KR20230107663A

KR20230107663A - 지속형 신경 성장 인자 폴리펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20230107663A
Application number: KR1020237020217A
Authority: KR
Inventors: 핑 리; 레이 장
Original assignee: 스테이드슨 (베이징) 바이오팔마슈티칼스 캄퍼니 리미티드
Priority date: 2020-11-19
Filing date: 2021-11-19
Publication date: 2023-07-17
Also published as: CA3199589A1; CN117946281A; ZA202306005B; EP4247841A1; WO2022105847A1; AU2021384629A1; TW202229322A; CN114829384B; CN114829384A; JP2023551440A; AU2021384629B2

Abstract

N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 신경 성장 인자(NGF) 폴리펩타이드, 이의 제조 방법 및 용도가 제공된다.

Description

지속형 신경 성장 인자 폴리펩타이드 및 이의 용도

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2020년 11월 19일에 출원된 국제 특허 출원 PCT/CN2020/129925의 우선권을 주장하며, 그 내용은 전체적으로 참조로 본 명세서에 포함된다.

ASCII 텍스트 파일에 대한 서열 목록의 제출

ASCII 텍스트 파일에 대한 다음 제출물의 내용은 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다: 서열목록의 컴퓨터 판독 가능 형식(CRF)(파일명: 202009094982_SEQLIST.txt, 기록 날짜: 2020년 9월 9일, 크기: 169KB).

발명의 분야

본 발명은 N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티(moiety) 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 신경 성장 인자(NGF) 폴리펩타이드, 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.

뉴로트로핀은 척추동물 신경계의 발달 및 성인 단계에서 뉴런의 생존 및 유지에 중요한 성장 인자의 고도로 상동성인 계열(family)이다. 제한된 뉴로트로핀 생산은 말초 신경계(PNS) 또는 중추 신경계(CNS)에서 뉴런의 변성 또는 사멸로 이어질 수 있다.

신경 성장 인자(NGF)는 1953년 이탈리아 과학자 Levi-Montlcini가 마우스 육종 세포에서 발견한 뉴로트로핀 계열의 첫 번째 구성원이다. NGH는 신경세포 영양과 신경돌기 성장 촉진의 이중 생물학적 기능을 갖는 신경세포 성장 조절제로서, 중추 및 말초 뉴런의 기능적 특성의 발달, 분화, 성장, 재생 및 발현에 중요한 조절 역할을 수행한다. NGF는 α, β 및 γ의 세 가지 하위 단위를 포함한다. β 소단위는 비공유 결합을 통해 두 개의 단일 사슬이 결합하여 형성되는 활성 영역이다.

NGF는 수십 년 동안 연구되어 왔다. 그러나 NGF 제품은 시중에 거의 없으며 대부분이 각막궤양, 시신경 좌상, 시신경 손상을 포함하는 안과 질환 치료에 주로 사용된다. 근본적인 이유는 실제 적용의 한계와 문제점에 있다.

다른 단백질과 마찬가지로 NGF의 생물학적 활성은 2차 및 3차 구조에 의존하므로 제조, 정제, 보관 및 투여 과정에서 생물학적 활성을 유지하는 것이 특히 중요하다.

또한, NGF는 통증을 유발할 수 있으며, 이는 일부 환자가 적용하는 동안 견딜 수 없기 때문에 부분적으로 사용이 제한된다. 통증은 신경생리학적 기전에 따라 감각통과 신경병증성 통증의 두 가지 유형으로 나눌 수 있다. 전자는 유해자극에 의해 직접적으로 발생하는 것으로 조직손상이나 염증반응과 관련이 있으며 염증성 통증이라고도 한다. 후자는 체감각신경계의 손상이나 질병에 의해 직접적으로 발생하는 만성통증이다. NGF는 염증 매개체의 방출, 이온 채널의 개방에 영향을 미치고 통증을 유발하는 신경 섬유의 성장을 촉진함으로써 통증의 병태생리학적 과정에 관여하며; 이온 채널과 분자 신호 조절을 통해 통증 발생에 관여한다. 일부 학자들은 NGF가 통증 유발 물질의 발현 촉진을 통해 통증을 유발할 수도 있으며 유기체 손상 후 신경 세포의 발아(budding) 및 재생을 변화시킬 수 있다고 추측한다. 연구에 따르면 인간에게 통각과민을 일으키지 않는 최대 용량은 약 0.03μg/kg이다(Petty et al., Ann Neurol. 1994; 36(2):244-246). 그러나 이러한 저용량은 NGF의 적용을 제한하고 또한 중추신경계에 대한 사용과 같은 적응증의 확장을 제한한다.

단백질 약물로서 신경 성장을 촉진하는 NGF의 활성 부분은 주로 β-NGF에 있다. β-NGF는 침강계수 2.5S, 분자량 13.5KDa로 대사과정에서 사구체에 의해 쉽게 걸러져 인비보(in vivo)에서 반감기가 짧다. 연구에 따르면 β-NGF 약물을 근육주사한 마우스는 T1/2(β) = 2.2시간, Tmax = 0.5시간이며, 주사 빈도는 하루에 한 번이었다. NGF를 주사하는 동안 주사 부위 또는 주사측 하지(lower limb)의 통증 부작용으로 인해, 총 투여 횟수 및 빈도를 줄이는 것이 바람직할 것이다.

본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및 공개된 특허 출원의 개시 내용은 그들의 전체 내용이 본 명세서에 참고로 포함된다.

본 개시는 지속형 신경 성장 인자 폴리펩타이드 및 이의 용도를 제공한다.

발명의 간단한 요약

본 출원의 한 양태는 N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 신경성장인자(NGF) 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서 NGF 모이어티는 서열번호: 1~4 중 어느 하나의 아미노산 서열(서열번호: 1~3 중 어느 하나와 같은 서열)을 포함하며, 여기서 Fc 모이어티는 IgG1 Fc 또는 IgG4 Fc로부터 유래한다.

상기 기재된 지속형 NGF 폴리펩타이드 중 임의의 하나에 따른 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 펩타이드 링커를 통해 Fc 모이어티에 융합된다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 서열번호: 68-99 중 어느 하나, 예를 들어 서열번호: 68-72, 또는 서열번호: 68 또는 69 중 어느 하나와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 (GGGGS)n(서열번호: 70)의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 중 어느 하나이다.

상기 기재된 지속형 NGF 폴리펩타이드 중 임의의 하나에 따른 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8의 아미노산 서열을 포함하는 IgG1 Fc로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 8에 비해 E233, L234, L235, G236, G237, N297, A327, A330, 및 P331 중 어느 하나 이상으로부터 선택되는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 8에 비해 E233P, L234V, L234A, L235A, L235E, G236del, G237A, N297A, A327G, A330S, 및 P331S 중 어느 하나 이상으로부터 선택되는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8의 처음 5개 아미노산이 추가로 결여된다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 8에 상대적인 L234A, L235A 및 P331S 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 11 또는 12의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드는 서열번호: 62-64 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 8에 비해 E233P, L234V, L235A, G236del, A327G, A330S 및 P331S 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 15 또는 16의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드는 서열번호: 66의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 8에 비해 L234A, L235E, G237A, A330S 및 P331S 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 13 또는 14의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드는 서열번호: 65의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 8에 비해 N297A 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 9 또는 10의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드는 서열번호: 61의 아미노산 서열을 포함한다.

상기 기재된 지속형 NGF 폴리펩타이드 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 IgG4 Fc로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 17에 상대적으로 S228, F234 및 L235 중 하나 이상으로부터 선택된 위치에서 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 17에 상대적으로 S228P, F234A 및 L235A 중 하나 이상으로부터 선택되는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 18의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드는 서열번호: 67의 아미노산 서열을 포함한다.

상기 기재된 지속형 NGF 폴리펩타이드 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드는 개인(예를 들어 인간)에게 정맥내, 근육내 또는 피하 투여 시 반감기가 적어도 약 10시간(예를 들어, 적어도 약 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90 또는 100시간)이다.

상기 기재된 지속형 NGF 폴리펩타이드 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드는 서열번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 NGF 모이어티를 포함하는 NGF 폴리펩타이드에 비해 통증을 덜 유발한다(예를 들어, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 미만의 통증).

또한 본 명세서에 기술된 임의의 지속형 NGF 폴리펩타이드를 인코딩하는 단리된 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터, 이러한 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포(예를 들어, CHO 세포, HEK 293 세포, Hela 세포 또는 COS 세포), 조성물(예를 들면, 약학적 조성물), 키트, 본 명세서에 기술된 임의의 지속형 NGF 폴리펩타이드를 포함하는 제조품이 제공된다. 본 명세서에 기술된 임의의 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 그의 약학적 조성물을 사용하여 개인(예를 들어, 인간)에서 NGF 관련 질환(예를 들어, 신경계 질환 또는 비신경계 질환)을 치료하는 방법이 또한 제공된다.

본 개시는 지속형 신경 성장 인자 폴리펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

도 1A-1F는 인간 야생형 IgG1 Fc IGHG1*05 및 IgG1 Fc 천연 변이체 IGHG1*03(도 1A), 변형된 IgG1 Fc M1-5 및 IGHG1*03(도 1B), 변형된 IgG1 Fc M3-5 및 IGHG1*03(도 1C), 변형된 IgG1 Fc M5-5 및 IGHG1*03(도 1D), 변형된 IgG1 Fc M7 및 IGHG1*03(도 1E), 및 변형된 IgG4 Fc 및 인간 야생형 IgG4 Fc(도 1F)에 대한 서열 정렬을 도시한다.
도 2는 신호 펩티드(SP), 프로펩티드 및 성숙한 NGF를 함유하는 preproNGF의 구조를 도시한다. 주요 절단 부위에서의 푸린 절단은 proNGF에서 성숙한 NGF로의 과정을 담당한다.
도 3A-3M은 상이한 시점에서 40℃ 가속 안정성 시험 하에서 다양한 성숙 NGF-Fc 융합 단백질의 응집체 %, 단편 % 및 단량체 %의 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 측정을 도시한다.
도 4A-4M은 상이한 시점에서 40℃ 가속 안정성 시험 하에서 다양한 성숙 NGF-Fc 융합 단백질의 모세관 전기영동-소듐도데실설페이트(CE-SDS) 측정을 도시한다.
도 5A-5B는 다양한 NGF-Fc 융합 단백질에 의해 처리된 TF-1 세포 증식 활성을 도시한다. SuTaiSheng® 마우스 NGF, 돌연변이 NGF 118aa(mNGF118) 및 재조합 인간 NGF(rhNGF)가 대조군으로 사용되었다.
도 6A-6D는 래트(rat)의 인비보(in vivo) 성장에서 우수한 경추 신경절(SCG)에 대한 다양한 NGF-Fc 융합 단백질의 생체활성을 도시한다. SuTaiSheng® 마우스 NGF 및 mNGF118은 대조군으로 사용되었다. PBS는 음성 대조군으로 사용되었다.
도 7A는 혈장에서 2-118-L3Fc10-M3-5, 2-118-L3G4-BM 및 mNGF118 대조군(Fc 융합이 없는 돌연변이체 β-NGF 118aa)의 약동학(PK) 프로파일을 도시한다. 도 7B는 235 μg/kg으로 근육내 주사될 때 인비보(in vivo) 반감기를 도시한다.
도 8은 NGF(SuTaiSheng® 마우스 NGF 또는 mNGF118) 또는 NGF-Fc 융합 단백질(2-118-L3Fc10-M3-5 또는 2-118-L3G4-BM)로 처리된 당뇨병 마우스의 상처 봉합률을 도시한다. PBS 처리는 음성 대조군으로 사용되었다.
도 9A-9B는 NGF(SuTaiSheng® 마우스 NGF 또는 mNGF118) 또는 NGF-Fc 융합 단백질(2-118-L3Fc10-M3- 5 또는 2-118-L3G4-BM)로 처리된 인간 난소 과립막 유사 종양 세포주(KGN)의 증식률 및 분비된 에스트로겐 농도를 도시한다. 도 9C는 NGF(SuTaiSheng® 마우스 NGF 또는 mNGF118) 또는 NGF-Fc 융합 단백질(2-118-L3Fc10-M3-5 또는 2-118-L3G4-BM)로 처리된 조기 난소 부전의 래트 모델에서 난포의 수를 도시한다.
도 10A 및 10B는 NGF(SuTaiSheng® 마우스 NGF 또는 mNGF118), NGF-Fc 융합 단백질(2- 118-L3Fc10-M3-5 또는 2-118-L3G4-BM), 또는 음성 대조군으로서 0.9% 염화나트륨 용액으로 처리된 신경영양성 각막염의 래트 모델의 각막 플루오레세인 나트륨 염색 점수(도 10A) 및 평균 각막 신경 길이(도 10B)를 도시한다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드를 제공한다. "지속형 NGF 폴리펩타이드", "지속형 NGF-Fc 융합 단백질" 및 "지속형 NGF 구성"이라는 용어는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.

NGF는 중추 및 말초 뉴런의 기능적 특성의 발달, 분화, 성장, 재생 및 발현에서 중요한 조절 역할을 한다. 이는 약시, 신경종, 다양한 신경 손상 및 신경계 질환을 포함한 신경계 이형성증의 치료에 사용되었다. 그러나 통증 유발, 짧은 인비보(in vivo) 반감기, 통각 과민을 피하기 위한 낮은 용량 제한, 빈번한 투여 등의 부작용으로 인해 NGF의 광범위한 적용이 제한된다. 더 긴 반감기 및/또는 더 큰 분자량을 갖는 모이어티에 단백질 약물을 융합시키는 것은 특정 단백질 약물의 지속성 활성을 가능하게 하는 전략이다. 그러나 반감기를 연장하면서 단백질 약물의 생물학적 활성을 증가시키거나 유지하는 것은 여전히 임상적으로 어려운 문제이다.

본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드는 다음의 우수한 효과 중 하나 이상을 갖는다: 1) 인비트로 및 인비보 모두에서, 이용 가능한 NGF-Fc 융합 단백질 또는 NGF 약물보다 훨씬 우수한 생물학적 활성(예를 들어 우수한 자궁경부 신경절 성장 촉진)이 있으며; 2) 인비보에서 반감기가 매우 길어 융합 모이어티가 없는 NGF 단백질에 비해 월등히 길 뿐만 아니라, 시판되는 NGF-Fc 융합 단백질에 비해 월등히 길어, 투여 빈도 및 총 투여횟수를 감소시켜 편의성을 제공하고 환자에게 드는 비용을 감소시키며; 3) 통증 등의 부작용을 경감시키거나 심지어 무통증까지 가능하게 하여, 환자가 견딜 수 있는 용량을 증가시켜 적응증 확대 및 중추신경계에 적용 가능성을 제공하며; 4) 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)이 감소되거나 최소화되어 치료 중 바람직하지 않은 면역 반응을 피하며; 5) 우수한 열 안정성(예를 들어 높은 용융 온도(Tm) 및/또는 높은 개시 응집 온도(Tagg))을 가지며; 6) 단편화, 응집체 형성 및/또는 응집체 증가가 적거나 없는 가속된 응력(예를 들어 가열) 하에서 우수한 안정성을 가져 약물 특성을 유지하며; 및 7) 인비보에서 NGF 관련 질환, 예를 들어 당뇨병성 신경병증, 알츠하이머병, 신경영양성 각막염과 같은 신경계 질환, 조기 난소 부전 및 정자 형성 장애(예를 들어 정자감소증(oligozoospermia), 정자무력증(asthenospermia), 감약정자증(oligoasthenospermia))와 같은 비신경계 질환을 치료하는데 매우 효과적이며, 비-Fc 융합 NGF 모이어티에 비해 유사하거나 보다 나은 치료 효능을 갖는다.

따라서, 본 출원의 한 측면은 N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서 NGF 모이어티는 서열번호: 1-4 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며, Fc 모이어티는 IgG1 Fc 또는 IgG4 Fc로부터 유래된다.

또한 이러한 지속형 NGF 폴리펩타이드를 인코딩하는 단리된 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터, 이러한 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포, 이러한 지속형 NGF 폴리펩타이드를 생산하는 방법, 이러한 지속형 NGF 폴리펩타이드를 포함하는 약학적 조성물 및 제조품, 이러한 지속형 NGF 폴리펩타이드, 또는 이의 약학적 조성물로 질병(예를 들어, 당뇨병성 신경병증, 알츠하이머병 및 신경영양성 각막염과 같은 신경 변성 또는 손상과 관련된 신경계 질환, 조기 난소 부전 및 정자 형성 장애와 같은 비신경계 질환)을 치료하는 방법이 제공된다.

I. 정의

본 발명의 실시는 달리 구체적으로 나타내지 않는 한, 당해 분야의 기술 범위 내에서 바이러스학, 면역학, 미생물학, 분자 생물학 및 재조합 DNA 기술의 통상적인 방법을 사용할 것이며, 이들 중 다수는 설명의 목적으로 하기에 기재되어 있다. 이러한 기술은 논문에 완전히 설명되어 있다. 예를 들어 Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, N.Y. (2009); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., John Wiley & Sons, 1995; Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2001); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I&II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984) 및 기타 유사한 참고문헌을 참조한다.

본 명세서에서 사용되는 "치료(treatment)" 또는 "치료하는(treating)"은 임상 결과를 포함하는 유익하거나 원하는 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적을 위해 유익하거나 원하는 임상 결과는 다음 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 질병으로 인한 하나 이상의 증상 완화, 질병의 정도 감소, 질병 안정화(예를 들어 질병 악화 예방 또는 지연), 질병 확산 예방 또는 지연, 질병 재발 예방 또는 지연 , 질병 진행 지연 또는 둔화, 질병 상태 개선, 질병의 차도(부분 또는 전체) 제공, 질병 치료에 필요한 하나 이상의 다른 약물의 용량 감소, 질병 진행 지연, 삶의 질 증가 및/또는 생존 기간 연장. 또한 "치료"는 질병의 병리학적 결과의 감소를 포함한다. 본 발명의 방법은 이러한 치료 측면 중 임의의 하나 이상을 고려한다. 예를 들어, 질병으로 인한 증상 감소, 질병으로 고통받는 사람들의 삶의 질 향상, 질병 치료에 필요한 다른 약물의 용량 감소 및/또는 개인의 생존 연장을 포함하나 이에 제한되지 않는 질병과 관련된 하나 이상의 증상이 완화되거나 제거되면 개인은 성공적으로 "치료"된다.

"예방하다"라는 용어 및 "예방되는", "예방하는" 등과 같은 유사한 단어는 질병 또는 상태의 재발 가능성을 예방, 억제, 또는 감소시키기 위한 접근법을 나타낸다. 또한 질병 또는 상태의 재발을 지연시키거나 질병 또는 상태의 증상의 재발을 지연시키는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 "예방" 및 유사한 단어는 또한 질병 또는 상태의 재발 전에 질병 또는 상태의 강도, 효과, 증상 및/또는 부담을 감소시키는 것을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 질병의 발달을 "지연"시키는 것은 질병의 발달을 연기, 방해, 둔화, 지체, 안정화 및/또는 지연시키는 것을 의미한다. 이 지연은 질병 및/또는 치료 중인 개인의 병력에 따라 다양한 시간이 될 수 있다. 질병의 발달을 "지연"시키는 방법은 그 방법을 사용하지 않을 때와 비교할 때 주어진 시간 프레임에서 질병 발병 확률을 감소 및/또는 주어진 시간 프레임에서 질병의 정도를 감소시키는 방법이다. 이러한 비교는 일반적으로 통계적으로 상당한 수의 개인을 사용하는 임상 연구를 기반으로 한다.

본 명세서에서 사용되는 "유효량"이라는 용어는 특정 장애, 상태 또는 질병을 치료하기에, 예를 들어 하나 이상의 증상의 개선, 완화, 경감 및/또는 지연하기에 충분한 작용제 또는 작용제의 조합의 양을 의미한다. 일부 실시양태에서, 유효량은 질병 발달을 지연시키기에 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 질병 재발을 예방하거나 지연시키기에 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유효량의 약물 또는 조성물은 (i) 뉴런 생존을 지원; (ii) 신경돌기 성장 촉진; (iii) 신경화학적 분화를 강화; (iv) 췌장 β 세포의 증식 촉진; (v) 선천적 및/또는 후천적 면역을 유도; (vi) 질병의 발생 및/또는 재발을 예방 또는 지연; 및/또는 (vii) 질병과 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도 완화할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 "개체" 또는 "대상체"는 인간, 소, 말, 고양이, 개, 설치류 또는 영장류를 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유동물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 개체는 인간이다.

"불변 도메인"이라는 용어는 항원-결합 부위를 포함하는 가변 도메인인 면역글로불린의 다른 부분에 비해 더 보존된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 분자의 부분을 지칭한다. 불변 도메인은 중쇄의 C_H1, C_H2 및 C_H3 도메인(통칭하여 C_H) 및 경쇄의 CHL(또는 C_L) 도메인을 포함한다. 면역글로불린 중쇄(C_H)의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 부류 또는 이소타입으로 지정될 수 있다. IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개 부류의 면역글로불린이 있으며, 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지정된 중쇄를 가진다. γ 및 α 부류는 C_H 서열 및 기능의 비교적 작은 차이에 기초하여 하위 부류로 추가로 나뉘며, 예를 들어 인간은 다음 하위 부류를 발현한다: IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2.

본 명세서에서 "Fc 영역", "단편 결정화 가능 영역", "Fc 도메인" 또는 "Fc 모이어티"라는 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는 데 사용된다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 Cys226 위치의 아미노산 잔기 또는 Pro230에서 카복실 말단까지 뻗어 있는 것으로 정의된다. Fc 영역의 C-말단 리신(EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은 예를 들어 단백질의 생산 또는 정제 동안 또는 단백질을 인코딩하는 핵산을 재조합적으로 조작함으로써 제거될 수 있다. 본 명세서에 기술된 구성에 사용하기에 적합한 천연 서열 Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2(IgG2A, IgG2B), IgG3 및 IgG4를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 IgG "이소타입" 또는 "하위부류"라는 용어는 이들의 불변 영역의 화학적 및 항원성 특징에 의해 정의되는 면역글로불린의 임의의 하위부류를 의미한다. 면역글로불린에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5가지 주요 부류가 있으며, 이들 중 몇몇은 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2와 같은 하위부류(이소타입)로 추가로 나뉠 수 있다. 서로 다른 종류의 면역글로불린에 해당하는 중쇄 불변 도메인을 각각 α, γ, ε, γ 및 μ라고 한다. 상이한 종류의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 구성은 잘 알려져 있고 예를 들어 Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W.B. Saunders, Co., 2000)에 일반적으로 설명되어 있다.

"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 Fc 함유 구성(예를 들어, 항체)의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술한다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 더욱이, 바람직한 FcR은 IgG 항체(감마 수용체)에 결합하는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위클래스의 수용체를 포함하며, 이들 수용체의 대립형질 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태를 포함하며, FcγRII 수용체는 FcγRIIA("활성화 수용체") 및 FcγRIIB("억제 수용체")를 포함하며, 주로 그의 세포질 도메인이 다른 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 세포질 도메인에 면역 수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 세포질 도메인에 면역수용체 티로신 기반 억제 모티프(ITIM)를 포함한다(M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997) 참조). FcRs은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)에서 리뷰되었다. 미래에 확인될 FcR을 포함하는 다른 FcR은 본 명세서에서 "FcR"이라는 용어에 포함된다.

"Fc 수용체" 또는 "FcR"이라는 용어는 또한 모체 IgG를 태아로 전달하는 역할을 하는 신생(neonatal) 수용체 FcRn을 포함한다. Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994). FcRn에 대한 결합을 측정하는 방법은 공지되어 있다(예를 들어 Ghetie and Ward, Immunol. Today 18: (12): 592-8 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology 15 (7): 637-40 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279 (8): 6213-6 (2004); WO 2004/92219 (Hinton et al.) 참조한다. 인간 FcRn 고친화성 결합 폴리펩타이드의 인비보에서 FcRn에 대한 결합 및 혈청 반감기는 예를 들어 인간 FcRn을 발현하는 트랜스제닉 마우스 또는 형질감염된 인간 세포주에서, 또는 변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩타이드가 투여되는 영장류에서 분석될 수 있다. WO 2004/42072(Presta)는 FcR에 대한 결합을 개선하거나 감소시킨 항체 변이체를 기술한다. 예를 들어, Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) 참조한다.

"항체 이펙터(effector) 기능"은 Fc 함유 구성(예를 들어 항체)의 Fc 영역(천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인할 수 있는 생물학적 활성을 말하며 Fc 이소타입에 따라 다르다. 항체 이펙터 기능의 예시는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체(예를 들어 B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다. "감소 또는 최소화된" 항체 이펙터 기능은 야생형 또는 변형되지 않은 Fc 함유 구성(예를 들어 항체)으로부터 적어도 50%(대안적으로 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%) 감소된 것을 의미한다. 항체 이펙터 기능의 결정은 당업자에 의해 쉽게 결정되고 측정될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 보체 결합, 보체 의존성 세포독성 및 항체 의존성 세포독성의 항체 이펙터 기능이 영향을 받는다. 일부 실시양태에서, 이펙터 기능은 글리코실화를 제거한 불변 영역에서의 돌연변이, 예를 들어 "이펙터리스(effectorless) 돌연변이"를 통해 제거된다. 일부 실시양태에서, 이펙터리스 돌연변이는 C_H2 영역의 N297A 또는 DANA 돌연변이(D265A+N297A)이다. Shields et al., J. Biol. Chem. 276 (9): 6591-6604 (2001). 또는 이펙터 기능을 감소시키거나 제거하는 추가 돌연변이에는 K322A 및 L234A/L235A(LALA)가 포함된다. 대안적으로, 이펙터 기능은 글리코실화하지 않는 숙주 세포(예를 들어, 대장균)에서의 발현과 같은 생산 기술을 통해 감소되거나 제거될 수 있거나, 이펙터 기능 촉진에 비효과적이거나 덜 효과적인 변경된 글리코실화 패턴을 초래한다 (예를 들어, Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278(5): 3466-3473 (2003).

"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 ADCC는 분비된 Ig(또는 리간드-Fc 구성)가 이러한 세포독성 이펙터 세포가 항원 함유(또는 리간드 수용체 함유) 표적 세포에 특이적으로 결합하고 이어서 세포독소로 표적 세포를 죽일 수 있게 하는 특정 세포독성 세포(예를 들어, 자연 살해(NK) 세포, 호중구 및 대식세포)에 존재하는 Fc 수용체(FcRs)에 결합되는 세포독성의 형태를 의미한다. 항체(또는 Fc 함유 구성)는 세포독성 세포를 "무장(arm)"시키고 이 메커니즘에 의해 표적 세포를 죽이는 데 필요하다. ADCC를 매개하는 일차세포인 NK세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포에서의 Fc 발현은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991)의 464 페이지에 표 2에 요약된다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 미국등록특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호에서 기술된 것처럼 인비트로 ADCC 분석이 수행될 수 있다. 이러한 분석에 유용한 이펙터 세포에는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포가 포함된다. 대안적으로 또는 추가로 관심 분자의 ADCC 활성은 예를 들어 Clynes et al., PNAS USA 95:652-656 (1998)에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 인비보에서 평가될 수 있다.

"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에 표적 세포가 용해되는 것을 의미한다. 고전적인 보체 경로의 활성화는 Fc에 융합된 리간드를 통해 동족 수용체에 결합된 Fc 함유 구성(적절한 하위 부류의)에 대한 보체 시스템(C1q)의 첫 번째 구성요소의 결합에 의해 시작된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)에 기술된 것처럼 CDC 분석이 수행될 수 있다. 변경된 Fc 영역 아미노산 서열 및 증가 또는 감소된 C1q 결합 능력을 갖는 항체 변이체는 미국특허번호 6,194,551B1 및 WO99/51642에 기술된다. 이들 특허공보의 개시 내용은 본 명세서에 참조로 구체적으로 포함된다. 또한, Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000) 참조한다.

본 명세서에 사용된 "특이적으로 결합하다", "특이적으로 인식하다" 또는 "특이적이다"라는 용어는 리간드 및 수용체 사이의 결합과 같은 측정가능하고 재현가능한 상호작용을 지칭하며, 이는 생물학적 분자를 포함한 분자의 이질적인 집단의 존재하에서 리간드의 존재를 결정한다. 예를 들어, 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드는 다른 수용체에 결합하는 것보다 더 큰 친화성, 결합력, 더 쉽게 및/또는 더 긴 지속 시간으로 이 수용체에 결합하는 리간드이다. 일부 실시양태에서, 관련되지 않은 수용체에 대한 리간드의 결합 정도는 예를 들어 방사면역분석(RIA)에 의해 측정된 바와 같이 표적 수용체에 대한 리간드의 결합의 약 10% 미만이다. 일부 실시양태에서, 표적 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드는 ≤10^-5 M, ≤10^-6 M, ≤10^-7 M, ≤10^-8 M, ≤10^-9 M, ≤10^-10 M, ≤10^-11 M, 또는 ≤10^-12 M의 평형 해리 상수(K_d)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 리간드는 상이한 종으로부터의 수용체 사이에 보존된 수용체에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 특이적 결합은 배타적 결합을 포함할 수 있지만 요구하지는 않는다. 리간드의 결합 특이성은 당업계에 공지된 방법에 의해 실험적으로 결정될 수 있다. 이러한 방법은 웨스턴 블롯, ELISA-, RIA-, ECL-, IRMA-, EIA-, BIACORE^TM-테스트 및 펩타이드 스캔을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

"결합 친화도"는 일반적으로 분자의 단일 결합 부위(예를 들어 리간드) 및 그의 결합 파트너(예를 들어 수용체) 사이의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 의미한다. 달리 나타내지 않는 한, 본 명세서에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화성을 의미한다. 결합 친화도는 K_d, K_off, K_on, 또는 K_a로 나타낼 수 있다. 본 명세서에 사용된 "K_off"라는 용어는 s^-1 단위로 표현되는 반응 속도 선택 설정으로부터 결정된 리간드/수용체 복합체로부터 리간드의 해리에 대한 오프(off) 속도 상수를 지칭하도록 의도된다. 본 명세서에서 사용되는 "K_on"이라는 용어는 M^-1s^-1 단위로 표현되는 리간드/수용체 복합체를 형성하기 위해 수용체에 대한 리간드의 회합에 대한 온(on) 속도 상수를 지칭하도록 의도된다. 본 명세서에서 사용되는 평형 해리 상수 "Kd"라는 용어는 특정 리간드-수용체 상호작용의 해리 상수를 의미하고, 평형에서 수용체 용액에 존재하는 모든 수용체의 절반을 차지하는 데 필요한 리간드 농도를 기술하며, K_off/K_on과 같으며 M 단위로 표시된다. K_d의 측정은 모든 결합제가 용액에 있음을 전제로 한다. 수용체가 세포막에 있는 경우, 상응하는 평형 속도 상수는 EC50으로 표현되며, 이는 K_d의 좋은 근사치를 제공한다. 친화 상수 K_a는 M^-1 단위로 표현되는 해리 상수 K_d의 역수이다. 해리 상수(Kd)는 수용체에 대한 리간드의 친화성을 나타내는 지표로 사용된다. 이러한 방법을 사용하여 도출할 수 있는 K_d값은 M(mol/L) 단위로 표시된다.

반 최대 억제 농도(IC₅₀)는 특정 생물학적 또는 생화학적 기능을 억제하는 물질(예를 들어 리간드)의 유효성을 측정한 것이다. 이는 주어진 생물학적 과정을 절반으로 억제하는 데 필요한 특정 약물 또는 기타 물질(억제제, 예를 들어 리간드)의 양을 나타낸다. 값은 일반적으로 몰 농도로 표시된다. IC₅₀은 작용제 약물 또는 기타 물질(예를 들어 리간드)의 "EC₅₀"과 유사하다. EC₅₀은 또한 인비보에서 최대 효과의 50%를 얻는 데 필요한 혈장 농도를 나타낸다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "IC₅₀"은 인비트로에서 수용체 생물활성의 50%를 중화시키는데 필요한 리간드의 유효 농도를 나타내기 위해 사용된다. IC₅₀ 또는 EC₅₀은 FACS 분석(경쟁 결합 분석)에 의한 리간드 결합의 억제, 세포 기반 사이토카인 방출 분석 또는 증폭된 발광 근접 동종 분석(AlphaLISA)과 같은 생물학적 분석에 의해 측정될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 "공유 결합"은 하나 이상의 전자를 공유하는 2개의 원자 사이의 안정한 결합을 의미한다. 공유 결합의 예시는 펩티드 결합 및 이황화 결합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에서 사용되는 "펩티드 결합"은 아미노산의 카르복실기와 인접한 아미노산의 아민기 사이에 형성된 공유 결합을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 "이황화 결합"은 하나 이상의 이황화 결합에 의한 2개의 Fc 단편의 조합과 같이 2개의 황 원자 사이에 형성된 공유 결합을 의미한다. 2개의 단편에서 티올기를 연결함으로써 2개의 단편 사이에 하나 이상의 이황화 결합이 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 2개의 Fc 단편의 하나 이상의 시스테인 사이에 하나 이상의 이황화 결합이 형성될 수 있다. 이황화 결합은 2개의 티올 그룹의 산화에 의해 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 공유 결합은 공유 결합에 의해 직접 연결된다. 일부 실시양태에서, 공유 결합은 펩티드 결합 또는 이황화 결합에 의해 직접 연결된다.

펩티드 또는 폴리펩타이드 서열에 대한 "백분율(%) 아미노산 서열 동일성" 및 "상동성"은 필요한 경우 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 서열 정렬 및 갭을 도입한 이후, 서열 동일성의 일부로 임의의 보존적 치환을 고려하지 않은, 특정 펩티드 또는 폴리펩타이드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 목적을 위한 정렬은 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 MEGALIGN^TM(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당업계의 기술 내에 있는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 폴리펩타이드의 "C 말단"은 인접한 아미노산 잔기의 카르복실기와 펩티드 결합을 형성하기 위해 아민기를 제공하는 폴리펩타이드의 마지막 아미노산 잔기를 지칭한다. 본 명세서에 사용된 폴리펩타이드의 "N 말단"은 인접한 아미노산 잔기의 아민기와 펩티드 결합을 형성하기 위해 카르복실기를 제공하는 폴리펩타이드의 첫 번째 아미노산을 의미한다.

"단리된" 폴리펩타이드는 생산 환경(예를 들어, 천연 또는 재조합)의 구성요소로부터 확인, 분리 및/또는 회수된 것이다. 바람직하게는, 단리된 폴리펩타이드는 그의 생산 환경으로부터의 모든 다른 성분과 회합되지 않는다. 재조합 형질감염 세포에서 생성된 것과 같은 생산 환경의 오염 성분은 일반적으로 폴리펩타이드에 대한 연구, 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이며 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 (1) 예를 들어, Lowry 방법에 의해 결정된 바와 같이 95중량% 초과의 폴리펩타이드, 일부 실시양태에서는 99중량% 초과의 폴리펩타이드로; (2) 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 얻기에 충분한 정도로; 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 비환원 또는 환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의한 균질성을 위해 정제될 것이다. 단리된 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 자연 환경의 적어도 하나의 구성요소가 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내의 제자리(in situ) 폴리펩타이드를 포함한다. 그러나 일반적으로 단리된 폴리펩타이드는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

구성(본 명세서에 기술된 NGF 폴리펩타이드와 같은 구성)을 인코딩하는 "단리된" 핵산 분자는 이것이 생산되는 환경에서 일반적으로 결합되는 적어도 하나의 오염 핵산 분자로부터 식별되고 분리된 핵산 분자이다. 바람직하게는, 단리된 핵산은 생산 환경과 관련된 모든 구성요소와 관련이 없다. 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드를 인코딩하는 단리된 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 설정 이외의 형태이다. 따라서 단리된 핵산 분자는 세포에 자연적으로 존재하는 본 명세서에 기술된 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산과 구별된다. 분리된 핵산은 일반적으로 핵산 분자를 포함하는 세포에 포함된 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 염색체외에 또는 자연 염색체 위치와 다른 염색체 위치에 존재한다.

"대조군 서열"은 특정 숙주 유기체에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 의미한다. 예를 들어, 원핵생물에 적합한 대조군 서열은 프로모터, 선택적으로 오퍼레이터 서열 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 있을 때 "작동 가능하게 연결"된다. 예를 들어, 전서열 또는 분비 리더(secretory leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동 가능하게 연결되며; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되며; 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 위치한다면 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동 가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 연속적이며, 분비 리더의 경우 연속적이고 판독 단계에 있음을 의미한다. 그러나 인핸서는 연속적일 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 결찰을 통해 이루어진다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커는 통상적인 관행에 따라 사용된다.

본 명세서에서 사용되는 "벡터"라는 용어는 그것이 연결된 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 이 용어는 벡터가 도입된 숙주 세포의 게놈에 통합된 벡터뿐만 아니라 자가 복제 핵산 구조로서의 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본 명세서에서 "발현 벡터"로 지칭된다.

본 명세서에서 사용되는 "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"이라는 용어는 외인성 핵산이 숙주 세포로 전달 또는 도입되는 과정을 의미한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산으로 형질감염, 형질전환 또는 형질도입된 세포이다. 세포는 1차 대상 세포 및 그 자손을 포함한다.

"숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양"이라는 용어는 상호 교환적으로 사용되며 이러한 세포의 자손을 포함하여 외인성 핵산이 도입된 세포를 의미한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이는 계대의 수에 관계없이 1차 형질전환된 세포 및 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량이 부모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있지만 돌연변이를 포함할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본 명세서에 포함된다.

"약학적 조성물"의 "약학적 제형"이라는 용어는 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 하는 형태이고, 제형이 투여되는 대상체에게 허용할 수 없을 정도로 독성인 추가 성분을 함유하지 않는 제형을 의미한다. 이러한 제형은 무균이다. "멸균" 제형은 무균이거나 모든 살아있는 미생물 및 포자가 없다.

본 명세서에 기술된 본 발명의 실시양태는 "구성되는" 및/또는 "필수적으로 구성되는" 실시양태를 포함하는 것으로 이해된다.

본 명세서에서 값 또는 매개변수 "약"에 대한 언급은 그 값 또는 매개변수 자체에 관한 변형을 포함(및 설명)한다. 예를 들어, "약 X"에 대한 설명은 "X"에 대한 설명을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 값 또는 매개변수가 "아닌"에 대한 언급은 일반적으로 값 또는 매개변수 "이외"를 의미하고 설명한다. 예를 들어, X 유형의 질병을 치료하는 데 사용되지 않는 방법은 해당 방법이 X 이외의 유형의 질병을 치료하는 데 사용된다는 것을 의미한다.

본 명세서에서 "약 X-Y"라는 용어는 "약 X 내지 약 Y"와 동일한 의미를 갖는다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수형 "a", "or" 및 "the"는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다.

II. 지속형 NGF 폴리펩타이드

본 출원의 한 측면은 N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드를 제공한다. 일부 실시양태에서, N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드가 제공되며, 여기서 NGF 모이어티는 서열번호: 1-4 중 어느 하나(예를 들어, 서열번호: 1-3 중 어느 하나)의 아미노산 서열을 포함하고(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 Fc 모이어티는 IgG1 Fc 또는 IgG4 Fc로부터 유도된다. 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드는 개인(예를 들어, 인간)에게 정맥내, 근육내 또는 피하 투여될 때 반감기가 적어도 약 10시간(예를 들어, 적어도 약 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 또는 100시간)이다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드는 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 NGF 모이어티에 비해 통증을 덜 유발한다(예를 들어, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 덜한 통증).

일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 펩티드 링커를 통해 Fc 모이어티에 융합된다. 이에 따라 일부 실시양태에서, N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티, 펩티드 링커(예를 들어 서열번호: 68-99 중 어느 하나, 예를 들어 서열번호: 68-72 중 어느 하나), 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드가 제공되며, 여기서 상기 NGF 모이어티는 서열번호: 1-4 중 어느 하나(예를 들어 서열번호: 1-3 중 임의의 것)의 아미노산 서열을 포함하며(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 상기 Fc 모이어티는 IgG1 Fc 또는 IgG4 Fc로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 (GGGGS)n(서열번호: 70)의 아미노산 서열을 포함하며(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 중 임의의 것이다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 서열번호: 68 또는 69의 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드는 개인(예를 들어, 인간)에게 정맥내, 근육내 또는 피하 투여될 때, 반감기가 적어도 약 10시간(예를 들어, 적어도 약 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 또는 100시간 중 어느 것)이다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드는 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 NGF 모이어티에 비해 통증을 덜 유발한다(예를 들어, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 덜한 통증).

일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 인간 IgG1 Fc와 같은 IgG1 Fc로부터 유도된다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 야생형 IgG1 Fc(예를 들어, 인간 IgG1 Fc) 또는 이의 천연 변이체이다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8의 아미노산 서열을 포함하는 IgG1 Fc로부터 유도된다. 따라서 일부 실시양태에서, N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티, 선택적 펩티드 링커(예를 들어 서열번호: 68-99 중 어느 하나, 예를 들어 서열번호: 68-72 중 어느 하나), 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드가 제공되며, 여기서 NGF 모이어티는 서열번호: 1-4 중 어느 하나(예를 들어, 서열번호: 1-3 중 어느 하나)의 아미노산 서열을 포함하고(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8의 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티, 선택적 펩티드 링커(예를 들어, 서열번호: 68-99 중 어느 하나, 예를 들어 서열번호: 68-72 중 어느 하나), 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드가 제공되며, 여기서 NGF 모이어티는 서열번호: 1-4 중 어느 하나(예를 들어, 서열번호: 1-3 중 어느 하나)의 아미노산 서열을 포함하고(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8(예를 들어, 서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 IgG1 Fc로부터 유도된다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8의 처음 5개 아미노산이 결여되어 있다. 일부 실시양태에서, N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티, 선택적 펩티드 링커(예를 들어, 서열번호: 68-99 중 어느 하나, 예를 들어 서열번호: 68-72 중 어느 하나), 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드가 제공되며, 여기서 NGF 모이어티는 서열번호: 1-4 중 어느 하나(예를 들어, 서열번호: 1-3 중 어느 하나)의 아미노산 서열을 포함하고(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8(예를 들어, 서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 IgG1 Fc로부터 유도되고, 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8(예를 들어 서열번호: 8)에 비해 E233, L234, L235, G236, G237, N297, A327, A330, 및 P331 중 하나 이상으로부터 선택된 위치에 돌연변이를 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티, 선택적 펩티드 링커(예를 들어, 서열번호: 68-99 중 어느 하나, 예를 들어 서열번호: 68-72 중 어느 하나), 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드가 제공되며, 여기서 NGF 모이어티는 서열번호: 1-4 중 어느 하나(예를 들어, 서열번호: 1-3 중 어느 하나)의 아미노산 서열을 포함하고(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8(예를 들어, 서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 IgG1 Fc로부터 유도되고, 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8(예를 들어 서열번호: 8)에 비해 E233P, L234V, L234A, L235A, L235E, G236del, G237A, N297A, A327G, A330S, 및 P331S 중 하나 이상으로부터 선택된 돌연변이를 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8의 처음 5개 아미노산이 추가로 결여되어 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 (GGGGS)n(서열 번호: 70)의 아미노산 서열을 포함하며(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 중 임의의 것이다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 서열번호: 68 또는 69의 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드는 개인(예를 들어, 인간)에게 정맥내, 근육내 또는 피하 투여될 때 반감기가 적어도 약 10시간(예를 들어, 적어도 약 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 또는 100시간 중 임의의 시간)이다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드는 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 NGF 모이어티에 비해 덜한 통증(예를 들어 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 덜한 통증)을 유발한다.

일부 실시양태에서, N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티, 선택적 펩티드 링커(예를 들어, 서열번호: 68-99 중 어느 하나, 예를 들어 서열번호: 68-72 중 어느 하나), 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드가 제공되며, 여기서 NGF 모이어티는 서열번호: 1-4 중 어느 하나(예를 들어, 서열번호: 1-3 중 어느 하나)의 아미노산 서열을 포함하고(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8(예를 들어, 서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 IgG1 Fc로부터 유도되고, 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8(예를 들어 서열번호: 8)에 비해 L234, L235, 및 P331의 위치에 돌연변이를 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8(예를 들어 서열번호: 8)의 처음 5개 아미노산이 추가로 결여된다. 일부 실시양태에서, N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티, 선택적 펩티드 링커(예를 들어, 서열번호: 68-99 중 어느 하나, 예를 들어 서열번호: 68-72 중 어느 하나), 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드가 제공되며, 여기서 NGF 모이어티는 서열번호: 1-4 중 어느 하나(예를 들어, 서열번호: 1-3 중 어느 하나)의 아미노산 서열을 포함하고(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8(예를 들어, 서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 IgG1 Fc로부터 유도되고, 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8(예를 들어 서열번호: 8)에 비해 L234A, L235A, 및 P331S 돌연변이를 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티, 선택적 펩티드 링커(예를 들어, 서열번호: 68-99 중 어느 하나, 예를 들어 서열번호: 68-72 중 어느 하나), 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드가 제공되며, 여기서 NGF 모이어티는 서열번호: 1-4 중 어느 하나(예를 들어, 서열번호: 1-3 중 어느 하나)의 아미노산 서열을 포함하고(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8(예를 들어, 서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 IgG1 Fc로부터 유도되고, 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8(예를 들어 서열번호: 8)에 비해 L234A, L235A, 및 P331S 돌연변이를 포함하며(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8(예를 들어 서열번호: 8)의 처음 5개 아미노산이 추가로 결여된다. 따라서 일부 실시양태에서, N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티, 선택적 펩티드 링커(예를 들어, 서열번호: 68-99 중 어느 하나, 예를 들어 서열번호: 68-72 중 어느 하나), 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드가 제공되며, 여기서 NGF 모이어티는 서열번호: 1-4 중 어느 하나(예를 들어, 서열번호: 1-3 중 어느 하나)의 아미노산 서열을 포함하고(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 11 또는 12의 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 (GGGGS)n(서열번호: 70)의 아미노산 서열을 포함하며(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 중 임의의 것이다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 서열번호: 68 또는 69의 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, 서열번호: 62-64 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되는) 지속형 NGF 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드는 개인(예를 들어, 인간)에게 정맥내, 근육내 또는 피하 투여시 반감기가 적어도 약 10시간(예를 들어, 적어도 약 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 또는 100시간)이다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드는 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 NGF 모이어티에 비해 통증을 덜 유발한다(예를 들어, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 덜한 통증).

일부 실시양태에서, N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티, 선택적 펩티드 링커(예를 들어, 서열번호: 68-99 중 어느 하나, 예를 들어 서열번호: 68-72 중 어느 하나), 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드가 제공되며, 여기서 NGF 모이어티는 서열번호: 1-4 중 어느 하나(예를 들어, 서열번호: 1-3 중 어느 하나)의 아미노산 서열을 포함하고(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8(예를 들어, 서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 IgG1 Fc로부터 유도되고, 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8(예를 들어 서열번호: 8)에 비해 E233, L234, L235, G236, A327, A330, 및 P331의 위치에 돌연변이를 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8(예를 들어 서열번호: 8)의 처음 아미노산 5개가 추가로 결여된다. 일부 실시양태에서, N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티, 선택적 펩티드 링커(예를 들어, 서열번호: 68-99 중 어느 하나, 예를 들어 서열번호: 68-72 중 어느 하나), 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드가 제공되며, 여기서 NGF 모이어티는 서열번호: 1-4 중 어느 하나(예를 들어, 서열번호: 1-3 중 어느 하나)의 아미노산 서열을 포함하고(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8(예를 들어, 서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 IgG1 Fc로부터 유도되고, 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8(예를 들어 서열번호: 8)에 비해 E233, L234, L235, G236, A327, A330, 및 P331 돌연변이를 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티, 선택적 펩티드 링커(예를 들어, 서열번호: 68-99 중 어느 하나, 예를 들어 서열번호: 68-72 중 어느 하나), 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드가 제공되며, 여기서 NGF 모이어티는 서열번호: 1-4 중 어느 하나(예를 들어, 서열번호: 1-3 중 어느 하나)의 아미노산 서열을 포함하고(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8(예를 들어, 서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 IgG1 Fc로부터 유도되고, 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8(예를 들어 서열번호: 8)에 비해 E233P, L234V, L235A, G236del, A327G, A330S, 및 P331S 돌연변이를 포함하며(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8(예를 들어 서열번호: 8)의 처음 5개 아미노산이 추가로 결여된다. 따라서 일부 실시양태에서, N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티, 선택적 펩티드 링커(예를 들어, 서열번호: 68-99 중 어느 하나, 예를 들어 서열번호: 68-72 중 어느 하나), 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드가 제공되며, 여기서 NGF 모이어티는 서열번호: 1-4 중 어느 하나(예를 들어, 서열번호: 1-3 중 어느 하나)의 아미노산 서열을 포함하고(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 15 또는 16의 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 (GGGGS)n(서열번호: 70)의 아미노산 서열을 포함(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며)하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 중 임의의 것이다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 서열번호: 68 또는 69의 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며). 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서 서열번호: 66의 아미노산 서열을 포함하거나(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되는) 지속형 NGF 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드는 개인(예를 들어 인간)에게 정맥내, 근육내, 또는 피하 투여시 적어도 약 10시간(예를 들어 적어도 약 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 또는 100 시간)의 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드는 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 NGF 모이어티에 비해 덜한 통증(예를 들어 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 덜한 통증)을 유발한다.

일부 실시양태에서, N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티, 선택적 펩티드 링커(예를 들어, 서열번호: 68-99 중 어느 하나, 예를 들어 서열번호: 68-72 중 어느 하나), 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드가 제공되며, 여기서 NGF 모이어티는 서열번호: 1-4 중 어느 하나(예를 들어, 서열번호: 1-3 중 어느 하나)의 아미노산 서열을 포함하고(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8(예를 들어, 서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 IgG1 Fc로부터 유도되고, 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8(예를 들어 서열번호: 8)에 비해 L234, L235, G237, A330, 및 P331의 위치에 돌연변이를 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8(예를 들어 서열번호: 8)의 처음 아미노산 5개가 추가로 결여된다. 일부 실시양태에서, N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티, 선택적 펩티드 링커(예를 들어, 서열번호: 68-99 중 어느 하나, 예를 들어 서열번호: 68-72 중 어느 하나), 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드가 제공되며, 여기서 NGF 모이어티는 서열번호: 1-4 중 어느 하나(예를 들어, 서열번호: 1-3 중 어느 하나)의 아미노산 서열을 포함하고(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8(예를 들어, 서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 IgG1 Fc로부터 유도되고, 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8(예를 들어 서열번호: 8)에 비해 L234A, L235E, G237A, A330S, 및 P331S 돌연변이를 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티, 선택적 펩티드 링커(예를 들어, 서열번호: 68-99 중 어느 하나, 예를 들어 서열번호: 68-72 중 어느 하나), 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드가 제공되며, 여기서 NGF 모이어티는 서열번호: 1-4 중 어느 하나(예를 들어, 서열번호: 1-3 중 어느 하나)의 아미노산 서열을 포함하고(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8(예를 들어, 서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 IgG1 Fc로부터 유도되고, 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8(예를 들어 서열번호: 8)에 비해 L234A, L235E, G237A, A330S, 및 P331S 돌연변이를 포함하며(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8(예를 들어 서열번호: 8)의 처음 5개 아미노산이 추가로 결여된다. 따라서 일부 실시양태에서, N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티, 선택적 펩티드 링커(예를 들어, 서열번호: 68-99 중 어느 하나, 예를 들어 서열번호: 68-72 중 어느 하나), 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드가 제공되며, 여기서 NGF 모이어티는 서열번호: 1-4 중 어느 하나(예를 들어, 서열번호: 1-3 중 어느 하나)의 아미노산 서열을 포함하고(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 13 또는 14의 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 (GGGGS)n(서열번호: 70)의 아미노산 서열을 포함하며(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 중 임의의 것이다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 서열번호: 68 또는 69의 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서 서열번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되는) 지속형 NGF 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드는 개인(예를 들어 인간)에게 정맥내, 근육내, 또는 피하 투여시 적어도 약 10시간(예를 들어 적어도 약 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 또는 100 시간)의 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드는 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 NGF 모이어티에 비해 덜한 통증(예를 들어 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 덜한 통증)을 유발한다.

일부 실시양태에서, N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티, 선택적 펩티드 링커(예를 들어, 서열번호: 68-99 중 어느 하나, 예를 들어 서열번호: 68-72 중 어느 하나), 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드가 제공되며, 여기서 NGF 모이어티는 서열번호: 1-4 중 어느 하나(예를 들어, 서열번호: 1-3 중 어느 하나)의 아미노산 서열을 포함하고(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8(예를 들어, 서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 IgG1 Fc로부터 유도되고, 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8(예를 들어 서열번호: 8)에 비해 N297의 위치에 돌연변이를 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8(예를 들어 서열번호: 8)의 처음 아미노산 5개가 추가로 결여된다. 일부 실시양태에서, N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티, 선택적 펩티드 링커(예를 들어, 서열번호: 68-99 중 어느 하나, 예를 들어 서열번호: 68-72 중 어느 하나), 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드가 제공되며, 여기서 NGF 모이어티는 서열번호: 1-4 중 어느 하나(예를 들어, 서열번호: 1-3 중 어느 하나)의 아미노산 서열을 포함하고(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8(예를 들어, 서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 IgG1 Fc로부터 유도되고, 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8(예를 들어 서열번호: 8)에 비해 N297A 돌연변이를 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티, 선택적 펩티드 링커(예를 들어, 서열번호: 68-99 중 어느 하나, 예를 들어 서열번호: 68-72 중 어느 하나), 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드가 제공되며, 여기서 NGF 모이어티는 서열번호: 1-4 중 어느 하나(예를 들어, 서열번호: 1-3 중 어느 하나)의 아미노산 서열을 포함하고(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8(예를 들어, 서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 IgG1 Fc로부터 유도되고, 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8(예를 들어 서열번호: 8)에 비해 N297A 돌연변이를 포함하며(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8(예를 들어 서열번호: 8)의 처음 5개 아미노산이 추가로 결여된다. 따라서 일부 실시양태에서, N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티, 선택적 펩티드 링커(예를 들어, 서열번호: 68-99 중 어느 하나, 예를 들어 서열번호: 68-72 중 어느 하나), 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드가 제공되며, 여기서 NGF 모이어티는 서열번호: 1-4 중 어느 하나(예를 들어, 서열번호: 1-3 중 어느 하나)의 아미노산 서열을 포함하고(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 9 또는 10의 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며). 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 (GGGGS)n(서열번호: 70)의 아미노산 서열을 포함하며(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 중 임의의 것이다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 서열번호: 68 또는 69의 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서 서열번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되는) 지속형 NGF 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드는 개인(예를 들어 인간)에게 정맥내, 근육내, 또는 피하 투여시 적어도 약 10시간(예를 들어 적어도 약 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 또는 100 시간)의 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드는 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 NGF 모이어티에 비해 덜한 통증(예를 들어 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 덜한 통증)을 유발한다.

일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 인간 IgG4 Fc와 같은 IgG4 Fc로부터 유도된다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 야생형 IgG4 Fc(예를 들어 인간 IgG4 Fc) 또는 이의 천연 변이체이다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 IgG4 Fc로부터 유도된다. 따라서 일부 실시양태에서, N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티, 선택적 펩티드 링커(예를 들어, 서열번호: 68-99 중 어느 하나, 예를 들어 서열번호: 68-72 중 어느 하나), 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드가 제공되며, 여기서 NGF 모이어티는 서열번호: 1-4 중 어느 하나(예를 들어, 서열번호: 1-3 중 어느 하나)의 아미노산 서열을 포함하고(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티, 선택적 펩티드 링커(예를 들어, 서열번호: 68-99 중 어느 하나, 예를 들어 서열번호: 68-72 중 어느 하나), 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드가 제공되며, 여기서 NGF 모이어티는 서열번호: 1-4 중 어느 하나(예를 들어, 서열번호: 1-3 중 어느 하나)의 아미노산 서열을 포함하고(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 IgG4 Fc로부터 유도된다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 17의 처음 아미노산 5개가 결여된다. 일부 실시양태에서, N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티, 선택적 펩티드 링커(예를 들어, 서열번호: 68-99 중 어느 하나, 예를 들어 서열번호: 68-72 중 어느 하나), 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드가 제공되며, 여기서 NGF 모이어티는 서열번호: 1-4 중 어느 하나(예를 들어, 서열번호: 1-3 중 어느 하나)의 아미노산 서열을 포함하고(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 IgG4 Fc로부터 유도되고, 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 17에 비해 S228, F234, 및 L235 중 어느 하나 이상으로부터 선택된 위치에 돌연변이를 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티, 선택적 펩티드 링커(예를 들어, 서열번호: 68-99 중 어느 하나, 예를 들어 서열번호: 68-72 중 어느 하나), 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드가 제공되며, 여기서 NGF 모이어티는 서열번호: 1-4 중 어느 하나(예를 들어, 서열번호: 1-3 중 어느 하나)의 아미노산 서열을 포함하고(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 IgG4 Fc로부터 유도되고, 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 17에 비해 S228, F234, 및 L235 위치에 돌연변이를 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티, 선택적 펩티드 링커(예를 들어, 서열번호: 68-99 중 어느 하나, 예를 들어 서열번호: 68-72 중 어느 하나), 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드가 제공되며, 여기서 NGF 모이어티는 서열번호: 1-4 중 어느 하나(예를 들어, 서열번호: 1-3 중 어느 하나)의 아미노산 서열을 포함하고(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 IgG4 Fc로부터 유도되고, 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 17에 비해 S228, F234, 및 L235 중 하나 이상으로부터 선택된 돌연변이를 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티, 선택적 펩티드 링커(예를 들어, 서열번호: 68-99 중 어느 하나, 예를 들어 서열번호: 68-72 중 어느 하나), 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드가 제공되며, 여기서 NGF 모이어티는 서열번호: 1-4 중 어느 하나(예를 들어, 서열번호: 1-3 중 어느 하나)의 아미노산 서열을 포함하고(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 IgG4 Fc로부터 유도되고, 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 17에 비해 S228, F234, 및 L235A 돌연변이를 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 17의 처음 5개 아미노산 서열이 추가로 결여된다. 따라서 일부 실시양태에서, N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티, 선택적 펩티드 링커(예를 들어, 서열번호: 68-99 중 어느 하나, 예를 들어 서열번호: 68-72 중 어느 하나), 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드가 제공되며, 여기서 NGF 모이어티는 서열번호: 1-4 중 어느 하나(예를 들어, 서열번호: 1-3 중 어느 하나)의 아미노산 서열을 포함하고(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 Fc 모이어티는 서열번호: 18의 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 (GGGGS)n(서열번호: 70)의 아미노산 서열을 포함하며(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되며), 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 중 임의의 것이다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 서열번호: 68 또는 69의 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서 서열번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되는) 지속형 NGF 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드는 개인(예를 들어 인간)에게 정맥내, 근육내, 또는 피하 투여시 적어도 약 10시간(예를 들어 적어도 약 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 또는 100 시간)의 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드는 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 NGF 모이어티에 비해 덜한 통증(예를 들어 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 덜한 통증)을 유발한다.

일부 실시양태에서, 서열번호: 34, 36, 38, 40, 42, 44, 및 46 중 임의의 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되는) 지속형 NGF 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 서열번호: 6의 신호 펩티드 서열을 제외하고, 서열번호: 34, 36, 38, 40, 42, 44, 및 46 중 임의의 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되는) 지속형 NGF 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드는 개인(예를 들어 인간)에게 정맥내, 근육내, 또는 피하 투여시 적어도 약 10시간(예를 들어 적어도 약 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 또는 100 시간)의 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드는 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 NGF 모이어티에 비해 덜한 통증(예를 들어 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 덜한 통증)을 유발한다.

NGF 모이어티

NGF는 초기에 발현될 때 α-NGF, β-NGF 및 γ-NGF(2:1:2 비율)의 3가지 단백질의 7S, 130kDa 복합체에 있다. 이 복합체의 γ 서브유닛은 세린 프로테아제로 작용하여 β 서브유닛의 N-말단을 절단함으로써 단백질을 기능적 NGF로 활성화시킨다. 인간 NGF 유전자는 1번 염색체의 짧은 팔에 위치하며 완전한 NGF 엑손은 일반적으로 preproNGF 전구체(서열번호: 50)라고 지칭되는 241개의 아미노산을 인코드한다. PreproNGF 전구체는 시그널 펩타이드 서열(서열번호: 6), 프로펩타이드(서열번호: 5) 및 성숙한 NGF 서열(β-NGF, 서열번호: 4)을 포함한다. preproNGF 전구체의 시그널 펩타이드는 소포체에서 절단되어 proNGF 전구체(223개 아미노산; 서열번호: 54)를 형성한다. proNGF 전구체는 소포체(endoplasmic reticulum)에 호모다이머(homodimer) 형태로 존재하다가 골지체(Golgi apparatus)로 옮겨져 proNGF 전구체 다이머가 프로펩타이드 상의 3개의 Furin 모티프에서 Furin에 의해 절단된다. 성숙한 NGF 서열에 대해 위치 -1 및 -2에 위치한 푸린 모티프에서 푸린에 의한 절단은 성숙한 β-NGF 이량체를 생성하며, 각 단량체는 118개 또는 120개의 아미노산을 함유한다. 성숙한 β-NGF 이합체는 이후 세포 외부로 운반된다. 절단되지 않은 일부 proNGF 전구체도 세포 외부로 분비된다. NGF 구조에 대해 도 2를 참조한다.

NGF는 다양한 종에 존재하며 수컷 마우스 악하선, 소 정액 혈장, 뱀독, 기니피그 전립선, 인간 태반 조직 등에 풍부하다. 마우스 NGF와 인간 NGF 사이의 아미노산 서열 상동성은 최대 약 90%이다.

NGF는 신경퇴행성 장애와 관련된 트로포미오신 수용체 키나아제 A(TrkA) 및 저친화성 NGF 수용체(LNGFR/p75NTR)와 결합한다. TrkA 수용체에 대한 NGF 결합은 수용체의 동종이합체화(homodimerization)를 유도하고, 이는 다시 티로신 키나아제 세그먼트의 자가인산화를 유발하여 PI 3-키나아제, ras 및 PLC 신호 경로의 활성화를 유도한다. p75NTR 수용체는 또한 TrkA와 함께 이종이량체를 형성할 수 있으며, 이는 NGF에 대해 더 높은 친화도 및 특이성을 갖는다. 한편, proNGF는 p75NTR 및 sortilin에 높은 친화력으로 결합하여 NRAGE 및 Rac를 모집하여 주로 세포 사멸을 유발하는 JNK 신호 캐스케이드를 활성화하는 신호 복합체를 생성한다. p75NTR에 결합하는 ProNGF는 또한 NFκB의 활성화를 촉진하여 신경 생존을 유도할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 "NGF 모이어티"라는 용어는 NGF 분자, 이의 종 변이체, 단편, 돌연변이체 또는 유도체를 의미한다. NGF 모이어티는 NGF 수용체에 결합하고 NGF 수용체를 통해 신호 전달을 유도하는 것과 같이 적어도 어느 정도의 부모 NGF 활성을 유지하는 절단된 버전, 번역 후 변형된 버전, 하이브리드 변이체, 펩티드 모방체, 생물학적 활성 단편, 결실 변이체, 치환 변이체 또는 추가 변이체일 수 있다. 본 명세서에 기술된 "부모 NGF" 또는 "부모 NGF"는 NGF 모이어티가 조작, 변형 또는 유래된 NGF 참조 서열을 의미한다.

일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 야생형 NGF이다. 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 NGF 천연 변이체이다. 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 약 6개 이하의 아미노산(예를 들어, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1aa) 돌연변이 부위를 포함하는 NGF와 같은 NGF의 유사체이다. 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 NGF의 유도체이다. 본 명세서에서 사용되는 "NGF의 유도체"라는 용어는 NGF 또는 NGF의 유사체의 아미노산 서열을 갖지만, 또한 하나 이상의 아미노산 측기, α 탄소 원자, 말단 아미노기 또는 말단 카르복실기에서 추가적인 화학적 변형을 갖는 분자를 의미한다. 화학적 변형에는 화학적 모이어티 추가, 새로운 결합 생성 및 화학적 모이어티의 제거가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 아미노산 측기에서의 변형은 라이신의 엡실론 아미노기의 아실화, 아르기닌, 히스티딘 또는 라이신의 N-알킬화, 글루탐산 또는 아스파르트산의 카르복실의 알킬화 및 글루타민 또는 아스파라긴의 탈아미노화를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 말단 아미노기에서의 변형은 탈아미노화, N-저급 알킬, N-di-저급 알킬 및 N-아실 변형을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 말단 카르복실기에서의 변형은 아미드, 저급 알킬 아실, 디알킬 아미드 및 저급 알킬 에스테르 변형을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 저급 알킬기는 C1-C4 알킬기이다. 또한, 하나 이상의 측기 또는 말단기는 화학 분야의 당업자에게 공지된 보호기에 의해 보호될 수 있다. 아미노산의 알파 탄소는 모노- 또는 디-메틸화될 수 있다. 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 페길화된 NGF와 같은 변형된 NGF, 또는 글리코실화된 NGF와 같은 공유적으로 변형된 NGF이다.

NGF 모이어티는 가축 동물(예를 들어, 소, 양, 염소, 고양이, 개, 당나귀 및 말), 영장류(예를 들어 인간 및 원숭이 또는 침팬지와 같은 비인간 영장류), 토끼 및 설치류(예를 들어 마우스, 랫트(rats), 게르빌루스쥐(gerbils), 및 햄스터)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유동물과 같은 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다.

일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 인간 NGF(hNGF)이다. 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 야생형(wt) hNGF이다. 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 hNGF 천연 변이체이다. 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 약 6개 이하의 아미노산(예를 들어 6, 5, 4, 3, 2 또는 1aa) 돌연변이 부위를 포함하는 hNGF와 같은 hNGF의 유사체이다. 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 hNGF의 유도체이다. hNGF의 많은 활성 단편, 유사체 및 유도체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 이러한 활성 단편, 유사체 및 유도체 중 임의의 하나가 본 출원에서 사용되는 NGF 모이어티일 수 있다.

본 명세서에 기재된 NGF 모이어티는 인간 조직 또는 다른 공급원과 같은 다양한 공급원으로부터 분리되거나 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조된 NGF일 수 있다. 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 재조합 hNGF(rhNGF)와 같은 재조합 NGF이다. 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 재조합 쥐과(murine) NGF와 같은 쥐과 NGF이다.

일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 전장 NGF이다. 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 전장 NGF 분자의 대부분 또는 완전한 생물학적 활성, 예를 들어 전장 β-NGF의 대부분 또는 완전한 생물학적 활성을 생성할 수 있는 NGF의 기능적 단편이다. 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 preproNGF(인간 preproNGF와 같은) 또는 이의 활성 단편, 즉 신호 펩티드, 프로펩티드 및 β-NGF 모두의 전체 길이 또는 단편을 포함하는 것이다. 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 서열번호: 47-50 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 proNGF(인간 proNGF와 같은) 또는 이의 활성 단편이며, 즉 프로펩티드 및 β-NGF 모두의 전체 길이 또는 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 서열번호: 51-54 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 성숙 NGF 또는 이의 활성 단편, 즉 β-NGF의 전체 길이 또는 활성 단편(인간 β-NGF와 같은)을 포함한다. 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 서열번호: 1-4 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 야생형 인간 β-NGF(서열번호: 4)이다. 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 마지막 2개의 아미노산이 절단된 야생형 인간 β-NGF(서열번호: 3)이다. 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 β-NGF의 N-말단에 신호 펩티드를 포함하고, 신호 펩티드는 상이한 분자 또는 동일한 NGF 분자로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 신호 펩티드는 서열번호: 6의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 β-NGF의 N-말단에 프로펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로펩티드는 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 야생형 NGF의 대부분 또는 전체 생물학적 활성을 생성할 수 있는 돌연변이 또는 변이체 NGF와 같은 돌연변이 또는 변이체 NGF이다. 돌연변이 NGF 모이어티는 NGF 분자(예를 들어, 성숙한 β-NGF)의 하나 이상의 아미노산에 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이 NGF 모이어티는 NGF의 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이 NGF 모이어티는 NGF의 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산의 결실 또는 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이 NGF 모이어티는 NGF에서 하나 이상의 아미노산의 변형을 포함한다.

일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는다. "보존적 치환"은 치환된 아미노산과 동일한 순전하 및 대략 동일한 크기 및 모양을 갖는 또 다른 아미노산의 치환을 의미한다. 곁사슬에 있는 탄소 원자와 헤테로원자의 총 수가 4개 이하로 차이가 나면, 지방족 또는 치환된 지방족 아미노산 곁사슬을 가진 아미노산은 대략 같은 크기이다. 곁사슬에 있는 가지의 수가 하나 이상 다르지 않을 때 아미노산은 거의 같은 모양을 가진다. 측쇄에 페닐 또는 치환된 페닐기를 갖는 아미노산은 크기와 모양이 거의 동일한 것으로 간주할 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 보존적 치환을 위해 천연 아미노산을 사용하는 것이 바람직하다. 또한 아래의 "아미노산 치환" 하위 섹션을 참조한다.

본 명세서에 사용된 "아미노산"은 아미노산 유사체 및 유도체를 포함하는 천연 발생 아미노산 및 비천연 발생 아미노산 모두를 포함하는 가장 넓은 의미로 사용된다. 후자는 아미노산 모이어티를 포함하는 분자를 포함한다. 당업자는 이러한 넓은 정의에 따라 본 명세서의 아미노산이 예를 들어 단백질을 형성하는 자연 발생 L-아미노산; D-아미노산; 아미노산 유사체 및 유도체와 같은 화학적으로 변형된 아미노산; 노르류신, β-알라닌, 오르니틴, GABA 등과 같이 단백질을 형성하지 않는 자연 발생 아미노산; 및 당업계에 공지된 아미노산 특성을 갖는 화학적으로 합성된 화합물을 포함하는 것을 이해할 것이다. 본 명세서에서 사용되는 "단백질-형성"이라는 용어는 대사 경로를 통해 세포의 펩티드, 폴리펩타이드 또는 단백질에 혼입될 수 있는 아미노산을 의미한다.

합성 비-천연 아미노산, 치환된 아미노산 또는 하나 이상의 D-아미노산을 포함하는 비-천연 발생 아미노산을 본 발명의 지속형 NGF 폴리펩타이드(또는 NGF 모이어티)에 삽입하는 것은 여러 이점을 가질 수 있다. D-아미노산 함유 펩티드 등은 L-아미노산 함유 대응물에 비해 인비트로 또는 인비보에서 증가된 안정성을 나타낸다. 따라서 더 큰 세포내 안정성이 요구되는 경우, D-아미노산의 혼입과 같은 펩티드 구성이 특히 유용하다. 특히, D-펩티드 등은 내인성 펩티다아제 및 프로테아제 활성에 저항성을 나타내어, 분자의 생체이용률을 향상시키고 필요할 때 인비보에서 수명을 연장시킨다. 또한, D-펩티드 등은 T 헬퍼 세포에 대한 II형 주요 조직적합성 복합체(MHC)에 의한 제한된 제시를 위해 효과적으로 처리될 수 없기 때문에, 대상체에서 체액성 면역 반응을 덜 유도할 수 있다.

일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 야생형 NGF에 비해 감소된 부작용(예를 들어, 통증)을 갖거나 통증이 없는 돌연변이체 또는 변이체 NGF이다. 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 야생형 NGF에 비해 적어도 약 5%(예를 들어, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 90%, 95% 또는 100% 중 어느 하나) 통증을 적어도 약 5% 감소시키며, 예를 들어 투여 후 하나 이상의(예를 들어 모든) 시점에서 적어도 약 5% 감소시킨다. 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 야생형 NGF에 비해 적어도 약 5%(예를 들어 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100% 중 어느 하나) 통증 역치를 증가시킨다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 개인의 통증 역치는 약 8이고, 통증 역치는 야생형 NGF를 투여한 후 약 6으로 떨어지는 반면, 돌연변이 또는 변이체 NGF(또는 본 명세서에 기술된 것을 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드) 투여 후 통증 역치는 약 8에 머물렀으며, 즉 통증이 약 25% 감소하거나 통증 역치가 약 25% 증가했다. 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 CN107286233A, WO2017157325, 및 WO2017157326에 기재된 바와 같은 돌연변이 또는 변이체 NGF이며, 이들의 내용은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 인간 야생형 β-NGF 서열(서열번호: 4)에 비해 F12E 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 서열번호: 2의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 F12E 돌연변이를 포함하고 인간 야생형 β-NGF 서열(서열번호: 4)에 비해 마지막 2개 아미노산이 절단된다. 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 서열번호: 1의 아미노산 서열(이하 "mNGF118"로도 지칭됨)을 포함한다.

본 명세서에 기술된 NGF 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드의 아미노산 서열 변이체는 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 적절한 변형을 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 그러한 변형은 예를 들어 NGF 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구성이 원하는 특성, 예를 들어 유지/개선된 리간드-수용체 결합, 유지/향상된 생체 활성(예를 들어 신경세포의 성장 촉진, 유지, 증식, 및/또는 생존), 유지/향상된 반감기, 유지/감소된 ADCC/CDC, 유지/감소된 통증 유발 활성 등을 가지고 있다면 결실, 삽입 및 대체의 임의의 조합이 최종 구성에 도달할 수 있다.

보존적 치환은 표 A에 제시되어 있다. "예시적인 치환"이라는 제목 하에 표 A에 보다 실질적인 변화가 제공되며, 이는 아미노산 측쇄 부류와 관련하여 하기에 추가로 설명된다. 아미노산은 일반적인 측쇄 특성에 따라 그룹화될 수 있다: (1) 소수성: Norleucine, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) 산성: Asp, Glu; (4) 염기성: His, Lys, Arg; (5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및 (6) 방향족: Trp, Tyr, Phe. 비보존적 치환은 이러한 부류 중 하나의 구성원을 다른 부류로 치환하는 것을 수반한다. 아미노산 치환은 위에서 언급한 원하는 활성에 대해 단백질 구조 및 스크리닝된 제품에 도입될 수 있다.

표 A. 아미노산 치환(Amino acid substitutions)

Fc 모이어티

본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드는 C-말단에 Fc 모이어티를 포함한다.

일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 임의의 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 및 이들의 서브타입으로부터 유도된다. IgG는 모든 면역글로불린 중에서 혈청 함량이 가장 높고 혈청 반감기가 가장 길다. 다른 면역글로불린과 달리 IgG는 Fc 수용체(FcR)에 결합한 후 효과적으로 재활용된다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)로부터 유도된다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 인간 IgG로부터 유도된다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 CH2 및 CH3을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 힌지 영역의 전부 또는 일부를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 인간 IgG1 또는 인간 IgG4로부터 유도된다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티의 2개의 서브유닛은 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 그 이상)의 이황화 결합을 통해 이합체화된다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티의 각 서브유닛은 전장 Fc 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티의 각 서브유닛은 이량체화 동안 이황화 결합 짝짓기 오류를 감소시키기 위해 N-말단 시스테인이 더 적은 절단된 Fc 도메인과 같은 N-말단 절단된 Fc 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 N-말단에서 절단되며, 예를 들어 완전한 면역글로불린 Fc 도메인의 처음 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산이 결여되어 있다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 삽입, 결실 및/또는 치환과 같은 하나 이상의 돌연변이를 함유한다.

높은 생물학적 활성, 긴 반감기 및 낮은 면역독성(예를 들어, ADCC 및/또는 CDC)을 갖는 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드를 제공하는 Fc 모이어티를 스크리닝하는 것이 바람직하다.

Fc 도메인을 통해 Fc 함유 단백질은 보체를 활성화하고 Fc 수용체(FcR)와 상호 작용할 수 있다. 이러한 고유한 면역글로불린 특징은 NGF-Fc 융합 단백질이 바람직한 NGF 수용체 발현 세포보다 Fc 수용체를 발현하는 세포를 표적으로 할 수 있기 때문에 바람직하지 않게 여겨져 왔으며, Fc 융합 단백질의 긴 반감기를 추가로 고려할 때, 전신 독성으로 인해 치료 환경에서의 적용이 어렵다. 따라서 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 FcR에 대한 변경된 결합, 특히 Fcγ 수용체(ADCC에 대해 책임 있음)에 대한 변경된 결합 및/또는 변경된 이펙터 기능, 예를 들어 변경된 항체 의존 세포 매개 세포 독성(ADCC), 항체 의존 세포 식균 작용(ADCP) 및/또는 보체 의존 세포 독성(CDC)을 갖도록 조작된다(예를 들어, 하나 이상의 아미노산 돌연변이 포함). 바람직하게는, 이러한 아미노산 돌연변이(들)는 FcRn 수용체에 대한 결합을 감소시키지 않는다(반감기를 담당함).

ADCC, ADCP 또는 CDC와 같은 하나 이상의 이펙터 기능을 제거하도록 돌연변이된 Fc 모이어티(예를 들어, 인간 IgG1 Fc)는 이하에서 "이펙터가 없는" 또는 "거의 이펙터가 없는" Fc 모이어티로 지칭된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 L234A, L235E, G237A, A330S, 및 P331S와 같은 (각각의 Fc 서브유닛에서와 같은) 돌연변이 중 하나 이상을 포함하는 이펙터 없는 인간 IgG1 Fc이다. IgG1 Fc에서 K322A, L234A 및 L235A의 조합은 FcγR 및 C1q 결합을 거의 완전히 없애기에 충분하다 (Hezareh et al. J Virol 75, 12161-12168, 2001). MedImmune은 세 가지 돌연변이 L234F/L235E/P331S 세트가 매우 유사한 효과를 갖는다는 것을 확인했다(Oganesyan et al., Acta Crystallographica 64, 700-704, 2008). 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 최적의 FcR 상호작용에 필요한 것으로 알려진 IgG1 Fc 도메인의 N297 상의 글리코실화의 변형을 포함한다. Fc 모이어티 변형은 Wang et al. ("IgG Fc engineering to modulate antibody effector functions," Protein Cell. 2018 Jan; 9(1): 63-73)에 언급된 임의의 적합한 IgG Fc 조작일 수 있으며, 그 내용은 전체적으로 참고로 본 명세서에 포함된다.

일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드는 ADCC 및/또는 CDC가 없거나 검출가능한 ADCC 및/또는 CDC가 없다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드는 동일한 NGF 모이어티를 포함하지만 야생형 또는 변형되지 않은 Fc 단편을 포함하는 NGF-Fc 구성과 비교하여 ADCC 및/또는 CDC에서 적어도 약 5%(예를 들어 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 중 어느 하나) 감소를 갖는다.

글리코실화 변이체(Glycosylation variants)

일부 실시양태에서, Fc 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드는 구성물이 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변형된다. Fc 모이어티에 대한 글리코실화 부위의 추가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성될 수 있다.

포유동물 세포에 의해 생성된 천연 Fc-함유 단백질은 일반적으로 Fc 영역의 C_H2 도메인의 Asn297에 N-결합에 의해 일반적으로 부착된 분지형, 바이안테나형(biantennary) 올리고당을 포함한다. 예를 들어, Wright et al. TIBTECH 15:26-32(1997) 참조한다. 올리고당은 다양한 탄수화물, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코사민(GlcNAc), 갈락토스 및 시알산뿐만 아니라 바이안테나형 올리고당 구조의 "줄기"에서 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 특정 개선된 특성을 생성하기 위해 Fc 모이어티에서 올리고당류의 변형이 이루어질 수 있다.

일부 실시양태에서, Fc 모이어티에 (직접 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 결여된 탄수화물 구조를 갖는 본 명세서에 기술된 Fc 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드가 제공된다. 예를 들어, 이러한 Fc 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드에서 푸코스의 양은 약 1% 내지 약 80%, 약 1% 내지 약 65%, 약 5% 내지 약 65%, 또는 약 20% 내지 약 40%일 수 있다. 푸코스의 양은 MALDI-TOF 질량 분광법에 의해 측정된 바와 같이 Asn 297에 부착된 모든 글리코구조(예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 고(high) 만노오스 구조)의 합과 비교하여 Asn297에서 당 사슬 내의 푸코스의 평균 양을 계산하여 결정되며, 예를 들어 WO 2008/077546에 기재된 바와 같다. Asn297은 Fc 도메인(Fc 영역 잔기의 EU 넘버링)에서 대략 위치 297에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; Asn297은 Fc 도메인의 사소한 서열 변이로 인해 위치 297의 약 ±3개 아미노산 업스트림 또는 다운스트림, 즉 위치 294와 300 사이에 위치할 수도 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국공개특허 번호 US 2003/0157108(Presta, L.); US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd) 참조한다. "푸코실 제거된" 또는 "푸코스 결여된" 항체 변이체에 관한 예시적인 공개문헌들은 다음을 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). 푸코실 제거된 Fc 함유 단백질을 생산할 수 있는 세포주의 예시에는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포가 포함된다(Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); 미국특허출원번호 US 2003/0157108 A1, Presta, L; 및 WO　2004/056312 A1, Adams et al., 특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주, 예를 들어 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 넉아웃 CHO 세포 (예를 들어 Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 및 WO2003/085107 참조).

이펙터 기능 변이체

일부 실시양태에서, 본 출원은 Fc 이펙터 기능을 전부는 아니지만 일부 보유하는 Fc 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드를 고려하며, 이는 인비보에서 지속형 NGF 폴리펩타이드의 반감기가 중요하지만 특정 이펙터 기능(예를 들어 CDC 및 ADCC)이 불필요하거나 유해한 응용에 바람직한 후보가 된다. CDC 및/또는 ADCC 활동의 감소/고갈을 확인하기 위해 인비트로 및/또는 인비보 세포독성 분석을 수행할 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체(FcR) 결합 분석은 Fc 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드에 FcgR 결합이 결여되어 있지만(따라서 ADCC 활성이 결여된 것 같음) FcRn 결합 능력은 유지하는지 확인하기 위해 수행될 수 있다. ADCC를 매개하는 일차 세포인 NK(Natural Killer) 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포에서의 FcR 발현은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)의 464 페이지에 표 2에 요약된다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 인비트로 분석의 비제한적인 예시는 미국등록특허 5,500,362에 기재되어 있다(예를 들어 Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) 및 Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 참조(Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987) 참조). 대안적으로, 비방사성 분석 방법이 사용될 수 있다(예를 들어 유세포 분석을 위한 ACTI^TM 비방사성 세포독성 분석(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; 및 CytoTox 96^® 비방사성 세포독성 분석 (Promega, Madison, WI). 이러한 분석에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 NK 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 예를 들어 Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 인비보에서 측정될 수 있다. C1q 결합 분석은 또한 지속형 NGF 폴리펩타이드가 C1q에 결합할 수 없고 따라서 CDC 활성이 없다는 것을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어 WO 2006/029879 및 WO 2005/100402의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성을 측정하기 위해, CDC 분석이 수행될 수 있다(예를 들어, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); and Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004) 참조). FcRn 결합 및 인비보에서 클리어런스/반감기 측정은 또한 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다(예를 들어 Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006) 참조).

감소된 이펙터 기능을 갖는 Fc 모이어티는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것들을 포함한다(미국특허번호 6,737,056). 이러한 Fc 돌연변이는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 둘 이상에 치환을 포함하며, 이는 알라닌에 잔기 265 및 297의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이를 포함한다(미국특허번호 7,332,581). FcR에 대한 결합이 증가되거나 감소된 특정한 항체 변이체가 기술된다(예를 들어 미국특허번호 6,737,056; WO 2004/056312, 및 Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) 참조). 일부 실시양태에서, 변형은 예를 들어 미국특허번호 6,194,551, WO　99/51642, 및 Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)에 기술된 것처럼 변경된 C1q 결합 및/또는 CDC(즉 증가 또는 감소된)를 초래하는 Fc 도메인에서 이루어진다.

일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 반감기를 증가시키고/시키거나 신생 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합을 향상시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 반감기가 증가하고 모계 IgG를 태아로 전달하는 역할을 하는 신생 FcRn에 대한 결합이 개선된 항체(Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994))는 US2005/0014934A1 (Hinton et al.)에 기술된다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 향상시키는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 도메인을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 하나 이상의 Fc 영역 잔기에서 치환, 예를 들어 Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것을 포함한다(미국특허번호 7,371,826).

또한 Fc 도메인 변이체에 대한 다른 예시들에 관해 Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); U.S. Patent No. 5,648,260; U.S. Patent No. 5,624,821; 및 WO 94/29351을 참조한다.

시스테인 조작된 변이체

일부 실시양태에서, Fc 도메인의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 시스테인-조작된 Fc 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시양태에서, 치환된 잔기는 Fc 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드의 접근 가능한 부위에서 발생한다. 이러한 잔기를 시스테인으로 치환함으로써 반응성 티올 그룹은 Fc 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드의 접근 가능한 위치에 위치하며, 지속형 NGF 폴리펩타이드 접합체를 생성하기 위해 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티와 같은 다른 모이어티에 분자를 접합하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하기 잔기 중 임의의 하나 이상이 시스테인으로 치환될 수 있다: 중쇄의 A118(EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 도메인의 S400(EU 넘버링). 시스테인 조작된 분자는 예를 들어 미국특허번호 7,521,541에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.

일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 IgG1 Fc로부터 유도된다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 인간 IgG1 Fc로부터 유도된다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 야생형 IgG1 Fc(IGHG1*05)이다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 IgG1의 천연 변이체(예를 들어, IGHG1*05에 비해 D239E 및 L241M 이중 돌연변이를 포함하는 IGHG1*03)이다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 IgG1 Fc의 힌지 영역을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 IgG1 Fc의 N-말단으로부터 절단된 많아야 약 5개 이하의 아미노산을 포함하며, 예를 들어 IgG1 Fc의 N-말단으로부터 처음, 처음 2개, 처음 3개, 처음 4개, 또는 처음 5개 아미노산 절단과 같다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 하나 이상의 이펙터리스 돌연변이 및/또는 탈당화 돌연변이(들)를 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8에 상대적인 E233, L234, L235, G236, G237, N297, A327, A330, 및 P331 중 하나 이상으로부터 선택된 위치에서의 돌연변이를 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8에 상대적인 E233P, L234V, L234A, L235A, L235E, G236del, G237A, N297A, A327G, A330S, 및 P331S 중 하나 이상으로부터 선택된 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8의 처음 (N-말단) 5개 아미노산이 추가로 결여된다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8에 비해 위치 N297에 돌연변이를 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8에 비해 위치 N297A 돌연변이를 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 9 또는 10의 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8에 비해 위치 L234, L235, 및 P331에 돌연변이를 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8에 비해 위치 L234A, L235A, 및 P331S에 돌연변이를 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 11 또는 12의 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8에 비해 위치 L234, L235, G237, A330, 및 P331에 돌연변이를 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8에 비해 L234A, L235E, G237A, A330S, 및 P331S 돌연변이를 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 13 또는 14의 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8에 비해 위치 E233, L234, L235, G236, A327, A330, 및 P331에 돌연변이를 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8에 비해 E233P, L234V, L235A, G236del, A327G, A330S, 및 P331S 돌연변이를 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 15 또는 16의 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다).

일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 IgG4 Fc로부터 유도된다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 인간 IgG4 Fc로부터 유도된다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 야생형 IgG4 Fc이다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 IgG4의 천연 변이체이다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 IgG4 Fc의 힌지 영역을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 IgG4 Fc의 N-말단으로부터 절단된 많아야 약 5개 아미노산을 포함하며, 예를 들어 igG4 Fc의 N-말단으로부터 처음, 처음 2개, 처음 3개, 처음 4개, 또는 처음 5개 아미노산을 절단된 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 이펙터리스 돌연변이 및/또는 탈당화 돌연변이(들)를 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 17에 비해 S228, F234, 및 L235 중 하나 이상으로부터 선택된 위치에 돌연변이를 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 17에 비해 위치 S228, F234, 및 L235에 돌연변이를 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 17에 비해 S228P, F234A, 및 L235A 중 하나 이상으로부터 선택된 돌연변이를 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 17에 비해 돌연변이 S228P, F234A, 및 L235A를 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 18의 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다). 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 17의 처음 (N-말단) 5개 아미노산이 추가로 부족하다. 일부 실시양태에서, Fc 모이어티는 서열번호: 19 또는 20의 아미노산을 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다).

링커

NGF 모이어티 및 Fc 모이어티는 임의의 링커(예를 들어 펩티드 링커, 비펩티드 링커)를 통해 연결된다. 일부 실시양태에서, 링커는 유연한 링커이다. 일부 실시양태에서, 링커는 안정한 링커이다. 일반적으로, 바람직한 링커는 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드의 구성에 의해 형성된 적절한 접힘 및 형태에 영향을 미치지 않거나 유의하게 영향을 미치지 않는다. 바람직하게는, 링커는 지속형 NGF 폴리펩타이드에 유연성을 부여하고, NGF 생물학적 기능을 유지/개선하고/하거나 지속형 NGF 폴리펩타이드의 인비보에서의 반감기 및/또는 안정성에 유의미한 영향을 미치지 않는다. 일부 실시양태에서, 링커는 안정한 링커이다(예를 들어, 프로테아제, 특히 MMP에 의해 절단되지 않음).

일부 실시양태에서, 링커는 펩티드 링커이다. 펩티드 링커는 임의의 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 약 1 내지 약 10개의 아미노산 길이, 약 3 내지 약 18개의 아미노산 길이, 약 1 내지 약 20개의 아미노산 길이, 약 10 내지 약 20개의 아미노산 길이, 약 21 내지 약 30개의 아미노산 길이, 약 1 내지 약 30개의 아미노산 길이, 약 10 내지 약 30개의 아미노산 길이, 약 1 내지 약 50개의 아미노산 길이, 약 5 내지 약 40개의 아미노산 길이, 약 12 내지 약 18개의 아미노산 길이, 또는 약 4 내지 약 25개의 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 아미노산 길이 중 하나이다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 약 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 아미노산 길이 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 약 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개의 아미노산 길이 중 어느 하나이다. 바람직하게는, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드의 인비보 기능 및/또는 안정성은 잠재적인 바람직하지 않은 도메인 상호작용을 방지하기 위해 링커 펩타이드를 첨가함으로써 최적화된다. 일부 실시양태에서, 링커 길이는 바람직하지 않은 도메인 상호작용을 방지하고/하거나 생물학적 기능 및/또는 안정성을 최적화하는 데 필요한 길이를 초과하지 않는다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 최대 약 30개 아미노산 길이, 예컨대 최대 약 20개 아미노산 길이, 또는 최대 약 15개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 링커는 약 5 내지 약 30개의 아미노산 길이, 또는 약 5 내지 약 18개의 아미노산 길이이다.

펩티드 링커는 천연 발생 서열 또는 비천연 발생 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 중쇄 단독 항체의 힌지 영역에서 유래된 서열을 링커로 사용할 수 있다. 예를 들어 WO1996/34103을 참조한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 힌지이다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 돌연변이된 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 힌지이다. 일부 실시양태에서, 링커는 유연한 링커이다. 예시적인 유연한 링커는 글리신 폴리머 (G)_n (서열번호: 73), 글리신-세린 폴리머 (예를 들어 (GS)_n (서열번호: 74), (GGS)_n (서열번호: 75), (GGGS)_n(서열번호: 76), (GGS)_n(GGGS)_n (서열번호: 77), (GSGGS)_n (서열번호: 78), (GGSGS)_n (서열번호: 79), 또는 (GGGGS)_n (서열번호: 70) 포함, 여기서 n은 적어도 하나의 정수), 글리신-알라닌 폴리머, 알라닌-세린 폴리머, 및 기타 당업계에 알려진 유연한 링커를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 글리신 및 글리신-세린 폴리머는 상대적으로 구조화되지 않았으므로 구성요소 사이에서 중성 테더(tether) 역할을 할 수 있다. 글리신은 심지어 알라닌보다 현저하게 더 많은 phi-psi 공간에 접근하고 더 긴 측쇄를 가진 잔류물보다 훨씬 덜 제한적이다 (Scheraga, Rev. Computational Chem. 11 173-142 (1992) 참조). 예시적인 유연한 링커는 GG (서열번호: 86), GGSG (서열번호: 87), GGSGG (서열번호: 88), GSGSG (서열번호: 89), GSGGG (서열번호: 90), GGGSG (서열번호: 91), GSSSG (서열번호: 92), GGSGGS (서열번호: 93), SGGGGS (서열번호: 94), GGGGS (서열번호: 95), (GA)_n (서열번호: 96, n은 최소 1인 정수), GRAGGGGAGGGG (서열번호: 97), GRAGGG (서열번호: 98), GSGGGSGGGGSGGGGS (서열번호: 80), GGGSGGGGSGGGGS (서열번호: 81), GGGSGGSGGS (서열번호: 82), GGSGGSGGSGGSGGG (서열번호: 83), GGSGGSGGGGSGGGGS (서열번호: 84), GGSGGSGGSGGSGGSGGS (서열번호: 85), GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호: 68), GGGGGGSGGGGSGGGGSA (서열번호: 69), GSGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호: 71), KTGGGSGGGS (서열번호: 72) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 링커는 ASTKGP(서열번호: 99)의 서열을 포함한다. 통상의 기술자는 지속형 NGF 폴리펩타이드의 설계가 모두 또는 부분적으로 유연한 링커를 포함할 수 있고, 링커는 유연한 링커 부분뿐만 아니라 덜 유연한 구조를 부여하는 하나 이상의 부분을 포함하여 원하는 지속형 NGF 폴리펩타이드 구조 및 기능을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 세린-글리신이 풍부하다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 서열번호: 68-72 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 (GGGGS)_n(서열번호: 70)의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 정수이고, 바람직하게는 n은 2 내지 6, 더 바람직하게는 n은 3 또는 4의 정수이다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 서열번호: 68 또는 69의 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다).

다른 링커 고려사항에는 용해도, 친유성, 친수성, 소수성, 안정성(계획된 분해뿐만 아니라 다소 안정적), 강성, 유연성, 면역원성, NGF 모이어티/NGF 수용체 결합, 마이셀 또는 리포좀으로 통합되는 능력 등과 같은 생성된 지속형 NGF 폴리펩타이드의 물리적 또는 약동학적 특성에 대한 영향이 포함된다.

결합 친화도

분자(예를 들어, NGF 모이어티, 또는 NGF 모이어티를 포함하는 NGF 폴리펩타이드) 및 그의 결합 파트너(예를 들어, TrkA와 같은 NGF 수용체)의 결합 친화성은 당업계에 알려진 임의의 적합한 리간드 결합 분석 또는 항체/항원 결합 분석, 예를 들어, 웨스턴 블롯, 샌드위치 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), Meso Scale Discovery(MSD) 전기화학발광, 비드 기반 다중 면역검정(MIA), RIA, 표면 플라즈마 공명(SPR), ECL, IRMA, EIA, Biacore 분석, Octet 분석, 펩타이드 스캔 등에 의해 실험적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, NGF 모이어티, NGF 모이어티를 포함하는 NGF 폴리펩타이드, 또는 그의 수용체(예를 들어, TrkA) 또는 다양한 마커 제제로 표시된 그의 서브유닛을 사용하거나 BiacoreX(Amersham Biosciences)를 사용하여 용이한 분석이 가능하며, 이는 키트에 첨부된 사용설명서 및 실험조작방법에 따른 일반의약품(over-the-counter), 측정키트 또는 이와 유사한 키트이다.

일부 실시양태에서, 단백질 마이크로어레이가 큰 규모에서 본 명세서에 기술된 NGF 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드의 이의 수용체에 대한 상호작용, 기능 및 활성을 분석하는데 사용된다. 단백질 칩은 다양한 포획 단백질(예를 들어 NGF 수용체 또는 이의 서브유닛)과 결합된 지지 표면을 갖는다. 이후 형광 표지된 프로브 분자가(예를 들어 본 명세서에 기술된 NGF 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드) 어레이에 첨가되고, 결합된 포획 단백질과 상호작용에 따라, 형광 신호가 방출되고 레이저 스캐너에 의해 판독된다.

결합 친화도는 또한 SPR (Biacore T-200)를 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 항-인간 IgG 항체는 EDC/NHS 화학을 사용하여 CM-5 센서 칩의 표면에 결합된다. 인간 TrkA-Fc 융합 단백질은 이의 표면에 걸쳐 포획된 리간드로 사용된다. 본 명세서에 기술된 NGF 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드의 계열 희석은 포획된 리간에 결합에 허용되고, TrkA에 대한 NGF의 결합 및 분해는 실시간으로 모니터링될 수 있다. 평형 해리 상수(K_d) 및 해리 속도 상수는 BIA 평가 소프트웨어를 사용하여 동역학 분석을 수행함으로써 측정될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 NGF 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드와 이의 수용체(예를 들어 TrkA) 또는 이의 서브유닛 사이의 결합의 K_d는 약 ≤10^-5 M, ≤10^-6 M, ≤10^-7 M, ≤10^-8 M, ≤10^-9 M, ≤10^-10 M, ≤10^-11 M, 또는 ≤10^-12 M 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 야생형 NGF 및 이의 수용체(예를 들어 TrkA)와 이의 서브유닛 사이의 결합의 K_d는 본 명세서에 기술된 NGF 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드 및 동일한 수용체(예를 들어 TrkA) 또는 이의 서브유닛 사이의 결합의 K_d와 유사하거나(예를 들어 동일하거나) 적어도 약 1.5배(예를 들어 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 500, 또는 1000배)이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 NGF 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드와 이의 수용체(예를 들어 P75) 또는 이의 서브유닛 사이의 결합의 K_d는 야생형 NGF 및 동일한 수용체(예를 들어 P75) 또는 이의 서브유닛 사이의 결합의 K_d와 유사하거나(예를 들어 동일하거나) 적어도 약 2배(예를 들어 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 500, 또는 1000배 중 어느 하나)이다.

일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 돌연변이 또는 변형(예를 들어 번역후 변형)을 포함하며, 돌연변이/변형된 NGF 모이어티(또는 지속형 NGF 폴리펩타이드)와 이의 수용체(예를 들어 TrkA) 또는 이의 서브유닛 사이의 결합의 K_d는 야생형 NGF 및 동일한 수용체(예를 들어 TrkA) 사이의 결합의 K_d와 유사하거나(예를 들어 동일하거나) 적어도 약 2배(예를 들어 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 500, 또는 1000배 중 어느 하나)이다. 일부 실시양태에서, NGF 모이어티는 돌연변이 또는 변형(예를 들어 번역후 변형)을 포함하며, 야생형 NGF 및 이의 수용체(예를 들어 P75) 또는 이의 서브유닛 사이의 결합의 K_d는 돌연변이/변형된 NGF 모이어티(또는 지속형 NGF 폴리펩타이드) 및 동일한 수용체(예를 들어 P75) 사이의 결합의 K_d와 유사하거나(예를 들어 동일하거나) 적어도 약 2배(예를 들어 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 500, 또는 1000배 중 어느 하나)이다.

생물활성

본 명세서에 기술된 NGF, NGF 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드의 생물활성을 측정하기 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 생물활성은 CN103376248A 및 CN108727486A에 기술된 것과 같은 TF-1 세포 증식 분석에 의해 측정될 수 있으며, 이들의 내용은 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다. 또한 아래 실시예 4를 참조한다. 생물활성은 또한 신생 래트(rat)에서 우수한 경추 신경절(SCG) 성장을 촉진하거나(예를 들어, 하기 실시예 5 참조), 닭 배아에서 후근신경절(dorsal root ganglion) 성장을 촉진하는 능력(예를 들어 WO2017157326 참조, 이의 전체 내용은 참조로 본 명세서에 포함됨)에 기초하여 측정될 수 있다. 생물활성은 또한 i) 당뇨병성 신경병증의 동물 모델/환자에서와 같은 상처 치유의 개선(예를 들어, 실시예 7 참조); ii) 알츠하이머병의 동물 모델/환자에서와 같은 공간 인지, 기억 및/또는 학습 능력의 개선(예를 들어, 실시예 8 참조); iii) 난소 과립막 유사 종양 세포주 증식 및/또는 에스트로겐 분비의 개선, 및/또는 조기 난소 부전의 동물 모델/환자에서 난포 감소의 역전(예를 들어, 실시예 9 참조); iv) 정자 형성 장애의 동물 모델/환자에서 정자 수 및/또는 운동성 감소의 구조, 및/또는 고환 정세관 위축, 정세관 정자 형성 장애 및/또는 부고환관 세포 단편에 대한 치료 효과(예를 들어, 실시예 10 참조); 또는 v) 신경영양성 각막염의 동물 모델/환자에서 손상된 각막의 온전성 회복(예를 들어, 플루오레세인 나트륨 염색 검정에 의함), 및/또는 손상된 각막 신경의 구조(예를 들어, 각막 신경 길이 측정에 의함) (예를 들어, 실시예 11 참조); 등에 기초하여 측정될 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 적용 가능한 분석은 NGF 모이어티 또는 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드의 생물활성을 시험하기 위해 채택될 수 있다.

생물분석은 NGF의 생물학적 활성에 초점을 맞추고 이를 판독값으로 사용한다. 생물분석에서 샘플의 활성은 민감한 세포주(예를 들어 테스트 샘플에 의존적 및/또는 반응하는 일차 세포 배양 또는 인비트로 적응된 세포주) 또는 NGF 관련 질병의 동물 모델/인간에서 테스트되며, 이 활성(예를 들어 세포 증식)의 결과는 표준 NGF 제제 또는 대조군(예: 마우스 NGF, mNGF118 또는 공지된 지속형 NGF 폴리펩타이드)와 비교된다. NGF의 생물학적 활성의 다른 측면은 다음을 포함한다: (i) 뉴런 생존 지원; (ii) 신경돌기 성장 촉진; (iii) 신경화학적 분화 향상; (iv) 췌장 β 세포의 증식 촉진; (v) 선천적 및/또는 후천적 면역 유도; (vi) 손상된 신경 세포 회복 및/또는 손상 방지(예: 신경영양성 각막염); (vii) 난포 세포의 증식 및/또는 에스트로겐 분비 촉진; (viii) 상처 치유 촉진(예: 당뇨병성 신경병증에서); (ix) 신경퇴행성 질환(예: 알츠하이머병)을 앓는 대상체의 공간 인지, 기억 및/또는 학습 능력 개선; (x) 신경변성의 치료 및/또는 예방; (xi) 고환 정세관 위축, 정세관 정자 형성 장애 및/또는 부고환관 세포 단편의 치료; (xii) 정자 수 및/또는 운동성의 감소를 구하거나 정자 수 및/또는 운동성을 증가(예: 정자 형성 장애); 및/또는 (xiii) 난소 난포의 수 및/또는 기능 감소를 역전시키거나 난소 난포의 수 및/또는 기능을 증가시킨다(예: 조기 난소 부전). 이러한 모든 활동을 측정하기 위한 인비트로 및/또는 인비보 분석은 신경 생존 분석 또는 신경 돌기 성장 분석과 같이 사용할 수 있다.

예를 들어, TF-1 세포 증식 분석에서 샘플(예: 지속형 NGF 폴리펩타이드) 및 대조군(예: 비히클 또는 SuTaiSheng® 마우스 NGF)의 계열 희석액을 96-웰 플레이트에 준비한 다음, TF-1 세포를 각 웰에 첨가하고 습한 인큐베이터에서 37°C, 5% CO₂하에 배양한다. 배양 후 며칠(예: 3일)에 MTS 용액을 세포 현탁액의 각 웰에 추가하고 37°C, 5% CO₂에서 3시간 동안 배양한다. 그런 다음 490nm 및 650nm에서 흡광도를 분광광도계로 측정하여 NGF 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드가 TF-1 세포 증식을 촉진하는 방법을 나타낼 수 있다. 데이터는 대조군 샘플로 정규화될 수 있다. 또한 예시적인 방법에 대해서는 실시예 4를 참조한다.

세포 신호 분석은 또한 본 명세서에 기술된 NGF 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드의 생물활성을 시험하기 위해 사용될 수 있다. 전체 및 인산화 형태의 신호 단백질을 모두 정량화하기 위해, 예를 들어 ADP, AMP, UDP, GDP 및 성장 인자와 같은 신호 전달에 관여하는 효소 반응 동안 생성된 분석물을 검출하기 위해, 다양한 세포 신호 분석 키트가 상업적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 NGF 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드와 함께 세포를 배양한 후, 특정 키나제가 활성인지를 결정하기 위해, 세포 용해물을 방사성 인산염의 존재 하에 효소에 대한 공지된 기질에 노출시킨다. 생성물은 전기영동(면역침전 유무에 관계없이)에 의해 분리된 다음 겔이 X선 필름에 노출되어 단백질이 동위원소를 통합했는지 여부를 측정한다. 일부 실시양태에서, 세포 상에서 본 명세서에 기재된 NGF 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드의 생물활성은 신호 단백질을 위치시키기 위해 면역조직화학에 의해 측정된다. 예를 들어, 신호 단백질 자체에 대한 항체 또는 활성화된 상태의 신호 단백질을 사용할 수 있다. 이 항체는 인산염 또는 기타 활성화 형태를 포함하는 인식 에피토프를 가지고 있다. 일부 실시양태에서, 특정 신호전달 단백질의 이동(예를 들어, 신호전달 분자의 핵 전좌)은 형광 단백질 유전자, 예를 들어 녹색 형광 단백질(GFP)을 연구할 단백질을 인코딩하는 유전자 벡터에 통합함으로써 추적될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 상에서 본 명세서에 기술된 NGF 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드의 생물활성은 웨스턴 블롯에 의해 테스트된다. 예를 들어, 모든 티로신-인산화 단백질(또는 다른 인산화 아미노산, 예를 들어, 세린 또는 트레오닌)은 항포스포티로신 항체(또는 다른 인산화 아미노산에 대한 항체)를 사용하여 일시적인 순서로 자극 이후 얻은 세포 용해물의 웨스턴 블롯에서 검출할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 상에서 본 명세서에 기술된 NGF 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드의 생물활성은 면역침전에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 특정 신호 단백질 또는 모든 티로신 인산화 단백질에 대한 1차 항체는 비드에 가교된다. 본 명세서에 기재된 NGF 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드와 함께 배양 후 세포는 프로테아제 억제제를 함유하는 완충액에서 용해된 다음 항체-코팅된 비드와 함께 배양된다. SDS 전기영동을 이용하여 단백질을 분리한 후, 웨스턴 블랏에서 설명한 절차를 이용하여 단백질을 동정한다. 일부 실시양태에서, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST) 결합, 또는 "풀다운" 분석이 또한 사용될 수 있는데, 이는 직접적인 단백질-단백질(예를 들어, 신호 단백질) 상호작용을 측정한다.

예를 들어, RAS/ERK1/2 신호는 예를 들어 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 ERK1/2의 인산화에 의해 세포 성장을 촉진하는 NGF 생체활성을 반영하기 위해 측정될 수 있다. 예를 들어, ERK1/2 인산화는 분자의 인산화 버전에 특이적인 항체를 사용하여 측정할 수 있다(선택적으로 유세포 분석과 함께). 예를 들어, 닭 배아 후근 신경절(DRG) 또는 TF-1 세포는 본 명세서에 기술된 NGF 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드와 함께 37℃에서 배양된다. 배양 후, 세포는 인산화 상태를 보존하기 위해 즉시 고정되고 투과화된다. 세포는 인산화된 ERK1/2, 예를 들어 Alexa488-접합된 항-ERK1/2 pT202/pY204(BD Biosciences)에 대한 항체로 염색되고 유세포 분석기로 분석된다. PI 3-키나아제 신호전달은 또한 NGF 생체활성을 반영하기 위해 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, PI 3-키나아제 신호전달은 포스포-S6 리보솜 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 측정할 수 있다(선택적으로 유세포 분석과 함께).

본 명세서에 기술된 NGF 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드의 생물활성은 또한 인비보 또는 엑스비보 실험에 의해, 예를 들어 지표 세포의 증식을 측정함으로써, 신호 전달의 유도 또는 억제를 측정함으로써, 조직 부피 및 /또는 무게 등을 측정함으로써 반영될 수 있다.

예를 들어, SCG 인비보 성장 분석에서, 샘플(예: 지속형 NGF 폴리펩타이드) 및 대조군(예: PBS 또는 SuTaiSheng® 마우스 NGF)은 단일 주사 또는 다중 주사로 신생아 랫트의 목에 피하 투여될 수 있다. 이 쥐는 주입 후 며칠 후 SCG 해부를 위해 희생된다. SCG는 인비보 성장을 촉진하는 NGF 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드의 생체 활성을 연구하기 위해 형태에 대해 무게를 측정하고 기록될 수 있다. 또한 예시적인 방법에 대해서는 실시예 5를 참조한다.

후근 신경절 성장 분석에서 닭 배아 후근 신경절(예: 8일령)을 다양한 농도의 샘플(예: 지속형 NGF 폴리펩타이드) 또는 대조군(예: PBS 또는 SuTaiSheng® 마우스 NGF)을 함유하는 배지에 첨가할 수 있으며, 5% CO₂ 및 37℃, 예를 들어 24시간 동안 포화 습도 인큐베이터에서 배양한다. 후근 신경절의 성장 상태를 모니터링하는데, 이는 후근 신경절 성장을 촉진하는 NGF 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드의 생체활성을 반영할 수 있다. AU/mg에 반영된 분석에 NGF 표준이 포함된 경우 샘플의 특정 생물활성도 계산될 수 있다. 테스트할 샘플의 특정 활성도(AU/mg) = 참고 제품의 활성(AU/ml) Х [샘플의 사전 희석 계수 Х 희석점에서 해당 참고 제품의 활성(AU/ml) / 참고 제품의 실제 활성(AU/ml)]. 또한 예시적인 방법에 대하여 WO2017157326의 실시예 5를 참조한다.

일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 NGF 모이어티(또는 지속형 NGF 폴리펩타이드)은 야생형 NGF(또는 야생형 NGF를 포함하는 폴리펩타이드)와 비교하여 이의 생체활성을 유지/증진/감소시키는 돌연변이 또는 변형(예를 들어, 번역 후 변형)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 돌연변이된 또는 변형된 NGF 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드는 야생형 NGF(또는 야생형 NGF를 포함하는 폴리펩타이드)에 비해 유사하거나(예를 들어 동일하거나) 적어도 약 2배(예를 들어 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 500, 1000, 5000, 또는 10000배 이상 중 어느 하나)의 생물활성(예를 들어 세포 성장 촉진)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드는 NGF 모이어티(예를 들어 지속형 NGF 폴리펩타이드의 상응하는 NGF 모이어티)와 유사하거나(예를 들어 동일하거나) 적어도 약 1.1배(예를 들어 적어도 약 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100배, 또는 그 이상 중 어느 하나)의 생물활성(예를 들어 세포 성장 촉진, 상처 치료)을 갖는다.

약동학(PK)

약동학(PK)은 일단 대상체에게 투여된 약물(예를 들어, 본 명세서에 기술된 NGF 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드)의 흡수, 분포, 대사 및 배설을 의미한다. 임상적 유용성을 결정하는 데 유용할 수 있는 약동학 매개변수에는 혈청/혈장 농도, 시간 경과에 따른 혈청/혈장 농도, 최대 혈청/혈장 농도(C_max), 최대 농도에 도달하는 시간(T_max), 반감기(t_1/2), 투여 간격내 농도 시간 곡선하 면적(AUC_τ) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 기술된 NGF 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드와 같은 약물 또는 참조 약물(예를 들어, SuTaiSheng® 마우스 NGF)의 PK 곡선을 얻기 위한 기술은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Heller et al., Annu Rev Anal Chem, 11, 2018; and Ghandforoush-Sattari et al., J Amino Acids, Article ID 346237, Volume 2010 참조한다. 일부 실시양태에서, 개체에서 본 명세서에 기재된 NGF 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드의 PK 곡선은 개체로부터의 혈액, 혈장 또는 혈청 샘플에서 측정된다. 일부 실시양태에서, 개체에서 본 명세서에 기술된 NGF 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드의 PK 곡선은 LC-MS/MS 또는 ELISA와 같은 질량 분석 기술을 사용하여 측정된다. PK 곡선에 대한 PK 분석은 예를 들어 PKSolver V2 소프트웨어를 사용하는 비구획 분석과 같은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다 (Zhang Y. et al., "PKSolver: An add-in program for pharmacokinetic and pharmacodynamic data analysis in Microsoft Excel," Comput Methods Programs Biomed. 2010; 99(3):306-1). 또한 예시적인 방법에 대해서는 실시예 6을 참조한다.

"C"는 대상체의 혈장, 혈청 또는 임의의 적절한 체액 또는 조직에서 약물(예를 들어, NGF 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드)의 농도를 나타내며, 일반적으로 예를 들어 단위 부피당 질량으로 표현되며, 예를 들어 밀리리터당 나노그램으로 표현된다. 편의상, 혈청 또는 혈장 내 약물 농도는 본 명세서에서 "혈청 농도" 또는 "혈장 농도"로 지칭된다. 약물 투여 후 임의의 시점에서의 혈청/혈장 농도(예를 들어, NGF 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드, 예를 들어 i.v., i.p. 또는 피하 투여)는 C_time 또는 C_t로 언급된다. 투약 기간 동안 최대 혈청/혈장 약물 농도는 C_max로 참조되는 반면, C_min은 투약 간격 종료 시점의 최소 혈청/혈장 약물 농도를 의미하며; C_ave는 투약 간격 동안의 평균 농도를 나타낸다.

"생체이용률"이라는 용어는 약물(예를 들어, NGF 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드)이 전신 순환계에 들어가 작용 부위에 접근하는 정도(종종 속도)를 의미한다.

"AUC"는 혈청/혈장 농도-시간 곡선 아래 면적이며, 투약 간격 내의 농도 시간 곡선 아래 면적(AUC_τ), "전체 노출" 또는 "시간에 따른 총 약물 노출"(AUC_0-last 또는 AUC_0-inf), 투여 후 시간 t에서의 농도 시간 곡선 아래 면적(AUC_0-t) 등과 같은 생체이용률의 가장 신뢰할 수 있는 척도로 간주된다.

혈청/혈장 농도 피크 시간(T_max)은 약물(예를 들어 NGF 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드) 투여 후 피크 혈청/혈장 농도(C_max)에 도달하는 시간이다.

반감기(t_1/2)는 혈장 또는 혈청(또는 기타 생물학적 기질)에서 측정된 약물 농도(예: NGF 모이어티 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드)가 특정한 시점에서 이의 농도 또는 양이 정확히 절반으로 감소하는 데 필요한 시간이다. 예를 들어, IV 투약 후 혈장 또는 혈청 내 약물 농도는 분포 및 제거로 인해 감소한다. IV 투여 후 시간 경과에 따른 약물 농도의 혈장 또는 혈청 프로필에서, 첫 번째 단계 또는 급속한 감소는 주로 분포로 인한 것으로 간주되는 반면, 감소의 후기 단계는 두 프로세스 모두 두 단계에서 발생하더라도 일반적으로 더 느리고 주로 제거로 인한 것으로 간주된다. 분포는 충분한 시간이 지난 후에 완료되는 것으로 간주된다. 일반적으로 제거 반감기는 혈장/혈청 농도 대 시간 곡선의 말기 또는 제거(우성) 단계에서 결정된다. 예를 들어, Michael Schrag and Kelly Regal, "Chapter 3　-　Pharmacokinetics and Toxicokinetics" of "A Comprehensive Guide to Toxicology in Preclinical Drug Development", 2013 참조한다.

일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드는 적어도 약 5시간, 예를 들어 적어도 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70 , 80, 90, 100, 150, 200, 250, 또는 300시간 또는 그 이상 중 어느 하나의 반감기를 갖는다(예를 들어, 인간에게 i.v., s.c., 또는 근육내 투여). 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 지속형 NGF 폴리펩타이드는 약 5시간 내지 약 300시간, 예를 들어 약 8시간 내지 약 100시간, 약 10시간 내지 약 60시간, 약 15시간 내지 약 60시간, 또는 약 20시간 내지 약 58시간의 반감기를 갖는다(예를 들어 인간에게 i.v. 투여). 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드는 단일 투여, 예를 들어 단일 정맥내 주사 또는 주입, 단일 근육내 주사 또는 단일 피하 주사로 투여된다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드의 순환 반감기는 약 55시간이다.

일부 실시양태에서, NGF 모이어티의 반감기는 약 1시간 내지 약 2.5시간, 예컨대 약 1.5시간 내지 약 2.4시간이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 지속형 NGF 폴리펩타이드의 순환 반감기는 상응하는 NGF 모이어티(즉, 지속형 NGF 폴리펩타이드 내에 포함되지만 Fc 융합은 없는 NGF 모이어티) 또는 야생형 NGF의 순환 반감기의 적어도 약 5배이며, 예를 들어 상응하는 NGF 모이어티 또는 야생형 NGF에 비해 적어도 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100배 또는 그 이상 중 어느 하나이다.

통증 유발 활성

NGF는 동물과 인간에게 통증을 유발하므로 통증에 대해 잘 검증된 표적이다. 성인의 경우, 특히 NGF는 중추 및 말초 뉴런 하위 집합의 건강 및 생존을 촉진한다(Huang & Reichardt, Ann. Rev. Neurosci. 24:677-736 (2001)). NGF는 또한 이러한 뉴런의 기능적 특성의 조절에 기여하고 통각수용기(nociceptors)라고 하는 감각 통증 수용체의 민감성 또는 흥분성에 대한 긴장성 조절을 발휘한다(Priestley et al., Can. J. Physiol. Pharmacol. 80:495-505 (2002); Bennett, Neuroscientist 7:13-17 (2001)). 통각수용기는 통증을 지각하게 만드는(통각 수용) 다양한 유해 자극을 감지하고 중추신경계로 전달한다. NGF 수용체는 통각수용기에 위치한다. NGF의 발현은 손상되고 염증이 생긴 조직에서 증가하고 인간의 통증 상태에서 상향 조절된다. NGF-유도 통각(nociception)/통증은 고친화성 NGF 수용체인 trkA(티로신 수용체 키나아제 A)에 의해 매개된다(Sah, et al., Nat. Rev. Drug Disc. 2:460-72 (2003)).

가장 넓은 의미에서 "통증"은 이를 경험하는 개인에게 매우 주관적인 경험적 현상을 말하며 환경 및 문화적 배경을 포함한 개인의 정신 상태에 의해 영향을 받는다. "신체적" 통증은 일반적으로 실제 또는 잠재적인 조직 손상을 유발하는 제3자가 인지할 수 있는 자극과 연결될 수 있다. 이러한 관점에서, 국제 통증 연구 협회(IASP)에 따르면 통증은 "실제 또는 잠재적인 조직 손상과 관련되거나 그러한 손상의 관점에서 설명되는 감각적 및 감정적 경험"으로 간주될 수 있다. 그러나 통증의 일부 경우에는 인지할 수 있는 원인이 없다. 예를 들어, 심인성 요인에 의해 이미 존재하는 신체적 통증의 악화를 포함하는 심인성 통증 또는 인지할 수 있는 통증 원인의 증거 없이 심리적 장애가 있는 사람에서 때때로 지속적이고 인지되는 통증의 증후군.

통증은 통각수용성 통증, 신경병성/신경성 통증, 돌발성 통증, 이질통, 통각과민, 감각과민, 감각이상(dysesthesia), 지각이상(paresthesia), 과민증, 환상지 통증, 심인성 통증, 돌발성 마취, 신경통, 신경염을 포함한다. 다른 분류에는 악성 통증, 협심증 및/또는 특발성 통증, 복합 부위 통증 증후군 I, 복합 부위 통증 증후군 II가 포함된다. 통증의 유형과 증상은 상호 배타적일 필요는 없다. 이러한 용어는 IASP에서 정의한 대로 사용된다.

통각수용성 통증은 유해한 자극에 대한 반응으로 말초 신경의 특화된 감각 통각수용기에 의해 시작되어 유해한 자극을 활동 전위로 인코딩한다. 일반적으로 Aδ 섬유 및 (폴리모달(Polymodal)) C 섬유에 있는 통각수용기는 피부 바로 아래, 힘줄, 관절 및 신체 기관에서 끝나는 자유 신경 종말이다. 후근 신경절(DRG) 뉴런은 말초와 척수 사이의 통신 사이트를 제공한다. 신호는 척수를 통해 뇌간 및 시상 부위로 처리되고 마지막으로 대뇌 피질로 전달되며, 여기서 일반적으로(항상 그런 것은 아님) 통증 감각을 유발한다. 통각 수용성 통증은 신체 조직을 자극하거나 손상시킬 가능성이 있는 다양한 화학적, 열적, 생물학적(예: 염증) 또는 기계적 사건으로 인해 발생할 수 있으며, 일반적으로 통각수용기에서 통각 활동을 유발하는 데 필요한 강도의 특정 최소 임계값을 초과한다.

신경병성 통증은 일반적으로 말초 또는 중추 신경계의 비정상적인 기능의 결과이며 각각 말초 또는 중추 신경병성 통증을 유발한다. 신경병성 통증은 IASP에 의해 신경계의 일차 병변 또는 기능 장애에 의해 시작되거나 유발되는 통증으로 정의된다. 신경병성 통증은 종종 특히 만성적인 경우에 신경계에 실제적인 손상을 포함한다. 염증성 통각수용성 통증은 일반적으로 조직 손상 및 그에 따른 염증 과정의 결과이다. 신경병성 통증은 관찰 가능한 조직 손상의 명백한 치유 이후에도(예를 들어, 수개월 또는 수년) 지속될 수 있다.

신경병증성 통증의 경우, 영향을 받는 부위의 감각 처리가 비정상이 될 수 있으며 일반적으로 통증을 유발하지 않는 무해한 자극(예: 열, 접촉/압력)이 통증을 유발하거나(즉, 이질통) 유해한 자극이 일반적으로 고통스러운 자극에 대한 반응에서 통증에 대한 과장된 인식을 유발할 수 있다(즉, 통각 과민). 또한, 전기적 따끔거림이나 충격 또는 "핀과 바늘"(즉, 지각 이상(paresthesias))과 유사한 감각 및/또는 불쾌한 특성을 갖는 감각(즉, 감각 이상(dysesthesias))이 정상적인 자극에 의해 유발될 수 있다. 돌발성 통증은 기존의 만성 통증이 악화되는 것이다. 과민증은 자극에 대한 비정상적으로 고통스러운 반응으로 인해 발생하는 고통스러운 증후군이다. 대부분의 경우 자극은 통증 역치를 증가시키면서 반복적이며, 이는 환자가 통증으로 인식할 수 있는 통증의 최소 경험이라고 할 수 있다.

신경병성 통증의 예는 촉각 이질통(예를 들어, 신경 손상 후 유도됨) 신경통(예를 들어, 대상포진(herpetic) 후(또는 대상포진(shingles) 후) 신경통, 삼차신경통), 반사성 교감 신경 이영양증/작열통(신경 외상), 암 통증의 구성요소(예를 들어, 암 자체 또는 염증과 같은 관련 상태로 인한 통증 또는 화학 요법, 수술 또는 방사선 요법과 같은 치료로 인한 통증), 환상지 통증, 포획 신경병증(예: 수근관 증후군) 및 말초 신경병증(예: 당뇨병, HIV, 만성 알코올 사용, 다른 독소(많은 화학 요법 포함)에 대한 노출, 비타민 결핍 및 기타 다양한 의학적 상태)이 포함된다. 신경병성 통증은 수술, 상처, 헤르페스, 당뇨병성 신경병증, 다리 또는 팔의 절단, 암 등과 같은 다양한 원인에 의한 신경 손상 후 신경계의 병리학적 작용 발현에 의해 유발되는 통증을 포함한다. 신경병성 통증과 관련된 의학적 상태에는 외상성 신경 손상, 뇌졸중, 다발성 경화증, 척수공동증, 척수 손상 및 암이 포함된다.

통증 유발 자극은 종종 통증 경험에 기여할 수 있는 염증 반응을 유발한다. 일부 상태에서 통증은 통각수용성 요인과 신경병성 요인의 복잡한 혼합에 의해 유발되는 것으로 보인다. 예를 들어, 만성 통증은 종종 염증성 통각수용성 통증 또는 신경병성 통증, 또는 이들의 혼합을 포함한다. 초기 신경계 기능 장애 또는 손상은 염증 매개체의 신경 방출 및 후속 신경병성 염증을 유발할 수 있다. 예를 들어, 편두통은 신경병성 통증과 통각수용성 통증의 혼합을 나타낼 수 있다. 또한, 근막 통증은 아마도 근육으로부터의 침해수용성 입력에 이차적이지만 비정상적인 근육 활동은 신경병증 상태의 결과일 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드는 예를 들어 Fc 융합이 없는 상응하는 NGF 모이어티, 야생형 NGF 또는 본 명세서에 기술되지 않은 다른 NGF-Fc 융합 단백질(이하 "참조 NGF 구성"으로 지칭)에 비해 대상체에서 통증 유발 활성이 감소되거나 전혀 없다. 일부 실시양태에서, 통증은 급성 통증, 단기 통증, 지속성 또는 만성 통각수용성 통증, 또는 지속성 또는 만성 신경병성 통증이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드는 참조 NGF 구성(예를 들어, 야생형 β-NGF)에 비해 통증을 적어도 약 10% 덜 유발하며, 예를 들어 참조 NGF 구성에 비해 적어도 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 중 어느 하나만큼 통증을 덜 유발한다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드는 대상체에게 투여될 때 통증을 유발하지 않는다.

통증 유발 활성은 WO2017157325, WO2017157326 및 CN108727486A에 기술된 것과 같은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있으며, 이들의 내용은 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, 통증은 통증 역치에 의해 측정되며, 통증 역치가 높을수록 통증이 적다.

예를 들어, 통증 유발 활성은 환자에게 다양한 척도에 따라 경험한 통증의 질과 강도를 평가하도록 요청하여 측정할 수 있다. 구두 통증 척도는 단어를 사용하여 무통증, 경미한 통증, 중등도 통증 및 중증 통증의 범위를 설명하며 각각에 0-3점을 부여한다. 그렇지 않으면, 환자에게 0(통증 없음)에서 10(가장 심한 통증)까지의 숫자 통증 척도에 따라 통증을 평가하도록 요청할 수 있다. 시각적 아날로그 척도(VAS)에서 수직선 또는 수평선에는 통증이 없는 상태에서 가장 심한 통증까지 통증을 설명하는 단어가 있으며 환자는 현재 통증 수준을 나타내는 지점에 선을 표시해야 한다. McGill 통증 지수를 통해 환자는 일련의 짧은 목록에서 통증을 가장 잘 설명하는 단어, 예를 들어 두드리는 것(pounding), 타는 것(burning), 꼬집는 것(pinching)을 선택하여 통증의 질과 강도를 모두 설명할 수 있다. VAS 또는 숫자 척도를 사용하는 데 어려움을 겪는 성인에게는, 예를 들어 FACES 또는 비언어적 환자의 경우 다른 통증 척도, 예를 들어 행동 평가 척도를 사용할 수 있다. 기능적 활동 점수는 통증 부위와 관련된 작업을 수행하도록 요청함으로써 환자가 통증으로 인해 얼마나 방해를 받는지와 관련이 있다. 예를 들어 참조 NGF 구성과 비교하여 이러한 유형의 척도를 사용한 통증 점수의 개선은 시험 NGF 구성(예를 들어, 본 명세서에 기재된 지속형 NGF 폴리펩타이드)에 대한 통증 유발의 감소된 부작용을 잠재적으로 나타낼 것이다.

일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드의 통증 유발 활성은 통증 역치를 결정하기 위해 핫 플레이트 방법(54-55℃)에 의해 마우스에서 시험될 수 있다. 간략하게, 반응 적격 마우스를 마취한 다음, 신경 클램핑 방법을 사용하여 마우스 좌골 신경 손상 모델을 생성하는 반면, 좌골 신경은 분리되지만 모의 수술 그룹에서 클램핑되지 않는다. 그런 다음 마우스를 세 그룹으로 나눈다: 모의 수술 그룹, 손상 대조군(일반 식염수) 및 실험 그룹(본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드 및/또는 마우스 β-NGF와 같은 대조군 NGF로 처리됨). 각 마우스의 통증 임계값은 뒷발을 핥는 대기 시간으로 표시되며, 이는 수술 전과 수술 후 다른 시점에서 측정할 수 있다. 통증 역치 증가 % = (손상 후 10일째 통증 역치 - 손상 전 통증 역치) Х 100% / 손상 전 통증 역치.

본 명세서에 기재된 지속형 NGF 폴리펩타이드의 통증 유발 활성은 또한 통증 역치를 결정하기 위해 기계적 자극 하에 마우스에서 휘어진 발톱 반응을 측정함으로써 마우스에서 시험될 수 있다. 이는 단기 통증 유발 상태 또는 장기 통증 유발 상태에서 테스트할 수 있다. 간단히 말해서, 반응 적격 마우스는 본 명세서에 기술된 비히클 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드(또는 마우스 β-NGF와 같은 대조군 NGF; 다양한 농도일 수 있음)를 발에 s.c. 주사한 다음, 주사 후 기계적 자극(예를 들어, 상이한 시점) 하에 휘어진 발톱 반응이 측정되고, 이는 치료 후 통증 역치를 반영한다.

본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드의 통증 유발 활성은 또한 행동 시험에 의해 시험될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 비히클 또는 지속형 NGF 폴리펩타이드(또는 마우스 β-NGF와 같은 대조군 NGF; 다양한 농도일 수 있음)를 마우스의 관절에 투여할 수 있으며, 이후 샘플이 통증을 유발하는지 여부를 투여 후 레그(leg) 리프팅 유지 시간 및 레그 리프팅 횟수(예를 들어 다른 시점에)를 기록하여 전체 레그 리프팅 지속 시간을 계산하여 조사할 수 있다. 전체 레그 리프팅 지속 시간이 짧을수록 통증 유발 활성이 적음을 나타낸다.

안정성

일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드는 물리적 안정성, 화학적 안정성 및/또는 생물학적 안정성과 같은 우수한 안정성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드는 높은 융점(Tm) 및/또는 높은 개시 응집 온도(Tagg)와 같은 우수한 열 안정성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드는 가속된 스트레스(예를 들어, 고온) 하에서 단편화, 응집체 형성 및/또는 응집체 증가가 적거나 전혀 없는 우수한 안정성을 갖는다.

단백질의 안정성, 특히 응집에 대한 감수성은 주로 단백질 분자의 형태 및 콜로이드 안정성에 의해 결정된다. 일반적으로 응집의 가장 일반적인 형태인 비-천연 단백질 응집의 첫 번째 단계는 분자 구조의 약간의 동요, 예를 들어 단백질의 부분적 풀림, 즉 구조적 변화라고 여겨진다. 이것은 단백질의 구조적 안정성에 의해 결정된다. 두 번째 단계에서 부분적으로 펼쳐진 분자는 확산 및 랜덤 브라운 운동에 의해 응집체를 형성하기 위해 근접하게 된다. 이 두 번째 단계는 주로 분자의 콜로이드 안정성에 의해 좌우된다(Chi et al., Roles of conformational stability and colloidal stability in the aggregation of recombinant human granulocyte colony stimulating factor. Protein Science, 2003 May; 12(5): 903-913 참조). 본 명세서에서 사용되는 "안정성"이라는 용어는 일반적으로 단백질과 같은 생물학적 활성제의 완전성을 유지하거나 분해, 변성, 응집 또는 풀림을 최소화하는 것과 관련된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "향상된 안정성"은 일반적으로 분해, 변성, 응집 또는 풀림을 초래하는 것으로 알려진 조건 하에서 관심 단백질(예를 들어, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드)이 대조군 단백질(예: 예를 들어, 다른 NGF-Fc 융합 단백질)에 비해 큰 안정성을 유지하는 것을 의미한다.

시차주사열량측정법(DSC) 및 시차주사형광측정법(DSF)은 단백질 제형의 안정성을 예측하기 위해 사용되는 당업계에 잘 알려진 기술이다. 구체적으로, 이들 기술은 주어진 제형에서 단백질의 풀림 온도 (Tm)를 결정하는데 사용될 수 있다. 장기간 상온 보관을 위해 주어진 제형에서 단백질에 대한 높은 Tm 측정값을 보다 강력하고 안정한 단백질 제형과 연관시키는 것은 당업계의 표준이다.

"안정한" 단백질(또는 제형), 예를 들어 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드는 본질적으로 제조 공정 동안 및/또는 저장 시 그의 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 유지한다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 다양한 분석 기술은 당업계에서 이용 가능하며 Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) and Jones, A. (1993) Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90에서 리뷰된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 단백질의 안정성은 분해(예를 들어, 단편화) 및/또는 응집된 단백질의 비율이 낮은 용액 중의 단량체 단백질의 비율에 따라 결정된다. 바람직하게는, 단백질(또는 제형)은 실온(약 30℃) 또는 40℃에서 적어도 1개월 동안 안정하고/하거나 약 2-8℃에서 적어도 6개월 동안 또는 적어도 1년 또는 최소 2년 동안 안정하다. 또한, 단백질(또는 제형)은 바람직하게는 동결(예를 들어, -70℃까지) 및 해동(이하 "동결/해동 사이클"이라 함) 후에 안정하다.

단백질, 예를 들어 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드는 색 및/또는 투명도의 육안 검사시 또는 UV 광산란 또는 크기배제 크로마토그래피에 의해 측정된 불안정성의 징후, 예를 들어 응집, 침전 및/또는 변성의 징후를 실질적으로 나타내지 않는 경우 제형에서 "물리적 안정성을 유지"한다. 응집은 개별 단백질 분자 또는 복합체가 공유 또는 비공유 결합하여 응집체를 형성하는 과정이다. 응집은 눈에 보이는 침전물이 형성될 정도로 진행될 수 있다.

단백질, 예를 들어 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드는 주어진 시간에서 화학적 안정성이 단백질이 여전히 그의 생물학적 활성을 유지하는 것으로 간주되는 정도라면(예를 들어, 상기 "생물활성" 하위 섹션에서 언급된 바와 같이) 제형에서 "그의 화학적 안정성을 유지"한다. 화학적 안정성은 예를 들어 화학적으로 변경된 형태의 단백질을 검출하고 정량화하여 평가할 수 있다. 화학적 변경은 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피, SDS-PAGE 및/또는 매트릭스- 보조 레이저 탈착 이온화/비행 시간 질량 분석법(MALDI/TOF MS)을 사용하여 평가할 수 있는 크기 수정(예: 클리핑)을 포함할 수 있다. 다른 유형의 화학적 변경에는 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피로 평가할 수 있는 전하 변경(예: 탈아미드화 또는 산화의 결과로 발생)이 포함된다.

단백질, 예를 들어 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드는 약학적 제형 내의 단백질이 의도된 목적을 위해 생물학적 활성인 경우 제형에서 "생물학적 활성을 유지"한다. 예를 들어, 제형 내 단백질의 생물학적 활성이 제형이 제조된 시점에 나타난 생물학적 활성의 약 30%, 약 20% 또는 약 10%(분석 오차 내) 이내인 경우 생물학적 활성이 유지된다.

당업자는 단백질(예를 들어, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드)의 안정성이 제형의 조성 이외에 다른 특징에 의존한다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어 안정성은 온도, 압력, 습도, pH 및 외부 형태의 방사선에 의해 영향을 받을 수 있다. 단백질 제형에서 단백질(예를 들어, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드)의 안정성은 다양한 수단에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질 안정성은 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 측정된다. SEC는 유체역학적 크기, 확산 계수 및 표면 특성의 조합을 기반으로 분석물(예: 단백질과 같은 거대분자)을 분리한다. 따라서, 예를 들어, SEC는 다양한 변성 상태의 단백질 및/또는 분해된 단백질로부터 천연 3차원 형태로 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드를 분리할 수 있다. SEC에서 고정상은 일반적으로 유리 또는 강철 칼럼 내의 조밀한 3차원 매트릭스에 채워진 불활성 입자로 구성된다. 이동상은 순수한 물, 수성 완충액, 유기 용매, 이들의 혼합물 또는 기타 용매일 수 있다. 고정상 입자는 특정 크기 이하의 종만 들어갈 수 있는 작은 구멍 및/또는 채널을 가지고 있다. 따라서 큰 입자는 이러한 구멍과 채널로부터 배제되지만 더 작은 입자는 흐르는 이동상에서 제거된다. 입자가 고정상 공극에서 고정된 상태로 보내는 시간은 부분적으로 입자가 침투할 수 있는 공극 속으로 얼마나 멀리 가느냐에 달려 있다. 이동상 흐름에서 이들을 제거하면 컬럼에서 용리하는 데 시간이 더 오래 걸리고 크기 차이에 따라 입자가 분리된다. 예시적인 방법을 제공하는 실시예 3을 참조한다.

일부 실시양태에서, SEC는 단백질(예를 들어, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드) 또는 그의 단편을 확인하거나 특성화하기 위한 확인 기술과 조합된다. 단백질 식별 및 특성화는 크로마토그래피 기술, 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 모세관 전기영동-도데실황산나트륨(CE-SDS), 면역분석법, 전기영동, 자외선/가시광선/적외선 분광법, 라만 분광법, 표면 강화 라만 분광법, 질량 분광법, 가스 크로마토그래피, 정적 광산란(SLS), 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR), 원편광 이색성(CD), 요소 유도 단백질 전개 기술, 고유 트립토판 형광, 시차 주사 열량계 및/또는 ANS 단백질 결합을 포함하는 다양한 기술에 의해 달성될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

일부 실시양태에서, 샘플 제형(예를 들어, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드를 포함함) 및 참조 제형(예를 들어, 다른 NGF-Fc 융합 단백질 또는 표준을 포함함)는 단량체의 함량, 응집된 및/또는 단편화된 단백질(및/또는 단편화 증가%, 응집 증가% 등)을 측정하기 위해 처리 단계 전에 임의로 분석되며, 하기 실시예 3에서 기술된 것과 같다. 이어서, 각각의 단백질 제형은 처리 단계를 거친다. 예를 들어, 각각의 단백질 제형은 특정 온도(예를 들어, 40℃, 25℃ 또는 5℃)에서 장기간(예를 들어, 3개월, 6개월, 12개월 또는 그 이상) 동안 보관될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질 제형은 교반 스트레스 분석과 같은 물리적 스트레스 테스트를 거친다. 일부 실시양태에서, 단백질 제형은 고온(예를 들어, 40℃), 고습도 및/또는 낮은 pH 등을 포함하는 가속 스트레스 하에서 처리되는 것과 같은 가속 안정성 시험을 거친다. 일부 실시양태에서, 단백질 제형은 동결 및 해동의 주기를 겪는다. 일부 실시양태에서, 동일한 단백질 제형의 샘플은 차등 처리를 받으며, 예를 들어 상이한 온도에서 일정 기간 동안 보관된다. 처리 단계 후, 단백질 제형은 단백질 단량체, 응집체 및/또는 단편(및/또는 단편화 증가%, 응집 증가% 등)의 함량을 결정하기 위해 분석된다. 일부 실시양태에서, 단백질 제형은 용융 온도(Tm) 및/또는 개시 응집 온도(Tagg)를 측정하기 위해 연속 가열 하에 처리되며, 예를 들어 온도를 약 20℃에서 약 95℃로 증가시키는 것(예를 들어, 약 0.3℃/분의 가열 속도)으로 처리된다. Tm 및 Tagg는 형광 단백질 분석기에서 각각 266 nm/473 nm 하에서 형광 흡광도 및 광산란의 변화로 측정할 수 있다. 높은 Tm은 높은 열 안정성을 나타낸다. Tagg가 높을수록 응집 가능성이 낮음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드는 적어도 약 51℃, 52℃, 53℃, 54℃, 55℃, 56℃, 57℃, 58℃, 59℃, 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃, 67℃, 68℃, 69℃, 70℃, 또는 75℃ 중 어느 하나와 같은 적어도 약 50℃의 Tm을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드는 적어도 약 51℃, 52℃, 53℃, 54℃, 55℃, 56℃, 57℃, 58℃, 59℃, 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃, 67℃, 68℃, 69℃, 70℃, 71℃, 72℃, 73℃, 74℃, 75℃, 76℃, 77℃, 78℃, 79℃, 80℃, 또는 85℃ 중 어느 하나와 같은 적어도 약 50℃의 Tagg를 갖는다.

조성물 또는 제형의 물리적 안정성과 같은 안정성은 샘플의 겉보기 광 감쇠(흡광도 또는 광학 밀도) 측정을 포함하여 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 측정될 수 있다. 광 감쇠의 이러한 측정은 제형의 혼탁도와 관련된다. 제형의 혼탁도는 부분적으로 용액에 용해된 단백질의 고유한 특성이며, 일반적으로 비탁법으로 결정되며 비탁계 탁도 단위(NTU)로 측정된다.

혼탁도, 예를 들어 용액 중의 하나 이상의 성분 농도, 예를 들어 단백질 및/또는 염 농도의 함수로서의 혼탁도는 또한 제형의 "유백광(opalescence)" 또는 "유백광 외관"으로 지칭된다. 탁도는 알려진 탁도의 현탁액을 사용하여 생성된 표준 곡선을 참조하여 계산할 수 있다. 약학적 조성물에 대한 혼탁도를 결정하기 위한 참조 표준은 유럽 약전 기준에 기초할 수 있다(European Pharmacopoeia, Fourth Ed., Directorate for the Quality of Medicine of the Council of Europe (EDQM), Strasbourg, France). 유럽 약전 기준에 따르면 투명한 용액은 탁도가 유럽 약전 기준에 따라 대략 3인 참조 현탁액보다 작거나 같은 탁도를 갖는 용액으로 정의된다. 혼탁(Nephelometric) 탁도 측정은 연관성 또는 비이상성 효과가 없는 경우 일반적으로 농도에 따라 선형으로 변하는 Rayleigh 산란을 감지할 수 있다. 약학적 단백질의 물리적 안정성을 평가하기 위한 다른 방법, 예를 들어 크기-배제 크로마토그래피 또는 분석 초원심분리는 당업계에 잘 알려져 있다.

일부 실시양태에서, 안정성은 낮거나 감지할 수 없는 수준의 입자 형성을 갖는 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드를 함유하는 제형을 말한다. 본 명세서에서 사용된 "낮은 수준 내지 감지할 수 없는 수준의 입자 형성"이라는 어구는 HIAC 분석 또는 육안 분석을 통해 측정된 것처럼 30개 미만의 입자/mL, 20개 미만의 입자/ml, 20개 미만의 입자/ml, 15개 미만의 입자/ml, 10개/ml 미만의 입자/ml, 5개 미만 입자/ml, 2개 미만 입자/ml 또는 1개 미만 입자/ml를 포함하는 샘플을 의미한다. 일부 실시양태에서, HIAC 분석 또는 육안 분석에 의해 지속형 NGF 폴리펩타이드 제형의 어떤 입자도 검출되지 않는다.

"실질적인 단백질 응집"은 참조 단백질 제형의 단백질 응집 수준보다 실질적으로 더 큰 단백질 제형의 단백질 응집 수준을 의미한다. 참조 단백질 제형은 저장 기간 전 또는 처리 전(예를 들어, 불안정한 조건, 예를 들어 상승된 온도, 습도, pH 및/또는 장기 저장 전)에 동일한 단백질 제형일 수 있다. 참조 단백질 제형은 동일한 조건 하에서 테스트된 상이한 단백질 제형(예를 들어, 다른 NGF-Fc 융합 단백질, 또는 Fc 융합이 없는 NGF 모이어티)일 수 있다.

"단백질 응집이 실질적으로 없는"은 참조 제형보다 응집된 단백질의 수준 또는 백분율이 상당히 더 높지 않은 본 발명의 단백질(또는 제형)을 의미한다. 예를 들어, 이러한 문구는 단백질 응집 수준이 약 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2% 또는 0.1% 미만인 단백질(또는 제형)을 의미한다. 단백질 응집 수준은 본 명세서의 실시예 3에 기술된 바와 같은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 지속형 NGF 폴리펩타이드는 단백질 응집이 실질적으로 없다(예를 들어, 가속 안정성 시험 하에서). 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드는 최대 약 15%의 단백질 응집, 예컨대 최대 약 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 0.5% 중 어느 하나의 단백질 응집(예: 가열과 같은 가속 안정성 시험 하에서)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드는 단백질 응집을 갖지 않는다(예를 들어, 가열과 같은 가속 안정성 시험 하에서). 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드는 약 15% 이하의 응집 증가, 예컨대 약 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3% 2% 또는 1% 중 어느 하나 이하의 응집 증가(예: 가속 가열과 같은 가속 안정성 시험 하에서)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 안정성은 SEC에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 안정성은 CE-SDS에 의해 측정된다.

일부 실시양태에서, 안정성은 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드의 감소된 단편화를 의미한다. 본 명세서에 사용된 "낮거나 검출할 수 없는 수준의 단편화"라는 용어는 예를 들어 HPSEC에 의해 측정된 피크에서, 또는 감소된 모세관 겔 전기영동(rCGE)에 의해 다중 피크(예: 서브유닛만큼 많은 피크)에서, 전체 단백질의 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상을 포함하는 샘플을 의미하며, 분해되지 않은 단백질 또는 이의 분해되지 않은 단편을 나타내고, 각각 총 단백질의 5% 이상, 4% 이상, 3% 이상, 2% 이상, 1% 이상 또는 0.5% 이상을 갖는 다른 단일 피크를 포함하지 않는다. 본 명세서에서 사용되는 "환원된(reduced) 모세관 겔 전기영동"은 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드와 같은 Fc-함유 단백질에서 이황화 결합을 환원시키기에 충분한 환원 조건 하에서의 모세관 겔 전기영동을 의미한다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드는 약 0% 내지 약 15% 단편화, 예컨대 약 0% 내지 약 12% 단편화(예를 들어, 가속 가열과 같은 가속 안정성 시험 하에서)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드는 약 30% 이하의 단편화, 예컨대 약 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22 %, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 중 어느 하나 이하의 단편화(예: 가속 가열과 같은 가속 안정성 테스트에서)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드는 단편화를 갖지 않는다(예를 들어, 가속 가열과 같은 가속 안정성 시험 하에서). 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드는 약 30% 이하의 단편화 증가, 예컨대 약 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% , 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 중 어느 하나 이하의 단편화 증가(예: 가속 가열과 같은 가속 안정성 시험에서)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드는 적어도 약 75% 주요 피크, 예컨대 적어도 약 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 중 어느 하나의 주요 피크(예: 가속 가열과 같은 가속 안정성 시험에서)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 안정성은 SEC에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 안정성은 CE-SDS에 의해 측정된다.

지속형 NGF 폴리펩타이드의 유도체

일부 실시양태에서, 본 명세서에서 제공되는 지속형 NGF 폴리펩타이드는 당업계에 공지되어 있고 쉽게 입수할 수 있는 추가의 비단백질성 모이어티를 포함하도록 추가로 변형될 수 있다. 지속형 NGF 폴리펩타이드의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 수용성 중합체의 비제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 프로프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올(예: 글리세롤), 폴리비닐 알코올 및 이들의 혼합물을 포함하나 이제 제한되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에 대한 안정성으로 인해 제조에 유리할 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 지속형 NGF 폴리펩타이드에 부착된 중합체의 수는 다양할 수 있으며, 하나 이상의 중합체가 부착된 경우 이들은 동일한 분자이거나 다른 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 지속형 NGF 폴리펩타이드 유도체가 정의된 조건 등에서 치료에 사용하고자 하는, 개선되는 지속형 NGF 폴리펩타이드의 특정한 특징 또는 기능을 포함하는 고려사항에 기초하여 결정될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드는 발색단, 형광단(예를 들어, 쿠마린, 크산텐, 시아닌, 피렌, 보라폴리아자인다센, 옥사진 및 이들의 유도체), 형광 단백질(예: GFP, 피코빌리단백질 및 이의 유도체), 인광 염료(예: 디옥세탄, 크산텐 또는 카르보시아닌 염료, 란타나이드 킬레이트), 탠덤 염료(예: 시아닌-피코빌리단백질 유도체 및 크산텐-피코빌리단백질 유도체), 입자(예: 금 클러스터, 콜로이드 금, 미세구, 양자점), 합텐, 효소(예: 퍼옥시다제, 포스파타제, 글리코시다제, 루시페라제) 및 방사성 동위원소(예: ¹²⁵I,　³H,　¹⁴C,　³²P)로 이루어진 군으로부터 선택된 표지를 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드는 하나 이상의 생물학적 활성 단백질, 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 포함하도록 추가로 변형될 수 있다. 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 "생체활성" 또는 "생물학적 활성"은 특정 기능을 수행하기 위해 신체에서 생물학적 활성을 나타내는 것을 의미한다. 예를 들어, 단백질, DNA 등과 같은 특정 생체분자와 결합하여 그 생체분자의 활성을 촉진 또는 억제하는 것을 의미할 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체활성 단백질 또는 이의 단편은 질병 또는 병태의 예방 또는 치료를 위한 활성 약물 물질로서 환자에게 투여되는 단백질 및 폴리펩타이드 뿐만 아니라 진단 목적으로 사용되는 단백질 및 폴리펩타이드, 예컨대 진단 테스트 또는 인비트로 분석에 사용되는 효소, 백신과 같이 질병을 예방하기 위해 환자에게 투여되는 단백질 및 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 생체활성 단백질 또는 이의 단편은 면역 자극/면역 조절, 막 수송 또는 효소 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 생물학적 활성 단백질, 폴리펩타이드 또는 그의 단편은 효소, 호르몬, 성장 인자, 사이토카인 또는 그의 혼합물이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 활성 단백질, 폴리펩타이드 또는 단편은 표적 펩티드(예: 항원 또는 다른 단백질)를 특이적으로 인식할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드 내에 포함될 수 있는 생물활성 단백질 또는 이의 단편은 항원-결합 단백질(예: 항체)이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드 내에 포함될 수 있는 생물활성 단백질 또는 그의 단편은 항체를 연상시키는 항원-결합 도메인을 포함하는 작은 조작된 단백질인 항체 모방체이다(Geering and Fussenegger, Trends Biotechnol., 33(2):65-79, 2015). 이러한 분자는 기존의 인간 스캐폴드 단백질에서 파생되며 단일 폴리펩타이드를 포함한다. 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드 내에 포함될 수 있는 예시적인 항체 모방체는 디자인된 안키린 반복 단백질(DARPin; N- 및 C-말단 Cap 도메인 옆에 있는 3-5개의 완전 합성 안키린 반복을 포함함), 아비디티 멀티머(avidity multimer)(아비머; 다중 A 도메인을 포함하는 고친화성 단백질, 각 도메인은 표적에 대한 친화도가 낮음), 또는 안티칼린(4개의 접근 가능한 루프가 있는 리포칼린 스캐폴드 기반, 각각의 서열은 무작위)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 지속형 NGF 폴리펩타이드 내에 포함될 수 있는 생물활성 단백질 또는 그의 단편은 아르마딜로 반복 단백질(예를 들어, β-카테닌, α-임포틴, 플라코글로빈, 선종성 대장 용종증(APC))이며, 이는 아르마딜로 반복 단위(길이가 약 40개 잔기인 특징적이고 반복적인 아미노산 서열)를 포함한다. 각 아르마딜로 반복은 헤어핀 구조를 형성하는 한 쌍의 알파 나선으로 구성된다. 알파 솔레노이드 구조로 알려진 것을 반복 형태로 여러 개 복사한다. 아르마딜로 반복 단백질은 특정 보존된 측쇄 또는 펩타이드의 자유 N- 또는 C-말단과의 상호작용 없이 펩타이드 백본의 일정한 결합 방식에 의존하여 다양한 유형의 펩타이드에 결합할 수 있다. 반복 단백질의 본질적인 모듈성과 결합된 잔기에 의해 펩티드 잔기를 인식할 수 있는 가능성은 아르마딜로 반복 단백질이 펩티드 결합을 위한 일반적인 스캐폴드 설계를 위한 유망한 후보가 되게 한다.

III. 지속형 NGF 폴리펩타이드를 인코딩하는 벡터

본 발명은 또한 본 명세서에 기술된 임의의 지속형 NGF 폴리펩타이드를 인코딩하는 단리된 핵산, 본 명세서에 기술된 임의의 지속형 NGF 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 또한 본 명세서에 기재된 임의의 지속형 NGF 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 분리된 숙주 세포(예를 들어, CHO 세포, HEK 293 세포, Hela 세포 또는 COS 세포), 또는 본 명세서에 기재된 임의의 지속형 NGF 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 지속형 NGF 폴리펩타이드의 N-말단에서 신호 펩티드 서열(예를 들어, 서열번호: 6)을 추가로 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 지속형 NGF 폴리펩타이드의 N-말단에서 프로펩티드 서열(예를 들어, 서열번호: 5)을 추가로 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 지속형 NGF 폴리펩타이드의 N-말단에서 신호 펩티드 서열(예를 들어, 서열번호: 6)에 이어서 프로펩티드 서열(예를 들어, 서열번호: 5)을 추가로 인코딩한다.

따라서 일부 실시양태에서, N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드를 인코딩하는 단리된 핵산이 제공되며, 여기서 NGF 모이어티는 서열번호: 1-4 중 어느 하나(예를 들어, 서열번호: 1-3 중 어느 하나)의 아미노산 서열을 포함하거나(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되는), 여기서 Fc 모이어티는 IgG1 Fc 또는 IgG4 Fc로부터 유도된다. 일부 실시양태에서, 서열번호: 61-67 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되는) 지속형 NGF 폴리펩타이드를 인코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 5' 말단에서 서열번호: 6의 신호 펩티드 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 5' 말단에서 서열번호: 5의 프로펩티드 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 (5'에서 3'으로) 서열번호: 6의 신호 펩티드 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 이어서 5' 말단에서 서열번호: 5의 프로펩티드 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 서열번호: 34, 36, 38, 40, 42, 44, 및 46 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되는) 지속형 NGF 폴리펩타이드를 인코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 일부 실시양태에서, 서열번호: 34, 36, 38, 40, 42, 44, 및 46 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되는), 서열번호: 6의 신호 펩티드 서열을 제외하는, 지속형 NGF 폴리펩타이드를 인코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 일부 실시양태에서, 서열번호: 33, 35, 37, 39, 41, 43, 및 45 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함하는(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성되는) 단리된 핵산이 제공된다.

일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 임의의 지속형 NGF 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터는 포유동물 세포(예를 들어 CHO 세포, HEK 293 세포, Hela 세포, COS 세포)와 같은 진핵 세포에서 복제 및 통합되기에 적합하다. 일부 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 비바이러스 벡터, 예를 들어 pTT5이다.

포유류 세포로의 유전자 전달을 위해 다수의 바이러스 기반 시스템이 개발되었다. 바이러스 벡터의 예시는 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 단순 헤르페스 바이러스 벡터 및 이들의 유도체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바이러스 벡터 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) 및 기타 바이러스학 및 분자생물학 매뉴얼에 기술된다. 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 이종 핵산은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 벡터에 삽입되고 레트로바이러스 입자에 패키징될 수 있다. 이어서 재조합 바이러스는 분리되어 인비트로 또는 엑스비보에서 조작된 포유동물 세포로 전달될 수 있다. 다수의 레트로바이러스 시스템이 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 다수의 아데노바이러스 벡터가 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 렌티바이러스 벡터가 사용된다. 일부 실시양태에서, 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터가 사용된다. 예를 들어, 구조(construct) 단백질 코딩 서열(들)을 운반하는 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터는 당업계에 공지된 프로토콜로 패키징될 수 있다. 생성된 렌티바이러스 벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 포유동물 세포를 형질도입하는데 사용될 수 있다. 렌티바이러스와 같은 레트로바이러스에서 파생된 벡터는 이식유전자의 장기적이고 안정적인 통합과 자손 세포에서의 전파를 허용하기 때문에 장기 유전자 전달을 달성하는 데 적합한 도구이다. 렌티바이러스 벡터는 또한 면역원성이 낮고 증식하지 않는 세포를 형질도입할 수 있다.

일부 실시양태에서, 벡터는 비-바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 pTT5 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 Sleeping Beauty (SB) 트랜스포존 시스템 또는 PiggyBac 트랜스포존 시스템과 같은 트랜스포존이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 예를 들어 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA) 및 폴리락트산(PLA), 폴리(에틸렌 이민)(PEI), 및 덴드리머를 포함하는 폴리버 기초 비바이러스성 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 양이온성 리포좀, 지질 나노에멀젼 및 고체 지질 나노입자(SLN)와 같은 양이온성 지질 기반 비바이러스성 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 폴리-L-리신과 같은 펩티드 기반 유전자 비바이러스성 벡터이다. 게놈 편집에 적합한 공지의 비바이러스성 벡터 중 임의의 것이 지속형 NGF 폴리펩타이드-인코딩 핵산(들)을 숙주 세포에 도입하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어 Yin H. et al., Nature Rev. Genetics (2014) 15:521-555; Aronovich EL et al. "The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy." Hum. Mol. Genet. (2011) R1: R14-20; 및 Zhao S. et al. "PiggyBac transposon vectors: the tools of the human gene editing." Transl. Lung Cancer Res. (2016) 5(1): 120-125를 참조하며, 이들은 참조로 본 명세서에 포함된다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 지속형 NGF 폴리펩타이드를 인코딩하는 임의의 하나 이상의 핵산 또는 벡터는 전기천공법, 초음파천공법, 광천공법, 자기감염법(magnetofection), 하이드로포레이션법을 포함하는 물리적 방법에 의해 숙주 세포(예를 들어, CHO, HEK 293, Hela 또는 COS)에 도입되지만 이에 제한되지 않는다.

일부 실시양태에서, 벡터는 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터, pTT5 벡터)를 통해 형질감염된 숙주 세포 집단으로부터 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 선택하기 위한 선택가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자를 함유한다. 선택 가능한 마커와 리포터 유전자는 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하는 적절한 조절 서열 옆에 있을 수 있다. 예를 들어, 벡터는 핵산 서열의 발현 조절에 유용한 전사 및 번역 종결자, 개시 서열 및 프로모터를 함유할 수 있다.

핵산은 예를 들어 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 하나 이상의 선택가능한 마커를 사용하는 것을 포함하여 당업계에 알려진 임의의 분자 클로닝 방법을 사용하여 벡터에 클로닝될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 원핵 세포 또는 진핵 세포(예를 들어, 포유동물 세포)에서의 유전자 발현을 위해 다양한 프로모터가 연구되었고, 당업계에 공지된 임의의 프로모터가 본 발명에 사용될 수 있다. 프로모터는 대략 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터와 같은 조절된 프로모터로 분류될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산은 구성적 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 구성적 프로모터는 이종 유전자(전이유전자라고도 함)가 숙주 세포에서 구성적으로 발현되도록 한다. 본 명세서에서 고려되는 예시적인 프로모터는 사이토메갈로바이러스 즉시-초기 프로모터(CMV), 인간 신장 인자-1알파(hEF1α), 유비퀴틴 C 프로모터(UbiC), 포스포글리세로키나아제 프로모터(PGK), 유인원 바이러스 40 초기 프로모터(SV40 ), CMV 초기 인핸서(CAGG)와 결합된 치킨 β-액틴 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 폴리오마 인핸서/단순 헤르페스 티미딘 키나아제(MC1) 프로모터, 베타 액틴(β-ACT) 프로모터, "골수 증식성 육종 바이러스 인핸서, 음성 대조군 영역 삭제, d1587rev 프라이머-결합 부위 치환(MND)" 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 트랜스유전자 발현 유도에 대한 이러한 구성적 프로모터의 효율성은 수많은 연구에서 광범위하게 비교되었다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산은 CMV 프로모터에 작동가능하게 연결된다.

일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산은 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 유도성 프로모터는 조절된 프로모터의 범주에 속한다. 유도성 프로모터는 물리적 조건, 숙주 세포의 미세환경, 또는 숙주 세포의 생리학적 상태, 유도제(즉, 유도제) 또는 이들의 조합과 같은 하나 이상의 조건에 의해 유도될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유도 조건은 숙주 세포에서 내인성 유전자의 발현을 유도하지 않는다. 일부 실시양태에서, 유도 조건은 유도자, 조사(예컨대 이온화 방사선, 광), 온도(예컨대 열), 산화환원 상태, 및 숙주 세포의 활성화 상태로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 유도성 프로모터는 NFAT 프로모터, TETON^® 프로모터, 또는 NFκB 프로모터일 수 있다.

IV. 제조 방법

또한 본 명세서에 기술된 임의의 지속형 NGF 폴리펩타이드를 제조하는 방법이 제공된다. 따라서 일부 실시양태에서, 다음을 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드를 생산하는 방법이 제공된다: (a) 인코딩된 지속형 NGF 폴리펩타이드를 발현하는데 효과적인 조건 하에 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드를 인코딩하는 임의의 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포(예를 들어 CHO 세포, HEK 293 세포, Hela 세포, 또는 COS 세포)를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 숙주 세포로부터 발현된 지속형 NGF 폴리펩타이드를 수득하는 단계. 일부 실시양태에서, (a) 단계의 방법은 본 명세서에 기재된 지속형 NGF 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 생산하는 단계를 추가로 포함한다. 본 명세서에 기재된 지속형 NGF 폴리펩타이드는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하거나 본 명세서에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 또한 예시적인 방법에 대해서는 실시예 1을 참조한다.

일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드는 포유동물 세포와 같은 진핵 세포에서 발현된다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드는 원핵 세포로 발현된다. 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드가 원핵 세포로 발현될 때, 생성된 proNGF-(선택적 링커)-Fc 모이어티는 프로펩타이드 서열에 대해 프로세싱될 수 없다. 따라서, 원핵 세포 발현에 사용될 때 지속형 NGF 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산은 프로펩타이드 서열(예를 들어, 서열번호: 5)을 인코딩하는 핵산 서열 없이 디자인될 수 있다.

1. 원핵 세포에서 재조합 생산

a) 벡터 구성

본 출원의 단백질 구성을 인코딩하는 다중핵산 서열은 표준 재조합 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 합성기 또는 PCR 기술을 사용하여 합성할 수 있다. 일단 수득되면, 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열은 원핵생물 숙주에서 이종 폴리뉴클레오티드를 복제 및 발현할 수 있는 재조합 벡터에 삽입된다. 당업계에 이용가능하고 공지된 많은 벡터가 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 적절한 벡터의 선택은 주로 벡터에 삽입될 핵산의 크기와 벡터로 형질전환될 특정 숙주 세포에 따라 달라질 것이다. 각 벡터는 그 기능(이종 폴리뉴클레오티드의 증폭 또는 발현, 또는 둘 다) 및 그것이 상주하는 특정 숙주 세포와의 호환성에 따라 다양한 구성 요소를 포함한다. 벡터 성분은 일반적으로 복제 기점, 선택 마커 유전자, 프로모터, 리보솜 결합 부위(RBS), 신호 서열, 이종 핵산 삽입체 및 전사 종결 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

일반적으로, 숙주 세포와 호환되는 종으로부터 유래된 레플리콘 및 제어 서열을 함유하는 플라스미드 벡터가 이들 숙주와 관련하여 사용된다. 벡터는 일반적으로 복제 부위뿐만 아니라 형질전환된 세포에서 표현형 선택을 제공할 수 있는 마킹 서열을 가지고 있다. 예를 들어, 대장균은 일반적으로 대장균 종에서 유래한 플라스미드인 pBR322를 사용하여 형질전환된다. pBR322는 암피실린(Amp) 및 테트라사이클린(Tet) 저항성을 인코딩하는 유전자를 포함하므로 형질전환된 세포를 쉽게 식별할 수 있는 수단을 제공한다. pBR322, 그 유도체, 또는 다른 미생물 플라스미드 또는 박테리오파지는 또한 내인성 단백질의 발현을 위해 미생물 유기체에 의해 사용될 수 있는 프로모터를 함유하거나 함유하도록 변형될 수 있다. 특정 항체의 발현을 위해 사용되는 pBR322 유도체의 예시는 Carter et al., 미국특허번호 5,648,237에 상세히 기술된다.

또한, 숙주 미생물과 호환되는 레플리콘 및 제어 서열을 포함하는 파지 벡터는 이들 숙주와 관련된 형질전환 벡터로 사용될 수 있다. 예를 들어, GEM^TM-11과 같은 박테리오파지는 대장균 LE392와 같은 민감한 숙주 세포를 형질전환하는 데 사용될 수 있는 재조합 벡터를 만드는 데 사용될 수 있다.

프로모터는 발현을 조절하는 시스트론의 업스트림(5')에 위치한 번역되지 않은 조절 서열이다. 원핵생물의 프로모터는 일반적으로 유도성 및 구성성의 두 부류로 나뉜다. 유도성 프로모터는 배양 조건의 변화, 예를 들어 영양소의 유무 또는 온도 변화에 반응하여 제어 하에 시스트론의 증가된 수준의 전사를 개시하는 프로모터이다.

다양한 잠재적 숙주 세포에 의해 인식되는 다수의 프로모터가 잘 알려져 있다. 선택된 프로모터는 제한 효소 절단을 통해 소스 DNA로부터 프로모터를 제거하고 분리된 프로모터 서열을 본 출원의 벡터에 삽입함으로써 폴리펩타이드를 인코딩하는 시스트론 DNA에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 천연 프로모터 서열 및 많은 이종 프로모터 둘 다 표적 유전자의 증폭 및/또는 발현을 지시하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이종 프로모터는 일반적으로 천연 표적 폴리펩타이드 프로모터와 비교하여 발현된 표적 유전자의 더 큰 전사 및 더 높은 수율을 허용하기 때문에 이용된다.

원핵 숙주와 함께 사용하기에 적합한 프로모터는 PhoA 프로모터, -갈락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 트립토판(trp) 프로모터 시스템 및 tac 또는 trc 프로모터와 같은 하이브리드 프로모터를 포함한다. 그러나, 박테리아에서 기능하는 다른 프로모터(예를 들어, 다른 공지된 박테리아 또는 파지 프로모터)도 또한 적합하다. 이들의 핵산 서열이 공개되어 숙련된 작업자가 임의의 필요한 제한 부위를 제공하기 위해 링커 또는 어댑터를 사용하여 표적 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 시스트론에 작동 가능하게 결합할 수 있다(Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269).

일부 실시양태에서, 재조합 벡터 내의 각각의 시스트론은 발현된 폴리펩타이드의 막을 가로지르는 전위를 지시하는 분비 신호 서열 성분을 포함한다. 일반적으로 신호 서열은 벡터의 구성 요소이거나 벡터에 삽입되는 표적 폴리펩타이드 DNA의 일부일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 선택된 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 처리되는(즉, 신호 펩티다제에 의해 절단되는) 것이어야 한다. 이종 폴리펩타이드 고유의 신호 서열을 인식하고 처리하지 않는 원핵 숙주 세포의 경우, 신호 서열은 예를 들어 알칼리 포스파타제, 페니실리나제, Ipp 또는 열안정성 엔테로톡신 II(STII) 리더, LamB, PhoE, PelB, OmpA 및 MBP로 이루어진 군으로부터 선택된 원핵 신호 서열에 의해 치환된다.

일부 실시양태에서, 본 출원에 따른 단백질 구성의 생산은 숙주 세포의 세포질에서 일어날 수 있고, 따라서 각각의 시스트론 내에 분비 신호 서열의 존재를 필요로 하지 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분은 발현되고, 접히고, 조립되어 세포질 내에서 단백질 구조물을 형성한다. 특정 숙주 균주(예: 대장균 trxB^- 균주)는 이황화 결합 형성에 유리한 세포질 조건을 제공하여 발현된 단백질 서브유닛의 적절한 폴딩 및 조립을 허용한다. Proba 및 Pluckthun, Gene, 159:203(1995) 참조한다.

b) 원핵 숙주 세포

본 출원의 단백질을 발현하기에 적합한 원핵 숙주 세포는 그람-음성 또는 그람-양성 유기체와 같은 고세균 및 유박테리아를 포함한다. 유용한 박테리아의 예시는 에스케리키아(Escherichia) (예를 들어 대장균), 바실리(Bacilli)(예를 들어, B. subtilis), 엔테로박테리아(Enterobacteria), 슈도모나스(Pseudomonas) 종 (예를 들어, P. aeruginosa), 살모넬라 티피무리엄(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 시겔라(Shigella), 리조비아(Rhizobia), 비트레오실라(Vitreoscilla), 또는 파라코커스(Paracoccus)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 그람 음성 세포가 사용된다. 일부 실시양태에서, 대장균 세포는 본 발명을 위한 숙주로서 사용된다. 대장균 균주의 예시는 균주 W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; ATCC Deposit No. 27,325) 및 이의 유도체, 유전자형 W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 lac Iq lacL8 AompT A(nmpc-fepE) degP41 kan^R을 갖는 균주 33D3을 포함한다(미국특허번호 5,639,635). E. coli 294 (ATCC 31,446), E. coli B, E. coli 1776 (ATCC 31,537) 및 E. coli RV308 (ATCC 31,608)와 같은 다른 균주 및 이의 유도체도 또한 적합하다. 이들 예시는 제한적이기보다는 예시적이다. 규정된 유전자형을 갖는 임의의 상기 언급된 박테리아의 유도체를 구성하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990)에 기술된다. 일반적으로 세균의 세포에서 레플리콘의 복제성을 고려하여 적절한 세균을 선택하는 것이 필요하다. 예를 들어, pBR322, pBR325, pACYC177 또는 pKN410과 같은 잘 알려진 플라스미드를 사용하여 레플리콘을 공급하는 경우 대장균, 세라티아 또는 살모넬라 종을 숙주로 적절하게 사용할 수 있다.

통상적으로, 숙주 세포는 최소량의 단백질 분해 효소를 분비해야 하며, 추가적인 프로테아제 억제제가 바람직하게는 세포 배양물에 혼입될 수 있다.

c) 단백질 생산

숙주 세포는 전술한 발현 벡터로 형질전환되고, 프로모터 유도, 형질전환체 선택 또는 원하는 서열을 인코딩하는 유전자 증폭에 적합하도록 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양된다. 형질전환은 DNA가 염색체외 요소로서 또는 염색체 통합체에 의해 복제가능하도록 DNA를 원핵생물 숙주에 도입하는 것을 의미한다. 사용된 숙주 세포에 따라 그러한 세포에 적합한 표준 기술을 사용하여 형질전환이 수행된다. 염화칼슘을 사용하는 칼슘 처리는 일반적으로 상당한 세포벽 장벽을 포함하는 박테리아 세포에 사용된다. 변형을 위한 또 다른 방법은 폴리에틸렌 글리콜/DMSO를 사용한다. 사용되는 또 다른 기술은 전기천공법이다.

본 출원의 단백질 구성물을 생산하는데 사용되는 원핵 세포는 당업계에 공지되고 선택된 숙주 세포의 배양에 적합한 배지에서 성장된다. 적합한 배지의 예로는 루리아 브로스(luria broth, LB)과 필요한 영양 보충제가 있다. 일부 실시양태에서, 배지는 또한 발현 벡터를 함유하는 원핵 세포의 성장을 선택적으로 허용하기 위해, 발현 벡터의 구성에 기초하여 선택된 선별제를 함유한다. 예를 들어, 암피실린 내성 유전자를 발현하는 세포의 성장을 위해 배지에 암피실린을 첨가한다.

탄소, 질소 및 무기 인산염 공급원 외에 필요한 보충제는 단독으로 또는 복합 질소 공급원과 같은 다른 보충제 또는 매체와의 혼합물로 적절한 농도로 포함될 수도 있다. 임의로 배양 배지는 글루타티온, 시스테인, 시스타민, 티오글리콜레이트, 디티오에리트리톨 및 디티오트레이톨로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 환원제를 함유할 수 있다. 원핵 숙주 세포는 적절한 온도에서 배양된다. 예를 들어 대장균 성장의 경우, 바람직한 온도 범위는 약 20℃ 내지 약 39℃, 보다 바람직하게는 약 25℃ 내지 약 37℃, 훨씬 더 바람직하게는 약 30℃이다. 배지의 pH는 주로 숙주 유기체에 따라 약 5 내지 약 9 범위의 임의의 pH일 수 있다. 대장균의 경우, pH는 바람직하게는 약 6.8 내지 약 7.4, 보다 바람직하게는 약 7.0이다.

본 출원의 발현 벡터에 유도성 프로모터를 사용하는 경우, 프로모터의 활성화에 적합한 조건에서 단백질 발현을 유도한다. 본 출원의 한 측면에서, PhoA 프로모터는 폴리펩타이드의 전사를 제어하기 위해 사용된다. 따라서 형질전환된 숙주세포를 인산염 제한 배지에서 배양하여 유도한다. 바람직하게는, 인산염-제한 배지는 C.R.A.P 배지이다(예를 들어, Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147참조). 당업계에 공지된 바와 같이, 사용되는 벡터 구성에 따라 다양한 다른 유도제가 사용될 수 있다.

본 출원의 발현된 단백질 구성은 숙주 세포의 원형질막으로 분비되고 그로부터 회수된다. 단백질 회수는 일반적으로 삼투 충격, 초음파 처리 또는 용해와 같은 수단에 의해 일반적으로 미생물을 파괴하는 것을 포함한다. 세포가 파괴되면 원심분리 또는 여과를 통해 세포 파편 또는 전체 세포를 제거할 수 있다. 예를 들어, 친화성 수지 크로마토그래피에 의해 단백질을 추가로 정제할 수 있다. 대안적으로, 단백질은 배양 배지로 수송되어 그 안에서 분리될 수 있다. 세포는 배양물로부터 제거될 수 있고 배양물 상청액은 여과되고 생성된 단백질의 추가 정제를 위해 농축된다. 발현된 폴리펩타이드는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 및 웨스턴 블롯 분석과 같은 일반적으로 알려진 방법을 사용하여 추가로 분리하고 확인할 수 있다.

대안적으로, 단백질 생산은 발효 공정에 의해 대량으로 수행된다. 재조합 단백질 생산을 위해 다양한 대규모 유가(fed-batch) 발효 절차를 사용할 수 있다. 대규모 발효는 적어도 1000리터의 용량, 바람직하게는 약 1,000 내지 100,000리터의 용량을 갖는다. 이러한 발효기는 산소와 영양분, 특히 포도당(바람직한 탄소/에너지원)을 분배하기 위해 교반기 임펠러를 사용한다. 소규모 발효는 일반적으로 체적 용량이 약 100리터 이하이고 약 1리터에서 약 100리터 범위일 수 있는 발효기에서의 발효를 의미한다.

발효 공정 동안, 단백질 발현의 유도는 통상적으로 세포가 원하는 밀도, 예를 들어 약 180-220의 OD₅₅₀으로 적합한 조건 하에 성장된 후에 개시되며, 이 단계에서 세포는 초기 정지기에 있다. 당업계에 공지되고 상기 기재된 바와 같이, 사용되는 벡터 구성에 따라 다양한 유도제가 사용될 수 있다. 세포는 유도 전에 더 짧은 기간 동안 성장할 수 있다. 세포는 일반적으로 약 12-50시간 동안 유도되지만, 더 길거나 더 짧은 유도 시간이 사용될 수 있다.

본 출원의 단백질 구성의 생산 수율 및 품질을 개선하기 위해, 다양한 발효 조건이 변형될 수 있다. 예를 들어, 분비된 폴리펩타이드의 적절한 조립 및 폴딩을 개선하기 위해 Dsb 단백질(DsbA, DsbB, DsbC, DsbD 또는 DsbG) 또는 FkpA(샤페론 활성을 갖는 펩티딜프롤릴 시스-, 트랜스-이성화효소)와 같은 샤페론을 과발현하는 추가 벡터 활성을 사용하여 숙주 원핵 세포를 공동 형질전환할 수 있다. 샤페론 단백질은 박테리아 숙주 세포에서 생성된 이종 단백질의 적절한 폴딩 및 용해도를 촉진하는 것으로 입증되었다. Chen et al. (1999) J Bio Chem 274:19601-19605; Georgiou et al., U.S. Pat. No. 6,083,715; Georgiou et al., 미국특허번호 6,027,888; Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105; Ramm and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113; Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210.

발현된 이종 단백질(특히 단백질 분해에 민감한 것)의 단백질 분해를 최소화하기 위해, 단백질 분해 효소가 결핍된 특정 숙주 균주가 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포 균주는 프로테아제 III, OmpT, DegP, Tsp, 프로테아제 I, 프로테아제 Mi, 프로테아제 V, 프로테아제 VI 및 이들의 조합과 같은 공지된 박테리아 프로테아제를 인코딩하는 유전자에 유전적 돌연변이(들)를 초래하도록 변형될 수 있다. 일부 대장균 프로테아제 결핍 균주가 활용 가능하며 예를 들어 Joly et al. (1998), supra; Georgiou et al., 미국특허번호 5,264,365; Georgiou et al., 미국특허번호 5,508,192; Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996)에 기술된다.

단백질 분해 효소가 결핍되고 하나 이상의 샤페론 단백질을 과발현하는 플라스미드로 형질전환된 대장균 균주는 본 출원의 단백질 구성을 인코딩하는 발현 시스템에서 숙주 세포로 사용될 수 있다.

d) 단백질 정제

본 명세서에서 생성된 단백질 구성은 추가 분석 및 사용을 위해 실질적으로 균질한 제제를 얻기 위해 추가로 정제된다. 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 방법이 사용될 수 있다. 다음 절차는 적합한 정제 절차의 예시이다: 면역친화성 또는 이온 교환 컬럼에서의 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 또는 DEAE와 같은 양이온 교환 수지에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 및 예를 들어 Sephadex G-75를 사용한 겔 여과.

일부 실시양태에서, 고상에 고정된 단백질 A는 본 출원의 Fc 영역을 포함하는 단백질 구성의 면역친화성 정제에 사용된다. 단백질 A는 Fc 함유 구성, 예를 들어 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드에 높은 친화도로 결합하는 스타필로코커스 아우레아스로부터의 42kDa 표면 단백질이다. Lindmark et al (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13. 단백질 A가 고정되는 고상은 바람직하게는 유리 또는 실리카 표면을 포함하는 컬럼, 더 바람직하게는 조절된 기공 유리 컬럼 또는 규산 컬럼이다. 일부 응용 분야에서 컬럼은 오염 물질의 비특이적 부착을 방지하기 위해 글리세롤과 같은 시약으로 코팅되었다. 그 다음 고상에 비특이적으로 결합된 오염 물질을 제거하기 위해 고상을 세척한다. 마지막으로 관심 단백질 구조는 용출에 의해 고상에서 회수된다.

2. 진핵 세포에서 재조합 생산

진핵생물 발현의 경우, 벡터 구성요소는 일반적으로 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자 및 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

a) 신호 서열 구성요소

진핵 숙주에서 사용하기 위한 벡터는 또한 성숙한 단백질 또는 폴리펩타이드의 N-말단에 특정 절단 부위를 갖는 신호 서열 또는 다른 폴리펩타이드를 인코딩하는 삽입물일 수 있다. 선택되는 이종 신호 서열은 바람직하게는 숙주 세포에 의해 인식되고 처리되는(즉, 신호 펩티다제에 의해 절단되는) 것이다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들어 단순 헤르페스 gD 신호가 이용가능하다. 그러한 전구체 영역에 대한 DNA는 본 출원의 단백질 구성물을 인코딩하는 DNA에 판독(reading) 프레임으로 결찰된다.

b) 복제 원점

일반적으로 복제 원점 구성요소는 포유류 발현 벡터에 필요하지 않는다(SV40 원점은 일반적으로 초기 프로모터를 포함하기 때문에 사용될 수 있음).

c) 선택 유전자 구성요소

발현 및 클로닝 벡터는 선택 가능한 마커라고도 하는 선택 유전자를 포함할 수 있다. 통상적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 기타 독소(예: 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린)에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지에서 사용할 수 없는 중요한 영양소를 공급하는 단백질을 인코딩하며, 예를 들어 바실리(Bacilli)에 대한 D-알라닌 라세미화효소를 인코딩하는 유전자이다.

선택 계획의 한 예시는 숙주 세포의 성장을 정지시키기 위해 약물을 사용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생산하므로 선택 요법에서 생존한다. 그러한 우세한 선택의 예시는 약물인 네오마이신, 마이코페놀산 및 히그로마이신을 사용한다.

포유동물 세포에 적합한 선별가능한 마커의 또 다른 예는 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 디아미나제, 오르니틴 디카르복실라제 등과 같은 본 출원의 단백질 구성을 인코딩하는 핵산을 흡수할 수 있는 적격 세포의 식별을 가능하게 하는 것들이다.

예를 들어, DHFR 선택 유전자로 형질전환된 세포는 모든 형질전환체를 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트(Mtx)를 포함하는 배양 배지에서 배양하여 먼저 식별한다. 야생형 DHFR이 사용될 때 적절한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결핍된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주(예를 들어, ATCC CRL-9096)이다.

대안적으로, DNA 서열, 야생형 DHFR 단백질, 및 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제(APH)와 같은 또 다른 선택 가능한 마커를 인코딩하는 폴리펩타이드로 형질전환되거나 공동 형질전환된 숙주 세포(특히 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는 아미노글리코시드 항생제, 예를 들어 카나마이신, 네오마이신 또는 G418과 같은 선택 가능한 마커에 대한 선별제를 함유하는 배지에서 세포 성장에 의해 선택된다. 미국특허번호 4,965,199 참조한다.

d) 프로모터 구성요소

발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 숙주 유기체에 의해 인식되고 원하는 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 사실상 모든 진핵생물 유전자는 전사가 시작되는 부위로부터 약 25~30개 기반 업스트림에 위치한 AT가 풍부한 영역을 가지고 있다. 많은 유전자의 전사 시작으로부터 70-80개 염기 업스트림에서 발견되는 또 다른 서열은 N이 임의의 뉴클레오티드일 수 있는 CNCAAT 영역이다. 대부분의 진핵생물의 3' 말단에는 코딩 서열의 3' 말단에 폴리 A 꼬리를 추가하기 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 있다. 이들 서열 모두는 진핵 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 또한 상기 "III. 지속형 NGF 폴리펩타이드를 인코딩하는 벡터' 섹션을 참조한다.

포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 폴리펩타이드 전사는 이러한 프로모터가 숙주 세포 시스템과 양립 가능한 경우에, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스(예: 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 가장 바람직하게는 유인원 바이러스 40(SV40)와 같은 바이러스의 게놈, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로부터로부터, 열충격 프로모터로부터 수득된 프로모터에 의해 조절된다.

SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 기점도 포함하는 SV40 제한 단편으로 편리하게 얻을 수 있다. 인간 사이토메갈로바이러스의 초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로 편리하게 얻을 수 있다. 소 유두종 바이러스를 벡터로 사용하여 포유류 숙주에서 DNA를 발현시키는 시스템은 미국특허번호 4,419,446에 개시된다. 이 시스템의 수정은 미국특허번호 4,601,978에 기술된다. 단순포진 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터의 제어 하에 마우스 세포에서 인간-인터페론 cDNA의 발현에 관한 문헌 Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982)을 참조한다. 대안적으로 라우스 육종(Rous Sarcoma) 바이러스 긴 말단 반복을 프로모터로 사용할 수 있다.

e) 인헨서 요소 구성요소

고등 진핵생물에 의한 본 출원의 단백질 구성을 인코딩하는 DNA의 전사는 종종 인핸서 서열을 벡터에 삽입함으로써 증가된다. 현재 많은 인핸서 서열이 포유류 유전자(글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질 및 인슐린)에서 알려져 있다. 그러나 통상적으로 진핵 세포 바이러스의 인핸서를 사용할 것이다. 예를 들면 복제 원점(100-270 bp)의 후반에 있는 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 원점의 후반에 있는 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한 진핵생물 프로모터의 활성화를 위한 인헨싱 요소에 대해 Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)를 참조한다. 인헨서는 폴리펩타이드 인코딩 서열에 5' 또는 3' 위치에서 벡터로 스플라이싱될 수 있으나, 바람직하게 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다.

f) 전사 종결 구성요소

진핵생물 숙주 세포(효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는 또한 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 포함할 것이다. 이러한 서열은 일반적으로 진핵생물 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 번역되지 않은 5' 및 종종 3' 영역에서 이용 가능하다. 이들 영역은 폴리펩타이드-인코딩 mRNA의 번역되지 않은 부분에서 폴리아데닐화된 단편으로 전사된 뉴클레오티드 단편을 포함한다. 유용한 전사 종결 구성요소 중 하나는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO94/11026 및 여기에 개시된 발현 벡터를 참조한다.

g) 숙주 세포의 선택 및 형질전환

본 명세서의 벡터에서 DNA를 클로닝 또는 발현하기에 적합한 숙주 세포는 척추동물 숙주 세포를 포함하는 본 명세서에 기술된 고등 진핵 세포를 포함한다. 배양(조직 배양)에서 척추동물 세포의 번식은 일상적인 절차가 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예시는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통(COS-7, ATCC CRL 1651); 원숭이 신장 조직에서 유래한 COS 섬유아세포 유사 세포주; 인간 배아 신장 계통(현탁 배양에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); 아기 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR(CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 마우스 세르톨리(sertoli) 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개의 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 쥐 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TR1 세포(Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 세포주(Hep G2)이다.

숙주 세포는 단백질 구성 생산을 위한 상기 기술된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고, 프로모터 유도, 형질전환체 선택 또는 원하는 서열을 인코딩하는 유전자 증폭에 적합하도록 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양된다.

h) 숙주 세포의 배양

본 출원의 단백질 구성을 생산하는데 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 숙주세포의 배양에는 Ham's F10(Sigma), Minimal Essential Medium((MEM), (Sigma), RPMI-1640(Sigma), Dulbecco's Modified Eagle's Medium((DMEM), Sigma)과 같은 시판되는 배지가 적합하다. 추가로, Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), 미국특허번호 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국특허 Re. 30,985에 기술된 임의의 배지가 숙주 세포를 위한 배양 배지로 사용될 수 있다. 이러한 배지는 필요에 따라 호르몬 및/또는 기타 성장 인자(예: 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염(예: 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충제(예: HEPES), 뉴클레오티드(예: 아데노신 및 티미딘), 항생제(예: GENTAMYCIN^TM 약물), 미량 원소(일반적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로 정의됨) 및 포도당 또는 동등한 에너지원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충물이 또한 당업자에게 공지된 적절한 농도로 포함될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것이며, 당업자에게 자명할 것이다.

i) 단백질 정제

재조합 기술을 사용하는 경우, 본 발명의 단백질 구성은 주변세포질 공간에서 세포내로 생성되거나 배지로 직접 분비될 수 있다. 단백질 구조가 세포 내에서 생성되는 경우, 첫 번째 단계로 미립자 잔해, 숙주 세포 또는 용해된 단편이 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)은 대장균의 주변 세포질 공간으로 분비되는 항체를 분리하는 과정을 기술하고 있다. 간략하게, 세포 페이스트는 아세트산나트륨(pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드(PMSF)의 존재 하에 약 30분에 걸쳐 해동된다. 세포 파편은 원심분리로 제거할 수 있다. 단백질 구조물이 배지로 분비되는 경우, 그러한 발현 시스템으로부터의 상청액은 일반적으로 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어 Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 장치를 사용하여 먼저 농축된다. PMSF와 같은 프로테아제 억제제는 단백질 분해를 억제하기 위해 상기 단계 중 임의의 단계에 포함될 수 있고 항생제는 우발적 오염물의 성장을 방지하기 위해 포함될 수 있다.

세포로부터 제조된 단백질 조성물은 예를 들어 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있으며, 친화성 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 친화성 리간드로서 단백질 A의 적합성은 Fc 함유 단백질 구조에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소타입에 따라 다르다. 단백질 A는 1, 2, 또는 4개 중쇄를 함유하는 인간 면역글로불린에 기초한 Fc 함유 단백질을 정제하는데 사용될 수 있다(Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 이소타입 alca 인간 3에 대해 권장된다(Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). 친화성 리간드가 부착된 매트릭스는 대부분 아가로스이지만 다른 매트릭스도 사용할 수 있다. 제어된 기공 유리 또는 폴리(스티렌-디비닐) 벤젠과 같은 기계적으로 안정적인 매트릭스는 아가로스로 달성할 수 있는 것보다 더 빠른 유속과 더 짧은 처리 시간을 허용한다. 단백질 구조가 C_H3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABXTMresin(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)이 정제에 유용하다. 이온 교환 컬럼에서의 분류, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지(예: 폴리아스파르트산 컬럼)에서 헤파린 SEPHAROSE^TM 크로마토그래피상 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전과 같은 단백질 정제를 위한 다른 기술들이 또한 회수되는 단백질의 구조에 따라 가능하다.

임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 관심 단백질 구성 및 오염물을 포함하는 혼합물은 약 2.5-4.5 사이의 pH로 용리(elution) 완충액을 사용하는, 바람직하게 낮은 염 농도에서 수행되는(예를 들어 약 0-0.25M 염) 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용될 수 있다.

V. 약학적 조성물

추가로 본 명세서에 기술된 임의의 지속형 NGF 폴리펩타이드 및 임의로 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 따라서 일부 실시양태에서, N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드, 및 임의로 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물이 제공되며, 여기서 NGF 모이어티는 서열번호: 1~4 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 Fc 모이어티는 IgG1 Fc 또는 IgG4 Fc로부터 유도된다. 약학적 조성물은 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로, 원하는 정도의 순도를 갖는 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드를 임의의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 제조될 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)).

재구성된 제형은 동결건조된 지속형 NGF 폴리펩타이드를 희석제에 용해시켜 단백질이 전체적으로 분산되도록 함으로써 제조될 수 있다. 본 출원에서 사용하기에 적합한 예시적인 약학적으로 허용되는(인간에게 투여하기에 안전하고 무독성인) 희석제는 멸균수, 주사용 정균수(BWFI), pH 완충 용액(예를 들어, 인산염- 완충 식염수), 멸균 식염수 용액, 링거 용액 또는 덱스트로스 용액, 또는 염 및/또는 완충액의 수용액을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드의 균질한 집단을 포함한다. 균일한 집단은 지속형 NGF 폴리펩타이드가 서로 정확히 동일함을 의미하며, 예를 들어 동일한 지속형 NGF 폴리펩타이드 구성, 동일한 NGF 모이어티, 존재하는 경우 동일한 링커 및 동일한 Fc 모이어티를 의미한다. 일부 실시양태에서, 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%)의 약학적 조성물 내의 지속형 NGF 폴리펩타이드는 균질하다.

일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드 및 선택적으로 약학적으로 허용되는 담체로 필수적으로 구성된다(예를 들어 구성된다). 일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 임의의 proNGF-Fc 또는 preproNGF-Fc 융합 단백질을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 약 5% 이하(예를 들어, 약 4%, 3%, 2% 또는 1% 중 어느 하나 이하) proNGF-Fc 또는 preproNGF-Fc 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 임의의 숙주 세포(예를 들어, CHO) 단백질을 포함하지 않는다.

약학적 조성물은 바람직하게는 안정해야 하며, 그 안에 함유된 단백질은 본질적으로 저장시 그의 물리적 및 화학적 안정성 및 온전성을 유지한다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 다양한 분석 기술이 당업계에서 이용 가능하며 Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) and Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)에서 검토되었다. 선택한 시간 동안 선택한 온도에서 안정성을 측정할 수 있다. 빠른 스크리닝을 위해 제형은 40℃에서 2주 내지 1개월 동안 유지될 수 있으며, 이때 안정성이 측정된다. 제형이 2-8°C에서 저장되는 경우, 일반적으로 제형은 적어도 1개월 동안 30°C 또는 40°C에서 안정해야 하고/하거나 적어도 2년 동안 2-8°C에서 안정해야 한다. 제형이 30°C에서 보관되는 경우 일반적으로 제형은 30°C에서 최소 2년 동안 안정해야 하고/하거나 40°C에서 최소 6개월 동안 안정해야 한다. 예를 들어, 보관 중 응집 정도는 단백질 안정성의 지표로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드의 안정한 제형은 제형 내에 응집체로서 존재하는 지속형 NGF 폴리펩타이드의 약 10% 미만(바람직하게는 약 5% 미만)을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 예를 들어 약 2-25℃, 예컨대 약 2-8℃에서 적어도 약 15일, 예컨대 적어도 약 20일, 1개월, 2개월, 3개월, 6개월, 1년, 2년, 3년 또는 그 이상 중 어느 하나의 저장 수명을 갖는다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "저장 수명"은 약학적 제형에서 치료 단백질(예를 들어, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드)과 같은 활성 성분이, 약학적 제형이 특정 저장 조건 하에, 예를 들어 2-8°C에서 저장될 때, 최소한의 분해(예를 들어, 약 5% 이하 분해, 예를 들어 약 4%, 3%, 또는 2% 이하 분해)를 갖는 저장 기간을 의미한다. 단백질 또는 제형 안정성을 평가하기 위한 예시적인 기술은 단백질 구조적 변화를 검출하기 위해, 예를 들어 응집을 검출하기 위한 크기-배제 크로마토그래피(SEC)-HPLC, 예를 들어 단백질 단편화를 검출하기 위한 역상(RP)-HPLC, 예를 들어 단백질 전하의 변화를 검출하기 위한 이온 교환-HPLC, 질량 분석법, 형광 분광법, 원편광 이색성(CD) 분광법, 푸리에 변환 적외선 분광법(FT-IR) 및 라만 분광법을 포함한다. 이러한 모든 기술은 약학적 제형에서 단백질의 분해를 평가하고 해당 제형의 저장 수명을 결정하기 위해 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 약학적 제형은 약 2-8°C에서 저장될 때 적어도 약 15일 동안(예를 들어 적어도 약 20일, 1개월, 2개월, 3개월, 6개월, 1년, 2년, 3년 또는 그 이상) 동안 약 5% 이하(예를 들어 약 4%, 3%, 2%, 또는 1% 이하)의 분해(예를 들어 단편화, 응집, 또는 언폴딩)를 나타낸다.

허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며 완충제, 아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E, 메타중아황산나트륨을 포함한 항산화제; 방부제, 등장화제(예: 염화나트륨), 안정제, 금속 착물(예: Zn-단백질 착물); EDTA 및/또는 비이온성 계면활성제와 같은 킬레이트제를 포함한다.

생리학적으로 허용되는 담체의 예시는 인산염, 구연산염 및 기타 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제(예: 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 고분자; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 포도당, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로즈, 만니톨, 트레할로즈 또는 소르비톨과 같은 당류; 나트륨과 같은 염 형성 카운터 이온; 금속 착물(예: Zn-단백질 착물); 및/또는 TWEEN^TM, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 PLURONICS^TM또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.

완충액은 특히 안정성이 pH에 따라 달라지는 경우 치료 효과를 최적화하는 범위에서 pH를 제어하는 데 사용된다. 완충액은 바람직하게는 약 50mM 내지 약 250mM 범위의 농도로 존재한다. 본 출원에서 사용하기에 적합한 완충제는 유기산 및 무기산 모두 및 이의 염을 포함한다. 예를 들어, 시트레이트, 포스페이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 옥살레이트, 락테이트, 아세테이트. 추가로, 버퍼는 트리스(Tris)와 같은 히스티딘 및 트리메틸아민 염을 포함할 수 있다.

방부제는 미생물 성장을 지연시키기 위해 첨가되며 일반적으로 0.2%-1.0%(w/v) 범위로 존재한다. 방부제의 첨가는 예를 들어 다용도(다중 용량) 제형의 생산을 용이하게 할 수 있다. 본 출원에서 사용하기에 적합한 방부제는 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 할라이드(예를 들어, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드), 벤제토늄 클로라이드; 티메로살, 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올, 3-펜탄올 및 m-크레졸을 포함한다.

종종 "안정화제"로 알려진 등장화제는 조성물에서 액체의 등장성을 조정하거나 유지하기 위해 존재한다. 단백질과 같은 큰 전하를 띤 생체 분자와 함께 사용하면 아미노산 측쇄의 하전된 그룹과 상호 작용하여 분자 간 및 분자 내 상호 작용의 가능성을 줄일 수 있기 때문에 종종 "안정제"라고 한다. 등장화제는 다른 성분의 상대적인 양을 고려하여 0.1% 내지 25중량%, 바람직하게는 1% 내지 5%의 임의의 양으로 존재할 수 있다. 바람직한 등장화제는 다가 당 알코올, 바람직하게는 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨과 같은 3가 이상의 당 알코올을 포함한다.

추가 부형제는 다음 중 하나 이상으로 작용할 수 있는 작용제를 포함한다: (1) 증량제, (2) 용해도 향상제, (3) 안정제 및 (4) 변성 또는 용기 벽에 대한 부착을 방지하는 작용제. 그러한 부형제는 다음을 포함한다: 다가 당 알코올(상기 열거됨); 알라닌, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 리신, 오르니틴, 류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌 등의 아미노산; 수크로즈, 락토즈, 락티톨, 트레할로즈, 스타키오즈, 만노즈, 소르보즈, 자일로즈, 리보즈, 리비톨, 미오이니시토즈, 미오이니시톨, 갈락토즈, 갈락티톨, 글리세롤, 사이클리톨(예를 들어, 이노시톨), 폴리에틸렌 글리콜과 같은 유기 당 또는 당 알코올; 요소, 글루타티온, 티옥트산, 티오글리콜산나트륨, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤, 티오황산나트륨과 같은 황 함유 환원제; 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 기타 면역글로불린과 같은 저분자량 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 고분자; 단당류(예: 자일로스, 만노스, 과당, 포도당, 이당류(예: 락토스, 말토스, 수크로스), 라피노스와 같은 삼당류; 및 덱스트린 또는 덱스트란과 같은 다당류.

비이온성 계면활성제 또는 세제("습윤제"라고도 함)는 단백질을 가용화하는 데 도움이 될 뿐만 아니라 교반 유발 응집으로부터 단백질을 보호하기 위해 존재하며, 이는 제형이 활성 단백질의 변성을 유발하지 않고 전단 표면 응력에 노출되도록 한다. 비이온성 계면활성제는 약 0.05mg/ml 내지 약 1.0mg/ml, 바람직하게는 약 0.07mg/ml 내지 약 0.2mg/ml의 범위로 존재한다.

적합한 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트(20, 40, 60, 65, 80 등), 폴리옥사머(184, 188 등), PLURONIC^® 폴리올, TRITON^®, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에테르(TWEEN®-20, TWEEN®-80 등), 라우로마크로골 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 10, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 자당 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로오스 및 카르복시메틸 셀룰로오스를 포함한다. 사용될 수 있는 음이온성 세제는 소듐 라우릴 설페이트, 디옥틸 소듐 설포석시네이트 및 디옥틸 소듐 설포네이트를 포함한다. 양이온성 세제는 벤즈알코늄 클로라이드 또는 벤제토늄 클로라이드가 포함된다.

약학적 조성물이 인비보 투여에 사용되기 위해서는 멸균되어야 한다. 약학적 조성물은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 멸균될 수 있다. 본 명세서의 약학적 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알에 넣는다.

지속 방출 제제가 제조될 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예는 길항제를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 상기 매트릭스는 성형 제품의 형태, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐로 있다. 지속 방출 매트릭스의 예시는 폴리에스테르, 하이드로겔(예: 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락타이드(미국특허번호 3,773,919), L-글루탐산과 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 젖산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT^TM(젖산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사 가능한 마이크로스피어) 및 폴리-D-(-)-3 -히드록시부티르산을 포함한다.

본 명세서의 약학적 조성물은 또한 치료되는 특정 적응증에 필요한 하나 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 역효과를 내지 않는 보완적 활성을 갖는 활성 화합물을 함유할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 적절하게 조합되어 존재한다.

활성 성분은 또한 제조된 마이크로캡슐에 포획될 수 있으며, 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐에 포획될 수 있으며, 예를 들어 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼에서 각각 하이드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences 18th edition에 개시되어 있다.

일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 일회용 밀봉 바이알과 같은 일회용 바이알에 함유된다. 일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 다용도 바이알에 함유된다. 일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 용기에 대량으로 함유된다. 일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 동결보존된다.

VI. 질병의 치료 방법

본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드 및 그의 조성물(예를 들어, 약학적 조성물)은 진단, 분자 분석 및 요법과 같은 다양한 적용에 유용하다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 유효량의 임의의 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 이의 약학적 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체(예를 들어, 인간)에서 질병(예를 들어, NGF-관련 질병, 예컨대 신경계 질환)을 치료하는 방법이 제공된다. 본 명세서에서 사용되는 "NGF-관련 질병"이라는 용어는 손상된 NGF 수용체 신호(예를 들어, 불충분한 NGF 양 및/또는 감소된 결합 친화성으로 인해)에 의해 유발되거나 이와 관련된 모든 질병 또는 장애, 또는 치료를 위해(예: 치료를 위해 신경 세포의 성장, 유지, 증식 및/또는 생존을 필요로 하는 손상/손상) NGF 생체활성을 요구하는 질병 또는 장애를 의미한다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드(또는 이의 약학적 조성물)는 정맥내, 근육내 또는 피하 투여된다.

따라서 일부 실시양태에서, N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티 및 Fc를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드(또는 이의 약학적 조성물)의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체(예를 들어 인간)에서 질병(예를 들어, NGF 관련 질병, 예를 들어 신경계 질환(예를 들어, 당뇨병성 신경병증, 알츠하이머병 또는 신경영양성 각막염) 또는 비신경계 질환(예를 들어, 조기 난소 부전 또는 정자 형성 장애)을 치료하는 방법이 제공되며, 여기서 NGF 모이어티는 서열번호: 1~4 중 어느 하나(예를 들어 서열번호: 1~3 중 어느 하나)의 아미노산 서열을 포함하며(또는 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성되며), 상기 Fc 모이어티는 IgG1 Fc 또는 IgG4 Fc로부터 유도된다. 일부 실시양태에서, 서열번호: 61~67 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 필수적으로 구성되거나, 또는 이들로 구성되는) 지속형 NGF 폴리펩타이드의 유효량(또는 이의 약학적 조성물)을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체(예를 들어 인간)에서 질병(예를 들어, NGF 관련 질병, 예를 들어, 신경계 질환(예를 들어, 당뇨병성 신경병증, 알츠하이머병 또는 신경영양성 각막염) 또는 비신경계 질환(예를 들어, 조기 난소 부전 또는 정자 형성 장애))을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드(또는 이의 약학적 조성물)는 정맥내, 근육내 또는 피하 투여된다.

본 명세서에 기재된 방법은 신경계 질환 및 비신경계 질환 모두를 치료하는데 적합하다.

신경(Neurological) 질환에는 신경계 질환이 포함된다. 신경계 질환은 중추 및/또는 말초 신경계의 신경 변성 또는 손상과 관련된 질환을 말한다. 신경계 질환의 특정 예시는 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 뇌졸중, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 안면 신경염, 두개뇌 또는 척수 외상, 급성 뇌혈관 질환, 뇌 위축, 말초 신경병증, 및 외상, 화상, 신부전, 손상 또는 화학약품/약물에 의해 유발된 신경 손상, 예를 들어 화학약품 또는 약물에 의해 유발된 급성 뇌혈관 중추신경손상 외에, 중추신경, 말초신경, 운동신경에 관계 없이 신경세포의 괴사 또는 소실을 특징으로 하는 기타 질환을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 신경계 질환에는 당뇨병, AIDS 또는 화학 요법과 관련된 신경병증과 같은 특정 상태와 관련된 말초 신경병증도 포함된다. 일부 실시양태에서, 신경계 질환은 다발성 경색 치매, 혈관성 치매, 알코올 중독으로 인한 기질적 뇌 질환으로 인한 인지 장애, 알츠하이머병, 파킨슨병, 간질, 다발성 경화증, 헌팅턴 무도병, 다운 증후군, 신경성 난청, 메니에르병, 뇌졸중, ALS, 벨마비(Bell's palsy), 척수성 근위축 관련 상태, 마비 관련 상태, 말초 신경병증, 외상으로 인한 신경 손상, 화상으로 인한 신경 손상, 신장 기능 장애로 인한 신경 손상, 부상으로 인한 신경 손상, 화학 요법의 독성 효과로 인한 신경 손상, 수술로 인한 신경 손상, 허혈로 인한 신경 손상, 감염으로 인한 신경 손상, 대사질환으로 인한 신경 손상, 영양결핍으로 인한 신경 손상으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 신경 질환은 당뇨병성 말초 신경병증, 독소 유발 말초 신경병증, 화학요법 유발 말초 신경병증, HIV 관련 말초 신경병증 및 운동신경에 영향을 미치는 말초 신경병증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 말초 신경병증이다. 일부 실시양태에서, 신경 질환은 신생아 저산소 허혈성 뇌병증, 뇌성마비, 중증 근병증, 신경 난청, 반회 후두 신경 손상, 외상성 뇌 손상, 치아 신경 손상, 뇌졸증, 다운 증후군, ALS, 다발성 경화증, 척수성 근위축, 미만성 뇌손상, 흉선 이형성증, 시신경 타박상, 여포성 이형성증, 척수 손상, 녹내장, 신경영양성 각막염, 시신경손상, 시신경척수염, 망막관련질환, 요실금, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 치매, 고혈압성 뇌내출혈 신경기능장애, 뇌소혈관질환, 급성허혈뇌졸중, 각막내피이영양증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨 족부궤양, 신경성 피부궤양, 욕창, 신경영양성 각막궤양, 당뇨병성 각막궤양, 및 황반공으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

비신경계 질환에는 비장의 위축, 비장의 타박상, 난소 예비력 감소, 조기 난소 부전(POF), 난소 과잉자극 증후군, 난소 잔류 증후군, 난소 여포성 이형성증, 정자 형성 장애(예: 정자감소증(oligozoospermia)(또는 정자과소증(oligospermia)), 정자무력증(asthenospermia), 감약정자증(oligoasthenospermia), 무정자증(azoospermia), 기형정자증(teratozoospermia), 과소정자증(oligoasthenoteratozoospermia)(OAT 증후군)), 허혈성 궤양, 스트레스성 궤양, 류마티스성 궤양, 간 섬유증, 각막 궤양, 화상, 구강 궤양 및 정맥성 하지 궤양을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 질병(예를 들어 NGF-관련 질병, 예를 들어 신경 질환(예를 들어 당뇨병성 신경병증, 알츠하이머병, 또는 신경영양성 각막염) 또는 비신경 질환(예를 들어 조기 난소 부전 또는 정자 형성 장애))를 치료하는 방법은 다음 생물활성 중 하나 이상을 갖는다: (i) 뉴런 생존 지원; (ii) 신경돌기 성장 촉진; (iii) 신경화학적 분화 향상; (iv) 췌장 β 세포의 증식 촉진; (v) 선천적 및/또는 후천적 면역 유도; (vi) 손상된 신경 세포(예를 들어, 각막(cornea) 각막(corneal) 신경)를 회복 및/또는 손상을 방지(예를 들어, 신경영양성 각막염에서); (vii) 난포 세포의 증식 및/또는 에스트로겐 분비 촉진; (viii) 상처 치유 촉진(예: 당뇨병성 신경병증에서); (ix) 신경퇴행성 질환(예: 알츠하이머병)을 앓는 대상체의 공간 인지, 기억 및/또는 학습 능력 개선; (x) 신경변성의 치료 및/또는 예방; (xi) 고환 정세관 위축, 정세관 정자 형성 장애 및/또는 부고환관 세포 단편의 치료; (xii) 정자 수 및/또는 운동성의 감소를 구하거나 정자 수 및/또는 운동성을 증가(예: 정자 형성 장애); (xiii) 난소 난포의 수 및/또는 기능의 감소를 방지/역전시키거나 난소 난포의 수 및/또는 기능을 증가(예: 조기 난소 부전); 및/또는 (xiv) 환자 생존 연장. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 약학적 조성물에 의해 매개되는 신경세포 생존을 지원하는 방법은 적어도 약 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 그 이상 중 어느 하나의 신경세포 생존율을 달성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 약학적 조성물에 의해 매개되는 신경돌기 파생물(outgrowth)을 촉진하는 방법은 신경돌기 파생물의 적어도 약 2배(예를 들어, 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 또는 50배 또는 그 이상 중 임의의 배수를 포함)의 신경돌기 성장을 촉진할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 약학적 조성물에 의해 매개되는 신경화학적 분화를 증진시키는 방법은 신경화학적 분화의 적어도 약 2배(예를 들어 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 또는 50 또는 그 이상 중 어느 하나의 배수를 포함) 증진시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 약학적 조성물에 의해 매개되는 췌장 β 세포의 증식을 촉진시키는 방법은 췌장 β 세포 증식의 적어도 약 2배(예를 들어 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 또는 50 또는 그 이상 중 어느 하나의 배수를 포함) 촉진시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 약학 조성물에 의해 매개되는 배란 유도 방법은 배란의 적어도 약 2배(예를 들어 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 또는 50 또는 그 이상 중 어느 하나의 배수를 포함) 증진시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 약학 조성물에 의해 매개되는 선천적 및/또는 후천적 면역을 유도하는 방법은 선천적 및/또는 후천적 면역의 적어도 약 1.1배(예를 들어 적어도 약 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 또는 50배 또는 그 이상 중 어느 것을 포함) 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 약학 조성물에 의해 매개되는 신경 손상을 구조 및/또는 예방하는 방법은 신경 손상의 적어도 약 5%(예를 들어 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 그 이상 중 어느 하나를 포함)를 구조 및/또는 예방할 수 있거나, 적어도 약 1.1배(예를 들어 적어도 약 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 또는 50배, 또는 그 이상 중 어느 하나를 포함)의 구조 및/또는 예방 효율을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 약학 조성물에 의해 매개되는 난포 세포의 증식 및/또는 에스트로겐 분비를 촉진하는 방법은 난포 세포의 증식 및/또는 에스트로겐 분비의 적어도 약 1.1배(예를 들어 적어도 약 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 또는 50배, 또는 그 이상 중 어느 하나를 포함) 촉진할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 약학 조성물에 의해 매개되는 상처 치료의 촉진 방법은 상처 치료의 적어도 약 1.1배(예를 들어 적어도 약 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 또는 50배 또는 그 이상 중 어느 하나를 포함) 촉진할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 약학 조성물에 의해 매개되는 신경퇴행성 질환(예를 들어 알츠하이머병)을 갖는 대상체의 공간 인지, 기억, 및/또는 학습 능력을 향상시키는 방법은 공간 인지, 기억, 및/또는 학습 능력의 적어도 약 1.1배(예를 들어 적어도 약 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 또는 50배, 또는 그 이상 중 어느 하나를 포함) 증진시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 약학 조성물에 의해 매개되는 신경퇴행의 치료 및/또는 예방 방법은 신경퇴행의 적어도 약 5%(예를 들어 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 그 이상 중 어느 하나를 포함)를 구조 및/또는 예방할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 약학적 조성물에 의해 매개되는 고환 정세관 위축, 정자 형성 장애 및/또는 부고환관 세포 단편을 치료하는 방법은 고환 정세관 위축, 정세관 정자 형성 장애, 및/ 또는 부고환관 세포 단편의 적어도 약 5%(예를 들어 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상 중 어느 하나를 포함) 치료할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 약학적 조성물에 의해 매개되는 정자 수 및/또는 운동성의 감소를 구조하는 방법은 정자 수 및/또는 운동성의 감소의 적어도 약 5%(예를 들어 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상 중 어느 하나를 포함)를 구조할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 약학적 조성물에 의해 매개되는 정자 수 및/또는 운동성을 증가시키는 방법은 정자 수 및/또는 운동성의 적어도 약 5%(예를 들어 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200% 또는 그 이상 중 어느 하나를 포함)를 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 약학적 조성물에 의해 매개되는 난포의 수 및/또는 기능 감소를 구조하는 방법은 난포 수 및/또는 기능 감소의 적어도 약 5%(예를 들어 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상 중 어느 하나를 포함)를 구조할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 약학적 조성물에 의해 매개되는 난포 수 및/또는 기능을 증가시키는 방법은 난포 수 및/또는 기능의 적어도 약 5%(예를 들어 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200% 또는 그 이상 중 어느 하나를 포함)를 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 약학적 조성물에 의해 매개되는 개체(예를 들어, 인간)의 생존을 연장시키는 방법은 개체의 생존을 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18, 24개월 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 또는 그 이상 연장시킬 수 있다.

본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 이의 약학적 조성물의 투여는 주사 또는 수혈을 포함하는 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 투여 경로는 단일 또는 단일 또는 다중 볼루스(bolus) 또는 적절한 방식으로 장기간에 걸친 주입과 같이 공지되고 허용되는 방법에 따른다. 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 이의 약학적 조성물은 환자에게 경구, 피하, 정맥내, 뇌내, 비강내, 경피, 복강내, 근육내, 폐내, 질내, 직장내, 안구내, 국소, 동맥경유, 진피내, 결절내, 경막내(intraputaminally) 또는 골수내, 척수강내, 심실내, 대뇌내, 척수내, 척수강내, 병변내, 또는 안구내 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 이의 약학적 조성물은 전신적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 이의 약학적 조성물은 정맥내 주입과 같은 주입에 의해 개체에게 투여된다. 면역요법을 위한 주입 기술은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1676 (1988) 참조). 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 이의 약학적 조성물은 피내 또는 피하(즉, 피부 아래) 주사에 의해 개체에게 투여된다. 피하 주사의 경우, 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 이의 약학적 조성물은 주사기를 사용하여 주사될 수 있다. 그러나, 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 이의 약학적 조성물의 투여를 위한 다른 장치는 주사 장치; 인젝터 펜; 자동 주사기 장치, 무바늘 장치; 및 피하 패치 전달 시스템과 같이 이용 가능하다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 이의 약학적 조성물은 정맥내 주사에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 이의 약학적 조성물은 뇌 또는 척추에 직접 주사된다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 이의 약학적 조성물은 상처 조직에 직접적으로와 같이 손상 또는 상처 부위에 국소적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 이의 약학적 조성물은 지속 방출 또는 연장 방출 수단에 의해 투여된다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여량 및 원하는 약물 농도는 계획된 특정 용도에 따라 달라질 수 있다. 적절한 투여량 또는 투여 경로의 결정은 통상의 기술자의 기술 범위 내에 있다. 동물 실험은 인간 치료를 위한 유효 용량 결정을 위한 신뢰할 수 있는 지침을 제공한다. 유효 용량의 종간 스케일링은 Mordenti, J. and Chappell, W. "The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics," In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-46에 설정된 원칙에 따라 수행될 수 있다.

지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 이의 약학적 조성물의 인비보 투여가 사용되는 경우, 정상 투여량은 투여 경로 및 포유동물 유형에 따라 약 0.01㎍/kg 내지 약 10mg/kg 포유동물 체중으로 다양할 수 있다. 상이한 제형이 상이한 치료 및 상이한 장애에 대해 효과적일 것이고, 특정 기관 또는 조직을 치료하기 위한 투여가 다른 기관 또는 조직에 대한 것과 상이한 방식으로 전달을 필요로 할 수 있다는 것은 본 출원의 범위 내에 있다. 또한, 투여량은 1회 이상의 개별 투여 또는 연속 주입에 의해 투여될 수 있다. 수일 이상에 걸쳐 반복 투여하는 경우, 상태에 따라 원하는 질병 증상 억제가 발생할 때까지 치료를 지속한다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 이 치료의 진행 상황은 기존의 기술과 분석법으로 쉽게 모니터링할 수 있다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 이의 약학적 조성물은 약 0.01㎍/kg 내지 약 10mg/kg, 예컨대 약 0.01㎍/kg 내지 약 1㎍/kg, 약 1㎍/kg 내지 약 100㎍/kg, 약 100㎍/kg 내지 약 500㎍/kg, 약 500㎍/kg 내지 약 1mg/kg, 약 1mg/kg 내지 약 10mg/kg, 또는 약 0.01㎍ /kg 내지 약 1 mg/kg의 양으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 이의 약학적 조성물은 개인(예를 들어, 인간)당 약 0.01㎍ 내지 약 1000㎍, 예컨대 개인당 약 0.01㎍ 내지 약 1㎍, 약 1㎍ 내지 약 500㎍, 약 500㎍ 내지 약 1000㎍, 약 1㎍ 내지 약 300㎍, 또는 약 100㎍ 내지 약 1000㎍의 용량으로 투여된다.

일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 이의 약학적 조성물은 1회 투여된다(예를 들어, 볼루스(bolus) 주사). 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 이의 약학적 조성물은 여러 번(예를 들어, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 또는 그 이상) 투여된다. 여러 번 투여하는 경우 동일하거나 다른 경로로 투여할 수 있으며 동일한 부위 또는 대체 부위에서 실시할 수 있다. 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 이의 약학적 조성물은 매일 내지 1년에 1회 투여될 수 있다. 투여 사이의 간격은 약 24시간 내지 1년 중 어느 하나일 수 있다. 간격도 불규칙할 수 있다(예: 종양 진행 후). 일부 실시양태에서, 투약 일정에 중단이 없다. 특정 환자에 대한 최적의 투여량 및 치료 요법은 질병의 징후에 대해 환자를 모니터링하고 그에 따라 치료를 조정함으로써 의학 분야의 숙련가에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 그의 약학적 조성물은 1일 1회 (매일), 2일 1회, 3일 1회, 4일 1회, 5일 1회, 6일 1회, 주 1회, 10일에 1회, 2주에 1회, 3주에 1회, 4주에 1회, 1개월에 1회, 2개월에 1회, 3개월에 1회, 4개월에 1회, 5개월에 1회, 5개월에 1회 6개월, 7개월에 1회, 8개월에 1회, 9개월에 1회 또는 1년에 1회 투여된다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 이의 약학적 조성물은 3일마다 1회 투여된다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 이의 약학적 조성물은 매주 1회 투여된다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 이의 약학적 조성물은 1개월에 1회 투여된다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 이의 약학적 조성물은 1일 1회 점적된다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 이의 약학적 조성물은 1일 3회 점적된다. 일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 이의 약학적 조성물은 1일 5회 점적된다.

일부 실시양태에서, 지속형 NGF 폴리펩타이드 또는 이의 약학적 조성물은 약 2회, 3회, 4회, 5회 또는 그 이상의 용량 중 어느 하나와 같은 분할 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 분할 용량은 약 1주, 1개월, 2개월, 3개월 또는 그 이상에 걸쳐 투여된다. 일부 실시예에서, 용량은 동등하게 분할된다. 일부 실시양태에서, 분할 용량은 총 용량의 약 20%, 약 30% 및 약 50%이다. 일부 실시양태에서, 연속 분할 용량 사이의 간격은 약 1일, 2일, 3일, 1주, 2주, 3주, 1개월, 3개월, 6개월 또는 그 이상이다. 수일 이상에 걸쳐 반복 투여하는 경우, 상태에 따라 원하는 질병 증상 억제가 발생할 때까지 치료를 지속한다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 이 치료의 진행 상황은 기존의 기술과 분석법으로 쉽게 모니터링할 수 있다.

VII. 제조품 및 키트

추가로 본 명세서에 기재된 임의의 지속형 NGF 폴리펩타이드를 포함하는 키트, 단위 투여량 및 제조품이 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 약학적 조성물 중 임의의 하나를 함유하고 바람직하게는 본 명세서에 기재된 장애 (예를 들어, 신경계 질환)의 치료에 사용하기 위한 것과 같은 그의 사용에 대한 지침을 제공하는 키트가 제공된다.

본 발명의 키트는 예를 들어 질병을 치료하기 위해 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함한다. 예를 들어, 상기 지침은 신경 질환과 같은 질환을 치료하기 위해 지속형 NGF 폴리펩타이드의 투여에 대한 설명을 포함한다. 키트는 개인이 질병을 가지고 있는지 여부 및 질병의 단계를 확인하는 것에 기초하여 치료에 적합한 개인(예를 들어, 인간)을 선택하는 설명을 추가로 포함할 수 있다. 지속형 NGF 폴리펩타이드의 사용과 관련된 지침에는 일반적으로 의도된 치료를 위한 투여량, 투여 일정 및 투여 경로에 대한 정보가 포함된다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지(예: 다중 용량 패키지) 또는 하위 단위 용량일 수 있다. 본 발명의 키트에 제공된 지침은 통상적으로 라벨 또는 패키지 삽입물(예를 들어, 키트에 포함된 종이 시트)에 기록된 지침이지만, 기계 판독 가능 지침(예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크에 담긴 지침)도 또한 허용된다. 본 출원의 키트는 적합한 패키징에 있다. 적합한 패키징은 바이알, 병, 항아리, 가요성 패키징(예를 들어, 밀봉된 마일러 또는 플라스틱 백) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 미니 펌프와 같은 주입 장치와 같은 특정 장치와 함께 사용하기 위한 패키지도 고려된다. 키트는 멸균 액세스 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 정맥 주사 용액 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개가 있는 바이알일 수 있음). 조성물 내의 적어도 하나의 활성제는 본 명세서에 기술된 지속형 NGF 폴리펩타이드이다. 용기는 제2의 약학적 활성제를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 완충액 및 해석 정보와 같은 추가 구성 요소를 선택적으로 제공할 수 있다. 일반적으로 키트는 용기 및 용기에 있거나 용기와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물(들)을 포함한다.

따라서 본 출원은 또한 (밀봉된 바이알과 같은) 바이알, 병, 단지, 가요성 포장 등을 포함하는 제조품을 제공한다. 제조품은 용기 및 용기 상에 또는 용기와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 적합한 용기에는 예를 들어 병, 바이알, 주사기 등이 포함된다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 일반적으로, 용기는 본 명세서에 기술된 질병 또는 장애(예를 들어, 신경 질환)를 치료하는 데 효과적인 조성물을 보유하고 멸균 액세스 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개가 있는 바이알일 수 있음). 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 개체의 특정 상태를 치료하기 위해 사용됨을 나타낸다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 개체에게 조성물을 투여하기 위한 지침을 추가로 포함할 것이다. 라벨에는 재구성 및/또는 사용을 위한 지침이 표시되어 있을 수 있다. 약학적 조성물을 수용하는 용기는 재구성된 제형의 반복 투여(예를 들어, 2 내지 6회 투여)를 허용하는 다용도 바이알일 수 있다. 패키지 삽입물은 이러한 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 용법, 용량, 투여, 금기 사항 및/또는 경고에 대한 정보를 포함하는 치료 제품의 상업용 패키지에 관례적으로 포함된 지침을 의미한다. 추가로, 제조품은 주사용 정균수(BWFI), 인산염 완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액과 같은 약학적으로 허용되는 완충액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 버퍼, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 재료를 추가로 포함할 수 있다.

키트 또는 제조품은 약국, 예를 들어 병원 약국 및 조제 약국에서 보관 및 사용하기에 충분한 양으로 포장된 약학적 조성물의 다중 단위 용량 및 사용 지침을 포함할 수 있다.

실시예

하기 실시예는 순수하게 본 발명의 예시를 위한 것이며 따라서 어떤 식으로든 본 발명을 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 다음의 실시예 및 상세한 설명은 제한이 아닌 예시를 위해 제공된다.

실시예 1: NGF 폴리펩타이드의 제조

플라스미드 구성

플라스미드 구성은 preproNGF-Fc 융합 단백질 2-118-L3Fc10-M1-5(서열번호: 34)로 예시된다. 유사한 방법이 다른 preproNGF-Fc 융합 단백질에 사용되었고, 대조군 prepro-mNGF118(서열번호: 47)은 F12E 돌연변이를 가지며 2개의 C-말단 아미노산(Arg-Ala)이 β-NGF에서 절단된 preproNGF이다. FD-G4Fc(CN105273087A 참조) 및 WM-G24Fc(CN106008722A 참조) 구성은 대조군으로 제공된다. NGF-1-15M7 (rhNGF-Fc1), NGF-L3Fc10M7-5 (rhNGF-Li-Fc1), 2-1-15M7 (rhNGF-(F12E)-Fc1), 및 NGF-4-12PAA (rhNGF-Fc4)은 WO2017157325에 설명된 구성이다. 다양한 NGF 폴리펩타이드의 구성에 대해 표 1을 참조하며, Fc 모이어티 정렬에 대해 도 1A~1F를 참조한다.

표 1. NGF 폴리펩타이드의 구성(configurations)

구성	성숙 β-NGF 모이어티	링커	Fc 모이어티
mNGF118 (prepro 서열번호: 47) (성숙 서열번호: 1)	mutant β-NGF 118aa (서열번호: 1)	/	/
FD-G4Fc(prepro 서열번호: 22) (성숙 서열번호: 55)	wt β-NGF 118aa (서열번호: 3)	GSGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호: 71)	변형된 IgG4 Fc-FD (서열번호: 19)
WM-G24Fc(prepro 서열번호: 24) (성숙 서열번호: 56)	wt β-NGF 118aa (서열번호: 3)	KTGGGSGGGS (서열번호: 72)	변형된 IgG2/4 Fc (서열번호: 20)
NGF-1-15M7(rhNGF-Fc1) (prepro 서열번호: 26) (성숙 서열번호: 57)	wt β-NGF 120aa (서열번호: 4)	/	IgG1 M7 (서열번호: 15)
NGF-L3Fc10M7-5(rhNGF-Li-Fc1) (prepro 서열번호: 28) (성숙 서열번호: 58)	wt β-NGF 120aa (서열번호: 4)	(G4S)₃ (서열번호: 68)	IgG1 M7-5 (N' minus 5aa) (서열번호: 16)
2-1-15M7(rhNGF-(F12E)-Fc1) (prepro 서열번호: 30) (성숙 서열번호: 59)	돌연변이 β-NGF 120aa (서열번호: 2)	/	IgG1 M7 (서열번호: 15)
NGF-4-12PAA(rhNGF-Fc4) (prepro 서열번호: 32) (성숙 서열번호: 60)	wt β-NGF 120aa (서열번호: 4)	/	변형된 IgG4 Fc (서열번호: 18)
2-118-L3Fc10-M1-5(prepro 서열번호: 34) (성숙 서열번호: 61)	돌연변이 β-NGF 118aa (서열번호: 1)	(G4S)₃ (서열번호: 68)	IgG1 M1-5 (N' minus 5aa) (서열번호: 10)
2-118-L3Fc10-M3-5(prepro 서열번호: 36) (성숙 서열번호: 62)	돌연변이 β-NGF 118aa (서열번호: 1)	(G4S)₃ (서열번호: 68)	IgG1 M3-5 (N' minus 5aa) (서열번호: 12)
NGF-118-L3Fc10-M3-5(prepro 서열번호: 38) (성숙 서열번호: 63)	wt β-NGF 118aa (서열번호: 3)	(G4S)₃ (서열번호: 68)	IgG1 M3-5 (N' minus 5aa) (서열번호: 12)
2-L3Fc10-M3-5(prepro 서열번호: 40) (성숙 서열번호: 64)	돌연변이 β-NGF 120aa (서열번호: 2)	(G4S)₃ (서열번호: 68)	IgG1 M3-5 (N' minus 5aa) (서열번호: 12)
2-118-L3Fc10-M5-5(prepro 서열번호: 42) (성숙 서열번호: 65)	돌연변이 β-NGF 118aa (서열번호: 1)	(G4S)₃ (서열번호: 68)	IgG1 M5-5 (N' minus 5aa) (서열번호: 14)
2-118-L3Fc10M7-5(prepro 서열번호: 44) (성숙 서열번호: 66)	돌연변이 β-NGF 118aa (서열번호: 1)	(G4S)₃ (서열번호: 68)	IgG1 M7-5 (N' minus 5aa) (서열번호: 16)
2-118-L3G4-BM(prepro 서열번호: 46) (성숙 서열번호: 67)	돌연변이 β-NGF 118aa (서열번호: 1)	GGGGGGSGGGGSGGGGSA (서열번호: 69)	변형된 IgG4 Fc (서열번호: 18)

다양한 preproNGF-Fc 융합 단백질(예: "2-118-L3Fc10-M1-5") 또는 prepro-mNGF118 대조군을 인코딩하는 핵산을 합성하여 pSC-T 벡터(예: "pSC-2-118-L3Fc10- M1-5") (Shanghai Jierui Bio-Engineering Co., Ltd. Beijing Branch)에 클로닝하였다. 제한 부위 HindIII 및 XhoI을 각각 포함하는 PCR 프라이머를 사용하여 다양한 preproNGF-Fc 융합 단백질 또는 prepro-mNGF118 대조군을 인코딩하는 핵산을 증폭한 다음, PCR 산물을 하우스(house) 생성 진핵 발현 벡터 pTT5(예: "pTT5-2- 118-L3Fc10-M1-5")로 서브클로닝하였다.

재조합 단백질의 발현

다양한 preproNGF-Fc 융합 단백질(예: pTT5-2-118-L3Fc10-M1-5) 또는 대조군 prepro-mNGF118을 인코딩하는 핵산을 운반하는 진핵 발현 벡터 pTT5로 형질감염된 293F 세포를 5일 동안 37℃, 8% CO₂, 120rpm 하에 배양했다. 발현된 단백질을 포함하는 상청액을 수집하였다.

재조합 단백질의 정제

발현된 NGF-Fc 융합 단백질을 먼저 단백질 A 친화성 정제로 대략적으로 정제한 다음 HiTrap^TM Butyl HP 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 서로 다른 소수성 특성을 기반으로 숙주 단백질로부터 추가로 분리했다. 그런 다음 잔류 응집체를 Superdex 200 Gel Filtration Column(GE Life Sciences)으로 제거하여 정제된 성숙한 NGF-Fc 융합 단백질에 도달했다. 성숙한 mNGF118 대조군은 먼저 HiTrap^TM 부틸 HP 컬럼(GE Healthcare)으로 정제한 다음 Superdex 200 겔 여과 컬럼(GE Life Sciences)으로 정제했다. 이들 단백질의 순도는 SDS-PAGE로 확인하였으며, 90% 이상이었다.

실시예 2: 성숙 NGF-Fc 융합 단백질의 열 안정성 연구

형광 단백질 분석기 UNcle(Unchained Labs)을 사용하여 시료의 용해 온도(Tm) 및 개시 응집 온도(Tagg)를 각각 계산하기 위해 시료 가열 중 266 nm/473 nm에서 형광 흡광도 및 광산란 변화를 측정했다. 초기온도는 20℃, 종료온도는 95℃, 가열속도는 0.3℃/min으로 설정했다. 측정을 위해 각 샘플을 3회 반복하였다. 결과는 표 2에 요약했다.

표 2. 성숙한 NGF-Fc 융합 단백질의 평균 용해 온도(Tm) 및 개시 응집 온도(Tagg)

구성 (성숙 NGF-Fc)	성숙 β-NGF 모이어티	링커	Fc 모이어티	Tm	Tagg
FD-G4Fc (성숙 서열번호: 55)	wt β-NGF 118aa (서열번호: 3)	GSGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호: 71)	변형된 IgG4 Fc-FD (서열번호: 19)	62.4°C	65°C
WM-G24Fc(성숙 서열번호: 56)	wt β-NGF 118aa (서열번호: 3)	KTGGGSGGGS (서열번호: 72)	변형된 IgG2/4 Fc (서열번호: 20)	62°C	63.7°C
NGF-1-15M7(rhNGF-Fc1) (성숙 서열번호: 57)	wt β-NGF 120aa (서열번호: 4)	/	IgG1 M7 (서열번호: 15)	63.4°C	71.4°C
NGF-L3Fc10M7-5(rhNGF-Li-Fc1) (성숙 서열번호: 58)	wt β-NGF 120aa (서열번호: 4)	(G4S)₃ (서열번호: 68)	IgG1 M7-5 (N' minus 5aa) (서열번호: 16)	63.7°C	76.6°C
2-1-15M7(rhNGF-(F12E)-Fc1) (성숙 서열번호: 59)	돌연변이 β-NGF 120aa (서열번호: 2)	/	IgG1 M7 (서열번호: 15)	63.3°C	70°C
NGF-4-12PAA(rhNGF-Fc4) (성숙 서열번호: 60)	wt β-NGF 120aa (서열번호: 4)	/	변형된 IgG4 Fc (서열번호: 18)	61.3°C	62.5°C
2-118-L3Fc10-M1-5(성숙 서열번호: 61)	돌연변이 β-NGF 118aa (서열번호: 1)	(G4S)₃ (서열번호: 68)	IgG1 M1-5 (N' minus 5aa) (서열번호: 10)	55.6°C	54.7°C
2-118-L3Fc10-M3-5(성숙 서열번호: 62)	돌연변이 β-NGF 118aa (서열번호: 1)	(G4S)₃ (서열번호: 68)	IgG1 M3-5 (N' minus 5aa) (서열번호: 12)	63.3°C	77°C
NGF-118-L3Fc10-M3-5(성숙 서열번호: 63)	wt β-NGF 118aa (서열번호: 3)	(G4S)₃ (서열번호: 68)	IgG1 M3-5 (N' minus 5aa) (서열번호: 12)	62.4°C	76.2°C
2-L3Fc10-M3-5(성숙 서열번호: 64)	돌연변이 β-NGF 120aa (서열번호: 2)	(G4S)₃ (서열번호: 68)	IgG1 M3-5 (N' minus 5aa) (서열번호: 12)	62.7°C	75.6°C
2-118-L3Fc10-M5-5(성숙 서열번호: 65)	돌연변이 β-NGF 118aa (서열번호: 1)	(G4S)₃ (서열번호: 68)	IgG1 M5-5 (N' minus 5aa) (서열번호: 14)	60.4°C	77.9°C
2-118-L3Fc10M7-5(성숙 서열번호: 66)	돌연변이 β-NGF 118aa (서열번호: 1)	(G4S)₃ (서열번호: 68)	IgG1 M7-5 (N' minus 5aa) (서열번호: 16)	64°C	76°C
2-118-L3G4-BM(성숙 서열번호: 67)	돌연변이 β-NGF 118aa (서열번호: 1)	GGGGGGSGGGGSGGGGSA (서열번호: 69)	변형된 IgG4 Fc (서열번호: 18)	64.7°C	66.5°C

용해 온도(Tm)

표 2에서 보는 바와 같이, 2-118-L3G4-BM은 IgG4 유래 Fc 단편(FD-G4Fc, WM-G24Fc, NGF-4-12PAA 및 2-118-L3G4-BM)을 포함하는 모든 성숙 NGF-Fc 융합 단백질 중에서, 또는 심지어 테스트된 모든 성숙 NGF-Fc 융합 단백질 중에서, 가장 높은 용해 온도(Tm), 즉 가장 우수한 열 안정성을 나타내었다.

IgG1-유래 Fc 단편을 포함하는 모든 성숙 NGF-Fc 융합 단백질 중에서, 2-118-L3Fc10-M1-5는 더 낮은 Tm(즉, 더 낮은 열 안정성)을 나타내는 반면, 다른 것들은 유사한 Tm을 나타냈다.

개시 응집 온도 (Tagg)

표 2에서 알 수 있는 바와 같이, IgG1 유래 Fc 단편을 포함하는 성숙한 NGF-Fc 융합 단백질(2-118-L3Fc10-M1-5 제외)은 IgG4 유래 Fc 단편을 포함하는 성숙 NGF-Fc 융합 단백질에 비해 더 높은 Tagg를 나타내었다. 이는 IgG1 유래 Fc 단편을 포함하는 성숙한 NGF-Fc 융합 단백질이 가열 과정에서 응집되는 경향이 적다는 것을 나타낸다.

IgG4 유래 Fc 단편을 포함하는 모든 성숙한 NGF-Fc 융합 단백질 중에서 2-118-L3G4-BM이 가장 높은 Tagg를 나타내어 다른 IgG4 유래 Fc 융합 구성에 비해 가열 과정에서 우수한 항응집 성능을 보였다.

IgG1 유래 Fc 단편을 포함하는 모든 성숙한 NGF-Fc 융합 단백질 중에서 2-118-L3Fc10-M1-5가 가장 낮은 Tagg(가열 과정에서 최악의 항응집 성능)를 나타내었고, NGF-1-15M7 및 2-1-15M7이 상대적으로 낮은 Tagg를 나타냈으며, 나머지 IgG1 유래 Fc 융합 구성은 높고 유사한 Tagg를 나타냈다.

실시예 3: 성숙 NGF-Fc 융합 단백질의 가속 안정성 시험

성숙한 NGF-Fc 융합 단백질을 PBS로 최종 농도 2mg/ml로 희석하고 40°C에서 배양했다. 배양 기간 동안 0일(그림에서 "0h"), 3일, 7일, 9일 및 14일에 샘플을 채취한 후 -80°C에서 보관했다. 샘플의 분해 및 응집은 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및 모세관 전기영동-소듐 도데실 설페이트(CE-SDS)에 의해 검출되었다.

크기 배제 크로마토그래피(SEC) 검출 방법

SEC는 컬럼에 채워진 수지를 통과할 때 크기 차이로 분자를 분리한다. 단백질 샘플을 4℃에서 5분 동안 10,000g에서 원심분리했다. 펠릿을 PBS로 재현탁시켰다. 80-100μL 샘플을 Waters® ACQUITY UPLC® H-Class Bio Tunable UV(TUV) 검출기에서 검출하기 위해 384웰 플레이트로 옮겼으며, 주입 부피는 20μL, 파장은 280nm, 유속은 0.25mL/분, 그리고 총 러닝타임 17분이었다. 이동상 완충액은 100mM PB(80mM Na₂HPO₄, 20 mM NaH₂PO₄), 300 mM NaCl, 10% 아세토니트릴, pH 7.2를 함유한다.

표 3 및 도 3A-3D에 나타낸 바와 같이, IgG4 유래 Fc 단편을 포함하는 모든 성숙 NGF-Fc 융합 단백질 중, 2-118-L3G4-BM 및 FD-G4Fc는 응집체 증가 및 단편 생성 측면에서 WM-G24Fc 및 NGF-4-12PAA보다 우수한 안정성을 나타냈다. NGF-4-12PAA는 매우 명백한 단편화를 보였고 단편화 비율은 49.59%에 도달한 반면(도 3A), 2-118-L3G4-BM 및 FD-G4Fc의 단편화 비율은 가속 스트레스 동안 2.1% 미만이었다. WM-G24Fc는 유의한 응집체 증가(응집체 백분율이 49.15%에 도달)뿐만 아니라 가속 스트레스 동안 명백한 단편화도 나타냈다(도 3C). 2-118-L3G4-BM 및 FD-G4Fc의 단량체 백분율은 85% 이상인 반면, WM-G24Fc 및 NGF-4-12PAA의 단량체 백분율은 시간이 지남에 따라 분명히 감소했다. 2-118-L3G4-BM과 비교하여, FD-G4Fc는 가속 스트레스 동안 더 많은 응집체 형성 및 단편화를 나타냈으며, 이는 2-118-L3G4-BM이 FD-G4Fc에 비해 더 나은 단편화 방지 및 응집 방지 활성을 가짐을 시사한다.

표 3 및 도 3E-3M에 나타낸 바와 같이, IgG1 유래 Fc 단편을 포함하는 모든 성숙 NGF-Fc 융합 단백질 중 2-118-L3Fc10-M3-5, 2-118-L3Fc10-M5-5, 2-118-L3Fc10M7-5 및 NGF-118-L3Fc10-M3-5는 다른 IgG1 유래 Fc 융합 단백질보다 가속 스트레스 하에서 유의하게 우수한 안정성을 나타내었으며, 검출 가능한 단편 형성이 없고(0%) 응집체 증가가 훨씬 적었다. 2-118-L3Fc10-M1-5는 또한 NGF-1-15M7, NGF-L3Fc10M7-5 및 2-1-15M7과 같은 IgG1 유래 Fc 융합 단백질과 비슷하거나 더 나은 안정성을 보였다.

표 3. 40℃ 가속 안정성 시험 하에서 성숙 NGF-Fc 융합 단백질의 다양한 성분 % 및 응집체 증가 %의 SEC 측정(14일째 샘플)

구성 (성숙 NGF-Fc)	성숙 β-NGF 모이어티	링커	Fc 모이어티	응집체%	단편%	주요피크%	응집체 증가%
FD-G4Fc	wt β-NGF 118aa	GSGGGSGGGGSGGGGSGGGGS	변형된 IgG4 Fc-FD	11.86	2.1	86.05	4.38
WM-G24Fc	wt β-NGF 118aa	KTGGGSGGGS	변형된 IgG2/4 Fc	49.15	16.48	34.36	45.6
NGF-1-15M7(rhNGF-Fc1)	wt β-NGF 120aa	/	IgG1 M7	12.34	5.71	81.94	12.12
NGF-L3Fc10M7-5(rhNGF-Li-Fc1)	wt β-NGF 120aa	(G4S)₃	IgG1 M7-5 (N' minus 5aa)	9.61	7.02	83.38	7.74
2-1-15M7(rhNGF-(F12E)-Fc1)	돌연변이 β-NGF 120aa	/	IgG1 M7	18.2	10.47	71.33	16.39
NGF-4-12PAA(rhNGF-Fc4)	wt β-NGF 120aa	/	modified IgG4 Fc	9.45	49.59	40.96	7.07
2-118-L3Fc10-M1-5	돌연변이 β-NGF 118aa	(G4S)₃	IgG1 M1-5 (N' minus 5aa)	11.38	4.43	84.19	9.51
2-118-L3Fc10-M3-5	돌연변이 β-NGF 118aa	(G4S)₃	IgG1 M3-5 (N' minus 5aa)	7.18	0	92.81	5.68
NGF-118-L3Fc10-M3-5	wt β-NGF 118aa	(G4S)₃	IgG1 M3-5 (N' minus 5aa)	5.31	0	94.68	4.12
2-L3Fc10-M3-5	돌연변이 β-NGF 120aa	(G4S)₃	IgG1 M3-5 (N' minus 5aa)	13.23	6.23	80.54	12.01
2-118-L3Fc10-M5-5	돌연변이 β-NGF 118aa	(G4S)₃	IgG1 M5-5 (N' minus 5aa)	6.29	0	93.71	4.14
2-118-L3Fc10M7-5	돌연변이 β-NGF 118aa	(G4S)₃	IgG1 M7-5 (N' minus 5aa)	5.04	0	94.96	4.2
2-118-L3G4-BM	돌연변이 β-NGF 118aa	GGGGGGSGGGGSGGGGSA	변형된 IgG4 Fc	10.32	1.39	88.29	9.24

모세관 전기영동-Sodium Dodecyl Sulfate (CE-SDS) 검출 방법

모세관 전기영동에서 샘플은 분자의 전하와 크기에 따라 달라지는 전기영동 이동성에 따라 모세관에서 분리된다. 먼저 40μL 1x 샘플 완충액 및 10μL 단백질 시료를 원심분리기 튜브에서 혼합하여 0.4μg/μL 단백질의 최종 농도를 포함하는 50μL 혼합물을 얻었다. 1μL 재구성된 25X 내부 표준(Internal Standard)을 혼합물에 첨가한 다음, 2.5μL 250mM 요오드아세트아미드를 첨가했다. 전체 혼합물을 볼텍싱하고 70°C에서 10분 동안 배양한 다음 식히고 잘 혼합하고 원심분리했다. 처리된 시료의 상등액 50 μL를 96-웰 플레이트로 옮겼다. 96웰 플레이트를 1,000g에서 10분 동안 원심분리한 다음 표준 프로토콜에 따라 CE-SDS 검출을 위해 Maurice 시스템(ProteinSimple)에 위치시켰다.

표 4 및 도 4A-4D에 나타낸 바와 같이, IgG4-유래 Fc 단편을 포함하는 모든 성숙 NGF-Fc 융합 단백질 중에서 가속 스트레스 동안 NGF-4-12PAA 및 WM-G24Fc가 매우 명백한 단편화를 나타냈고; 2-118-L3G4-BM은 가장 낮은 단편화를 보였다. 이는 SEC 결과와 일치한다. FD-G4Fc의 경우 주요 피크의 우측에 응집 피크가 나타났으나(도 4B), 2-118-L3G4-BM에서는 나타나지 않았다(도 4D). 결론적으로 2-118-L3G4-BM은 다른 IgG4 유래 Fc 융합 단백질에 비해 가속 스트레스 동안 훨씬 더 나은 안정성을 가지며 이는 SEC 결과와 일치한다.

표 4 및 도 4E-4M에서 알 수 있는 바와 같이, IgG1 유래 Fc 단편을 포함하는 모든 성숙한 NGF-Fc 융합 단백질 중에서 2-118-L3Fc10M7-5, NGF-118-L3Fc10-M3-5 및 2-118-L3Fc10-M3-5가 가속 스트레스 동안 가장 우수한 안정성을 가졌으며, 명백한 단편 피크가 나타나지 않고(도 4I, 4J 및 4M 참조), 14일째 시료의 단편 증분(increment)은 0%였다. 2-118-L3Fc10-M5-5는 또한 훨씬 더 적은 단편 증분(14일째에 5.8%)으로 우수한 안정성을 가졌다. 대조적으로, IgG1-유래 Fc 단편을 포함하는 다른 NGF-Fc 융합 단백질(예를 들어, NGF-L3Fc10M7-5)은 단편 형성 경향이 더 컸다.

표 4. 40℃ 가속 안정성 시험 하에서 성숙한 NGF-Fc 융합 단백질의 단편 % 및 단편 증분 %의 CE-SDS 측정(14일째 시료)

구성 (성숙 NGF-Fc)	성숙 β-NGF 모이어티	링커	Fc 모이어티	단편%	단편 증가%
FD-G4Fc	wt β-NGF 118aa	GSGGGSGGGGSGGGGSGGGGS	변형된 IgG4 Fc-FD	17.9	14.4
WM-G24Fc	wt β-NGF 118aa	KTGGGSGGGS	변형된 IgG2/4 Fc	91.6	67.8
NGF-1-15M7(rhNGF-Fc1)	wt β-NGF 120aa	/	IgG1 M7	15.8	8.6
NGF-L3Fc10M7-5(rhNGF-Li-Fc1)	wt β-NGF 120aa	(G4S)₃	IgG1 M7-5 (N' minus 5aa)	47	31
2-1-15M7(rhNGF-(F12E)-Fc1)	돌연변이 β-NGF 120aa	/	IgG1 M7	27	22.6
NGF-4-12PAA(rhNGF-Fc4)	wt β-NGF 120aa	/	변형된 IgG4 Fc	91.4	65.4
2-118-L3Fc10-M1-5	돌연변이 β-NGF 118aa	(G4S)₃	IgG1 M1-5 (N' minus 5aa)	16.7	11.9
2-118-L3Fc10-M3-5	돌연변이 β-NGF 118aa	(G4S)₃	IgG1 M3-5 (N' minus 5aa)	0	0
NGF-118-L3Fc10-M3-5	wt β-NGF 118aa	(G4S)₃	IgG1 M3-5 (N' minus 5aa)	0	0
2-L3Fc10-M3-5	돌연변이 β-NGF 120aa	(G4S)₃	IgG1 M3-5 (N' minus 5aa)	27.4	27.4
2-118-L3Fc10-M5-5	돌연변이 β-NGF 118aa	(G4S)₃	IgG1 M5-5 (N' minus 5aa)	5.8	5.8
2-118-L3Fc10M7-5	돌연변이 β-NGF 118aa	(G4S)₃	IgG1 M7-5 (N' minus 5aa)	0	0
2-118-L3G4-BM	돌연변이 β-NGF 118aa	GGGGGGSGGGGSGGGGSA	변형된 IgG4 Fc	11.4	10

요약하면, SEC 및 CE-SDS 결과에 기초하여: 1) IgG4-유래 Fc 단편을 포함하는 모든 성숙한 NGF-Fc 융합 단백질 중에서, 2-118-L3G4-BM이 FD-G4Fc보다 우수한 가속 안정성을 나타내었고, WM-G24Fc 및 NGF-4-12PAA보다 유의하게 우수한 가속 안정성을 보였으며; 2) IgG1 유래 Fc 단편을 포함하는 모든 성숙한 NGF-Fc 융합 단백질 중에서 2-118-L3Fc10-M3-5, NGF-118-L3Fc10-M3-5, 2-118-L3Fc10M7-5가 가장 우수한 가속 안정성을 보였고, 그 다음 다른 모든 구성에 비해 2-118-L3Fc10-M5-5였으며; 및 3) 상대적으로 말하면, IgG1 유래 Fc 단편을 포함하는 성숙한 NGF-Fc 융합 단백질은 IgG4 유래 Fc 단편을 포함하는 것에 비해 가속 스트레스 동안 더 우수한 항응집 특성을 나타냈다.

실시예 4: NGF-Fc 융합 단백질의 생체활성 추정을 위한 TF-1 세포 증식 분석

TF-1 세포 증식 분석을 사용하여 다양한 NGF-Fc 융합 단백질의 생체활성을 테스트했다.

TF-1 세포는 인자 의존적 인간 적백혈병 세포주이다. TF-1 세포를 기본 배양 배지(RPMI 1640 배지 + 10% FBS)에 재현탁하여 나중에 사용하기 위해 5.0x10⁴개 세포/mL를 함유하는 현탁액에 도달했다. SuTaiSheng® 마우스 NGF(표준 대조군), 다양한 NGF-Fc 융합 단백질의 시험 용액 및 mNGF118(돌연변이 β-NGF 118aa) 및 rhNGF(재조합 인간 야생형 β-NGF 120aa, 서열번호: 4, 실시예 1에 기술된 것처럼 제조 및 정제됨)의 대조군 용액을 위한 표준 용액을 제조하였으며, 미리 표지된 96웰 플레이트에 최종 단백질이 200U/mL Х 100μL/웰이 되도록 제조하였다. 그 다음, 5.0Х10⁴ 세포/mL TF-1 세포 현탁액 100 μL를 표준 대조군(SuTaiSheng® 마우스 NGF), 시험 NGF-Fc 융합 단백질 또는 대조군 용액을 함유하는 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가한 다음, 37°C, 5% CO₂ 하에서 습한 인큐베이터에서 72시간 동안 배양했다. CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega, Cat#G3581)의 분석 용액 20μL를 세포 현탁액의 각 웰에 첨가한 다음 37°C, 5% CO₂에서 3시간 동안 배양했다. 그런 다음 플레이트를 분광광도계에서 490nm 및 650nm에서 흡광도에 대해 측정했다. 데이터를 기록하고 표준 NGF 대조군(SuTaiSheng® 마우스 NGF)으로 정규화했다.

도 5A에서 알 수 있는 바와 같이 2-118-L3Fc10-M3-5는 IgG1 유래 Fc 단편을 포함하는 모든 성숙한 NGF-Fc 융합 단백질 중에서(또는 심지어 rhNGF, mNGF118 및 SuTaiSheng® 마우스 NGF를 포함하는 모든 NGF 구성 중에서) TF-1 세포 증식 촉진에 있어서 가장 높은 생체 활성을 나타냈으며; 가속 안정성 분석 하에서 2-118-L3Fc10-M3-5는 또한 3개의 가장 안정한 구성(2-118-L3Fc10-M3-5, NGF-118-L3Fc10-M3-5 및 2-118-L3Fc10M7-5) 중에서 가장 높은 생체 활성을 가졌다(실시예 3 참조). 도 5B에서 알 수 있는 바와 같이, IgG4-유래 Fc 단편을 포함하는 모든 성숙한 NGF-Fc 융합 단백질은 TF-1 세포 증식을 촉진하는 생체활성을 나타냈고, 2-118-L3G4-BM은 표준 대조군 SuTaiSheng® 마우스 NGF에 상당하는 생체활성을 나타냈다.

실시예 5: 랫트(rat)에서 다양한 NGF-Fc 융ㅎ압 단백질에 대한 인비보 생체활성 분석

상경부 신경절(SCG)은 약 30,000개의 뉴런으로 구성된 조직으로, 특히 출생 전 및 출생 후 발달 중에 NGF에 가장 민감한 조직 중 하나이다. TF-1 세포 증식 분석(실시예 4 참조)에서, IgG1- 또는 IgG4-유래 Fc 단편을 포함하는 특정 NGF-Fc 융합 단백질은 뛰어난 생체활성을 나타냈다. 다양한 NGF-Fc 융합 단백질을 랫트 SCG에 주입하고, 인비보에서 SCG 성장을 촉진하는 NGF-Fc 융합 단백질의 활성을 평가하기 위해 주입 후 여러 시점에서 SCG 크기를 측정했다.

신생 Sprague Dawley(SD) 랫트의 목에 다양한 NGF-Fc 융합 단백질 또는 NGF 대조군(SuTaiSheng® 마우스 NGF 또는 돌연변이 NGF118)을 피하 투여한 후, SCG 해부를 위해 희생시켰다. PBS 주입은 음성 대조군으로 사용되었다. 도 6A에 나타난 바와 같이, NGF 대조군 단백질(SuTaiSheng® 마우스 NGF 또는 돌연변이 NGF118) 또는 PBS를 0일, 1일, 2일 및 3일에 하루에 한 번 주사한 다음, SCG를 4일에 얻었다. 2-118-L3Fc10-M3-5 또는 2-118-L3G4-BM을 0일에 동일한 용량으로 단일 주사로 주사한 다음, 4일에 SCG를 얻었다. 간략히 설명하면, 단두(decapitation) 후 랫트의 머리를 수술대에 고정하고, 면봉으로 혈액을 빼낸 후, 먼저 기관과 대후공을 위치시킨 다음, 기관의 비스듬히 뒤쪽에 있는 경동맥초 조직을 찾아 마이크로 핀셋으로 제거하고, PBS가 들어있는 페트리 접시에 넣고 해부 현미경으로 SCG를 분리했다. 분리된 SCG 표면의 과량의 액체를 종이 티슈로 제거한 후 SCG를 깨끗한 접시 위에 놓고 무게를 측정하였다. SCG의 형태는 도 6B에 설명되어 있다. 기록된 데이터는 Student t 테스트로 분석하였다. **는 PBS 처리군과 비교하여 통계적으로 유의함을 나타낸다; n.s. PBS 처리 그룹과 비교하여 "유의성 없음"을 나타낸다. 도 6C에서 알 수 있는 바와 같이, 2nM의 투여 용량에서, 돌연변이 β-NGF 118aa(mNGF118), SuTaiSheng® 마우스 NGF 및 2-118-L3Fc10-M3-5는 PBS 음성 대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 SCG 성장을 촉진하지 않았다. 반면 2-118-L3G4-BM은 PBS 대조군과 비교하여 SCG 성장을 유의하게 촉진했다(**p<0.01). 5nM 투여량에서 NGF 대조군(SuTaiSheng® 마우스 NGF 또는 mNGF118) 또는 NGF-Fc 융합 단백질(2-118-L3G4-BM 또는 2-118-L3Fc10-M3-5)은 PBS 처리군과 비교하여 인비보에서 SCG 성장을 유의하게 촉진했으며(**p<0.01), SCG 성장 촉진 활성은 시험된 4개의 NGF 단백질 간에 유의한 차이가 없었다(n.s.는 p>0.05를 나타냄)(도 6D). 따라서 2-118-L3G4-BM의 단일 피하 주사는 SuTaiSheng® 마우스 NGF 또는 돌연변이 β-NGF 118aa(mNGF118)에 비해 2nM의 용량에서도 인비보에서 SCG 성장을 촉진하는 데 우수한 활성을 입증했다. 더 높은 투여량(5nM)에서, 2-118-L3G4-BM 또는 2-118-L3Fc10-M3-5의 단일 처리는 SCG 성장 촉진에서 유사한 활성을 입증했다.

실시예 6: 랫트에서 다양한 NGF 폴리펩타이드의 약동학(PK) 연구

성체 랫트에 주사함으로써 다양한 NGF 구성의 PK 프로필을 테스트했다.

24마리의 수컷 SD 랫트(생후 6-8주, 랫트당 약 250g-300g)를 무작위로 3개 그룹(각 그룹당 8마리)으로 나누고, 각각 2-118-L3Fc10-M3-5, 2-118-L3G4-BM 또는 mNGF118(Fc 융합이 없는 돌연변이 β-NGF 118aa)의 235 μg/kg을 근육내 주사했다. 주사 전(0시간) 또는 주사 후 1시간, 4시간, 8시간, 24시간, 48시간, 72시간, 120시간, 168시간, 216시간 및 288시간에 후안와 정맥에서 150μL의 혈액을 채취했다. 혈액 수집 후 혈장을 분리한 다음 Human NGF Matched ELISA Antibody Pair Set(Sino Biological, SEK11050)로 NGF 함량 테스트에 사용했다. 450nm-630nm 미만 표준의 평균 OD는 Y축에 대해 플롯되었고 표준의 농도는 X축에 대해 플롯되어 R²>0.98의 요구 사항과 함께 표준 곡선 선형 방정식을 생성했다. 그런 다음 표준 곡선 선형 방정식을 기반으로 다양한 샘플의 혈장 농도를 계산했다. GraphPad Prism 5.0을 사용하여 샘플 농도 대 시간의 세미-로그 플롯을 만들고, Phoenix WinNonlin 6.2를 PK 분석에 사용했으며, GraphPad Prism 5.0을 사용하여 반감기 산점도를 플롯했다.

도 7A에서 알 수 있는 바와 같이, NGF-Fc 융합 단백질은 Fc 융합이 없는 mNGF118 대조군과 비교하여 단일 근육내 주사 후 시간 경과에 따라 훨씬 더 높은 혈장 농도를 나타냈고; 2-118-L3G4-BM은 2-118-L3Fc10-M3-5와 비교하여 단일 근육 주사 후 시간 경과에 따라 유사한 혈장 농도를 나타냈다. 도 7B에서 알 수 있는 바와 같이, 2-118-L3G4-BM의 반감기(55시간)는 2-118-L3Fc10-M3-5의 반감기(55시간)와 거의 같았고, 둘 다 Fc 융합이 없는 mNGF118 대조군(반감기 1.75시간)보다 훨씬 길었다(약 31배). 이러한 결과는 2-118-L3G4-BM 또는 2-118-L3Fc10-M3-5의 단일 용량이 비-Fc 융합 NGF 대조군(SuTaiSheng 마우스 NGF 또는 mNGF118)의 연속 주입에 비해 인비보 SGC 성장을 촉진하는데 유사한 활성을 나타내는 이유를 추가로 설명한다(도 6D 참조).

wtNGF120(즉, "rhNGF", 인간 야생형 β-NGF 120aa, 서열번호: 4), NGF-1-15M7(rhNGF-Fc1), NGF-L3Fc10M7-5(rhNGF-Li-Fc1), 2-1-15M7(rhNGF-(F12E)-Fc1) 및 NGF-4-12PAA(rhNGF-Fc4)의 반감기는 WO2017157325의 표 2에 기재되어 있고 표 5에 요약되어 있다. 본 실험에서 테스트된 mNGF118의 반감기(1.75시간)는 WO2017157325에서 테스트된 wtNGF120의 반감기(1.8시간)와 유사하였다. 표 5에서 알 수 있는 바와 같이, Fc 융합이 없는 wtNGF120 또는 mNGF118 대조군과 비교하여, NGF-1-15M7 (rhNGF-Fc1), NGF-L3Fc10M7-5 (rhNGF-Li-Fc1), 및 2-1-15M7 (rhNGF-(F12E)-Fc1) 구성은 인비보에서 반감기를 17배 이상 연장시켰으며; 또한 NGF-4-12PAA(rhNGF-Fc4)보다 약 1.4배 더 길다. 여기에서 테스트된 2-118-L3G4-BM의 반감기(55시간)는 2-118-L3Fc10-M3-5의 반감기(55시간)와 거의 동일했으며, Fc 융합이 없는 모두 wtNGF120 또는 mNGF118 대조군에 비해 약 31배 더 높았으며, 또한 IgG1 또는 IgG4 유래 Fc 단편이 있는 이전에 테스트된 모든 성숙한 NGF-Fc 융합 단백질보다 훨씬 더 길다.

표 5. 성숙한 NGF 폴리펩타이드의 반감기

구성	성숙 β-NGF 모이어티	링커	Fc 모이어티	반감기 (t1/2, hrs)
wtNGF120 (rhNGF)	wt β-NGF 120aa	/	/	1.8
NGF-1-15M7(rhNGF-Fc1)	wt β-NGF 120aa	/	IgG1 M7	38.75
NGF-L3Fc10M7-5(rhNGF-Li-Fc1)	wt β-NGF 120aa	(G4S)₃	IgG1 M7-5 (N' minus 5aa)	33.83
2-1-15M7(rhNGF-(F12E)-Fc1)	돌연변이 β-NGF 120aa	/	IgG1 M7	32.24
NGF-4-12PAA(rhNGF-Fc4)	wt β-NGF 120aa	/	변형된 IgG4 Fc	23.1
mNGF118	돌연변이 β-NGF 118aa	/	/	1.75
2-118-L3Fc10-M3-5	돌연변이 β-NGF 118aa	(G4S)₃	IgG1 M3-5 (N' minus 5aa)	55
2-118-L3G4-BM	돌연변이 β-NGF 118aa	GGGGGGSGGGGSGGGGSA	변형된 IgG4 Fc	55

실시예 7: NGF-Fc 융합 단백질은 당뇨병성 신경병증의 상처 치유를 촉진한다

당뇨병성 신경병증은 당뇨병의 흔한 만성 합병증 중 하나로 상처 치유가 느리고 감염 정도가 다르며 궤양, 탄저병, 절단(amputation) 위험이 있는 환자가 특징이다. 이 실시예는 당뇨병성 신경병증 동물 모델에서 NGF-Fc 융합 단백질의 치료 효과 연구를 예시한다(예를 들어, 상처 치유 평가를 통해).

CD-1 마우스는 Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.에서 구입했다. 표준 방법으로 당뇨병 동물 모델을 확립했다(예를 들어 G. Graiani et al., "Nerve growth factor promotes reparative angiogenesis and inhibits endothelial apoptosis in cutaneous wounds of Type 1 diabetic mice." Diabetologia. 2004, 47(6):1047-54 참조). 당뇨병 유발 4주 후, 마우스를 마취시키고, 일회용 피부 펀치 장비로 견갑골 사이 부위에 직경 4mm의 전층(full-thickness) 피부 상처 2개를 나란히 생성하였다. 50μg/mL SuTaiSheng^® 마우스 NGF, mNGF118 또는 NGF-Fc 융합 단백질(2-118-L3Fc10-M3-5 또는 2-118-L3G4-BM)을 오른쪽 상처에 20μL/투여 용량으로 투여했다. 동일한 부피의 PBS를 왼쪽 상처에 투여하였다(음성 대조군으로 사용). PBS, SuTaiSheng^® 마우스 NGF 또는 mNGF118을 0일(마우스 등을 뚫은 후), 1, 2 및 3일에 하루에 한 번 투여했다. 동일한 용량의 2-118-L3Fc10-M3-5 또는 2-118-L3G4-BM을 단일 투여로 0일(드릴링 후)에 투여하였다. 드릴링 직후 상처 부위를 측정하여 0일째 상처 부위로 기록하였다. 4일 및 7일째 상처 부위를 측정하여 상처 봉합률을 계산하였다. 기록된 데이터는 Student t test로 분석하였다. 히스토그램은 GraphPad Prism 8.0.1로 그렸다.

도 8에 도시된 바와 같이, 모든 그룹에 대해 4일차에 비해 7일차 폐쇄가 개선되었으며; SuTaiSheng^® 마우스 NGF, mNGF118 및 NGF-Fc 융합 단백질(2-118-L3Fc10-M3-5 또는 2-118-L3G4-BM)은 모두 PBS 음성 대조군과 비교할 때 당뇨병성 상처 치유를 유의하게 촉진했다(p<0.01). 구체적으로, 4일차에 PBS 처리군의 평균 상처 부위는 SuTaiSheng^® 마우스 NGF, mNGF118 또는 NGF-Fc 융합 단백질 처리군보다 약 1.3배 더 컸다. 이러한 결과는 SuTaiSheng^® 마우스 NGF, mNGF118 또는 NGF-Fc 융합 단백질이 당뇨병 마우스의 느린 상처 치유 결함을 효과적으로 개선할 수 있음을 보여준다. 또한, 7일째에 NGF-Fc 융합 단백질을 투여한 당뇨병 마우스의 상처 봉합률은 SuTaiSheng^® 마우스 NGF 및 mNGF118 처리군보다 더 높았다. 이는 NGF(예: SuTaiSheng^® 마우스 NGF 또는 mNGF118)보다 NGF-Fc 융합 단백질의 우수한 인비보 치료 효과를 입증했다.

실시예 8: 알츠하이머병에 대한 NGF-Fc 융합 단백질의 치료 효과

알츠하이머병(Alzheimer's Disease, AD)은 진행성 기억 상실을 주요 임상 증상으로 하는 중추신경계의 퇴행성 질환으로, 주로 복잡한 병인을 가진 노인에게서 발생한다. 이 실시예는 인비보에서 AD에 대한 NGF-Fc 융합 단백질의 치료 효과 연구를 설명한다(예를 들어, 동물 행동 변화의 평가를 통해).

위스타(Wistar) 랫트를 사용하여 표준 방법으로 AD의 동물 모델을 확립했다(예를 들어 G.L. Wenk et al. "Basal forebrain neurons and memory: a biochemical, histological and behavioural study of differential vulnerability to ibotenate and quisqualate." Behav Neurosci, 1992, 106(6): 909-923 참조). 간략하게, 위스타 랫트는 이보텐산(IBO)의 정위 주사를 받았다. IBO 투여 2일 후, 마취된 AD 모델 랫트를 등으로 눕혔다. 150μg/mL NGF(SuTaiSheng^® 마우스 NGF 또는 mNGF118) 또는 NGF-Fc 융합 단백질(2-118-L3Fc10-M3-5 또는 2-118-L3G4-BM)을 총 투여량 100μL/투여로 비강내 투여했다. 같은 부피의 PBS를 투여한 AD 모델 쥐는 음성 대조군으로 사용되었다. NGF 또는 PBS는 7일 동안 1일 1회 지속적으로 투여하였다. NGF-Fc 융합 단백질은 단일 투여로 1일째에 투여되었다. 랫트의 행동 변화는 7일째 모리스 수중 미로(Morris water maze, MWM)에 의해 평가되었다. 간단히 말해, 모리스 수중 미로 장치를 사용하여 실험 전에 랫트가 플랫폼을 오르도록 훈련했다. 플랫폼 탐색 시간(탈주 대기 시간; 물에 진입하여 플랫폼에 오르기까지), 및 플랫폼이 설치되었다가 120초 이내에 제거된 위치를 건너는 시간을 실험 중에 기록했다. 기록된 데이터는 Student t test로 분석하였다.

표 6에 나타낸 바와 같이, SuTaiSheng^® 마우스 NGF, mNGF118 또는 NGF-Fc 융합 단백질(2-118-L3Fc10-M3-5 또는 2-118-L3G4-BM)로 처리된 AD 모델 랫트의 플랫폼 탐색 시간은 유의하게 짧아졌으며(*p<0.05), 음성대조군에 비해 플랫폼 통과시간이 유의하게 증가했다(*p<0.05). 따라서, 본 명세서에 기술된 NGF 및 NGF-Fc 융합 단백질은 둘 다 AD 모델 랫트의 공간 인지, 기억 및 학습 능력을 효과적으로 향상시킬 수 있다. 또한, 2-118-L3Fc10-M3-5 또는 2-118-L3G4-BM으로 처리한 AD 모델 랫트는 NGF로 처리된 랫트(SuTaiSheng^® 마우스 NGF 또는 mNGF118)에 비해 플랫폼 탐색 시간아 짧으며 플롯폼을 건너는 빈도는 높은 것으로 보였다. 이러한 데이터는 AD에 대한 NGF-Fc 융합 단백질의 우수한 인비보 치료 효과를 입증한다.

실시예 9: 조기 난소부전에 대한 NGF-Fc 융합 단백질의 치료 효과

조기 난소 부전(POF)은 난소 기능 부전으로 인해 발생하는 40세 이전의 자연적인 무월경을 말하며, 이는 종종 에스트로겐 수준의 감소, 난포 형성 호르몬 수준의 증가, 성선 자극 호르몬 수준의 증가를 동반하며 복잡한 병인 및 메커니즘을 가지고 있다. 본 실시예는 인비트로 인간 난소 과립막-유사 종양 세포주(KGN) 증식 분석 및 KGN 에스트로겐 분비 분석을 통해 POF를 치료할 때뿐만 아니라 POF 모델 랫트에서 NGF-Fc 융합 단백질의 치료 효능을 입증한다.

KGN 증식 분석에서, 100 μl KGN 현탁액(1Х10⁴개 세포/mL)을 분석 하루 전에 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 실험 전에 무혈청 DMEM 배지를 교체했다. 배지 교환 후, SuTaiSheng^® 마우스 NGF, mNGF118 또는 NGF-Fc 융합 단백질(2-118-L3Fc10-M3-5 또는 2-118-L3G4-BM)을 최종 농도 10μg/mL로 실험군 웰에 첨가했다. 음성 대조군은 배지 교환 후 어떠한 처리도 하지 않았다. 각 그룹에는 4개의 복제본이 있다. 48시간 후 각 웰에 10μL Cell Counting Kit-8(DOJINDO, #CK04)을 첨가하여 생존 세포를 측정하였다. 1시간 배양 후 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 기록된 데이터는 Student t test로 분석하였다. 히스토그램은 GraphPad Prism 8.0.1로 그렸다.

도 9A에 도시된 바와 같이, NGF(SuTaiSheng^® 마우스 NGF 또는 mNGF118) 및 NGF-Fc 융합 단백질(2-118-L3Fc10-M3-5 또는 2-118-L3G4-BM) 모두 음성 대조군에 비해 KGN 증식을 유의하게 촉진했다(p<0.05). 상대적으로 NGF-Fc 융합 단백질(2-118-L3Fc10-M3-5 또는 2-118-L3G4-BM)을 처리한 KGN이 NGF를 처리한 KGN에 비해 약간 높은 증식률을 보였다.

KGN 에스트로겐 분비 분석에서, 세포(합류(confluence)는 약 80%임)를 1Х10⁵개 세포/웰 밀도로 24-웰 플레이트에 접종한 다음, 무혈청 배지를 교체하였다. 배지 교환 후 SuTaiSheng® 마우스 NGF, mNGF118 또는 NGF-Fc 융합 단백질(2-118-L3Fc10-M3-5 또는 2-118-L3G4-BM)을 최종 농도 10μg/mL로 실험군 웰에 첨가했다. 음성 대조군은 배지 교환 후 어떠한 처리도 하지 않았다. 각 그룹에는 4개의 복제본이 있다. 18시간 배양 후 세포를 2회 세척한 후 2.2Х10^-8 M 테스토스테론(Beijing Solarbio Life Science & Technology Co., Ltd, #IT0110)과 0.01 IU/ml 난포자극호르몬(National Health Physics Program, Ovine FSH)으로 24시간 동안 처리하였다. 상등액을 얻어 1.6배 희석하였다. R&D systems에서 제작한 에스트로겐 측정 키트(KGE014)를 이용하여 450nm에서 흡광도 값을 측정하고 분비된 에스트로겐 농도를 계산하였다. 기록된 데이터는 Student t test로 분석하였다. GraphPad Prism 8.0.1을 사용하여 히스토그램을 그렸다.

도 9B에 도시된 바와 같이, NGF(SuTaiSheng^® 마우스 NGF 또는 mNGF118) 및 NGF-Fc 융합 단백질(2-118-L3Fc10-M3-5 또는 2-118-L3G4-BM) 모두 음성 대조군에 비해 KGN의 에스트로겐 분비를 유의하게 촉진했다(p <0.05). 상대적으로 말하면, NGF-Fc 융합 단백질(2-118-L3Fc10-M3-5 또는 2-118-L3G4-BM)을 처리한 KGN은 NGF를 처리한 KGN에 비해 약간 높은 에스트로겐 분비를 보였다.

4-비닐사이클로헥센 디에폭사이드(VCD)는 암컷 랫트의 난소에 있는 원시 난포와 일차 난포를 선택적으로 파괴할 수 있지만, 이차 난포와 부비강 난포에는 영향을 미치지 않아 암컷 랫트의 POF를 유발한다. POF 치료에 있어 NGF-Fc 융합 단백질의 인비보 효능을 더 연구하기 위해, SD 랫트에 VCD를 2주 연속 복강 주사하여 POF 랫트 모델을 확립했다(예를 들어 F.S. Muhammad et al., "Effects of 4-vinylcyclohexene diepoxide on peripubertal and adult Sprague-Dawley rats:ovarian,clinical, and pathologic outcomes." Comp Med, 2009,59(1):46-59 참조). NGF 치료는 동물 모델 확립이 시작되었을 때 시작되었으며, Day 1로 표시되었다. NGF(SuTaiSheng^® 마우스 NGF 또는 mNGF118) 또는 NGF-Fc 융합 단백질(2-118-L3Fc10-M3-5 또는 2-118-L3G4-BM)을 10μg/kg bw/주사의 용량으로 실험군에 피하 투여했으며; 동일한 부피의 멸균 식염수를 음성 대조군에 투여하였다. SuTaiSheng^® 마우스 NGF, mNGF118 또는 멸균 식염수를 quaque die alterna(격일)로 투여했다. NGF-Fc 융합 단백질(2-118-L3Fc10-M3-5 또는 2-118-L3G4-BM)을 주 1회 투여하였다. 42일 후, 모든 랫트를 희생시키고, 난소 조직을 얻어 고정하고, 파라핀에 포매하고, 절개하고, H&E(헤마톡실린 및 에오신)로 염색하였다. 그런 다음 난포의 수를 세었다. 기록된 데이터는 Student t test로 분석하였다. GraphPad Prism 8.0.1을 사용하여 히스토그램을 그렸다.

도 9C에 도시된 바와 같이, SuTaiSheng^® 마우스 NGF, mNGF118 및 NGF-Fc 융합 단백질(2-118-L3Fc10-M3-5 또는 2-118-L3G4-BM)은 모두 음성대조군에 비해 일차 난포의 수를 유의하게 증가시켰으며(p<0.05), 이는 POF로 유발된 일차 난포 수의 감소를 역전시키는 데 이들의 탁월한 효과를 보여준다. SuTaiSheng^® 마우스 NGF, mNGF118 또는 NGF-Fc 융합 단백질(2-118-L3Fc10-M3-5 또는 2-118-L3G4-BM)로 처리한 POF 랫트 모델은 대조군에 비해 원시 난포와 이차 난포의 수가 더 많았다.

실시예 10: NGF-Fc 융합 단백질의 감약정자증(oligoasthenospermia)에 대한 치료 효과

감약정자증은 주로 정자 양 및/또는 정자 운동성의 감소를 특징으로 한다. 정자는 고환의 정세관에서 증식 능력을 가진 생식 세포로부터 일련의 분열 및 분화 과정을 통해 생성된다. 열 스트레스는 생식 세포의 분열, 분화 및 정자 형성에 영향을 줄 수 있다. 본 실시예는 정자 형성 장애의 마우스 모델에서 감약정자증(정자감소증(oligozoospermia) 및 정자무력증(asthenospermia))에 대한 NGF-Fc 융합 단백질의 치료 효과 연구를 설명한다.

C57BL/6JSHjh 마우스(Shanghai Jihui Experimental Animal Breeding Co., Ltd)를 실험에 사용하였다. 실험군의 경우 20 μg/kg bw/주사 NGF(SuTaiSheng^® 마우스 NGF 또는 mNGF118) 또는 60 μg/kg bw/주사 NGF-Fc 융합 단백질(2-118-L3Fc10-M3-5 또는 2-118-L3G4- BM)을 사타구니에 피하주사하였다. 정상대조군 또는 정자형성장애 모델 대조군은 동량의 0.9% 염화나트륨 주사액을 처리하였다. 처리 첫날(NGF, NGF-Fc 융합 단백질 또는 염화나트륨)을 Day 1로 표시했다. 열 스트레스에 의해 유발된 정자 형성 장애의 마우스 모델을 확립하기 위해, 처리된 마우스를 첫 주사 후 4시간 후에 마취시켰다. 마우스의 고환이 음낭으로 하강한 후, 정자형성장애 모델 대조군, NGF 실험군, NGF-Fc 융합단백질 실험군 마우스의 하복부(뒷다리, 꼬리, 음낭)를 42℃ 항온 수조에 30분 동안 담갔으며, 한편 정상대조군 생쥐의 하복부를 25℃ 항온 수조에 30분간 담갔다. SuTaiSheng^® 마우스 NGF 또는 mNGF118를 격일로 투여했다. 2-118-L3G4-BM 또는 2-118-L3Fc10-M3-5를 주당 2회 투여하였다. 정상대조군 또는 정자형성장애 모델대조군은 0.9% 염화나트륨주사를 격일로 투여하였다. 총 투여 기간은 5주였다. 모든 마우스는 37일째에 희생시켰다. 좌측 부고환 꼬리를 채취하여 무게를 잰 후 37℃로 예열된 M199 배양 배지에 넣고, 여러 조각으로 자른 후, 37℃에서 5분 동안 배양기에 넣었다. 정자 현탁액을 얻어 M199 배양 배지로 1:6의 비율로 희석하였다. 혼합 후 희석액을 얻어 정자의 수와 운동성을 TOXIVOS Sperm Analyzer로 기록하였다. 기록된 데이터는 Student t test로 분석하였다.

표 7에서 나타난 바와 같이, 정자형성장애 모델 대조군의 정자수와 운동성은 정상대조군에 비해 현저히 낮아, 동물모델이 성공적으로 확립되었음을 입증한다. NGF(SuTaiSheng^® 마우스 NGF 또는 mNGF118) 및 NGF-Fc 융합 단백질(2-118-L3G4-BM 또는 2-118-L3Fc10-M3-5) 실험군의 정자 수 및 운동성은 정자형성 장애 모델 대조군에 비해 유의하게 증가했다. 이러한 결과는 NGF(SuTaiSheng^® 마우스 NGF 또는 mNGF118) 또는 NGF-Fc 융합 단백질(2-118-L3G4-BM 또는 2-118-L3Fc10-M3-5)의 피하 주사가 정자감소증, 정자무력증, 감약정자증과 같은 정자형성장애에서 정자 수의 감소 및 약한 정자 운동성을 효과적으로 구제할 수 있음을 보여준다.

표 7. NGF 또는 NGF-Fc 융합 단백질을 처리한 정자 형성 장애 마우스 모델에서 정자 수 및 정자 운동성

그룹	정자의 수(Х10 ⁶ /g)	정자 운동성(%)
정상 대조군	4222.5±592.1	79.7±5.3
정자형성장애 모델 대조군	1905.3±747.2	59.5±11.3
SuTaiSheng^® 마우스 NGF	3201.6±1246.0	71.5±20.4
mNGF118	2882.5±1093.6	69.6±10.9
2-118-L3Fc10-M3-5	3734.1±1290.2	77.0±11.3
2-118-L3G4-BM	3544.9±1442.9	73.8±9.1

NGF와 NGF-Fc 융합 단백질의 치료 효과를 추가로 연구하기 위해, 희생된 마우스의 오른쪽 고환과 부고환의 무게를 측정하고 10% 중성 포르말린으로 고정한 다음 포매, 절단 및 H&E 염색을 통해 조직병리를 평가하였다. 표 8에 나타낸 바와 같이, NGF(SuTaiSheng^® 마우스 NGF 또는 mNGF118) 및 NGF-Fc 융합 단백질(2-118-L3G4-BM 또는 2-118-L3Fc10-M3-5)은 고환 정세관 위축, 정세관 정자 형성 장애, 및 열 스트레스로 인한 부고환관 세포 단편에 유의한 치료 효과를 나타낸다.

또한, NGF-Fc 융합 단백질은 NGF와 유사하거나 더 나은 치료 효과(정자 수, 정자 운동성, 조직 병리학)를 입증했다.

실시예 11: 신경영양성 각막염에 대한 NGF-Fc 융합 단백질의 치료 효과

신경영양성 각막염은 각막 상피 치유 장애에 의해 발생하는 퇴행성 질환으로, 주로 각막 민감도의 감소를 특징으로 한다. 본 실시예는 신경영양성 각막염 래트 모델에서 신경영양성 각막염에 대한 NGF-Fc 융합 단백질의 치료 효과 연구를 설명한다(예를 들어, 각막 플루오레세인 나트륨 염색 분석 또는 각막 신경 길이 측정에 의함).

신경영양성 각막염 동물 모델을 확립하기 위해 생후 3일 된 SD 랫트에 8 mg/ml 캡사이신 용액(Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd., #C10831884)을 랫트당 50 μl의 용량으로 피하 주사했다. 캡사이신 주입 2주 후, 60 μg/ml NGF(SuTaiSheng^® 마우스 NGF 또는 mNGF118) 또는 NGF-Fc 융합 단백질(2-118-L3G4-BM 또는 2-118-L3Fc10-M3-5)을 안약 형태로 약 2시간 간격으로 20 μl/눈/투여를 하루 6회 투여했다. 동일한 부피의 0.9% 염화나트륨 용액을 음성 대조군과 동일한 빈도로 투여하였다. 투여 첫날을 D1로 표시하였다. 치료는 2주 동안 지속되었으며 D15에 각 그룹에서 한 번만 수행되었다.

NGF-Fc 융합 단백질의 치료 효과를 평가하기 위해 각막 플루오레세인 나트륨 염색을 시행하였다. 각막 플루오레세인 나트륨 염색 점수는 각막의 완전성과 손상 정도를 직접적으로 나타낼 수 있다. 손상되지 않은 각막은 염색될 수 없다. 손상된 각막만이 염색이 가능하며, 염색 점수가 높을수록 각막 손상 정도가 높다. 간략히 설명하면, 플루오레세인 나트륨 용액(3μL, 0.5%)을 랫트의 눈에 떨어뜨리고 1.5분 동안 눈을 염색하였다. 그런 다음 결막낭을 1.25mL의 멸균 생리 식염수로 10초마다 연속 3회 헹구었다. 각 세척 후 눈 주위의 생리 식염수를 종이 티슈로 적셨다. 염색 5분 후 슬릿 램프(코발트 블루 필터가 있는)로 안구 표면을 관찰하고 사진을 촬영하여 점수를 매겼다. 형광 염색의 등급을 매기기 위한 개선된 NEI 척도가 채점 기준으로 사용되었다. 구체적으로, 각 각막을 5개 영역(1-중앙 영역, 2-상부, 3-측두부, 4-비강, 5-하부)으로 구분하여, 각 영역별 최고점수는 8점이며, 0점은 유색 영역이 없음을 가리키며, 1은 스팟 유색 영역(spot colored area)이 해당 면적의 1%~25%임을 가리키며, 2는 스팟 유색 영역이 해당 면적의 26%~50%임을 가리키며, 3은 스팟 유색 영역이 해당 면적의 51%~75%임을 가리키며, 4는 스팟 유색 영역이 해당 면적의 76%~100%임을 가리킨다. 유색 영역이 조밀하거나 유착 부위(fusion in the area)가 뚜렷하게 보이면, 해당 영역에 유색 영역이 차지하는 비율에 따라 각각 1, 2, 3, 또는 4점을 추가로 부여하며, 즉 1%~25%의 유색 영역에 대해 추가 1점, 26%~50%의 유색 영역에 대해 추가 2점, 51~75%의 유색 영역에 대해 추가 3점, 76%~100%의 유색 영역에 대해 추가 4점을 부여한다. 각 눈의 최대 총점은 40점이었다. 측정은 0일째(첫 치료 전), 4일, 8일, 14일에 총 4회 측정하였다. 각막 플루오레세인 나트륨 염색의 총점을 계산하였다. 기록된 데이터는 SPSS13.0으로 분석하였고, GraphPad Prism 8.0.1을 사용하여 히스토그램을 그렸다.

도 10A에 도시된 바와 같이, NGF(SuTaiSheng^® 마우스 NGF 또는 mNGF118) 또는 NGF-Fc 융합 단백질(2-118-L3G4-BM 또는 2-118-L3Fc10-M3-5) 처리된 실험군에서 신경영양성 각막염 모델 랫트의 각막 플루오레세인 나트륨 염색 점수는 음성 대조군에 비해 유의하게 낮았으며(4일째 및 8일째에 p<0.01, 14일째에 p<0.001), 이는 NGF (SuTaiSheng^® 마우스 NGF 또는 mNGF118) 또는 NGF-Fc 융합 단백질 (2-118-L3G4-BM 또는 2-118-L3Fc10-M3-5)이 손상된 각막의 완전성을 유의하게 회복시킬 수 있음을 나타낸다. 상대적으로 말하자면, NGF-Fc 융합 단백질(2-118-L3Fc10-M3-5 또는 2-118-L3G4-BM) 처리된 각막은 NGF 처리된 각막에 비해 약간 더 낮은 플루오레세인 나트륨 염색 점수를 보였다.

치료 효능을 연구하기 위해 각막 신경 계수 분석을 추가로 수행했다. D15에 마지막 처리 1시간 후 랫트를 희생시켰다. 오른쪽 안구가 채취되었다. 각막 가장자리를 따라 각막을 분리하고, 세척하고, 포장하고, 염색하고, 유리 슬라이드에 고정하였다. 각막신경섬유의 형태를 광학현미경(200Х)으로 관찰하였다. 각막 부위를 중앙에서 방사상으로 4개의 절편으로 나누고, 4개의 각 절편에서 각막 신경이 가장 많은 시야를 촬영하였다. 그 후, 각 시야에서 각막신경의 길이를 측정하고, 4개 시야 모두에서 각막신경의 평균 길이를 최종 결과로 산출하였다. 데이터 처리는 SPSS13.0을 사용하였고, 히스토그램은 graphpad prism 8.0.1을 사용하였다.

도 10B에 도시된 바와 같이, NGF(SuTaiSheng^® 마우스 NGF 또는 mNGF118) 또는 NGF-Fc 융합 단백질(2-118-L3G4-BM 또는 2-118-L3Fc10-M3-5)로 처리된 신경영양성 각막염 랫트 모델의 평균 각막 신경 길이는 음성대조군보다 유의하게 길었다(p<0.05). 구체적으로, SuTaiSheng^® 마우스 NGF, mNGF118, 2-118-L3G4-BM 및 2-118-L3Fc10-M3-5로 처리된 랫트의 평균 각막 신경 길이는 각각 음성 대조군에 비해 약 1.14배, 1.14배, 1.21배 및 1.18배였다. 이러한 결과는 NGF(SuTaiSheng^® 마우스 NGF 또는 mNGF118) 또는 NGF-Fc 융합 단백질(2-118-L3G4-BM 또는 2-118-L3Fc10-M3-5)이 신경영양성 각막염으로 인한 각막 신경 손상을 효과적으로 치료할 수 있음을 입증한다.

서열목록

서열번호: 1 (돌연변이 인간 β-NGF, 118aa)

SSSHPIFHRGEESVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVR

서열번호: 2 (돌연변이 인간 β-NGF, 120aa)

SSSHPIFHRGEESVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRA

서열번호: 3 (야생형 인간 β-NGF, 118aa)

SSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVR

서열번호: 4 (야생형 인간 β-NGF, 120aa)

SSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRA

서열번호: 5 (NGF 프로펩타이드, 103aa)

EPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTHRSKR

서열번호: 6 (NGF 신호 펩타이드, 18aa)

MSMLFYTLITAFLIGIQA

서열번호: 7 (인간 야생형 IgG1 Fc IGHG1*05)

EPKSC DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

서열번호: 8 (인간 야생형 IgG1 Fc IGHG1*03, 천연 변이체)

EPKSC DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

서열번호: 9 (변형된 IgG1 Fc M1 [IGHG1*03에 대한 N297A])

EPKSC DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY A STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

서열번호: 10 (변형된 IgG1 Fc M1-5 [IGHG1*03에 대한 N297A, N' 5aa 절단])

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY A STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

서열번호: 11 (변형된 IgG1 Fc M3 [IGHG1*03에 대한 L234A+L235A+P331S])

EPKSC DKTHTCPPCPAPE AA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA S IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

서열번호: 12 (변형된 IgG1 Fc M3-5 [IGHG1*03에 대한 L234A+L235A+P331S, N' 5aa 절단])

DKTHTCPPCPAPE AA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA S IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

서열번호: 13 (변형된 IgG1 Fc M5 [IGHG1*03에 대한 L234A+L235E+G237A+A330S+P331S])

EPKSC DKTHTCPPCPAPE AE G A PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP SS IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

서열번호: 14 (변형된 IgG1 Fc M5-5 [IGHG1*03에 대한 L234A+L235E+G237A+A330S+P331S, N' 5aa 절단])

DKTHTCPPCPAPE AE G A PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP SS IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

서열번호: 15 (변형된 IgG1 Fc M7 [IGHG1*03에 대한 E233P+L234V+L235A+G236del+A327G+A330S+P331S])

EPKSC DKTHTCPPCPAP PVA GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK G LP SS IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

서열번호: 16 (변형된 IgG1 Fc M7-5 [IGHG1*03에 대한 E233P+L234V+L235A+G236del+A327G+A330S+P331S, N' 5aa 절단])

DKTHTCPPCPAP PVA GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK G LP SS IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

서열번호: 17 (인간 야생형 IgG4 Fc)

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

서열번호: 18 (변형된 IgG4 Fc [S228P+F234A+L235A])

ESKYGPPCP P CPAPE AA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

서열번호: 19 (변형된 IgG4 Fc-FD)

SKYGPPCP P CPAPEF E GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS P GK

서열번호: 20 (변형된 IgG2/4 Fc)

VE R K CCVE CP P CPAP PVA GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

서열번호: 21 (FD-G4Fc의 핵산 서열; 신호 펩티드는 이탤릭체, 프로펩티드는 사각형 표시, β-NGF(wt 118aa)는 볼드체, 링커는 밑줄, 변형된 IgG4 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

서열번호: 22 (FD-G4Fc의 아미노산 서열; 신호 펩티드는 이탤릭체, 프로펩티드는 사각형 표시, β-NGF(wt 118aa)는 볼드체, 링커는 밑줄, 변형된 IgG4 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

서열번호: 23 (WM-G24Fc의 핵산 서열; 신호 펩티드는 이탤릭체, 프로펩티드는 사각형 표시, β-NGF(wt 118aa)는 볼드체, 링커는 밑줄, 변형된 IgG2/4 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

서열번호: 24 (WM-G24Fc의 아미노산 서열; 신호 펩티드는 이탤릭체, 프로펩티드는 사각형 표시, β-NGF(wt 118aa)는 볼드체, 링커는 밑줄, 변형된 IgG2/4 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

서열번호: 25 (NGF-1-15M7의 핵산 서열; 신호 펩티드는 이탤릭체, 프로펩티드는 사각형 표시, β-NGF(wt 120aa)는 볼드체, 변형된 IgG1 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

서열번호: 26 (NGF-1-15M7의 아미노산 서열; 신호 펩티드는 이탤릭체, 프로펩티드는 사각형 표시, β-NGF(wt 120aa)는 볼드체, 변형된 IgG1 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

서열번호: 27 (NGF-L3Fc10M7-5의 핵산 서열; 신호 펩티드는 이탤릭체, 프로펩티드는 사각형 표시, β-NGF(wt 120aa)는 볼드체, 링커는 밑줄, 변형된 IgG1 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

서열번호: 28 (NGF-L3Fc10M7-5의 아미노산 서열; 신호 펩티드는 이탤릭체, 프로펩티드는 사각형 표시, β-NGF(wt 120aa)는 볼드체, 링커는 밑줄, 변형된 IgG1 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

서열번호: 29 (2-1-15M7의 핵산 서열; 신호 펩티드는 이탤릭체, 프로펩티드는 사각형 표시, β-NGF(돌연변이 120aa)는 볼드체, 변형된 IgG1 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

서열번호: 30 (2-1-15M7의 아미노산 서열; 신호 펩티드는 이탤릭체, 프로펩티드는 사각형 표시, β-NGF(돌연변이 120aa)는 볼드체, 변형된 IgG1 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

서열번호: 31 (NGF-4-12PAA의 핵산 서열; 신호 펩티드는 이탤릭체, 프로펩티드는 사각형 표시, β-NGF(wt 120aa)는 볼드체, 변형된 IgG1 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

서열번호: 32 (NGF-4-12PAA의 아미노산 서열; 신호 펩티드는 이탤릭체, 프로펩티드는 사각형 표시, β-NGF(wt 120aa)는 볼드체, 변형된 IgG1 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

서열번호: 33 (2-118-L3Fc10-M1-5의 핵산 서열; 신호 펩티드는 이탤릭체, 프로펩티드는 사각형 표시, β-NGF(돌연변이 118aa)는 볼드체, 링커는 밑줄, 변형된 IgG1 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

서열번호: 34 (2-118-L3Fc10-M1-5의 아미노산 서열; 신호 펩티드는 이탤릭체, 프로펩티드는 사각형 표시, β-NGF(돌연변이 118aa)는 볼드체, 링커는 밑줄, 변형된 IgG1 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

서열번호: 35 (2-118-L3Fc10-M3-5의 핵산 서열; 신호 펩티드는 이탤릭체, 프로펩티드는 사각형 표시, β-NGF(돌연변이 118aa)는 볼드체, 링커는 밑줄, 변형된 IgG1 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

서열번호: 36 (2-118-L3Fc10-M3-5의 아미노산 서열; 신호 펩티드는 이탤릭체, 프로펩티드는 사각형 표시, β-NGF(돌연변이 118aa)는 볼드체, 링커는 밑줄, 변형된 IgG1 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

서열번호: 37 (NGF-118-L3Fc10-M3-5의 핵산 서열; 신호 펩티드는 이탤릭체, 프로펩티드는 사각형 표시, β-NGF(wt 118aa)는 볼드체, 링커는 밑줄, 변형된 IgG1 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

서열번호: 38 (NGF-118-L3Fc10-M3-5의 아미노산 서열; 신호 펩티드는 이탤릭체, 프로펩티드는 사각형 표시, β-NGF(wt 118aa)는 볼드체, 링커는 밑줄, 변형된 IgG1 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

서열번호: 39 (2-L3Fc10-M3-5의 핵산 서열; 신호 펩티드는 이탤릭체, 프로펩티드는 사각형 표시, β-NGF(돌연변이 120aa)는 볼드체, 링커는 밑줄, 변형된 IgG1 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

서열번호: 40 (2-L3Fc10-M3-5의 아미노산 서열; 신호 펩티드는 이탤릭체, 프로펩티드는 사각형 표시, β-NGF(돌연변이 120aa)는 볼드체, 링커는 밑줄, 변형된 IgG1 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

서열번호: 41 (2-118-L3Fc10-M5-5의 핵산 서열; 신호 펩티드는 이탤릭체, 프로펩티드는 사각형 표시, β-NGF(돌연변이 118aa)는 볼드체, 링커는 밑줄, 변형된 IgG1 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

서열번호: 42 (2-118-L3Fc10-M5-5의 아미노산 서열; 신호 펩티드는 이탤릭체, 프로펩티드는 사각형 표시, β-NGF(돌연변이 118aa)는 볼드체, 링커는 밑줄, 변형된 IgG1 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

서열번호: 43 (2-118-L3Fc10M7-5의 핵산 서열; 신호 펩티드는 이탤릭체, 프로펩티드는 사각형 표시, β-NGF(돌연변이 118aa)는 볼드체, 링커는 밑줄, 변형된 IgG1 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

서열번호: 44 (2-118-L3Fc10M7-5의 아미노산 서열; 신호 펩티드는 이탤릭체, 프로펩티드는 사각형 표시, β-NGF(돌연변이 118aa)는 볼드체, 링커는 밑줄, 변형된 IgG1 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

서열번호: 45 (2-118-L3G4-BM 의 핵산 서열; 신호 펩티드는 이탤릭체, 프로펩티드는 사각형 표시, β-NGF(돌연변이 118aa)는 볼드체, 링커는 밑줄, 변형된 IgG1 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

서열번호: 46 (2-118-L3G4-BM 의 아미노산 서열; 신호 펩티드는 이탤릭체, 프로펩티드는 사각형 표시, β-NGF(돌연변이 118aa)는 볼드체, 링커는 밑줄, 변형된 IgG1 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

서열번호: 47 (돌연변이 인간 preproNGF; 신호 펩티드는 이탤릭체, 프로펩티드는 사각형 표시, β-NGF(돌연변이 118aa)는 볼드체)

서열번호: 48 (돌연변이 인간 preproNGF; 241aa; 신호 펩티드는 이탤릭체, 프로펩티드는 사각형 표시, β-NGF(돌연변이 120aa)는 볼드체)

서열번호: 49 (야생형 인간 preproNGF; 239aa; 신호 펩티드는 이탤릭체, 프로펩티드는 사각형 표시, β-NGF(wt 118aa)는 볼드체)

서열번호: 50 (야생형 인간 preproNGF; 241aa; 신호 펩티드는 이탤릭체, 프로펩티드는 사각형 표시, β-NGF(wt 120aa)는 볼드체)

서열번호: 51 (돌연변이 인간 proNGF; 221aa; 프로펩티드는 사각형 표시, β-NGF(돌연변이 120aa)는 볼드체)

서열번호: 52 (돌연변이 인간 proNGF; 223aa; 프로펩티드는 사각형 표시, β-NGF(돌연변이 120aa)는 볼드체)

서열번호: 53 (야생형 인간 proNGF; 221aa; 프로펩티드는 사각형 표시, β-NGF(wt 118aa)는 볼드체)

서열번호: 54 (야생형 인간 proNGF; 223aa; 프로펩티드는 사각형 표시, β-NGF(wt 120aa)는 볼드체)

서열번호: 55 (성숙한 FD-G4Fc의 아미노산 서열; β-NGF (wt 118aa)는 볼드체; 링커는 밑줄, 변형된 IgG4 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

SSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVR GSGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

서열번호: 56 (성숙한 WM-G24Fc의 아미노산 서열; β-NGF (wt 118aa)는 볼드체; 링커는 밑줄, 변형된 IgG2/4 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

SSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVR KTGGGSGGGS VERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

서열번호: 57 (성숙한 NGF-1-15M7의 아미노산 서열; β-NGF (wt 120aa)는 볼드체; 변형된 IgG1 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

SSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRA EPKSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

서열번호: 58 (성숙한 NGF-L3Fc10M7-5의 아미노산 서열; β-NGF (wt 120aa)는 볼드체; 링커는 밑줄, 변형된 IgG1 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

SSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRA GGGGSGGGGSGGGGS DKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

서열번호: 59 (성숙한 2-1-15M7의 아미노산 서열; β-NGF (돌연변이 120aa)는 볼드체; 변형된 IgG1 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

SSSHPIFHRGEESVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRA EPKSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

서열번호: 60 (성숙한 NGF-4-12PAA의 아미노산 서열; β-NGF (wt 120aa)는 볼드체; 변형된 IgG4 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

SSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRA ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

서열번호: 61 (성숙한 2-118-L3Fc10-M1-5의 아미노산 서열; β-NGF (돌연변이 118aa)는 볼드체; 링커는 밑줄, 변형된 IgG1 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

SSSHPIFHRGEESVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVR GGGGSGGGGSGGGGS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

서열번호: 62 (성숙한 2-118-L3Fc10-M3-5의 아미노산 서열; β-NGF (돌연변이 118aa)는 볼드체; 링커는 밑줄, 변형된 IgG1 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

SSSHPIFHRGEESVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVR GGGGSGGGGSGGGGS DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

서열번호: 63 (성숙한 NGF-118-L3Fc10-M3-5의 아미노산 서열; β-NGF (wt 118aa)는 볼드체, 링커는 밑줄, 변형된 IgG1 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

SSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVR GGGGSGGGGSGGGGS DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

서열번호: 64 (성숙한 2-L3Fc10-M3-5의 아미노산 서열; β-NGF (돌연변이 120aa)는 볼드체, 링커는 밑줄, 변형된 IgG1 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

SSSHPIFHRGEESVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRA GGGGSGGGGSGGGGS DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

서열번호: 65 (성숙한 2-118-L3Fc10-M5-5의 아미노산 서열; β-NGF (돌연변이 118aa)는 볼드체, 링커는 밑줄, 변형된 IgG1 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

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서열번호: 66 (성숙한 2-118-L3Fc10M7-5의 아미노산 서열; β-NGF (돌연변이 118aa)는 볼드체, 링커는 밑줄, 변형된 IgG1 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

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서열번호: 67 (성숙한 2-118-L3G4-BM의 아미노산 서열; β-NGF (돌연변이 118aa)는 볼드체, 링커는 밑줄, 변형된 IgG4 Fc는 이탤릭체 및 볼드체)

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서열번호: 68 (링커)

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SEQUENCE LISTING <110> STAIDSON (BEIJING) BIOPHARMACEUTICALS CO. , LTD. <120> LONG-ACTING NERVE GROWTH FACTOR POLYPEPTIDES AND USES THEREOF <160> 99 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant human 棺-NGF <400> 1 Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Glu Ser Val Cys Asp 1 5 10 15 Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys 20 25 30 Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val 35 40 45 Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val 50 55 60 Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys 65 70 75 80 Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln 85 90 95 Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu 100 105 110 Ser Arg Lys Ala Val Arg 115 <210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant human 棺-NGF <400> 2 Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Glu Ser Val Cys Asp 1 5 10 15 Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr 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actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc 1320 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380 tacacgcaga agagcctctc cctgtccccg ggtaaa 1416 <210> 26 <211> 472 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of NGF-1-15M7 <400> 26 Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala Phe Leu Ile Gly Ile 1 5 10 15 Gln Ala Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile 20 25 30 Pro Gln Ala His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu 35 40 45 Arg Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala 50 55 60 Gly Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg 65 70 75 80 Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu 85 90 95 Ala Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro 100 105 110 Phe Asn Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe 115 120 125 His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly 130 135 140 Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys 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cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 1020 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1080 aacaaagccc tcccagcctc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1140 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1200 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1260 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1320 ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1380 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtcc 1440 ccgggtaaa 1449 <210> 40 <211> 483 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 2-L3Fc10-M3-5 <400> 40 Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala Phe Leu Ile Gly Ile 1 5 10 15 Gln Ala Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile 20 25 30 Pro Gln Ala His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu 35 40 45 Arg Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala 50 55 60 Gly Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg 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155 160 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 165 170 175 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 180 185 190 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 195 200 205 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 210 215 220 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 225 230 235 240 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 245 250 255 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 260 265 270 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 275 280 285 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 290 295 300 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 305 310 315 320 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 325 330 335 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 340 345 350 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 355 <210> 67 <211> 365 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of mature 2-118-L3G4-BM <400> 67 Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Glu Ser Val Cys Asp 1 5 10 15 Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys 20 25 30 Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val 35 40 45 Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val 50 55 60 Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys 65 70 75 80 Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln 85 90 95 Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu 100 105 110 Ser Arg Lys Ala Val Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys 130 135 140 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 145 150 155 160 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 165 170 175 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 180 185 190 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 195 200 205 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 210 215 220 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 225 230 235 240 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 245 250 255 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 260 265 270 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 275 280 285 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 290 295 300 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 305 310 315 320 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 325 330 335 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 340 345 350 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 355 360 365 <210> 68 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 68 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 69 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 69 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Ala <210> 70 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker; (GGGGS)n, n is an integer of at least 1 <400> 70 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 71 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 71 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Ser 20 <210> 72 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 72 Lys Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 73 <211> 1 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker; (G)n, n is an integer of at least 1 <400> 73 Gly 1 <210> 74 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker; (GS)n, n is an integer of at least 1 <400> 74 Gly Ser 1 <210> 75 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker; (GGS)n, n is an integer of at least 1 <400> 75 Gly Gly Ser 1 <210> 76 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker; (GGGS)n, n is an integer of at least 1 <400> 76 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 77 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker; (GGS)n(GGGS)n, n is an integer of at least 1 <400> 77 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 78 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker; (GSGGS)n, n is an integer of at least 1 <400> 78 Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 79 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker; (GGSGS)n, n is an integer of at least 1 <400> 79 Gly Gly Ser Gly Ser 1 5 <210> 80 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 80 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 81 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 81 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 82 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 82 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 83 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 83 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 <210> 84 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 84 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 85 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 85 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Ser <210> 86 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 86 Gly Gly 1 <210> 87 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 87 Gly Gly Ser Gly 1 <210> 88 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 88 Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 89 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 89 Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 <210> 90 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 90 Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 <210> 91 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 91 Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 92 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 92 Gly Ser Ser Ser Gly 1 5 <210> 93 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 93 Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 94 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 94 Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 95 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 95 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 96 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker; (GA)n, n is an integer of at least 1 <400> 96 Gly Ala 1 <210> 97 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 97 Gly Arg Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 98 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 98 Gly Arg Ala Gly Gly Gly 1 5 <210> 99 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 99 Ala Ser Thr Lys Gly Pro 1 5

Claims

N-말단에서 C-말단까지 NGF 모이어티 및 Fc 모이어티를 포함하는 지속형 신경 성장 인자(NGF) 폴리펩타이드로서, 상기 NGF 모이어티는 서열번호: 1-3 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 Fc 모이어티는 IgG1 Fc 또는 IgG4 Fc로부터 유도되는 지속형 신경 성장 인자(NGF) 폴리펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 NGF 모이어티는 펩티드 링커를 통해 Fc 모이어티에 융합되는 지속형 NGF 폴리펩타이드.
제2항에 있어서, 상기 펩티드 링커는 서열번호: 68-72 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드.
제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 펩타이드 링커는 (GGGGS)_n (서열번호: 70)의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 중 어느 하나인 지속형 NGF 폴리펩타이드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8의 아미노산 서열을 포함하는 IgG1 Fc로부터 유도되는 지속형 NGF 폴리펩타이드.
제5항에 있어서, 상기 Fc 모이어티는 서열번호: 8에 비해 E233, L234, L235, G236, G237, N297, A327, A330, 및 P331 중 하나 이상으로부터 선택된 위치에 돌연변이를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드.
제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 Fc 모이어티는 서열번호: 8에 비해 E233P, L234V, L234A, L235A, L235E, G236del, G237A, N297A, A327G, A330S, 및 P331S 중 어느 하나 이상으로부터 선택된 돌연변이를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드.
제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 모이어티는 서열번호: 7 또는 8의 처음 5개 아미노산이 추가로 결여된 지속형 NGF 폴리펩타이드.
제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 모이어티는 서열번호: 8에 비해 L234A, L235A, 및 P331S 돌연변이를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드.
제9항에 있어서, 상기 Fc 모이어티는 서열번호: 11 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드.
제9항에 있어서, 상기 지속형 NGF 폴리펩타이드는 서열번호: 62-64 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드.
제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 모이어티는 서열번호: 8에 비해 E233P, L234V, L235A, G236del, A327G, A330S, 및 P331S 돌연변이를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드.
제12항에 있어서, 상기 Fc 모이어티는 서열번호: 15 또는 16의 아미노산 서열을 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드.
제13항에 있어서, 상기 지속형 NGF 폴리펩타이드는 서열번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드.
제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 모이어티는 서열번호: 8에 비해 L234A, L235E, G237A, A330S, 및 P331S 돌연변이를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드.
제15항에 있어서, 상기 Fc 모이어티는 서열번호: 13 또는 14의 아미노산 서열을 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드.
제16항에 있어서, 상기 지속형 NGF 폴리펩타이드는 서열번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드.
제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 모이어티는 서열번호: 8에 비해 N297A 돌연변이를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드.
제18항에 있어서, 상기 Fc 모이어티는 서열번호: 9 또는 10의 아미노산 서열을 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드.
제19항에 있어서, 상기 지속형 NGF 폴리펩타이드는 서열번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 모이어티는 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 IgG4 Fc로부터 유도된 지속형 NGF 폴리펩타이드.
제21항에 있어서, 상기 Fc 모이어티는 서열번호: 17에 비해 S228, F234, 및 L235 중 하나 이상으로부터 선택된 위치에 돌연변이를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드.
제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 Fc 모이어티는 서열번호: 17에 비해 S228P, F234A, 및 L235A 중 하나 이상으로부터 선택된 돌연변이를 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드.
제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 모이어티는 서열번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드.
제24항에 있어서, 상기 지속형 NGF 폴리펩타이드는 서열번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 지속형 NGF 폴리펩타이드.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지속형 NGF 폴리펩타이드는 인간 개체에게 정맥내, 근육내, 안구내 또는 피하 투여 시 반감기가 적어도 약 10시간인 지속형 NGF 폴리펩타이드.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지속형 NGF 폴리펩타이드는 서열번호: 3 또는 4의 아미노산 서열을 갖는 NGF 모이어티를 포함하는 NGF 폴리펩타이드에 비해 통증을 덜 유발하는 것인 지속형 NGF 폴리펩타이드.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 지속형 NGF 폴리펩타이드를 인코딩하는 단리된 핵산.
제28항의 핵산을 포함하는 벡터.
제29항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 지속형 NGF 폴리펩타이드 및 임의로 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
제31항의 약학적 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 NGF-관련 질환을 치료하는 방법.
제32항에 있어서, 상기 NGF-관련 질환이 신경(neurological) 질환인 방법.
제33항에 있어서, 상기 신경 질환은 신생아 저산소 허혈성 뇌병증, 뇌성마비, 중증 근병증, 신경 난청, 반회 후두 신경 손상, 외상성 뇌 손상, 치아 신경 손상, 뇌졸증, 다운 증후군, 근위축성측색경화증, 다발성 경화증, 척수성 근위축, 미만성 뇌손상, 흉선 이형성증, 시신경 타박상, 여포성 이형성증, 척수 손상, 녹내장, 신경영양성 각막염, 시신경손상, 시신경척수염, 망막관련질환, 요실금, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 치매, 고혈압성 뇌내출혈 신경기능장애, 뇌소혈관질환, 급성허혈뇌졸중, 각막내피이영양증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨 족부궤양, 신경성 피부궤양, 욕창, 신경영양성 각막궤양, 당뇨병성 각막궤양, 및 황반공으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 신경 질환이 당뇨병성 신경병증, 알츠하이머병 또는 신경영양성 각막염인 방법.
제32항에 있어서, 상기 NGF-관련 질환은 비신경(non-neurological) 질환인 방법.
제36항에 있어서, 상기 비신경 질환이 비장 위축, 비장 타박상, 난소 예비력 감소, 조기 난소 부전, 난소 과잉자극 증후군, 난소 잔류 증후군, 난소 여포성 이형성증, 정자감소증(oligozoospermia), 정자무력증(asthenospermia), 및 감약정자증(oligoasthenospermia)과 같은 정자 형성 장애(spermatogenesis disorder), 허혈성 궤양, 스트레스성 궤양, 류마티스성 궤양, 간 섬유증, 각막 궤양, 화상, 구강 궤양 및 정맥성 하지 궤양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
제36항 또는 제37항에 있어서, 상기 비신경 질환이 조기 난소 부전 또는 정자 형성 장애인 방법.
제32항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 조성물이 개체당 약 0.01㎍ 내지 약 1000㎍의 용량으로 투여되는 방법.
제32항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 조성물이 매주 약 1회 또는 매월 약 1회의 투여 빈도로 투여되는 방법.
제32항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 조성물이 경구, 피하, 정맥내, 뇌내, 비강내, 경피, 복강내, 근육내, 폐내, 질내, 직장내, 안구내 또는 국소 투여되는 방법.