CN103376248B - 神经生长因子活性定量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种神经生长因子活性定量测定方法，包括以下步骤：1)将处于对数生长期的TF-1细胞用不含血清和重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的基础培养基洗涤后重悬，获得TF-1细胞悬浮液；2)向梯度稀释的神经生长因子标准品和待测样品中分别加入所述TF-1细胞悬浮液，37℃、5％CO2孵育；然后分别加入指示剂，检测吸光度/荧光值，绘制标准曲线；3)通过标准曲线及样品的吸光度/荧光值计算待测样品的神经生长因子活性浓度。本发明的神经生长因子活性定量测定方法，具有较好的准确度和精密度。
Description
技术领域
本发明涉及一种神经生长因子活性定量测定方法。
背景技术
神经生长因子(以下简称NGF)的活性测定，目前业内采用的方法为鸡胚背根神经节法。传统的鸡胚背根神经节法是依据NGF诱导神经节生长、刺激轴突生产的特点而建立，具有特异性强等优点，但该方法检测每个浓度的NGF需要分离多个神经节，因不是分离后的每个神经节均能受刺激生长轴突，生长轴突的程度也并非一致，只要多个神经节中出现一个终点刺激效应者就可判定效价，操作繁琐、试验周期长、结果主观判定不能定量、重复性差，已不适于对该制品的质控要求，同时其作为一种半定量的方法，也存在一定局限性。
随着NGF在临床上的应用不断增加，生产规模不断加大，如何快速、简便且高通量地检测NGF生物活性成为其质量控制的关键。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有较好的准确度和精密度的NGF活性定量测定方法。
本发明所提供的NGF活性定量测定方法，包括以下步骤：
1)将处于对数生长期的TF-1细胞用不含血清和重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的基础培养基洗涤后重悬，获得TF-1细胞悬浮液；
2)向梯度稀释的神经生长因子标准品和待测样品中分别加入所述TF-1细胞悬浮液，37℃、5％CO2孵育；然后分别加入指示剂，检测吸光度/荧光值，绘制标准曲线；
3)通过标准曲线及样品的吸光度/荧光值计算待测样品的神经生长因子活性浓度。
本发明的NGF活性定量测定方法，其中，所述步骤1)中获得的所述TF-1细胞悬浮液还经过在37℃、5％CO2条件下培养18-20h的步骤。
本发明的NGF活性定量测定方法，其中，所述处于对数生长期的TF-1细胞通过在完全培养基中37℃、5％CO2条件下培养获得。
本发明的NGF活性定量测定方法，其中，所述完全培养基为含体积百分含量10％的胎牛血清以及10ng/ml重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的RPMI1640培养基。
本发明的NGF活性定量测定方法，其中，所述神经生长因子为鼠神经生长因子或人神经生长因子。
本发明的NGF活性定量测定方法，其中，所述指示剂为MTT、MTS或AlamarBlue。MTT全称为3-(4，5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3，5-di-phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐。MTS是其类似物，全称为[3-(4，5-dimethylthiazol-zyl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazoliuzolium，innersalt]。
优选地，所述加入指示剂为AlamarBlue。
本发明的NGF活性定量测定方法，其中，加入所述指示剂后，在37℃孵育，然后激发光560nm/发射光590nm检测荧光值。
本发明的NGF活性定量测定方法，其中，所述TF-1细胞悬浮液的浓度为1.5～2.5×105细胞/ml。
本发明的NGF活性定量测定方法，其中，所述TF-1细胞悬浮液的浓度为2×105细胞/ml。
本发明的NGF活性定量测定方法，其中，所述梯度稀释的样品中NGF活性浓度为5～20AU/ml。
本发明的NGF活性定量测定方法，其中，所述不含血清和重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的基础培养基优选为RPMI1640培养基。
本发明的NGF活性定量测定方法，其中，步骤1)中所述用不含血清的基础培养基洗涤的方法为：750rpm离心5min，换液后重复离心，优选重复洗涤3次。
本发明的NGF活性定量测定方法，其中，步骤2)中加入所述TF-1细胞悬浮液，37℃、5％CO2孵育44～52h，优选为48h。
本发明的NGF活性定量测定方法，具有较好的准确度和精密度。
附图说明
图1表示实施例1中绘制的标准曲线。
图2表示实施例1中样品稀释倍数与活性之间的稀释曲线。
图3表示实施例2中绘制的标准曲线。
图4表示实施例2中样品稀释倍数与活性之间的稀释曲线。
具体实施方式
TF-1细胞是人红系白血病患者的前髓细胞。本发明人通过大量实验发现在无血清和GMCSF存在条件下，NGF能延长离体培养的TF-1细胞的存活时间，并且TF-1细胞的存活数量与NGF生物浓度的关系具有正相关性，因而用TF-1细胞可进行NGF生物活性浓度的检测。在TF-1细胞中加入梯度稀释的NGF标准品及样品，培养一定时间，活细胞数量受到NGF影响会产生差异。加入各种指示剂，通过检测吸光值/荧光值直接反映活细胞数量的变化，间接测定出样品的NGF生物活性浓度。
如下将详细描述本发明的NGF活性定量测定方法，其中
主要试剂及仪器
主要试剂：
细胞株：TF-1细胞，购于协和医科大学基础医学院细胞中心
NGF标准品(参考品)：中国药品生物制品检定研究院，1000AU/支
待测样品：市售注射用鼠神经生长因子，规格：15000AU/支，舒泰神生产
重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGMCSF)：金坦生物技术股份有限公司
指示剂AlamarBlue：invitrogen公司，货号DAl1100
胎牛血清(FBS)：GIBCO公司，货号10099
基础培养基：RPMI1640培养基，GIBCO公司，货号11875
完全培养基：RPMI1640培养基+10％FBS+10ng/mlrhGMCSF
主要仪器：多功能酶标仪M5，MD公司
实施例1
一、NGF活性检测方法
1、检测用TF-1细胞的培养
用完全培养基培养TF-1细胞，放置于37℃、5％CO2的培养箱中培养至对数生长期，细胞形态饱满，数量满足需要，用RPMI1640培养基洗涤细胞，750rpm离心5min，换液后再离心，重复洗涤3次，以完全去除培养液中的血清和rhGMCSF。将细胞用RPMI1640培养基重悬，调整细胞悬液的浓度为2×105细胞/ml备用。
2、NGF体外活性检测
2.1标准品及待测样品稀释
2.1.1各稀释度标准品配制：
用1mlRPMI1640培养基溶解鼠神经生长因子标准品(1000AU/ml)，并预稀释到200AU/ml即标准品D1，然后对比稀释，共8个稀释度(100～0.78AU/ml)，依次命名为标准品D2～D9。
2.1.2各稀释度样品配制：
将市售注射用鼠神经生长因子(15000AU/支)用1mlRPMI1640培养基复溶，再用RPMI1640培养基进行800、1000、1200倍的稀释，分别对应为S1、S2、S3。
2.2alamarBlue法检测待测样品活性浓度
2.2.1分别将各稀释度标准品(D2～D9)及各稀释度待测样品(S1～S3)加入到96孔板中，50ul/孔，三个复孔，同时以50ul/孔的RPMI1640培养基作为阴性对照。
2.2.2加样的细胞孔每孔接种上述得到的细胞悬液100ul，37℃、5％CO2孵育48h。
2.2.3每孔加入15ulAlamarBlue，37℃孵育4h，激发光560nm/发射光590nm检测荧光发光，并绘制标准曲线，通过标准曲线及待测样品的荧光值计算待测样品的NGF活性浓度。
3、检测结果
3.1用M5酶标仪自带软件进行数据分析及结果处理，选取4参数法(4-P)做标准曲线。
3.2标准品及待测样品检测值，见下表1：
表1标准品及待测样品检测值
| D2 | D3 | D4 | D5 | D6 | D7 | D8 | D9 | S1 | S2 | S3 | |
| 1 | 10843 | 10757 | 10354 | 7550.6 | 5505.5 | 3694.1 | 3182.5 | 3046.4 | 9979.0 | 8612.5 | 8024.1 |
| 2 | 9868.1 | 11024 | 10831 | 8314.6 | 5842.7 | 3941.6 | 2695.9 | 2534.1 | 9722.3 | 8769.1 | 7801.3 |
| 3 | 10663 | 10664 | 10705 | 7648.7 | 5658.8 | 3102.8 | 2634.8 | 2491.4 | 9861.2 | 8815.6 | 7812.7 |
根据标准品浓度及其对应的荧光值，用4参数法绘制标准曲线如图1所示，其R2＝0.992。从标准曲线可知，本实施例活性检测方法的线性在5～20AU/ml范围内。
3.3待测样品活性浓度计算
根据各稀释度待测样品孔的荧光值，根据计算公式：y＝(2.66×103-1.09×104)/(1+(x/8.61)2.08)+1.09×104(参见图1标准曲线)，其中，y为待测样品孔的荧光值，x为待测样品孔样品对应的活性浓度，计算得出各稀释度待测样品孔的样品对应的活性浓度，再根据稀释度算出待测样品活性浓度结果，见下表2：
表2待测样品活性浓度计算表
注：本实施例标准曲线线性范围约为5～20AU/ml，稀释度800对应结果超出线性范围，舍弃，计算。
供试样品活性浓度终值＝(14174+13470)/2＝13822(AU/ml)。
二、NGF活性检测方法的方法学验证
1、NGF活性检测方法的准确度
由三位分析人员同时对活性浓度为1200AU/ml、1000AU/ml、800AU/ml的三个待测样品进行检测，每人每个样品检测3天，每天平行2个96孔板。取每个样品的所有结果计算均值、标准偏差值SD及变异系数CV、回收率，比较结果的偏差值及其与标示值的接近程度，结果如下表3所示：
表3
a分析者1、2和3在相同的实验室。
b每个值均为每天每板九个孔的平均值。
c每个值为每个浓度下1个分析者3天内所有结果的平均值。
d每个值为每个浓度下3个分析者3天内所有结果的总均值。
准确度研究结果显示，制备的3个不同浓度的待测样品，每个浓度的样品分别由3位分析人员的共18次测定结果的回收率范围在100±10％范围内，CV小于10％，结果良好，证实了该方法具有较好的准确度。
2、NGF活性检测方法的精密度
对上述NGF活性检测方法的准确度实验结果进行分析，分别考察同一分析人员3天中不同样品的每个稀释度下三个复孔的孔间重复性、同一分析人员在同一天的两个板子所得结果的重复性、同一分析人员在不同时间对同一样品检测结果的重复性，及不同分析人员在不同时间对同一样品检测结果的重复性。用CV表示反映实验方法的重复性和中间精密度。结果如下表4所示：
表4
从上述分析可看出，该方法孔间重复性良好，板间、不同日期间及分析者之间的重复性均在CV＜10％范围。总之，该方法的重复性及中间精密度的考察结果显示，该方法具有较好的精密度。
3、NGF稀释曲线的线性
根据待测样品的预估活性浓度，将待测样品稀释5个稀释度(稀释650、800、1000、1200、1500倍)，按上述方法测定各稀释度下样品的活性。以样品稀释倍数的倒数为横坐标，对应稀释度下的活性测定值为纵坐标，获得稀释曲线如图2。
可知，样品的稀释度与测定值之间具有良好的线性相关性。
实施例2
一、NGF活性检测方法
1、检测用TF-1细胞的培养
用完全培养基培养TF-1细胞，放置于37℃、5％CO2的培养箱中培养至对数生长期，细胞形态饱满，数量满足需要，用RPMI1640培养基洗涤细胞，750rpm离心5min，换液后再离心，重复洗涤3次，以完全去除培养液中的血清和rhGMCSF。将细胞用RPMI1640培养基在置于37℃，5％CO2培养箱培养18～20h后，调整细胞悬液的浓度为2×105细胞/ml备用。
2、NGF体外活性检测
与实施例1相同。
3、检测结果
3.1用M5酶标仪自带软件进行数据分析及结果处理，选取4参数法(4-P)做标准曲线。
3.2标准品及待测样品检测值，见下表5：
表5标准品及待测样品检测值
| D2 | D3 | D4 | D5 | D6 | D7 | D8 | D9 | S1 | S2 | S3 | |
| 1 | 11089 | 10719 | 10504 | 8490.8 | 3822.3 | 2452.6 | 1924.3 | 1844.3 | 9945.0 | 9151.9 | 8180.5 |
| 2 | 11286 | 11046 | 10334 | 8114.6 | 3927.3 | 2361.0 | 2007.8 | 1669.6 | 9892.8 | 9198.5 | 8101.4 |
| 3 | 10598 | 11483 | 10224 | 8648.3 | 4093.0 | 2713.1 | 1800.7 | 1555.0 | 9893.0 | 9211.3 | 8032.1 |
根据标准品浓度及其对应的荧光值，用4参数法绘制标准曲线如图3所示，其R2＝0.999。从标准曲线可知，本实施例活性检测方法的线性在5～20AU/ml范围内。
3.3待测样品活性浓度计算
具体计算方法同实施例1及下表6，其中同实施例1不同之处在于计算公式为：y＝(1.7×103-1.12×104)/(1+(x/9.59)2.15)+1.12×104(参见图3标准曲线)。表6待测样品活性浓度计算表
待测样品活性浓度终值＝(14770+15008+14663)/3＝14813(AU/ml)
二、NGF活性检测方法的方法学验证
1、NGF活性检测方法的准确度
具体准确度验证方法同与实施例1，结果如下表7所示：
表7
a分析者1、2和3在相同的实验室。
b每个值均为每天每板九个孔的平均值。
c每个值为每个浓度下1个分析者3天内所有结果的平均值。
d每个值为每个浓度下3个分析者3天内所有结果的总均值。
准确度研究结果显示，制备的3个不同浓度的待测样品，每个浓度的样品分别由3位分析人员的共18次测定结果的回收率范围在100±5％范围内，CV小于5％，结果良好，证实了该方法具有较好的准确度。
2、NGF活性检测方法的精密度
具体精密度验证方法同与实施例1，结果如下表8所示：
表8
从上述分析可看出，该方法孔间重复性良好，板间、不同日期间及分析者之间的重复性均在CV＜5％范围。总之，该方法的重复性及中间精密度的考察结果显示，该方法具有较好的精密度。
3、NGF稀释曲线的线性
稀释曲线绘制方法同实施例1，绘制得到的稀释曲线如图4。
可知，样品的稀释度与测定值之间具有良好的线性相关性。
Claims (22)
1.一种神经生长因子活性定量测定方法，包括以下步骤：
1)将处于对数生长期的TF-1细胞用不含血清和重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的基础培养基洗涤后重悬，获得TF-1细胞悬浮液，获得的所述TF-1细胞悬浮液还经过用RPMI1640培养基在37℃、5％CO2条件下培养18-20h；
2)向梯度稀释的神经生长因子标准品和待测样品中分别加入所述TF-1细胞悬浮液，37℃、5％CO2孵育；然后分别加入指示剂，检测吸光度/荧光值，绘制标准曲线，所述神经生长因子标准品和待测样品用RPMI1640基础培养基梯度稀释；
3)通过标准曲线及样品的吸光度/荧光值计算待测样品的神经生长因子活性浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述处于对数生长期的TF-1细胞通过在完全培养基中37℃、5％CO2条件下培养获得。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述完全培养基为含体积百分含量10％的胎牛血清以及10ng/ml重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的RPMI1640培养基。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述神经生长因子为鼠神经生长因子或人神经生长因子或其突变体。
5.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述指示剂为MTT、MTS或AlamarBlue。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述指示剂为MTT、MTS或AlamarBlue。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于加入所述指示剂后，在37℃孵育，然后激发光560nm/发射光590nm检测荧光值。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于加入所述指示剂后，在37℃孵育，然后激发光560nm/发射光590nm检测荧光值。
9.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述TF-1细胞悬浮液的浓度为1.5～2.5×105细胞/ml。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述TF-1细胞悬浮液的浓度为1.5～2.5×105细胞/ml。
11.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述TF-1细胞悬浮液的浓度为1.5～2.5×105细胞/ml。
12.根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于所述TF-1细胞悬浮液的浓度为1.5～2.5×105细胞/ml。
13.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述TF-1细胞悬浮液的浓度为2×105细胞/ml。
14.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于所述TF-1细胞悬浮液的浓度为2×105细胞/ml。
15.根据权利要求12所述的方法，其特征在于所述TF-1细胞悬浮液的浓度为2×105细胞/ml。
16.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述梯度稀释的待测样品中神经生长因子活性浓度为5～20AU/ml。
17.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述梯度稀释的待测样品中神经生长因子活性浓度为5～20AU/ml。
18.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述梯度稀释的待测样品中神经生长因子活性浓度为5～20AU/ml。
19.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述梯度稀释的待测样品中神经生长因子活性浓度为5～20AU/ml。
20.根据权利要求12所述的方法，其特征在于所述梯度稀释的待测样品中神经生长因子活性浓度为5～20AU/ml。
21.根据权利要求14所述的方法，其特征在于所述梯度稀释的待测样品中神经生长因子活性浓度为5～20AU/ml。
22.根据权利要求6、7、8、10、11、13或15中任一所述的方法，其特征在于所述梯度稀释的待测样品中神经生长因子活性浓度为5～20AU/ml。
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