(突变型人类proNGF,223aa；前导肽在方框中、β-NGF(突变体120aa)加粗)
SEQ ID NO:53(野生型人类proNGF,221aa；前导肽在方框中、β-NGF(野生型118aa)加粗)
SEQ ID NO:54(野生型人类proNGF,223aa；前导肽在方框中、β-NGF(野生型120aa)加粗)
SEQ ID NO:55(成熟FD-G4Fc的氨基酸序列；β-NGF(野生型118aa)加粗、接头加下划线、修饰的IgG4 Fc为斜体加粗)
SEQ ID NO:56(成熟WM-G24Fc的氨基酸序列；β-NGF(野生型118aa)加粗、接头加下划线、修饰的IgG2/4 Fc为斜体加粗)
SEQ ID NO:57(成熟NGF-1-15M7的氨基酸序列；β-NGF(野生型120aa)加粗、修饰的IgG1 Fc为斜体加粗)
SEQ ID NO:58(成熟NGF-L3Fc10M7-5的氨基酸序列；β-NGF(野生型120aa)加粗、接头加下划线、修饰的IgG1 Fc为斜体加粗)
SEQ ID NO:59(成熟2-1-15M7的氨基酸序列；β-NGF(突变体120aa)加粗、修饰的IgG1 Fc为斜体加粗)
SEQ ID NO:60(成熟NGF-4-12PAA的氨基酸序列；β-NGF(野生型120aa)加粗、修饰的IgG4 Fc为斜体加粗)
SEQ ID NO:61(成熟2-118-L3Fc10-M1-5的氨基酸序列；β-NGF(突变体118aa)加粗、接头加下划线、修饰的IgG1 Fc为斜体加粗)
SEQ ID NO:62(成熟2-118-L3Fc10-M3-5的氨基酸序列；β-NGF(突变体118aa)加粗、接头加下划线、修饰的IgG1 Fc为斜体加粗)
SEQ ID NO:63(成熟NGF-118-L3Fc10-M3-5的氨基酸序列；β-NGF(野生型118aa)加粗、接头加下划线、修饰的IgG1 Fc为斜体加粗)
SEQ ID NO:64(成熟2-L3Fc10-M3-5的氨基酸序列；β-NGF(突变体120aa)加粗、接头加下划线、修饰的IgG1 Fc为斜体加粗)
SEQ ID NO:65(成熟2-118-L3Fc10-M5-5的氨基酸序列；β-NGF(突变体118aa)加粗、接头加下划线、修饰的IgG1 Fc为斜体加粗)
SEQ ID NO:66(成熟2-118-L3Fc10M7-5的氨基酸序列；β-NGF(突变体118aa)加粗、接头加下划线、修饰的IgG1 Fc为斜体加粗)
SEQ ID NO:67(成熟2-118-L3G4-BM的氨基酸序列；β-NGF(突变体118aa)加粗、接头加下划线、修饰的IgG4 Fc为斜体加粗)
SEQ ID NO:68(接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:69(接头)
GGGGGGSGGGGSGGGGSA
SEQ ID NO:70(接头；n为至少是1的整数)
(GGGGS)n
SEQ ID NO:71(接头)
GSGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:72(接头)
KTGGGSGGGS
SEQ ID NO:73(接头；n为至少是1的整数)
(G)n
SEQ ID NO:74(接头；n为至少是1的整数)
(GS)n
SEQ ID NO:75(接头；n为至少是1的整数)
(GGS)n
SEQ ID NO:76(接头；n为至少是1的整数)
(GGGS)n
SEQ ID NO:77(接头；n为至少是1的整数)
(GGS)n(GGGS)n
SEQ ID NO:78(接头；n为至少是1的整数)
(GSGGS)n
SEQ ID NO:79(接头；n为至少是1的整数)
(GGSGS)n
SEQ ID NO:80(接头)
GSGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:81(接头)
GGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:82(接头)
GGGSGGSGGS
SEQ ID NO:83(接头)
GGSGGSGGSGGSGGG
SEQ ID NO:84(接头)
GGSGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:85(接头)
GGSGGSGGSGGSGGSGGS
SEQ ID NO:86(接头)
GG
SEQ ID NO:87(接头)
GGSG
SEQ ID NO:88(接头)
GGSGG
SEQ ID NO:89(接头)
GSGSG
SEQ ID NO:90(接头)
GSGGG
SEQ ID NO:91(接头)
GGGSG
SEQ ID NO:92(接头)
GSSSG
SEQ ID NO:93(接头)
GGSGGS
SEQ ID NO:94(接头)
SGGGGS
SEQ ID NO:95(接头)
GGGGS
SEQ ID NO:96(接头；n为至少是1的整数)
(GA)n
SEQ ID NO:97(接头)
GRAGGGGAGGGG
SEQ ID NO:98(接头)
GRAGGG
SEQ ID NO:99(接头)
ASTKGP
序列表
<110> 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司
<120> 长效神经生长因子多肽及其用途
<160> 99
<210> 1
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变型人类β-NGF
<400> 1
Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Glu Ser Val Cys Asp
1 5 10 15
Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys
20 25 30
Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val
35 40 45
Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val
50 55 60
Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys
65 70 75 80
Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln
85 90 95
Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu
100 105 110
Ser Arg Lys Ala Val Arg
115
<210> 2
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变型人类β-NGF
<400> 2
Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Glu Ser Val Cys Asp
1 5 10 15
Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys
20 25 30
Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val
35 40 45
Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val
50 55 60
Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys
65 70 75 80
Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln
85 90 95
Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu
100 105 110
Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala
115 120
<210> 3
<211> 118
<212> PRT
<213> 人类
<220>
<223> 野生型人类β-NGF
<400> 3
Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp
1 5 10 15
Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys
20 25 30
Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val
35 40 45
Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val
50 55 60
Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys
65 70 75 80
Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln
85 90 95
Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu
100 105 110
Ser Arg Lys Ala Val Arg
115
<210> 4
<211> 120
<212> PRT
<213> 人类
<220>
<223> 野生型人类β-NGF
<400> 4
Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp
1 5 10 15
Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys
20 25 30
Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val
35 40 45
Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val
50 55 60
Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys
65 70 75 80
Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln
85 90 95
Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu
100 105 110
Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala
115 120
<210> 5
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NGF 前导肽
<400> 5
Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile Pro Gln
1 5 10 15
Ala His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu Arg Arg
20 25 30
Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala Gly Gln
35 40 45
Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg Arg Leu
50 55 60
Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu Ala Ala
65 70 75 80
Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro Phe Asn
85 90 95
Arg Thr His Arg Ser Lys Arg
100
<210> 6
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NGF 信号肽
<400> 6
Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala Phe Leu Ile Gly Ile
1 5 10 15
Gln Ala
<210> 7
<211> 232
<212> PRT
<213> 人类
<220>
<223> 人类野生型 IgG1 Fc IGHG1*05
<400> 7
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 8
<211> 232
<212> PRT
<213> 人类
<220>
<223> 人类野生型 IgG1 Fc IGHG1*03，自然变体
<400> 8
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 9
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的IgG1 Fc M1
<400> 9
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 10
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的IgG1 Fc M1-5
<400> 10
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 11
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的IgG1 Fc M3
<400> 11
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 12
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的IgG1 Fc M3-5
<400> 12
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 13
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的IgG1 Fc M5
<400> 13
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 14
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的IgG1 Fc M5-5
<400> 14
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly
1 5 10 15
Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 15
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的IgG1 Fc M7
<400> 15
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
35 40 45
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
85 90 95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
100 105 110
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
115 120 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
130 135 140
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
165 170 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
195 200 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 16
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的IgG1 Fc M7-5
<400> 16
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
1 5 10 15
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
20 25 30
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
35 40 45
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
50 55 60
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
65 70 75 80
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
85 90 95
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
100 105 110
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
115 120 125
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
130 135 140
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
145 150 155 160
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
165 170 175
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
180 185 190
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
195 200 205
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
210 215 220
Gly Lys
225
<210> 17
<211> 229
<212> PRT
<213> 人类
<220>
<223> 人类野生型 IgG4 Fc
<400> 17
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 18
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的IgG4 Fc
<400> 18
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
1 5 10 15
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 19
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的IgG4 Fc-FD
<400> 19
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu
1 5 10 15
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Pro Gly Lys
225
<210> 20
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的IgG2/4 Fc
<400> 20
Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro
1 5 10 15
Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 21
<211> 1464
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FD-G4Fc的核酸序列
<400> 21
atgagcatgt tgttctacac tctgatcaca gcttttctga tcggcataca ggcggaacca 60
cactcagaga gcaatgtccc tgcaggacac accatccccc aagcccactg gactaaactt 120
cagcattccc ttgacactgc ccttcgcaga gcccgcagcg ccccggcagc ggcgatagct 180
gcacgcgtgg cggggcagac ccgcaacatt actgtggacc ccaggctgtt taaaaagcgg 240
cgactccgtt caccccgtgt gctgtttagc acccagcctc cccgtgaagc tgcagacact 300
caggatctgg acttcgaggt cggtggtgct gcccccttca acaggactca caggagcaag 360
cggtcatcat cccatcccat cttccacagg ggcgaattct cggtgtgtga cagtgtcagc 420
gtgtgggttg gggataagac caccgccaca gacatcaagg gcaaggaggt gatggtgttg 480
ggagaggtga acattaacaa cagtgtattc aaacagtact tttttgagac caagtgccgg 540
gacccaaatc ccgttgacag cgggtgccgg ggcattgact caaagcactg gaactcatat 600
tgtaccacga ctcacacctt tgtcaaggcg ctgaccatgg atggcaagca ggctgcctgg 660
cggtttatcc ggatagatac ggcctgtgtg tgtgtgctca gcaggaaggc tgtgagaggc 720
tccggcggcg gctccggtgg cggcggctca ggaggaggag gctccggtgg tggtggttcc 780
tccaagtatg gccccccctg ccccccctgc ccagcacctg agttcgaggg gggaccatca 840
gtcttcctgt tccccccaaa acccaaggac actctcatga tctcccggac ccctgaggtc 900
acgtgcgtgg tggtggacgt gagccaggaa gaccccgagg tccagttcaa ctggtacgtg 960
gatggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagtt caacagcacg 1020
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaacgg caaggagtac 1080
aagtgcaagg tctccaacaa aggcctcccg tcctccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1140
aaagggcagc cccgagagcc acaggtgtac accctgcccc catcccagga ggagatgacc 1200
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct accccagcga catcgccgtg 1260
gagtgggaaa gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1320
tccgacggct ccttcttcct ctacagcagg ctaaccgtgg acaagagcag gtggcaggag 1380
gggaatgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacacagaag 1440
agcctctccc tgtctccggg taaa 1464
<210> 22
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FD-G4Fc的氨基酸序列
<400> 22
Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala Phe Leu Ile Gly Ile
1 5 10 15
Gln Ala Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile
20 25 30
Pro Gln Ala His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu
35 40 45
Arg Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala
50 55 60
Gly Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg
65 70 75 80
Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu
85 90 95
Ala Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro
100 105 110
Phe Asn Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe
115 120 125
His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly
130 135 140
Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu
145 150 155 160
Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu
165 170 175
Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile
180 185 190
Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val
195 200 205
Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg
210 215 220
Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg Gly
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
245 250 255
Gly Gly Gly Ser Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
260 265 270
Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
275 280 285
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
290 295 300
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
305 310 315 320
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
325 330 335
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
340 345 350
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
355 360 365
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
370 375 380
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
385 390 395 400
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
405 410 415
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
420 425 430
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
435 440 445
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
450 455 460
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
465 470 475 480
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485
<210> 23
<211> 1434
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> WM-G24Fc的核酸序列
<400> 23
atgagcatgt tgttctacac tctgatcaca gcttttctga tcggcataca ggcggaacca 60
cactcagaga gcaatgtccc tgcaggacac accatccccc aagcccactg gactaaactt 120
cagcattccc ttgacactgc ccttcgcaga gcccgcagcg ccccggcagc ggcgatagct 180
gcacgcgtgg cggggcagac ccgcaacatt actgtggacc ccaggctgtt taaaaagcgg 240
cgactccgtt caccccgtgt gctgtttagc acccagcctc cccgtgaagc tgcagacact 300
caggatctgg acttcgaggt cggtggtgct gcccccttca acaggactca caggagcaag 360
cggtcatcat cccatcccat cttccacagg ggcgaattct cggtgtgtga cagtgtcagc 420
gtgtgggttg gggataagac caccgccaca gacatcaagg gcaaggaggt gatggtgttg 480
ggagaggtga acattaacaa cagtgtattc aaacagtact tttttgagac caagtgccgg 540
gacccaaatc ccgttgacag cgggtgccgg ggcattgact caaagcactg gaactcatat 600
tgtaccacga ctcacacctt tgtcaaggcg ctgaccatgg atggcaagca ggctgcctgg 660
cggtttatcc ggatagatac ggcctgtgtg tgtgtgctca gcaggaaggc tgtgagaaag 720
accggcggtg gctccggcgg cggctccgtg gagcggaagt gctgcgtgga gtgccccccc 780
tgccccgctc cccccgtggc tggaccatca gtcttcctgt tccccccaaa acccaaggac 840
actctcatga tctcccggac ccctgaggtc acgtgcgtgg tggtggacgt gagccaggaa 900
gaccccgagg tccagttcaa ctggtacgtg gatggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 960
aagccgcggg aggagcagtt caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 1020
caccaggact ggctgaacgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa aggcctcccg 1080
tcctccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagagcc acaggtgtac 1140
accctgcccc catcccagga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1200
aaaggcttct accccagcga catcgccgtg gagtgggaaa gcaatgggca gccggagaac 1260
aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcagg 1320
ctaaccgtgg acaagagcag gtggcaggag gggaatgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1380
gaggctctgc acaaccacta cacacagaag agcctctccc tgtctctggg taaa 1434
<210> 24
<211> 478
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> WM-G24Fc的氨基酸序列
<400> 24
Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala Phe Leu Ile Gly Ile
1 5 10 15
Gln Ala Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile
20 25 30
Pro Gln Ala His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu
35 40 45
Arg Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala
50 55 60
Gly Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg
65 70 75 80
Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu
85 90 95
Ala Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro
100 105 110
Phe Asn Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe
115 120 125
His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly
130 135 140
Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu
145 150 155 160
Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu
165 170 175
Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile
180 185 190
Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val
195 200 205
Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg
210 215 220
Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg Lys
225 230 235 240
Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Val Glu Arg Lys Cys Cys Val
245 250 255
Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe
260 265 270
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
275 280 285
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
290 295 300
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
305 310 315 320
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
325 330 335
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
340 345 350
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
355 360 365
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
370 375 380
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
385 390 395 400
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
405 410 415
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
420 425 430
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
435 440 445
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
450 455 460
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
465 470 475
<210> 25
<211> 1416
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NGF-1-15M7的核酸序列
<400> 25
atgagcatgt tgttctacac tctgatcaca gcttttctga tcggcataca ggcggaacca 60
cactcagaga gcaatgtccc tgcaggacac accatccccc aagcccactg gactaaactt 120
cagcattccc ttgacactgc ccttcgcaga gcccgcagcg ccccggcagc ggcgatagct 180
gcacgcgtgg cggggcagac ccgcaacatt actgtggacc ccaggctgtt taaaaagcgg 240
cgactccgtt caccccgtgt gctgtttagc acccagcctc cccgtgaagc tgcagacact 300
caggatctgg acttcgaggt cggtggtgct gcccccttca acaggactca caggagcaag 360
cggtcatcat cccatcccat cttccacagg ggcgaattct cggtgtgtga cagtgtcagc 420
gtgtgggttg gggataagac caccgccaca gacatcaagg gcaaggaggt gatggtgttg 480
ggagaggtga acattaacaa cagtgtattc aaacagtact tttttgagac caagtgccgg 540
gacccaaatc ccgttgacag cgggtgccgg ggcattgact caaagcactg gaactcatat 600
tgtaccacga ctcacacctt tgtcaaggcg ctgaccatgg atggcaagca ggctgcctgg 660
cggtttatcc ggatagatac ggcctgtgtg tgtgtgctca gcaggaaggc tgtgagaaga 720
gccgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctccagtc 780
gcaggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 960
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaaggcctcc catcctccat cgagaaaacc 1080
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1140
gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1200
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1260
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc 1320
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380
tacacgcaga agagcctctc cctgtccccg ggtaaa 1416
<210> 26
<211> 472
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NGF-1-15M7的氨基酸序列
<400> 26
Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala Phe Leu Ile Gly Ile
1 5 10 15
Gln Ala Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile
20 25 30
Pro Gln Ala His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu
35 40 45
Arg Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala
50 55 60
Gly Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg
65 70 75 80
Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu
85 90 95
Ala Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro
100 105 110
Phe Asn Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe
115 120 125
His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly
130 135 140
Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu
145 150 155 160
Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu
165 170 175
Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile
180 185 190
Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val
195 200 205
Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg
210 215 220
Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg
225 230 235 240
Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
245 250 255
Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
260 265 270
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
275 280 285
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
290 295 300
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
305 310 315 320
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
325 330 335
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
340 345 350
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
355 360 365
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
370 375 380
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
385 390 395 400
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
405 410 415
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
420 425 430
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
435 440 445
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
450 455 460
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 27
<211> 1446
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NGF-L3Fc10M7-5的核酸序列
<400> 27
atgagcatgt tgttctacac tctgatcaca gcttttctga tcggcataca ggcggaacca 60
cactcagaga gcaatgtccc tgcaggacac accatccccc aagcccactg gactaaactt 120
cagcattccc ttgacactgc ccttcgcaga gcccgcagcg ccccggcagc ggcgatagct 180
gcacgcgtgg cggggcagac ccgcaacatt actgtggacc ccaggctgtt taaaaagcgg 240
cgactccgtt caccccgtgt gctgtttagc acccagcctc cccgtgaagc tgcagacact 300
caggatctgg acttcgaggt cggtggtgct gcccccttca acaggactca caggagcaag 360
cggtcatcat cccatcccat cttccacagg ggcgaattct cggtgtgtga cagtgtcagc 420
gtgtgggttg gggataagac caccgccaca gacatcaagg gcaaggaggt gatggtgttg 480
ggagaggtga acattaacaa cagtgtattc aaacagtact tttttgagac caagtgccgg 540
gacccaaatc ccgttgacag cgggtgccgg ggcattgact caaagcactg gaactcatat 600
tgtaccacga ctcacacctt tgtcaaggcg ctgaccatgg atggcaagca ggctgcctgg 660
cggtttatcc ggatagatac ggcctgtgtg tgtgtgctca gcaggaaggc tgtgagaaga 720
gccggcggtg gcggctccgg cggtggcggc tccggcggtg gcggctccga caaaactcac 780
acatgcccac cgtgcccagc acctcctgtc gccggaccgt cagtcttcct cttcccccca 840
aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 900
gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 960
aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 1020
ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1080
aaaggcctcc catcctccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 1140
ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg 1200
acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1260
cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1320
ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1380
tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtccccg 1440
ggtaaa 1446
<210> 28
<211> 482
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NGF-L3Fc10M7-5的氨基酸序列
<400> 28
Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala Phe Leu Ile Gly Ile
1 5 10 15
Gln Ala Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile
20 25 30
Pro Gln Ala His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu
35 40 45
Arg Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala
50 55 60
Gly Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg
65 70 75 80
Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu
85 90 95
Ala Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro
100 105 110
Phe Asn Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe
115 120 125
His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly
130 135 140
Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu
145 150 155 160
Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu
165 170 175
Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile
180 185 190
Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val
195 200 205
Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg
210 215 220
Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg
225 230 235 240
Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
260 265 270
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
275 280 285
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
290 295 300
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
305 310 315 320
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
325 330 335
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
340 345 350
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
355 360 365
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
370 375 380
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
385 390 395 400
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
405 410 415
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
420 425 430
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
435 440 445
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
450 455 460
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
465 470 475 480
Gly Lys
<210> 29
<211> 1416
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2-1-15M7的核酸序列
<400> 29
atgagcatgt tgttctacac tctgatcaca gcttttctga tcggcataca ggcggaacca 60
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<211> 472
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2-1-15M7的氨基酸序列
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Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu
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275 280 285
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
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435 440 445
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450 455 460
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 31
<211> 1410
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NGF-4-12PAA的核酸序列
<400> 31
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NGF-4-12PAA的氨基酸序列
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Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu
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<211> 1443
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2-118-L3Fc10-M1-5的核酸序列
<400> 33
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gcacgcgtgg cggggcagac ccgcaacatt actgtggacc ccaggctgtt taaaaagcgg 240
cgactccgtt caccccgtgt gctgtttagc acccagcctc cccgtgaagc tgcagacact 300
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cggtcatcat cccatcccat cttccacagg ggcgaattct cggtgtgtga cagtgtcagc 420
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Lys
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ggtggcggct ccggcggtgg cggctccggc ggtggcggct ccgacaaaac tcacacatgc 780
ccaccgtgcc cagcacctga agctgagggg gcaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 840
cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 900
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195 200 205
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
385 390 395 400
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
405 410 415
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420 425 430
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
435 440 445
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
450 455 460
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470 475 480
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<211> 1458
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<213> 人工序列
<220>
<223> 2-118-L3G4-BM的核酸序列
<400> 45
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gcacgcgtgg cggggcagac ccgcaacatt actgtggacc ccaggctgtt taaaaagcgg 240
cgactccgtt caccccgtgt gctgtttagc acccagcctc cccgtgaagc tgcagacact 300
caggatctgg acttcgaggt cggtggtgct gcccccttca acaggactca caggagcaag 360
cggtcatcat cccatcccat cttccacagg ggcgaagagt cggtgtgtga cagtgtcagc 420
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gacccaaatc ccgttgacag cgggtgccgg ggcattgact caaagcactg gaactcatat 600
tgtaccacga ctcacacctt tgtcaaggcg ctgaccatgg atggcaagca ggctgcctgg 660
cggtttatcc ggatagatac ggcctgtgtg tgtgtgctca gcaggaaggc tgtgagagga 720
gggggaggcg gaggttcagg gggtggtggt tccggcggcg ggggatccgc cgagtccaaa 780
tatggtcccc catgcccacc ctgcccagca cctgaggctg cggggggacc atcagtcttc 840
ctgttccccc caaaacccaa ggacactctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 900
gtggtggtgg acgtgagcca ggaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc 960
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agttcaacag cacgtaccgt 1020
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 1080
aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1140
cagccccgag agccacaggt gtacaccctg cccccatccc aggaggagat gaccaagaac 1200
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1260
gaaagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1320
ggctccttct tcctctacag caggctaacc gtggacaaga gcaggtggca ggaggggaat 1380
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacaca gaagagcctc 1440
tccctgtctc tgggtaaa 1458
<210> 46
<211> 486
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2-118-L3G4-BM的氨基酸序列
<400> 46
Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala Phe Leu Ile Gly Ile
1 5 10 15
Gln Ala Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile
20 25 30
Pro Gln Ala His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu
35 40 45
Arg Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala
50 55 60
Gly Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg
65 70 75 80
Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu
85 90 95
Ala Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro
100 105 110
Phe Asn Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe
115 120 125
His Arg Gly Glu Glu Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly
130 135 140
Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu
145 150 155 160
Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu
165 170 175
Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile
180 185 190
Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val
195 200 205
Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg
210 215 220
Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg Gly
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
260 265 270
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
275 280 285
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
290 295 300
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
305 310 315 320
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
325 330 335
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
340 345 350
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
355 360 365
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
370 375 380
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
385 390 395 400
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
405 410 415
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
420 425 430
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg
435 440 445
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
450 455 460
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
465 470 475 480
Ser Leu Ser Leu Gly Lys
485
<210> 47
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变型人类preproNGF
<400> 47
Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala Phe Leu Ile Gly Ile
1 5 10 15
Gln Ala Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile
20 25 30
Pro Gln Ala His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu
35 40 45
Arg Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala
50 55 60
Gly Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg
65 70 75 80
Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu
85 90 95
Ala Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro
100 105 110
Phe Asn Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe
115 120 125
His Arg Gly Glu Glu Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly
130 135 140
Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu
145 150 155 160
Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu
165 170 175
Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile
180 185 190
Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val
195 200 205
Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg
210 215 220
Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg
225 230 235
<210> 48
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变型人类preproNGF
<400> 48
Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala Phe Leu Ile Gly Ile
1 5 10 15
Gln Ala Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile
20 25 30
Pro Gln Ala His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu
35 40 45
Arg Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala
50 55 60
Gly Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg
65 70 75 80
Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu
85 90 95
Ala Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro
100 105 110
Phe Asn Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe
115 120 125
His Arg Gly Glu Glu Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly
130 135 140
Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu
145 150 155 160
Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu
165 170 175
Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile
180 185 190
Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val
195 200 205
Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg
210 215 220
Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg
225 230 235 240
Ala
<210> 49
<211> 239
<212> PRT
<213> 人类
<220>
<223> 野生型人类preproNGF
<400> 49
Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala Phe Leu Ile Gly Ile
1 5 10 15
Gln Ala Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile
20 25 30
Pro Gln Ala His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu
35 40 45
Arg Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala
50 55 60
Gly Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg
65 70 75 80
Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu
85 90 95
Ala Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro
100 105 110
Phe Asn Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe
115 120 125
His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly
130 135 140
Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu
145 150 155 160
Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu
165 170 175
Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile
180 185 190
Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val
195 200 205
Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg
210 215 220
Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg
225 230 235
<210> 50
<211> 241
<212> PRT
<213> 人类
<220>
<223> 野生型人类preproNGF
<400> 50
Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala Phe Leu Ile Gly Ile
1 5 10 15
Gln Ala Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile
20 25 30
Pro Gln Ala His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu
35 40 45
Arg Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala
50 55 60
Gly Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg
65 70 75 80
Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu
85 90 95
Ala Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro
100 105 110
Phe Asn Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe
115 120 125
His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly
130 135 140
Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu
145 150 155 160
Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu
165 170 175
Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile
180 185 190
Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val
195 200 205
Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg
210 215 220
Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg
225 230 235 240
Ala
<210> 51
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变型人类proNGF
<400> 51
Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile Pro Gln
1 5 10 15
Ala His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu Arg Arg
20 25 30
Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala Gly Gln
35 40 45
Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg Arg Leu
50 55 60
Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu Ala Ala
65 70 75 80
Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro Phe Asn
85 90 95
Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg
100 105 110
Gly Glu Glu Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys
115 120 125
Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu
130 135 140
Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys
145 150 155 160
Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser
165 170 175
Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala
180 185 190
Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp
195 200 205
Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg
210 215 220
<210> 52
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变型人类proNGF
<400> 52
Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile Pro Gln
1 5 10 15
Ala His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu Arg Arg
20 25 30
Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala Gly Gln
35 40 45
Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg Arg Leu
50 55 60
Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu Ala Ala
65 70 75 80
Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro Phe Asn
85 90 95
Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg
100 105 110
Gly Glu Glu Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys
115 120 125
Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu
130 135 140
Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys
145 150 155 160
Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser
165 170 175
Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala
180 185 190
Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp
195 200 205
Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala
210 215 220
<210> 53
<211> 221
<212> PRT
<213> 人类
<220>
<223> 野生型人类proNGF
<400> 53
Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile Pro Gln
1 5 10 15
Ala His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu Arg Arg
20 25 30
Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala Gly Gln
35 40 45
Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg Arg Leu
50 55 60
Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu Ala Ala
65 70 75 80
Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro Phe Asn
85 90 95
Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg
100 105 110
Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys
115 120 125
Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu
130 135 140
Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys
145 150 155 160
Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser
165 170 175
Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala
180 185 190
Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp
195 200 205
Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg
210 215 220
<210> 54
<211> 223
<212> PRT
<213> 人类
<220>
<223> 野生型人类proNGF
<400> 54
Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile Pro Gln
1 5 10 15
Ala His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu Arg Arg
20 25 30
Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala Gly Gln
35 40 45
Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg Arg Leu
50 55 60
Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu Ala Ala
65 70 75 80
Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro Phe Asn
85 90 95
Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg
100 105 110
Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys
115 120 125
Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu
130 135 140
Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys
145 150 155 160
Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser
165 170 175
Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala
180 185 190
Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp
195 200 205
Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala
210 215 220
<210> 55
<211> 367
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 成熟 FD-G4Fc的氨基酸序列
<400> 55
Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp
1 5 10 15
Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys
20 25 30
Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val
35 40 45
Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val
50 55 60
Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys
65 70 75 80
Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln
85 90 95
Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu
100 105 110
Ser Arg Lys Ala Val Arg Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Lys Tyr Gly Pro
130 135 140
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val
145 150 155 160
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
165 170 175
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
180 185 190
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
195 200 205
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
210 215 220
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
225 230 235 240
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
245 250 255
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
260 265 270
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
275 280 285
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
290 295 300
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
305 310 315 320
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
325 330 335
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
340 345 350
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360 365
<210> 56
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 成熟 WM-G24Fc的氨基酸序列
<400> 56
Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp
1 5 10 15
Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys
20 25 30
Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val
35 40 45
Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val
50 55 60
Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys
65 70 75 80
Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln
85 90 95
Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu
100 105 110
Ser Arg Lys Ala Val Arg Lys Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro
130 135 140
Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
145 150 155 160
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
165 170 175
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
180 185 190
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
195 200 205
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
210 215 220
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
225 230 235 240
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
245 250 255
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
260 265 270
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
275 280 285
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
290 295 300
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
305 310 315 320
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
325 330 335
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
340 345 350
Leu Ser Leu Gly Lys
355
<210> 57
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 成熟 NGF-1-15M7的氨基酸序列
<400> 57
Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp
1 5 10 15
Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys
20 25 30
Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val
35 40 45
Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val
50 55 60
Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys
65 70 75 80
Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln
85 90 95
Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu
100 105 110
Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
115 120 125
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val
130 135 140
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
145 150 155 160
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
165 170 175
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
180 185 190
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
195 200 205
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
210 215 220
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
225 230 235 240
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
245 250 255
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
260 265 270
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
275 280 285
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
290 295 300
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
305 310 315 320
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
325 330 335
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345 350
<210> 58
<211> 361
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 成熟 NGF-L3Fc10M7-5的氨基酸序列
<400> 58
Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp
1 5 10 15
Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys
20 25 30
Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val
35 40 45
Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val
50 55 60
Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys
65 70 75 80
Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln
85 90 95
Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu
100 105 110
Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
130 135 140
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
145 150 155 160
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
165 170 175
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
180 185 190
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
195 200 205
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
210 215 220
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
225 230 235 240
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
245 250 255
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
260 265 270
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
275 280 285
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
290 295 300
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
305 310 315 320
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
325 330 335
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
340 345 350
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360
<210> 59
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 成熟 2-1-15M7的氨基酸序列
<400> 59
Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Glu Ser Val Cys Asp
1 5 10 15
Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys
20 25 30
Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val
35 40 45
Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val
50 55 60
Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys
65 70 75 80
Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln
85 90 95
Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu
100 105 110
Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
115 120 125
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val
130 135 140
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
145 150 155 160
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
165 170 175
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
180 185 190
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
195 200 205
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
210 215 220
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
225 230 235 240
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
245 250 255
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
260 265 270
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
275 280 285
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
290 295 300
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
305 310 315 320
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
325 330 335
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345 350
<210> 60
<211> 349
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 成熟 NGF-4-12PAA的氨基酸序列
<400> 60
Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp
1 5 10 15
Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys
20 25 30
Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val
35 40 45
Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val
50 55 60
Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys
65 70 75 80
Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln
85 90 95
Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu
100 105 110
Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
115 120 125
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
130 135 140
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
145 150 155 160
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
165 170 175
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
180 185 190
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
195 200 205
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
210 215 220
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
225 230 235 240
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
245 250 255
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
260 265 270
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
275 280 285
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
290 295 300
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
305 310 315 320
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
325 330 335
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
340 345
<210> 61
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 成熟 2-118-L3Fc10-M1-5的氨基酸序列
<400> 61
Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Glu Ser Val Cys Asp
1 5 10 15
Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys
20 25 30
Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val
35 40 45
Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val
50 55 60
Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys
65 70 75 80
Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln
85 90 95
Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu
100 105 110
Ser Arg Lys Ala Val Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
130 135 140
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
145 150 155 160
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
165 170 175
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
180 185 190
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
195 200 205
Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
210 215 220
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
225 230 235 240
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
245 250 255
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
260 265 270
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
275 280 285
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
290 295 300
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
305 310 315 320
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
325 330 335
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
340 345 350
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360
<210> 62
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 成熟 2-118-L3Fc10-M3-5的氨基酸序列
<400> 62
Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Glu Ser Val Cys Asp
1 5 10 15
Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys
20 25 30
Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val
35 40 45
Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val
50 55 60
Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys
65 70 75 80
Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln
85 90 95
Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu
100 105 110
Ser Arg Lys Ala Val Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
130 135 140
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
145 150 155 160
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
165 170 175
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
180 185 190
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
195 200 205
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
210 215 220
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
225 230 235 240
Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
245 250 255
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
260 265 270
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
275 280 285
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
290 295 300
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
305 310 315 320
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
325 330 335
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
340 345 350
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360
<210> 63
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 成熟 NGF-118-L3Fc10-M3-5的氨基酸序列
<400> 63
Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp
1 5 10 15
Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys
20 25 30
Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val
35 40 45
Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val
50 55 60
Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys
65 70 75 80
Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln
85 90 95
Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu
100 105 110
Ser Arg Lys Ala Val Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
130 135 140
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
145 150 155 160
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
165 170 175
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
180 185 190
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
195 200 205
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
210 215 220
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
225 230 235 240
Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
245 250 255
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
260 265 270
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
275 280 285
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
290 295 300
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
305 310 315 320
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
325 330 335
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
340 345 350
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360
<210> 64
<211> 362
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 成熟 2-L3Fc10-M3-5的氨基酸序列
<400> 64
Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Glu Ser Val Cys Asp
1 5 10 15
Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys
20 25 30
Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val
35 40 45
Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val
50 55 60
Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys
65 70 75 80
Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln
85 90 95
Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu
100 105 110
Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
130 135 140
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
145 150 155 160
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
165 170 175
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
180 185 190
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
195 200 205
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
210 215 220
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
225 230 235 240
Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
245 250 255
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
260 265 270
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
275 280 285
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
290 295 300
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
305 310 315 320
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
325 330 335
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
340 345 350
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360
<210> 65
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 成熟 2-118-L3Fc10-M5-5的氨基酸序列
<400> 65
Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Glu Ser Val Cys Asp
1 5 10 15
Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys
20 25 30
Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val
35 40 45
Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val
50 55 60
Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys
65 70 75 80
Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln
85 90 95
Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu
100 105 110
Ser Arg Lys Ala Val Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
130 135 140
Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
145 150 155 160
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
165 170 175
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
180 185 190
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
195 200 205
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
210 215 220
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
225 230 235 240
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
245 250 255
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
260 265 270
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
275 280 285
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
290 295 300
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
305 310 315 320
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
325 330 335
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
340 345 350
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360
<210> 66
<211> 359
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 成熟 2-118-L3Fc10M7-5的氨基酸序列
<400> 66
Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Glu Ser Val Cys Asp
1 5 10 15
Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys
20 25 30
Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val
35 40 45
Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val
50 55 60
Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys
65 70 75 80
Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln
85 90 95
Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu
100 105 110
Ser Arg Lys Ala Val Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
130 135 140
Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
145 150 155 160
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
165 170 175
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
180 185 190
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
195 200 205
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
210 215 220
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
225 230 235 240
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
245 250 255
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
260 265 270
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
275 280 285
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
290 295 300
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
305 310 315 320
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
325 330 335
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
340 345 350
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355
<210> 67
<211> 365
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 成熟 2-118-L3G4-BM的氨基酸序列
<400> 67
Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Glu Ser Val Cys Asp
1 5 10 15
Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys
20 25 30
Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val
35 40 45
Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val
50 55 60
Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys
65 70 75 80
Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln
85 90 95
Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu
100 105 110
Ser Arg Lys Ala Val Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
130 135 140
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
145 150 155 160
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
165 170 175
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
180 185 190
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
195 200 205
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
210 215 220
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
225 230 235 240
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
245 250 255
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
260 265 270
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
275 280 285
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
290 295 300
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
305 310 315 320
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
325 330 335
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
340 345 350
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
355 360 365
<210> 68
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 68
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 69
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 69
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Ala
<210> 70
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头; (GGGGS)n，n为至少是1的整数
<400> 70
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 71
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 71
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser
20
<210> 72
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 72
Lys Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 73
<211> 1
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头; (G)n，n为至少是1的整数
<400> 73
Gly
1
<210> 74
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头; (GS)n，n为至少是1的整数
<400> 74
Gly Ser
1
<210> 75
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头; (GGS)n，n为至少是1的整数
<400> 75
Gly Gly Ser
1
<210> 76
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头; (GGGS)n，n为至少是1的整数
<400> 76
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 77
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头; (GGS)n(GGGS)n，n为至少是1的整数
<400> 77
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 78
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头; (GSGGS)n，n为至少是1的整数
<400> 78
Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 79
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头; (GGSGS)n，n为至少是1的整数
<400> 79
Gly Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 80
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 80
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 81
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 81
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 82
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 82
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 83
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 83
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
<210> 84
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 84
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 85
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 85
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 86
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 86
Gly Gly
1
<210> 87
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 87
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 88
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 88
Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 89
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 89
Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 90
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 90
Gly Ser Gly Gly Gly
1 5
<210> 91
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 91
Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 92
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 92
Gly Ser Ser Ser Gly
1 5
<210> 93
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 93
Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 94
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 94
Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 95
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 95
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 96
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头; (GA)n，n为至少是1的整数
<400> 96
Gly Ala
1
<210> 97
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 97
Gly Arg Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 98
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 98
Gly Arg Ala Gly Gly Gly
1 5
<210> 99
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 99
Ala Ser Thr Lys Gly Pro
1 5

Claims (39)

1.一种长效神经生长因子(NGF)多肽，从N端到C端包含NGF部分和Fc部分，所述NGF部分的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述Fc部分来自IgG1 Fc或IgG4 Fc。
2.根据权利要求1所述的长效NGF多肽，所述NGF部分通过多肽接头与Fc部分融合。
3.根据权利要求2所述的长效NGF多肽，所述多肽接头的氨基酸序列为SEQ ID NOs:68-72中任一所示。
4.根据权利要求2所述的长效NGF多肽，所述多肽接头为氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ IDNO:70)，且所述n为1、2、3、4、5或6中的任何一个。
5.根据权利要求1所述的长效NGF多肽，所述Fc部分来自氨基酸序列为SEQ ID NO:7或8的IgG1 Fc。
6.根据权利要求5所述的长效NGF多肽，所述Fc部分进一步缺失氨基酸序列SEQ ID NO:7或8的前5个氨基酸。
7.根据权利要求5或6所述的长效NGF多肽，所述Fc部分相对于SEQ ID NO:8包含L234A、L235A和P331S突变。
8.根据权利要求7所述的长效NGF多肽，所述Fc部分的氨基酸序列为SEQ ID NO:11或12。
9.根据权利要求8所述的长效NGF多肽，所述长效NGF多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:62。
10.根据权利要求5或6所述的长效NGF多肽，所述Fc部分相对于SEQ ID NO:8包含E233P、L234V、L235A、G236del、A327G、A330S和P331S突变。
11.根据权利要求10所述的长效NGF多肽，所述Fc部分的氨基酸序列为SEQ ID NO:15或16。
12.根据权利要求11所述的长效NGF多肽，所述长效NGF多肽的氨基酸序列为SEQ IDNO:66。
13.根据权利要求5或6所述的长效NGF多肽，所述Fc部分相对于SEQ ID NO:8包含L234A、L235E、G237A、A330S和P331S突变。
14.根据权利要求13所述的长效NGF多肽，所述Fc部分的氨基酸序列为SEQ ID NO:13或14。
15.根据权利要求14所述的长效NGF多肽，所述长效NGF多肽的氨基酸序列为SEQ IDNO:65。
16.根据权利要求5或6所述的长效NGF多肽，所述Fc部分相对于SEQ ID NO:8包含N297A突变。
17.根据权利要求16所述的长效NGF多肽，所述Fc部分的氨基酸序列为SEQ ID NO:9或10。
18.根据权利要求17所述的长效NGF多肽，所述长效NGF多肽的氨基酸序列为SEQ IDNO:61。
19.根据权利要求1所述的长效NGF多肽，所述Fc部分来自氨基酸序列为SEQ ID NO:17的IgG4 Fc。
20.根据权利要求19所述的长效NGF多肽，所述Fc部分相对于SEQ ID NO:17包含突变S228P、F234A和L235A。
21.根据权利要求20所述的长效NGF多肽，所述Fc部分的氨基酸序列为SEQ ID NO:18。
22.根据权利要求21所述的长效NGF多肽，所述长效NGF多肽的氨基酸序列为SEQ IDNO:67。
23.根据权利要求1所述的长效NGF多肽，当通过静脉注射、肌肉注射、眼内或皮下注射为人类个体给药时，所述长效NGF多肽的半衰期至少为10小时。
24.根据权利要求1所述的长效NGF多肽，与包含氨基酸序列为SEQ ID NO:3或4的NGF部分的NGF多肽相比，所述长效NGF多肽引起更少的疼痛。
25.一种编码权利要求1-24中任一项所述长效NGF多肽的核酸。
26.一种包含权利要求25所述核酸的载体。
27.一种包含权利要求26所述载体的宿主细胞。
28.一种药物组合物，包含权利要求1-24中任一项所述长效NGF多肽，权利要求25所述的核酸、权利要求26所述的载体或权利要求27所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体和/或辅料。
29.权利要求1-24中任一项所述的长效NGF多肽、权利要求25所述的核酸、权利要求26所述的载体、权利要求27所述的宿主细胞、或权利要求28所述的药物组合物在制备用于治疗NGF相关疾病药物中的用途。
30.根据权利要求29所述的用途，所述NGF相关疾病为神经系统疾病。
31.根据权利要求30所述的用途，所述神经系统疾病选自由新生儿缺氧缺血性脑病、脑瘫、危重症肌病、神经性耳聋、喉返神经损伤、创伤性脑损伤、牙神经损伤、脑卒中、唐氏综合征、肌萎缩性脊髓侧索硬化症，多发性硬化、脊髓性肌萎缩、弥漫性脑损伤、胸腺发育不良、视神经挫伤、滤泡发育不良、脊髓损伤、青光眼、神经营养性角膜炎、视神经损伤、视神经脊髓炎、视网膜相关疾病、尿失禁、阿尔茨海默症、帕金森病、亨廷顿病、痴呆、高血压脑出血神经功能障碍、脑小血管疾病、急性缺血性中风、角膜内皮营养不良、糖尿病神经性病变、糖尿病足溃疡、神经源性皮肤溃疡、压疮、神经营养性角膜溃疡、糖尿病性角膜溃疡和黄斑裂孔所组成的组中。
32.根据权利要求30或31所述的用途，所述神经系统疾病为糖尿病神经性病变、阿尔茨海默症或神经营养性角膜炎。
33.根据权利要求29所述的用途，所述NGF相关疾病为非神经系统疾病。
34.根据权利要求33所述的用途，所述非神经系统疾病选自由脾萎缩、脾挫伤、卵巢储备功能下降、卵巢早衰、卵巢过度刺激综合征、卵巢残余综合征、卵巢卵泡发育不良、生精障碍、缺血性溃疡、应激性溃疡、类风湿性溃疡、肝纤维化、角膜溃疡、烧伤、口腔溃疡和下肢静脉溃疡所组成的组中。
35.根据权利要求33或34所述的用途，所述非神经系统疾病为卵巢早衰或生精障碍。
36.根据权利要求35所述的用途，所述生精障碍选自少精子症，弱精子症或少弱精子症。
37.根据权利要求29所述的用途，所述药物组合物以每个个体0.01μg至1000μg的剂量给药。
38.根据权利要求29所述的用途，所述药物组合物以每周一次或每月一次的给药频率给药。
39.根据权利要求29所述的用途，所述药物组合物通过口服、皮下、静脉、脑内、鼻内、经皮、腹膜内、肌肉内、肺内、阴道、直肠、眼内或局部方式给药。
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