CN103627790B - 肠炎沙门氏菌菌体及核酸标准物质的制备方法 - Google Patents

肠炎沙门氏菌菌体及核酸标准物质的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103627790B
CN103627790B CN201310411939.2A CN201310411939A CN103627790B CN 103627790 B CN103627790 B CN 103627790B CN 201310411939 A CN201310411939 A CN 201310411939A CN 103627790 B CN103627790 B CN 103627790B
Authority
CN
China
Prior art keywords
reference material
preparation
salmonella enteritidis
gdna
value
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201310411939.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103627790A (zh
Inventor
黄晓蓉
柯璐
郑晶
林杰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Inspection and Quarantine Technology Center of Fujian Entry Exit Inspection and Quarsntine Bureau
Original Assignee
Inspection and Quarantine Technology Center of Fujian Entry Exit Inspection and Quarsntine Bureau
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inspection and Quarantine Technology Center of Fujian Entry Exit Inspection and Quarsntine Bureau filed Critical Inspection and Quarantine Technology Center of Fujian Entry Exit Inspection and Quarsntine Bureau
Priority to CN201310411939.2A priority Critical patent/CN103627790B/zh
Publication of CN103627790A publication Critical patent/CN103627790A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103627790B publication Critical patent/CN103627790B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了肠炎沙门氏菌菌体及核酸标准物质的制备方法，其中肠炎沙门氏菌菌体标准物质的制备方法包括肠炎沙门氏菌的液体培养、鸡肉基质前处理、标准物质的制备、标准物质的包装与储存、标准物质的定值；肠炎沙门氏菌核酸标准物质的制备方法包括总gDNA的提取、总gDNA的特征性验证、SE-gDNA标准物质的制备、SE-gDNA标准物质的包装与储存、标准物质的定值。本发明提供的标准物质能够发挥包括鉴定、评价、分析、安全监控等用途，为生物特性标准物质的研制提供参考价值。

Description

肠炎沙门氏菌菌体及核酸标准物质的制备方法
技术领域
本发明属于食品检测技术领域，具体涉及肠炎沙门氏菌菌体及核酸标准物质的制备方法。
背景技术
肠炎沙门氏菌（Salmonellaenteritidis，SE）是引起食物中毒的常见致病菌，在公共卫生学上具有重要意义，家禽、蛋及肉类产品是SE的主要传播媒介，严重影响着养殖业的发展和人类健康，因此对易受SE污染的食品在流入市场前应进行严格的检测。
动物性食品安全问题被作为一个社会健康问题受到广泛的关注，与之相应的检测能力也正在不断提高，安全检测技术朝准确、快速、便捷的方向研发。检测工具，新的设备和试剂盒层出不穷，尤其是在免疫学、生物化学和分子生物学等方面更是研制出了各种新型的快速检测试剂盒，在提高沙门氏菌的检测速度，简化样品处理的繁杂步骤的同时降低了检测人员的操作要求，使其对试剂盒的利用产生依赖性。然而检测用试剂盒被广泛应用于市场，却没有统一的管理系统和规范的参照标准对其进行评估，造成这些试剂盒在质量上出现参差不齐的状况，表现在灵敏度、特异性和稳定性有所差异，使得各实验室间/各检测人员间检测结果在真实性上得不到保障，难免出现动物性食品中肠炎沙门氏菌的错检或漏检，不仅有可能导致我国进出口在国际贸易中发生重大经济损失，还有可能对人类的健康造成威胁。而目前，我国在动物性食品安全检测试剂盒上的管理基本处于空白，为了在提高肠炎沙门氏菌检测效率的同时保障实验室间以及检测人员间的检测能力，确保检测结果的有效性，必须规范对试剂盒产品的使用，填补管理上的空白，因此，研发可用于试剂盒和日常检测质量控制的标准物质势在必行。
然而，目前无论国内外对食品安全检测领域中的标准物质研究甚少，对于微生物标准物质的研究制备还是处于起步阶段，我国标准值的研制开始于20世纪80年代，研究至今我国标准物质虽已基本满足经济建设的需要，但随着科学技术的发展和新型材料设备的不断涌现，现有的标准物质品种已不能完全满足需求，尤其是在生物标准物质范围，我国研制的与食品分析有关的有证标准物质约390种，这些标准物质均为生物成分分析标准物质，主要用在食品安全、营养评价、环境卫生评价等方面。虽然我国在标准物质的研究上经过了20多年的研究，但是依然存在以下问题：种类少、重复研制现象多，在与微生物、畜禽等相关的成分标准物质的研究上还相对空白，研制的标准物质准确度不高，且很多标准物质不能提供出不确定度的参考信息。
生物标准物质分为生物成分标准物质和生物特性标准物质。菌种标准物质及菌种核酸标准物质是生物特性标准物质中较为特殊的一类，是生物标准物质研究的重要内容之一。而目前与微生物、畜禽等相关的成分标准物质的研究上还相对空白，研制的标准物质准确度不高，且很多标准物质不能提供出不确定度的参考信息。
为确保检验人员的检测能力、规范试剂盒的管理，降低食品中SE的检漏和检错率，应加大力度研制相关的生物特性标准物质，以使SE检测结果真实可靠。
发明内容
本发明的目的是为鉴定、评价、分析、安全监控食品中肠炎沙门氏菌提供标准物质，并为生物成分标准物质、生物特性标准物质的制备及验证提供参考价值。
本发明的技术方案是：
一种肠炎沙门氏菌菌体标准物质的制备方法，其特征在于：包括肠炎沙门氏菌的液体培养、鸡肉基质前处理、标准物质的制备、标准物质的包装与储存、标准物质的定值。具体步骤如下：
（1）肠炎沙门氏菌的液体培养
挑取单菌落于6mL无菌水中，涡旋振荡器上混匀，吸取1mL菌悬液于盛有100mLBPW增菌液的锥形瓶中，36±1℃培养22h；
（2）鸡肉基质前处理
鸡肉切成小块，并用剪刀挑除非肉组织，用高速组织捣碎机搅碎10min至肉糜状，收集肉糜500g/袋分装于均质袋，用拍击式均质器匀质3min后保存，选择高压蒸汽121℃，灭菌15min或钴-60灭菌，计量为6KGY；
（3）标准物质的制备
根据肠炎沙门氏菌液体培养的OD600值，用无菌生理盐水将其稀释至103级，将保护剂与稀释至103级的新鲜菌悬液按照5:1比例配制混合液，测定其pH值并用0.2M的NaOH调pH至7±0.1，于无菌均质袋中与25g鸡肉基质混合后，于拍击式均质器上拍击10s，倒入已灭菌的50mLPP瓶，轻轻旋上瓶盖，将制备好的样品于-70℃预冻5h后冻干；
（4）标准物质的包装与储存
冻干后的样品，连PP瓶一同装入铝箔袋中，在真空封口机上封口，制备好的标准物质于-20℃保存；
（5）标准物质的定值
吸取18mL无菌水对冻干物进行溶解复原，静置后全部倒入无菌带滤膜均质袋中，吸取25mL无菌磷酸盐缓冲液混合，拍击均质1min，制成1:2的初始菌悬液；用移液管吸取500μL的初始悬浮液的滤过部分于沙门氏菌显色培养基，涂布平板，静置，使液体被琼脂吸收后倒置放入培养箱中培养，36±1℃培养18~24h，计数典型菌落数，即为标准值；定值结果表示为：标准值±总不确定度。
其中，所述的步骤（3）中保护剂配方为20%脱脂奶+10%蔗糖+3%L-谷氨酸钠-水+纯水，pH值=6.7±0.1。
一种肠炎沙门氏菌核酸标准物质的制备方法，其特征在于：包括总gDNA的提取、总gDNA的特征性验证、SE-gDNA标准物质的制备、SE-gDNA标准物质的包装与储存、标准物质的定值。具体步骤如下：
（1）总gDNA的提取
取新鲜菌液，菌浓度达到0.5-1.5×109cells，提取gDNA，并进行gDNA纯度和浓度的初检测，将提取的符合要求的gDNA溶液合并混匀，利用荧光仪结合PicoGreen染料对提取的总gDNA进行浓度的测定；
（2）总gDNA的特征性验证
以invA-1、invA-2作为引物，PCR扩增后进行凝胶电泳，另取10μL的总gDNA溶液进行核酸凝胶电泳；对总gDNA的PCR反应产物进行纯化，回收纯化的样品进行克隆测序；
（3）SE-gDNA标准物质的制备
将符合标准物质制备要求的总gDNA溶液用TE溶液稀释至适当浓度，用已灭菌的小型离心管分装，使每支gDNA含量为1μg；于-70℃预冻6h后，置于冷冻干燥机冻干；
（4）SE-gDNA标准物质的包装与储存
将冻干好的样品放入塑料袋中，立即用封口机封口，贮存于-20℃；
（5）标准物质的定值
利用荧光值法进行定值，定值结果表示为：标准值±总不确定度。
其中，所述的步骤（1）总gDNA提取的纯度在1.75-1.90，浓度在70-100μg/mL范围内。
所述的步骤（2）引物invA-1、invA-2的序列为：
invA-1：5'-GTGAAATTTACGCCACGTTCGGGCAA-3'；
invA-2：5'-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3'。
本发明提供的标准物质能够发挥包括鉴定、评价、分析、安全监控等用途，为生物特性标准物质的研制提供参考价值。
本发明的有益效果及优点如下：
（1）本发明在生物活性标准物质研制的基础上添加基质，建立起一套含有鸡肉基质的肠炎沙门氏菌标准物质的制备技术。
（2）本发明的基质分为生制（钴-60辐射灭菌）、熟制（高温高压灭菌）两种类型，对两种不同物理状态下的基质采取相同的制备工艺，其一更好地符合微生物检测的实际状况，其二试探性观察生制与熟制鸡肉作为基质对菌种标准物质的影响。
（4）建立核酸标准物质的验证方法。
（3）建立起适用于标准物质的定值的方法及不确定度的评估方案，作为制备成果适用性的理论依据，给同类制作工艺提供参考。
附图说明
图1肠炎沙门氏菌菌体标准物质制备的技术路线
图2菌种生长曲线
图3生制基质稳定性试验
图4熟制基质稳定性试验
图5肠炎沙门氏菌核酸标准物质制备的技术路线
图6克隆子的测序峰图
图7测序比对结果
图8第7周gDNA电泳结果
图9第7周PCR反应物电泳结果
图10第12月gDNA电泳结果
图11第12月PCR反应物电泳结果
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，以进一步说明本发明。
实施例1：肠炎沙门氏菌菌体标准物质的制备
肠炎沙门氏菌Salmonellaenteritidis(ATCC13076)购自上海汉尼公司。肠炎沙门氏菌菌体标准物质制备的技术路线见图1。
（1）肠炎沙门氏菌的液体培养
挑取单菌落于6mL无菌水中，涡旋振荡器上混匀。吸取1mL菌悬液于盛有100mLBPW增菌液的锥形瓶中，36℃培养。
以培养时间为横坐标，以对应的OD600值为纵坐标绘制菌种生长曲线，见图2。培养时间10h-22h为菌株生长的对数期-稳定期。所以选择培养22h，此时肠炎沙门氏菌生长为稳定期。
以OD600为横坐标，其对应的菌落数对数值为纵坐标绘制浓度标准曲线（取时间为10h-22h的OD600值及菌落数对数值做浓度标准曲线）。
菌浓度标准曲线方程为：Y=9.6634X+8.0385（其中，Y值为菌浓度的对数值，X为菌液OD600）。
（2）鸡肉基质前处理
鸡肉切成小块，并用剪刀挑除非肉组织，用高速组织捣碎机搅碎10min至肉糜状，收集肉糜500g/袋分装于均质袋，用拍击式均质器匀质3min后保存，选择高压蒸汽121℃，灭菌15min或钴-60灭菌，计量为6KGY。
（3）基质对肠炎沙门氏菌的生长无影响
第一，根据《SNT1750-2006抗生素类检测MIA法》对鸡肉基质进行验证其是否残留抗生素四大类；
第二，吸取适当菌液于营养琼脂平板和血平板上，用涂抹棒涂抹均匀，取钴-60灭菌或高压蒸汽灭菌的的鸡肉糜8~9g，用无菌镊子夹取三小粒鸡肉糜间隔放置于制备好的平板上，用镊子轻轻压，36℃培养18-24h后鸡肉糜周围菌的生长无受到影响。
（4）标准物质的制备
根据肠炎沙门氏菌培养液的OD600，用无菌生理盐水将其稀释至103级，将保护剂（20%脱脂奶+10%蔗糖+3%L-谷氨酸钠-水+纯水，pH=6.71）与稀释至103级的新鲜菌悬液按照5:1比例配制混合液，测定其pH值并用0.2M的NaOH调pH值至7.0，于无菌均质袋中与25g鸡肉基质混合后，于拍击式均质器上拍击10s，倒入已灭菌的50mLPP瓶，轻轻旋上瓶盖，将制备好的样品于-70℃预冻5h后冻干。
（5）标准物质的包装与储存
冻干后的样品，连PP瓶一同装入铝箔袋中，在真空封口机上封口，制备好的标准物质于-20℃保存。
（6）标准物质的定值
吸取18mL无菌水对冻干物进行溶解复原，静置后全部倒入无菌带滤膜均质袋中，吸取25mL无菌磷酸盐缓冲液混合，拍击均质1min，制成1:2的初始菌悬液；用移液管吸取500μL的初始悬浮液的滤过部分于沙门氏菌显色培养基（法国CHROMagar）（平行吸取5次，制备5片平板），涂布平板，静置，使液体被琼脂吸收后倒置放入培养箱中培养，36℃培养18~24h，计数典型菌落，计数结果5个平行的平均值，即为标准值。
标准值结果见表1、表2。
（7）标准物质的总不确定度
第一，肠炎沙门氏菌菌落总数测定的不确定度评估
取含不同基质（高温高压灭菌基质、钴-60灭菌基质）的10份样品进行检测，每次检测作平行2次，每种基质共进行20次菌种计数的检测，计算其残差平方（SS），根据贝塞尔计算公式，计算出检测结果对数值标准偏差合并样本的标准差，以评估计数方法给标准物质带来的不确定度。计算结果为：钴-60灭菌基质的不确定度U1=0.018381；高温高压灭菌基质的不确定度U2=0.03647。
第二，肠炎沙门氏菌标准物质定值方法的不确定度评估
分别取不同基质的冻干标准物质10份，每份样品平行测量3次。计算结果为：钴-60灭菌基质的不确定度Ua=11；高温高压灭菌基质的不确定度Ub=8。
第三，电子天平称量的不确定度评估
参考测量依据：JJG99-2006《砝码检定规程》；JJG1036-2008《电子天平检定规程》；JJF1059-1999《测量不确定度评定与表示》。
试验过程中所用电子天平Satorius/德国的BS200S-WEI，最大量程为310g，测量分度d=1mg，检定分度e=10mg，线性误差△i=2mg，四角误差△c=1mg。本次试验所用的是加载最大标准砝码值为100g的F1等级砝码装置进行检测。经计算本试验用的电子天平的扩展不确定度为U=2.7934mg。相对于本标准品可忽略不计。
由以上三点可得，生制基质（钴-60灭菌）总不确定度为U=11.018381，取整为11；熟制基质（高温高压灭菌）总不确定度为U=8.03647，取整为8。因此检测结果表示时应剔除标准物质定值方法不确定度的影响。
（8）定值结果
定值结果表示为：标准值±总不确定度。
定值结果见表3、表4。
（9）菌体标准物质的均匀性
共进行了6个批次的成品制备，每批次制备两类基质各100份。各抽取15份，进行计数。结果如下：
注：Sr重复性标准差，r重复性限，RSDr相对重复性标准差，SR再现性标准差，R再现性限，RSDR相对再现性标准差
由表5统计分析结果可知，生制和熟制批次重复性标准差分别为2.185%和3.596%，再现性标准差分别为2.080%和3.514%，表明本法具有较好的重复性和再现性。
由表6说明两类基质批次间和批次内的含量差异不显著，这表明所研制的标准物质中SE的含量是均匀的。
（10）菌体标准物质的稳定性
以时间为横坐标以标准物质的菌数为纵坐标绘制曲线，见图3和图4。
结果表明：两种基质的标准物质在第一周内菌数大幅度下降，生制基质和熟制基质标准物质的菌数分别从最初的1790CFU/份和1800CFU/份下降到1120CFU/份和1230CFU/份，很不稳定。菌数在制备后一周内出现大幅度下降是由于环境突然改变，冻干给菌株造成了较大的物理性损伤，因此下降属于正常情况，而未受损菌株逐渐适应环境，因此生制基质在190天时稳定在800CFU/份，熟制基质在190天时稳定在700CFU/份。
实施例2：肠炎沙门氏菌核酸标准物质的制备
肠炎沙门氏菌核酸标准物质制备的技术路线见图5。
（1）总gDNA的提取
取新鲜菌液，菌浓度达到0.5-1.5×109cells，利用PuregeneYeast/Bact.KitB试剂盒进行gDNA的提取。使用EppendorfBioPhotometerplus进行gDNA纯度和浓度的初检测，将提取的符合要求的gDNA溶液合并混匀，利用便携式荧光仪结合PicoGreen染料对提取的总gDNA进行浓度的测定。
提取的纯度在1.75-1.90，浓度在70-100μg/mL范围内。
（2）总gDNA的特征性验证
以invA-1、invA-2（286bp）作为引物，进行PCR反应后进行凝胶电泳。另取10μL的总gDNA溶液进行核酸凝胶电泳；
利用UniversalDNAPurificationKit对总gDNA的PCR反应产物进行纯化。回收纯化的样品送至上海生工进行克隆测序。
测序结果用Chromas打开，测序峰见图6。测序峰图结果显示其信号强，无明显干扰，清晰可见。进行nucleotideblast，结果：Identities=100%，具体如图7。
（3）SE-gDNA标准物质的制备、包装与储存
将符合标准物质制备要求的总gDNA溶液用TE溶液稀释至适当浓度，用已灭菌的小型离心管分装，使每支gDNA含量为1μg。于-70℃预冻6h后，置于冷冻干燥机冻干。
（4）SE-gDNA标准物质的包装与储存
将冻干好的样品放入塑料袋中，立即用封口机封口保存。贮存于-20℃。
（5）标准物质的总不确定度
本试验的不确定度主要产生于ThePicofluorTM荧光计的测量。取30个样本，每个样本平行测试3次，以平均值进行分析，最后以观测列的平均值即估计值标准值作为不确定度的值。
经计算，单次测量结果试验的标准差=3.529，则：
=0.6442（其中n=30）。
因此，当检验结果以3次测量值的平均值表示时，其值区间分布于±0.6442ng/mL之间。这个取值区间适合于任何一次测量。
（6）标准物质的定值
利用荧光值法进行定值。定值结果表示为：标准值±总不确定度。标准值测定结果见表7。
因此该批次gDNA标准物质定值为：0.99±0.6442ng/mL。
（7）标准物质的均匀性
均匀性试验方法参照CNAS-GL03:2006《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》要求，利用荧光值法对同一个样品测定3次，其结果如表8所示。
F值=0.8357＜F0.05（14,30）=1.68，这表明在0.05显著性水平时，样品中的gDNA含量是均匀的。
（8）标准物质的稳定性追踪
模拟-20℃、4℃、25℃、60℃4个保存温度，对gDNA标准物质分组保存。每个保存温度各抽取3份样品，进行短期及长期稳定性追踪。
①短期稳定性
测定时间为：t=0（制备gDNA当天）、t=1（制备一周）、t=3、t=5、t=7。
四种保存温度下标准物质gDNA含量与t=0的gDNA含量对比，其统计结果如表9：
结果显示在-20℃、4℃、20℃条件下，1至7周标准物质含量稳定。而在60℃条件下，标准物质极不稳定。
第7周抽取样本进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图8和9，样本编号为：-20℃（198、231、287）；4℃（215、252、310）；25℃（265、267、290）；60℃（288、294、303）。结果显示：在－20℃、4℃、25℃温度下保存7周，gDNA电泳条带清晰，无明显杂带。PCR产物电泳结果显示，在-20℃、4℃、25℃，温度下保存7周均能扩增出invA。而保存温度为60℃时，虽invA特征基因能被扩增出，但gDNA电泳结果无条带。
②长期稳定性
测定的时间设为T=0（制备完成当天）、T=6（制备6个月）、T=12。
四种温度每个温度梯度抽3个样本，每个样本进行三次测量。结果以t=0为对照组，利用SPSS进行分析，其结果见表10。
由结果可知：在-20℃、和4℃保存至12个月，标准物质保持稳定。在25℃条件下保存6个月后，含量出现显著性差异，12个月后gDNA含量的变化与T=0相比出现极显著的差异，表明标准物质在25℃条件下不稳定。而保存在60℃的标准物质极不稳定。
第12月抽取样本进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图10和图11，样本编号为：-20℃（113、256、364）；4℃（307、312、345)；25℃(290、299、334)；60℃（225、276、303）。结果显示：在－20℃、4℃、25℃温度下保存12个月，gDNA电泳条带清晰，无明显杂带。PCR产物电泳结果显示，在-20℃、4℃、25℃，温度下保存12个月均能扩增出invA。而保存温度为60℃时，invA特征基因能被扩增出，而gDNA电泳结果无条带。

Claims (1)

1.一种肠炎沙门氏菌菌体标准物质的制备方法，其特征在于：包括肠炎沙门氏菌的液体培养、鸡肉基质前处理、标准物质的制备、标准物质的包装与储存、标准物质的定值，具体步骤如下：
（1）肠炎沙门氏菌的液体培养
挑取单菌落于6mL无菌水中，涡旋振荡器上混匀，吸取1mL菌悬液于盛有100mLBPW增菌液的锥形瓶中，36±1℃培养22h；
（2）鸡肉基质前处理
鸡肉切成小块，挑除非肉组织，搅碎至肉糜状，收集于均质袋，用拍击式均质器匀质后保存，选择高压蒸汽121℃，灭菌15min或钴-60灭菌，计量为6KGY；
（3）标准物质的制备
根据肠炎沙门氏菌液体培养的OD600，用无菌生理盐水将其稀释至103级，将保护剂与稀释至103级的新鲜菌悬液按照5:1比例配制混合液，测定其pH值并调pH值至7±0.1，于无菌均质袋中与25g基质混合后，均质器上拍击10s，倒入已灭菌的50mLPP瓶，轻轻旋上瓶盖，将制备好的样品于-70℃预冻5h后冻干；其中，保护剂配方为20%脱脂奶+10%蔗糖+3%L-谷氨酸钠+纯水，pH=6.7±0.1；
（4）标准物质的包装与储存
冻干后的样品，连PP瓶一同装入铝箔袋中，在真空封口机上封口，制备好的标准物质于-20℃保存；
（5）标准物质的定值
用无菌水对冻干物进行溶解复原，静置后全部倒入无菌带滤膜均质袋中，吸取25mL无菌磷酸盐缓冲液混合，拍击均质，制成初始菌悬液；用移液管吸取500μL初始菌悬液的滤过部分于沙门氏菌显色培养基，涂布平板，静置，使液体被琼脂吸收后倒置放入培养箱中培养，36±1℃培养18~24h，计数典型菌落数，即为标准值；定值结果表示为：标准值±总不确定度。
CN201310411939.2A 2013-09-11 2013-09-11 肠炎沙门氏菌菌体及核酸标准物质的制备方法 Active CN103627790B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310411939.2A CN103627790B (zh) 2013-09-11 2013-09-11 肠炎沙门氏菌菌体及核酸标准物质的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310411939.2A CN103627790B (zh) 2013-09-11 2013-09-11 肠炎沙门氏菌菌体及核酸标准物质的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103627790A CN103627790A (zh) 2014-03-12
CN103627790B true CN103627790B (zh) 2016-03-23

Family

ID=50209237

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310411939.2A Active CN103627790B (zh) 2013-09-11 2013-09-11 肠炎沙门氏菌菌体及核酸标准物质的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103627790B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107192822A (zh) * 2017-05-24 2017-09-22 中国检验检疫科学研究院 药品中沙门菌能力验证样品及其制备方法
CN107557427A (zh) * 2017-10-18 2018-01-09 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种含鱼肉基质的副溶血性弧菌标准物质
CN110596227B (zh) * 2019-08-08 2021-11-23 河北省食品检验研究院（国家果类及农副加工产品质量监督检验中心、河北省食品安全实验室） 飞行时间质谱即用型斯坦利沙门氏菌定性标准样品的制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101086008A (zh) * 2007-06-04 2007-12-12 杭州致远医学检验所有限公司 微生物检测质量控制标准物质及其制备方法
CN102719424A (zh) * 2012-05-30 2012-10-10 曹际娟 肠炎沙门氏菌核酸标准样品、其建立方法及应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101086008A (zh) * 2007-06-04 2007-12-12 杭州致远医学检验所有限公司 微生物检测质量控制标准物质及其制备方法
CN102719424A (zh) * 2012-05-30 2012-10-10 曹际娟 肠炎沙门氏菌核酸标准样品、其建立方法及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
沙门氏菌的检测技术进展;刘喆等;《中国动物传染病学报》;20121231;第20卷(第2期);第81-86页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN103627790A (zh) 2014-03-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104140994B (zh) 一种含鸡肉基质的金黄色葡萄球菌标准物质
CN103757089A (zh) 一种检测饮用水中卫生质量和gmp工厂表面卫生的atp生物发光试剂、方法及试剂盒
CN103627790B (zh) 肠炎沙门氏菌菌体及核酸标准物质的制备方法
CN105132519A (zh) 一种用于大肠杆菌定量检测的选择性培养基及大肠杆菌定量检测方法
CN101413872B (zh) 一种微生物活菌数快速检测方法
CN106755278B (zh) 人员防护装备防护性能评价用细菌标准物质及其制备方法
CN103592167B (zh) 基于荧光素酶标记工程菌的氟喹诺酮类药物残留检测方法
CN107764754A (zh) 一种微生物生物量的在线检测方法
CN109777856A (zh) 一种一万亿活芽胞每克枯草芽胞杆菌原粉活芽胞数的检测方法
CN113249428A (zh) 一种快速检测活菌量的方法
CN102183664A (zh) 基于管碟法的生物素含量测定方法
CN104330288A (zh) 一种高灵敏度测试游离生物素的方法
CN102680420A (zh) 一种快速微型化测定生物素的方法
CN103451264A (zh) 一种测定发酵乳活菌总数的方法
CN102321620A (zh) 苹果牛眼果腐病菌分子标准样品及其制备方法
CN105177109A (zh) 检测金黄色葡萄球菌的方法及试剂盒
CN108398496A (zh) 一种天然产物抗菌活性测定方法
CN102392070B (zh) 一种复合芽孢杆菌粉活菌含量的快速计数方法
CN115656060B (zh) 一种食品和乳品中叶酸的快速测定方法
CN103424370A (zh) 重金属胁迫下黄孢原毛平革菌活细胞生物量的检测方法
CN101270383A (zh) 一种番茄酱主要腐败微生物的检验方法
CN105466873A (zh) 一种发酵液中乳酸链球菌素效价的检测方法
CN102453745A (zh) 一种快速检测固体食品中细菌总数的方法
CN106119365A (zh) 一种基于微量量热法快速测定蛋壳表面菌落总数的方法
Ceccato-Antonini Microbiological Techniques and Methods for the Assessment of Microbial Contamination

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant