CN105165805A - 无蛋白液氮细胞冻存液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种无蛋白液氮细胞冻存液及其制备方法，每100ml无蛋白液氮细胞冻存液中含有2.0-15.0g的右旋糖酐、聚蔗糖和羟乙基淀粉中的任一种、0.2-2.0g的泊洛沙姆188、10ml的DMSO，余量为RPMI-1640细胞基础培养基。本发明的无蛋白液氮细胞冻存液由化学成分组成配制，不含蛋白，细胞复苏率高，稳定性好。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种无蛋白液氮细胞冻存液及其制备方法和使用方法。
背景技术
细胞冻存技术是细胞生物学技术中一个非常重要的手段，常规的细胞冻存液中，往往需要添加一定量的动物血清或至少添加人白蛋白等以达到较好的冻存效果，使用动物血清会有动物病原污染的可能性，人白蛋白来源困难和成本高，同时也存在污染人源病原体的可能。目前细胞冻存技术的使用已远远超出科研范围，特别近年来，随着细胞治疗技术和干细胞技术在临床上的推广，临床上对更为安全的细胞冻存液的需求非常迫切，特别是很多细胞需要长期保存。液氮冻存是保持细胞活性的最有效的方法，开发更为安全的无蛋白液氮细胞冻存液有着非常重要的意义。
发明内容
本发明主要提供了一种无蛋白液氮细胞冻存液及其制备方法和使用方法，由化学成分组成配制，不含蛋白，细胞复苏率高，稳定性好。其技术方案如下：
一种无蛋白液氮细胞冻存液，其特征在于：每100ml无蛋白液氮细胞冻存液中含有2.0-15.0g的右旋糖酐、聚蔗糖和羟乙基淀粉中的任一种、0.2-2.0g的泊洛沙姆188、10ml的DMSO，余量为RPMI-1640细胞基础培养基。
优选的，每100ml无蛋白液氮细胞冻存液中含有6.0g的右旋糖酐。
优选的，所述右旋糖酐的分子量为6-8万，右旋糖酐是以糖基为聚合单元的多羟基亲水性分子。
优选的，每100ml无蛋白液氮细胞冻存液中含有1.0g的泊洛沙姆188。
一种无蛋白液氮细胞冻存液的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取配方量的右旋糖酐，溶解于70％量的RPMI-1640细胞基础培养基中；
(2)在上述溶液中添加配方量的泊洛沙姆188；
(3)添加配方量的DMSO，然后添加剩余的RPMI-1640细胞基础培养基；
(4)在无菌条件下将上述混合液先用0.45μm滤膜进行澄清过滤，然后再用0.22μm滤膜进行过滤除菌，即得到无蛋白液氮细胞冻存液。
这种无蛋白液氮细胞冻存液的使用方法之一，具体的为，取淋巴细胞或间充制干细胞，用细胞洗涤液洗涤后，调整至每管中含有106个细胞，离心去除洗涤液，每管中加入1ml无蛋白液氮细胞冻存液悬浮细胞，然后用程序降温盒将含有悬浮细胞的无蛋白液氮细胞冻存液于-80℃在冰箱中冻存，第二天转移至液氮中保存即可。
采用上述无蛋白液氮细胞冻存液及其制备方法和使用方法，本发明具有以下优点：
本发明的无蛋白液氮细胞冻存液，完全由化学成分组成配制，不含蛋白，细胞复苏率高，能达到90％以上；因不添加人白蛋白、动物血清等，减少了细胞感染病原的可能性，将配好的细胞冻存液采用分级过滤的方法进行制备，避免高温消毒引起成分的破坏，导致对被冻存细胞在的毒性。该配方和制备方法达到对细胞非常好的冻存效果的同时，生产成本低，操作简化。
具体实施方式
右旋糖酐系蔗糖经肠膜状明串珠菌-1226(Leuconostocmesenteroides)发酵合成的一种高分子葡萄糖聚合物，经处理精制而得。由于聚合的葡萄糖分子数目不同，而产生不同分子量的产品。有高分子右旋糖酐(平均分子量10万-20万)、中分子右旋糖酐(平均分子量6万-8万)、低分子右旋糖酐(平均分子量2万-4万)小分子右旋糖酐(平均分子量1万-2万)。右旋糖酐在临床上有着非常广泛的用途，主要用作血浆代用品：中分子右旋糖酐用于出血性休克、创伤性休克及烧伤性休克等。低、小分子右旋糖酐，能改善微循环，预防或消除血管内红细胞聚集和血栓形成等，亦有扩充血容量作用。中分子右旋糖酐在其它领域也有着非常广泛的用途，最常用的是可用做淋巴细胞分离液的主要成分，鉴于其独特的天然亲水性高分子材料，我们尝试它用作细胞冻存液的组分。
泊洛沙姆188是一种常见的高分子药用辅料，性状为白色腊状固体或无色液体，固体密度为1.06g/cm3，为非离子型表面活性剂，是聚氧乙烯和聚氧丙烯的共聚物，平均分子量在7680-9510道尔顿。泊洛沙姆188水溶性非常好，是非常常用的一种药用辅料；具有较佳的乳化能力，常被用作药物的乳化剂；会形成胶束，可用作增溶剂，增加某些难溶药物的溶解度；可作为固体分散载体，增加药物的润湿性，提高内在溶解性。泊洛沙姆188安全性非常好，低毒性，无刺激过敏性，生物相容性和化学稳定性非常好，不引起溶血。近年来的研究表明，它对细胞膜封闭起到一定作用，可预防成年人骨骼肌坏死，治疗脑损伤，可以提高细胞存活率，它的主要功能是稳定由多种因素引起的细胞膜缺陷。鉴于泊洛沙姆188独特的特性，我们尝试用它作为细胞冻存液的组分。
本发明在现有的RPMI-1640细胞基础培养基的基础上添加右旋糖酐、泊洛沙姆188和DMSO，配制成一种不含有蛋白的细胞冻存液。
具体实施例
实施例1
1.无蛋白液氮细胞冻存液的配制
一种无蛋白液氮细胞冻存液的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取6.0g的右旋糖苷，溶解于70ml的RPMI-1640细胞基础培养基中；
(2)在上述溶液中添加1.0g的泊洛沙姆188；
(3)添加10mlDMSO，然后添加RPMI-1640细胞基础培养基定容至100ml；
2.无蛋白液氮细胞冻存液的配制和制备方法，先在非无菌条件下将上述混合液先用0.45μm滤膜进行澄清过滤，然后在无菌条件下再用0.22μm滤膜进行过滤除菌，即得到无蛋白液氮细胞冻存液。
实施例2
1.无蛋白液氮细胞冻存液的配制
一种无蛋白液氮细胞冻存液的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取4.0g的右旋糖苷，溶解于70ml的RPMI-1640细胞基础培养基中；
(2)在上述溶液中添加2.0g的泊洛沙姆188；
(3)添加10mlDMSO，然后添加RPMI-1640细胞基础培养基定容至100ml；
2.无蛋白液氮细胞冻存液的配制和制备方法，先在非无菌条件下将上述混合液先用0.45μm滤膜进行澄清过滤，然后在无菌条件下再用0.22μm滤膜进行过滤除菌，即得到无蛋白液氮细胞冻存液。
实施例3
1.无蛋白液氮细胞冻存液的配制
一种无蛋白液氮细胞冻存液的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取12.0g的右旋糖酐，溶解于70ml的RPMI-1640细胞基础培养基中；
(2)在上述溶液中添加0.5g的泊洛沙姆188；
(3)添加10mlDMSO，然后添加RPMI-1640细胞基础培养基定容至100ml；
2.无蛋白液氮细胞冻存液的配制和制备方法，先在非无菌条件下将上述混合液先用0.45μm滤膜进行澄清过滤，然后在无菌条件下再用0.22μm滤膜进行过滤除菌，即得到无蛋白液氮细胞冻存液。
对比细胞冻存液(含蛋白)
1.冻存液的配方和配制方法
将DMSO、胎牛血清和RPMI-1640培养基按照体积比为1:2:7的比例配制成100ml的冻存液，除菌过滤。
细胞活率测试
取实施例1-3及对比细胞冻存液，分别冻存冻存人淋巴细胞，冻存4周后进行细胞复苏，进行以下细胞活率分析操作：
将冻存的细胞于37℃水浴复苏，使其在2分钟内复苏，用RPMI-1640基础培养基稀释，取100μl细胞悬液和100μl的台盼兰染液混合，染色分析细胞活率，多做几组，取平均值。
表1细胞活率
由表1可知，用本发明制备的无蛋白液氮细胞冻存液冻存的细胞活率均达到90％以上，而使用对比冻存液冻存的细胞活率为88％左右，说明本发明的无蛋白液氮细胞冻存液,复苏效率高，适于细胞的长期保存。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种无蛋白液氮细胞冻存液，其特征在于：每100ml无蛋白液氮细胞冻存液中含有2.0-15.0g的右旋糖酐、聚蔗糖和羟乙基淀粉中的任一种、0.2-2.0g的泊洛沙姆188、10ml的DMSO，余量为RPMI-1640细胞基础培养基。
2.根据权利要求1所述的无蛋白液氮细胞冻存液，其特征在于：每100ml无蛋白液氮细胞冻存液中含有6.0g的右旋糖酐。
3.根据权利要求2所述的无蛋白液氮细胞冻存液，其特征在于：所述右旋糖酐的分子量为6-8万，右旋糖酐是以糖基为聚合单元的多羟基亲水性分子。
4.根据权利要求1所述的无蛋白液氮细胞冻存液，其特征在于：每100ml无蛋白液氮细胞冻存液中含有1.0g的泊洛沙姆188。
5.一种如权利要求1所述的无蛋白液氮细胞冻存液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)称取配方量的右旋糖酐，溶解于70％量的RPMI-1640细胞基础培养基中；
(2)在上述溶液中添加配方量的泊洛沙姆188；
(3)添加配方量的DMSO，然后添加剩余的RPMI-1640细胞基础培养基；
(4)在无菌条件下将上述混合液先用0.45μm滤膜进行澄清过滤，然后在无菌条件下再用0.22μm滤膜进行过滤除菌，即得到无蛋白液氮细胞冻存液。
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