CN110596227B - 飞行时间质谱即用型斯坦利沙门氏菌定性标准样品的制备方法 - Google Patents

飞行时间质谱即用型斯坦利沙门氏菌定性标准样品的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种飞行时间质谱即用型斯坦利沙门氏菌定性标准样品的制备方法，采用如下配置的专用冻干基质：1640细胞培养基，添加3‑7％w/w的蔗糖和6‑10％w/w的葡聚糖。本发明制备的标准冻干品经过定性检验、均匀性检验、运输稳定性检验、储藏条件稳定性检验、飞行质谱稳定性检验，性能指标均十分良好，填补了我国在这项技术上的空白，实现了即用型质谱鉴定综合参比体系标准参考样品的国产化，并能够进一步针对食品微生物建立飞行质谱数据库，推动我国食品微生物质谱检测实现质的发展。

Description

飞行时间质谱即用型斯坦利沙门氏菌定性标准样品的制备 方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种飞行时间质谱即用型斯坦利沙门氏菌定性标准样品的制备方法。
背景技术
目前常见的食品中沙门氏菌的检测方法普遍使用传统常规培养生理生化检测方法，此方法存在不少弊端。传统常规培养生理生化法，即利用微生物的形态及常规生理生化特性进行检测，通常是包括微生物形态学以及培养特性的评价。其无特殊设备要求，并且方法经典可靠，具有准确、直观、稳定性好且假阳性低的优点。但检测周期长，费时费力，且存在漏检率，很难满足市场快速准确的检测需求。
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱是近年来发展的一种新型的分析技术，可以实现对未知微生物的快速鉴定、分型、溯源等。但目前尚没有针对食品微生物建立的飞行质谱数据库，并且缺少阳性参考样品，特别是即用型质谱鉴定综合参比体系，标准参考样品尚未实现国产化，上述问题都成为了我国食品微生物质谱检测发展的影响因素。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种飞行时间质谱即用型斯坦利沙门氏菌定性标准样品的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。
飞行时间质谱即用型斯坦利沙门氏菌定性标准样品的制备方法，包括如下步骤：
A、标准样品的初始制备：取沙门氏菌一代新鲜培养物划线接种于PCA平板，36℃培养24h；然后用无菌棉签从平板上刮取菌苔，并混悬于专用冻干基质中，液氮条件下在西林瓶中制得初始标准样品；
其中，所述专用冻干基质的配置如下：以1640细胞培养基为基础，添加3-7％w/w的蔗糖和6-10％w/w的葡聚糖；
B、标准样品的冻存制备：将上步制备好的标准样品放入真空冷冻干燥器中，按照特定的工艺参数进行冻干，即得。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤A中，添加5％w/w蔗糖和8％w/w葡聚糖。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤A中，添加3％w/w蔗糖和7％w/w葡聚糖。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤A中，添加7％w/w蔗糖和10％w/w葡聚糖。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤A中，蔗糖的分子量为342，葡聚糖的分子量介于30000-50000。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤B中，所述特定的工艺参数包括：
B-1、预冻程序：-20℃200Min，-40℃200Min；
B-2、冷冻干燥程序：-35℃360Min，Vac 130mTorr；-30℃360Min，Vac 130mTorr；-25℃480Min，Vac 130mTorr；-20℃480Min，Vac 130mTorr；-10℃480Min，Vac 130mTorr；
B-3、最终维持：-20℃，Vac 100mTorr状态。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤B中之后还包括如下附加步骤：
C、定性检验：采用至少三组不同试验设备对步骤B制备的飞行时间质谱即用型斯坦利沙门氏菌定性标准样品进行定性检验，检验步骤依据作业指导书进行，鉴定所制备标准样品质谱的一致性；
D、均匀性检验：随机抽取步骤B制备的冻干标准样品20瓶，向每瓶标准样品中加入1mL生理盐水，将沙门氏菌冻干样品充分溶解，使用全自动微生物螺旋加样系统在E50模式下涂布于MH平板，每个样品做2个平行；置36℃±1℃培养24h；鉴定样品的均匀性；
E、运输稳定性检验：将步骤B所制备的冻干沙门氏菌属标准样品，放置于37℃和室温环境即25℃摇床内，模拟实验周期为2周，分别在0d、1d、2d、3d、5d、7d、14d测试观察，每个标准样品做3个平行；检验此温度下沙门氏菌标准样品的变化能否满足定性样品稳定性要求；同时每个平行另取样，进行飞行质谱检验；
F、储藏条件稳定性检验：步骤B所制备的标准品分别放置于4℃及-20℃条件下，经过28天时间的监测，鉴定样品的储存稳定性；
G、飞行质谱稳定性检验：将每次飞行质谱检验结果，进行分析整合，确定同时期不同温度下飞行质谱检测沙门氏菌标准样品的谱图一致。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：参见下文的试验例，本发明制备的标准冻干品经过定性检验、均匀性检验、运输稳定性检验、储藏条件稳定性检验、飞行质谱稳定性检验，性能指标均十分良好，填补了我国在这项技术上的空白！实现了即用型质谱鉴定综合参比体系标准参考样品的国产化，并能够进一步针对食品微生物建立飞行质谱数据库，推动我国食品微生物质谱检测实现质的发展。
由于以往的冻干基质为乳粉，而乳粉本身的在飞行质谱鉴定中会影响沙门氏菌的鉴定，因此本研究的一项核心技术在于对新基质的开发，最终选取1640细胞培养基，并针对冻干基质的构成和冻干基质各物质间浓度关系进行确认，拿到了最终的结果；试验表明，研发成果能够确保菌株存活率指标和稳定性指标均十分优异。
附图说明
图1是实施例6中，沙门氏菌标准样品25℃、37℃稳定性趋势图。
图2是实施例8中，沙门氏菌标准样品(通过裂解)飞行质谱图。
图3是实施例8中，沙门氏菌标准样品(直接)飞行质谱图。
具体实施方式
以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。
本飞行时间质谱即用型斯坦利沙门氏菌定性标准样品，使用的菌种为斯坦利沙门氏菌CMCC 50959，来自菌种保藏中心。检验过程无需繁琐的菌株培养，只需将标准样品复溶、离心就可作为阳性飞行质谱标准样品进行参考。
在本发明试验研究中，均匀性检验、稳定性检验和定性检验等，均依照GB/T15000.3—2008《标准样品工作导则(3)标准样品定值的一般原则和统计方法》国家标准。
实施例1、冻干基质的筛选。
沙门氏菌冻存条件实验筛选，重要针对冻干基质的构成和冻干基质各物质间浓度关系进行确认，提高菌株存活率和稳定性。
因以往的冻干基质为乳粉，而乳粉本身的在飞行质谱鉴定中会影响沙门氏菌的鉴定，故重新筛选的冻干基质。
经过研发，最终选取1640细胞培养基。通过对干基质各物质间浓度关系的筛选，最终确定冻干基质为：1640细胞培养基、5％蔗糖(分子量342)、8％葡聚糖(分子量40000)。
实施例2、初步制备。
将沙门氏菌一代新鲜培养物，划线接种于PCA平板，36℃培养24h。用无菌棉签从平板上刮取菌苔混悬于冻干保护剂中，使用紫外分光光度计调解菌浓度，使用液氮于西林瓶中，制备标准样品。
实施例3、冻存工艺的筛选。
将制备好的标准样品，放置入真空冷冻干燥器中，通过不同冷冻条件的筛选，得到干燥、真空密闭性良好的即用性标准样品。
通过对不同冷冻条件的筛选，最终确定了冻干条件为：预冻程序-20℃200Min，-40℃200Min；冷冻干燥程序-35℃360Min，Vac 130mTorr；-30℃360Min，Vac 130mTorr；-25℃480Min，Vac 130mTorr；-20℃480Min，Vac 130mTorr；-10℃480Min，Vac 130mTorr；最终维持在-20℃，Vac 100mTorr状态。
实施例4、定性检验。
组织5家单位对飞行时间质谱即用型斯坦利沙门氏菌定性标准样品进行定性。依据作业指导书，对标准样品进行定性研究及飞行质谱鉴定，整合5家单位数据，保证标准样品质谱的一致性。
实施例5、均匀性检验
随机抽取冻干标准样品20瓶，向每瓶标准样品中加入1mL生理盐水，将沙门氏菌冻干样品充分溶解，使用全自动微生物螺旋加样系统在E50模式下涂布于MH平板，每个样品做2个平行。置36℃±1℃培养24h。对结果进行统计分析，评价样品的均匀性。
实施例6、运输稳定性检验。
模拟运输条件试验：将冻干的沙门氏菌属标准样品，放置于37℃和室温环境(25℃摇床内)。模拟实验周期为2周，分别在0d、1d、2d、3d、5d、7d、14d测试观察，每个标准样品做3个平行。以验证此温度下沙门氏菌标准样品的变化能否满足定性样品稳定性要求。同时每个平行另取样，进行飞行质谱检验。
结果见下表&图1。
沙门氏菌模拟运输条件试验结果
Figure BDA0002160446170000061
根据实验结果可观察，在37℃环境下保存14d内，沙门氏菌标准样品活菌数量仍能没有太大变化，14d后仍有很高活性，而在25℃保存环境下，14天内活菌含量较37℃更加稳定，含量几乎没有下降，可以满足定性样品的要求。结合上述数据沙门氏菌标准样品在非高温季节，可以常温运输，而在高温季节可以采用泡沫箱加冰袋的方式低温进行运输。
实施例7、储藏稳定性检验。
储藏条件稳定性的模拟实验：储存条件稳定性试验，分别放置于4℃及-20℃条件下，筛选适宜的储存条件，在适宜的储存条件下经过28天时间的监测样品应为稳定的。稳定性检验的时间间隔可以按先密后疏的原则安排。在使用期间内应有多个时间间隔的监测数据。同时每个平行另取样，进行飞行质谱检验。
沙门氏菌储藏稳定性试验结果
Figure BDA0002160446170000062
对本批次生产的沙门氏菌进行28天的保藏稳定性监测-20℃保藏28天复苏率为108.8％，表明-20℃条件下对沙门氏菌标准样品是稳定。根据沙门氏菌的报道，样品于-20℃条件下，保存18个月样品仍然是稳定的；4℃条件下，保藏28天复苏率为112.4％，说明沙门氏菌标准样品在冷藏条件下，仍然能够长期保存。
实施例8、飞行质谱稳定性检验.
将每次飞行质谱检验结果，导入BN软件进行分析整合，确定质谱结果稳定性。
结果见附图2、3。同时期、不同温度下飞行质谱检测沙门氏菌标准样品，结果稳定，谱图一致，说明沙门氏菌标准样品作为阳性质控品能够长期保存。
综上实施例可见，本发明制备的标准冻干品经过定性检验、均匀性检验、运输稳定性检验、储藏条件稳定性检验、飞行质谱稳定性检验，性能指标均十分良好，填补了我国在这项技术上的空白！实现了即用型质谱鉴定综合参比体系标准参考样品的国产化，并能够进一步针对食品微生物建立飞行质谱数据库，推动我国食品微生物质谱检测实现质的发展。
上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。

Claims (2)

1.飞行时间质谱即用型斯坦利沙门氏菌定性标准样品的制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
A、标准样品的初始制备：取沙门氏菌一代新鲜培养物划线接种于PCA平板，36℃培养24h；然后用无菌棉签从平板上刮取菌苔，并混悬于专用冻干基质中，液氮条件下在西林瓶中制得初始标准样品；
其中，所述专用冻干基质由如下材料组成：以1640细胞培养基为基础，添加5% w/w的蔗糖和8% w/w的葡聚糖；葡聚糖的分子量介于30000-50000；
B、标准样品的冻存制备：将上步制备好的标准样品放入真空冷冻干燥器中，按照特定的工艺参数进行冻干，即得：
步骤B中，所述特定的工艺参数包括：
B-1、预冻程序：-20℃ 200 Min，-40 ℃ 200 Min；
B-2、冷冻干燥程序：-35 ℃ 360 Min，Vac 130 mTorr ；-30 ℃ 360 Min，Vac 130mTorr；-25 ℃ 480 Min，Vac 130 mTorr ；-20 ℃ 480 Min，Vac 130 mTorr；-10 ℃ 480Min，Vac 130 mTorr；
B-3、最终维持：-20 ℃，Vac 100 mTorr状态。
2.根据权利要求1所述的飞行时间质谱即用型斯坦利沙门氏菌定性标准样品的制备方法，其特征在于：步骤B中之后还包括如下附加步骤：
C、定性检验：采用至少三组不同试验设备对步骤B制备的飞行时间质谱即用型斯坦利沙门氏菌定性标准样品进行定性检验，检验步骤依据作业指导书进行，鉴定所制备标准样品质谱的一致性；
D、均匀性检验：随机抽取步骤B制备的冻干标准样品20瓶，向每瓶标准样品中加入1mL生理盐水，将沙门氏菌冻干样品充分溶解，使用全自动微生物螺旋加样系统在E50模式下涂布于MH 平板，每个样品做2个平行；置36℃±1 ℃培养24h；鉴定样品的均匀性；
E、运输稳定性检验：将步骤B所制备的冻干沙门氏菌属标准样品，放置于37℃和室温环境即25℃摇床内，模拟实验周期为2 周，分别在0d、1d、2d、3d、5d、7d、14d测试观察，每个标准样品做3个平行；检验此温度下沙门氏菌标准样品的变化能否满足定性样品稳定性要求；同时每个平行另取样，进行飞行质谱检验；
F、储藏条件稳定性检验：步骤B所制备的标准品分别放置于4℃及-20℃条件下，经过28天时间的监测，鉴定样品的储存稳定性；
G、飞行质谱稳定性检验：将每次飞行质谱检验结果，进行分析整合，确定同时期不同温度下飞行质谱检测沙门氏菌标准样品的谱图一致。
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