KR101160198B1 - 췌장 소도의 분리방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 적출한 췌장의 췌관 내에 단백질분해효소 저해제를 포함하는 보호액을 주입하는 단계(단계 1), 보호액이 주입된 췌장을 분해하는 단계(단계 3) 및 분해된 췌장 조직을 밀도구배제를 포함하는 정제액을 이용하여 정제하는 단계(단계 4)를 포함하는 췌장 소도의 분리방법을 제공한다. 또한, 췌관 내 주입용 보호액, 2층법용 췌장 보존액 및 소도 정제액을 제공한다.

Description

췌장 소도의 분리방법{METHOD OF SEPARATING PANCREATIC ISLET}

본 발명은 췌장 소도 이식에 있어서 중요 기술인 췌장 소도의 분리방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 췌장 소도의 분리에 있어서 매우 적합하게 사용할 수 있는 췌관(pancreatic duct) 내 주입용 보호액, 2층법용 췌장 보존액 및 췌장 소도 정제액에 관한 것이다.

인슐린을 투여하지 않으면 생명을 유지할 수 없는 이른바 인슐린 의존 상태에 있는 1형 당뇨병의 환자에 대해서, 췌장 소도 이식이라는 기술이 사회적으로 큰 주목을 끌고 있으며, 주로 유럽 및 미국에서 임상 치료법으로서 확립되고 있다.

췌장 소도 이식이란, 생체에서의 혈당 조절에 중심적 역할을 하고 있는 세포 집단의 췌장 소도를 문맥(門脈, portal vein) 내에 주입하는 세포 조직 이식을 의미한다. 소도 이식은 이식 수증자에게 침해가 적으므로, 1형 당뇨병 환자에게 있어 가장 이상적인 치료법으로 간주되고 있다.

2000년에 캐나다 에드몬톤(Admonton)에 있는 앨버트(Alberta) 대학에서 임상 소도 이식 치료의 성공이 보고되었다. 상기 보고 이래로 4년 동안 약 300 건의 소도 이식이 유럽 및 미국을 중심으로 행해져 왔다. 이러한 소도 이식은 앨버트 대학에서 확립된 이른바 「에드몬톤 프로토콜」을 기본으로 하여 실시되고 있다.

그러나, 지금까지의 기술로는 심지어 유럽 및 미국에서 행해지고 있는 뇌사 기증자로부터의 소도 이식에 대해서도 안정된 소도 수량을 얻지 못했고, 소정의 경우에서는 이식된 소도가 효과적으로 기능을 하지 않았다. 게다가 뇌사 기증자보다 조건이 더욱 좋지 않은 심장정지 기증자로부터의 소도 이식은 세계적으로도 거의 성공한 예가 없고, 심장정지 기증자로부터의 소도 이식은 지금까지 사실상 불가능하였다.

췌장 소도 이식의 성공률을 높이기 위해, 또한 심장정지 기증자로부터의 소도 이식을 성공시키기 위해서는 이식에 적절한 췌장 소도를 많이 이식시키는 것이 중요하다. 따라서, 이식가능한 췌장 소도의 수량을 향상시키기 위해 소도의 분리 기술의 개선이 강하게 요구되고 있다.

한편, 이식의 의학적 치료에 있어서, 이식 후 장기 이식 환자에게 우리나스타틴(ulinastatin) 또는 그 대체물을 투여하는 방법이 보고되고 있다(일본 공개특허 제2002－20309호 참조).

또한, 이식용 장기를 관류 또는 보존하기 위한 용액이 보고되어, 폐 이식에 있어서 뛰어난 효과가 확인되고 있다(일본 공개특허 평6－40801호 참조).

그러나, 소도 이식을 위한 최적 수단, 특히 소도의 분리 및 정제 기술에 관한 최적 수단은 아직 밝혀지지 않았다.

본 발명이 해결하려고 하는 과제

본 발명의 목적은 이식가능한 소도의 수량(yield)을 향상시킬 수 있는 소도의 분리 기술을 제공하는 것이다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명자들은 소도의 수량 향상을 주된 목적으로 하여 여러 가지의 연구를 거듭 수행한 결과, 특정 용액 및 방법을 이용함으로써 이식가능한 소도의 수량이 향상됨을 발견하였다. 본 발명자들은 더욱 예의 연구하여 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 하기와 같은 분리방법 및 용액에 관한 것이다.

항 1： 적출한 췌장의 췌관(pancreatic duct) 내에 단백질분해효소(protease) 저해제를 포함하는 보호액을 주입하는 단계(단계 1);

상기 보호액이 주입된 췌장 내에 효소 용액을 주입하여 췌장을 분해하는 단계(단계 3); 및

상기 분해된 췌장 조직을 밀도구배제(density gradient reagent)를 포함하는 정제액을 이용하여 정제하는 단계(단계 4)를 포함하는 췌장 소도 분리방법.

항 2：항 1에 있어서, 단계 1의 상기 보호액은 장기 중량 1 g 당 약 0.1~10 ml의 양으로 췌관 내에 주입되는 분리방법.

항 3：항 1 또는 2에 있어서, 단백질분해효소 저해제를 포함하는 보호액의 칼륨 농도는 약 4~50 mmol/L인 분리방법.

항 3A：항 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 단백질분해효소 저해제를 포함하는 보호액은 트레할로스(trehalose)를 더 포함하는 분리방법.

항 4：항 1 내지 3A 중 어느 하나에 있어서, 상기 보호액이 주입된 췌장을 2층법에 의해 보존시키는 단계(단계 2)를 더 포함하는 분리방법.

다시 말하면, 적출한 췌장의 췌관 내에 단백질분해효소 저해제를 포함하는 보호액을 주입하는 단계(단계 1);

상기 보호액이 주입된 췌장을 2층법에 의해 보존시키는 단계(단계 2);

상기 보호액이 주입된 췌장 내에 효소 용액을 주입하여 췌장을 분해하는 단계(단계 3); 및

상기 분해된 췌장 조직을 밀도구배제를 포함하는 정제액을 이용하여 정제하는 단계(단계 4)를 포함하는 췌장 소도 분리방법.

항 5：항 4에 있어서, 상기 단계 2의 2층법은 (i) 과불화탄소(perfluorocarbon)용액 및 (ⅱ) 단백질분해효소 저해제를 포함하고 약 4~50 mmol/L의 칼륨 농도를 갖는 보존액을 이용하는 2층법인 분리방법.

항 5A：항 5에 있어서, 상기 보존액(ⅱ)은 트레할로스를 더 포함하는 분리방법.

항 6：항 1 내지 5A 중 어느 하나에 있어서, 단계 4의 정제액은 트레할로스를 더 포함하는 분리방법.

항 7：항 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 단계 4의 밀도구배제는 요딕사놀(iodixanol)인 분리방법.

항 8：항 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 단계 4의 정제액은 단백질분해효소 저해제를 더 포함하는 분리방법.

항 8A：항 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 단백질분해효소 저해제는 우리나스타틴(ulinastatin), 메실산 가벡세이트(gabexate mesilate) 및 메실산 나파모스타트(nafamostat mesilate)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상인 분리방법.

항 9：단백질분해효소 저해제를 포함하는 췌관 내 주입용 보호액.

다시 말하면, 단백질분해효소 저해제를 포함하는 보호액을 소도 분리 동안 췌관 내에 주입하여 사용하는 방법. 상기 단백질분해효소 저해제는 바람직하게는 우리나스타틴, 메실산 가벡세이트 및 메실산 나파모스타트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상이다.

항 10：항 9에 있어서, 칼륨 농도가 약 4~50 mmol/L인 보호액.

항 10 A：항 9 또는 10에 있어서, 트레할로스를 더 포함하는 보호액.

항 11：단백질분해효소 저해제를 포함하고 칼륨 농도가 약 4~50 mmol/L인 2층법용 췌장 보존액.

다시 말하면, 단백질분해효소 저해제를 포함하고 칼륨 농도가 약 4~50 mmol/L인 보존액을 소도 분리 동안 2층법에 의해 췌장 보존에 사용하는 방법. 상기 단백질분해효소 저해제는 바람직하게는 우리나스타틴, 메실산 가벡세이트, 및 메실산 나파모스타트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상이다.

항 11 A： 항 11에 있어서, 트레할로스를 더 포함하는 보존액.

항 12：밀도구배제 및 트레할로스를 포함하는 췌장 소도의 정제액.

다시 말하면, 밀도구배제 및 트레할로스를 포함하는 용액을 소도 분리 동안 소도의 정제에 사용하는 방법.

항 13：항 12에 있어서, 밀도구배제가 요딕사놀인 정제액.

다시 말하면 요딕사놀 및 트레할로스를 포함하는 정제액.

항 14：항 12 또는 13에 있어서, 단백질분해효소 저해제를 더 포함하는 정제액.

다시 말하면, 항 12 또는 13에 있어서, 밀도구배제, 트레할로스 및 단백질분해효소 저해제를 포함하는 정제액. 상기 단백질분해효소 저해제는 바람직하게 우리나스타틴, 메실산 가벡세이트, 및 메실산 나파모스타트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상이다.

또한, 본 발명은 하기 실시형태를 포함한다.

항 15：하기와 같은 단계를 포함하는 췌장 소도의 분리방법：

적출한 췌장의 췌관 내에 트립신 저해제를 포함하는 조직 보호액 또는 보존액을 주입하는 단계(단계 1);

상기 보호액 또는 보존액이 주입된 췌장 내에 콜라게나제(collagenase) 용액을 주입하여 췌장을 팽화(distending)시키는 단계(단계 2)；

상기 팽화된 췌장 내의 용액의 온도를 상승시켜 콜라게나제를 활성화하고 췌장 조직을 분해하는 단계(단계 3)；

분해된 췌장 조직을 회수하는 단계(단계 4); 및

회수된 췌장 조직으로부터 소도를 분리하여 소도를 정제하는 단계(단계 5).

항 16：항 15에 있어서, 상기 단계 5는 하기와 같이 단계 5-1 ~ 5-3을 포함하는 분리방법：

밀도구배제가 첨가된 조직 보호액 또는 보존액을 포함하는 정제액에 밀도구배시키는 단계(단계 5-1)；

밀도구배된 정제액에 회수된 췌장 조직을 첨가하는 단계(단계 5-2); 및

췌장 조직이 첨가된 정제액을 원심분리하여 췌장 조직으로부터 소도를 분리함으로써 소도를 정제하는 단계(단계 5-3).

항 17：항 16에 있어서, 상기 단계 5-1이 하기 단계 5-1′인 분리방법：

트립신 저해제 및 밀도구배제를 조직 보호제 또는 보존액에 첨가시킨 정제액에 밀도구배시키는 단계(단계 5-1′).

항 18：항 16 또는 17에 있어서, 밀도구배제는 요딕사놀인 분리방법.

항 19：항 15 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 하기 단계를 더 포함하는 분리방법：

상기 보호액 또는 보존액이 주입된 췌장을 과불화탄소(perfluorocarbon)를 포함하는 층 및 트립신 저해제를 포함하는 조직 보호액 또는 보존액을 포함하는 층의 2층이 형성된 용기 내에 보존하는 단계(단계 1-2).

항 20：항 15 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 트립신 저해제는 우리나스타틴인 분리방법.

항 21：항 15 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 조직 보호액 또는 보존액의 칼륨 농도는 4~50 mmol/L인 분리방법.

항 22：칼륨 농도가 4~50 mmol/L인 조직 보호액 또는 보존액에 요딕사놀을 첨가하여 이루어진 췌장 소도 정제액.

항 23：항 22에 있어서, 트립신 저해제가 더 첨가된 정제액.

항 24：항 23에 있어서, 상기 트립신 저해제는 우리나스타틴인 정제액.

이하, 본 발명에 대해, 더욱 상세하게 설명한다.

I. 췌장 소도의 분리방법

본 발명에 있어서의 췌장 소도의 분리방법은 하기와 같은 단계를 포함한다:

적출한 췌장의 췌관 내에 단백질분해효소 저해제를 포함하는 보호액을 주입하는 단계(1);

상기 보호액이 주입된 췌장 내에 효소 용액을 주입하여 췌장을 분해하는 단계(3); 및

상기 분해된 췌장 조직을 밀도구배제를 포함하는 정제액을 이용하여 정제하는 단계(4).

또한, 본 발명은 하기와 같은 단계를 더 포함하는 방법도 포함한다：

상기 보호액이 주입된 췌장을 2층법에 의해 보존시키는 단계(2).

I(1). 췌관 내에 보호액을 주입하는 단계

본 발명의 분리방법은 기증자로부터 적출된 췌장의 췌관 내에 단백질분해효소 저해제를 포함하는 보호액을 주입하는 것을 포함한다. 췌관 내에 단백질분해효소 저해제를 포함하는 보호액을 주입함으로써, 췌장 조직이 적절히 보호되어 이식에 적절한 췌장 소도의 수량이 증가한다.

췌관 내 보호액의 주입량은 장기 상태 등에 따라 적절하게 설정할 수 있으나, 장기 중량 1 g 당 약 0.1~10 ml정도, 바람직하게는 약 0.1~2 ml 정도, 더욱 바람직하게는 약 1~1.5 ml 정도이다.

이러한 양을 주입하는 것은 보호액을 췌장 전체의 췌관 구석구석까지 신속하게 퍼지게 할 수 있어, 이로 인해 질 좋은 소도 수량이 증가하는 점에서 바람직하다.

상기 단백질분해효소 저해제는 적절하게 선택될 수 있으나, 우리나스타틴, 메실산 가벡세이트 및 메실산 나파모스타트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상이 훨씬 더 많은 소도 수량을 얻을 수 있다는 점에서 더욱 바람직하다.

상기 보호액은 저칼륨 농도를 갖는 것이 이식가능한 소도의 수량을 향상시킬 수 있는 점에서 바람직하다.

구체적으로는 보호액 1000 ml 당 칼륨 농도가 4~50 mM, 특히 10~50 mM 정도인 것이 바람직하다.

상기 보호액은 트레할로스를 더 포함하는 것이 이식가능한 소도의 수량을 향상시킬 수 있는 점에서 바람직하다.

보호액의 주입의 시점은 적절하게 설정할 수 있지만, 가능한 한 빠르게 수행하는 것이 바람직하고, 췌장을 적출한 직후인 것이 바람직하다.

보호액의 주입 방법은 적절하게 설정할 수 있으며, 예를 들면 적출한 췌장에 카테터(catheter)를 삽입하여 펌프로 주입 압력을 조절하는 동안 상기 카테터를 통해 주입할 수 있다.

삽입하는 카테터의 수는 적절하게 설정할 수 있으나, 바람직하게는 1개가 사용된다. 단일 카테터를 사용하면 장기 내에 주입하는 용액의 누락을 최소화하고, 상기 용액의 주입을 더욱 확실하게 실시할 수 있으며, 또한 장기의 손상도 감소시킬 수 있다.

I(2). 2층법을 이용하여 보존하는 단계

췌관 내에 보호액을 주입한 후 췌장은 2층법을 이용하여 보존하는 것이 바람직하다.

2층법은 용기 내에 과불화탄소용액과 보존액을 넣어 2층을 형성시킨 후, 용기 내에 산소를 공급하고 상기 용기 내에 췌장을 침지 보존함으로써 실시할 수 있다. 과불화탄소용액과 보존액과의 비율은 부피비로 1:1 정도이다. 산소의 공급은 적어도 30분 이상 실시하는 것이 바람직하다.

2층법을 이용하여 췌장을 보존함으로써 조직의 생존력(viability)을 높게 유지시킬 수 있다.

2층법에서 사용하는 보존액은 단백질분해효소 저해제를 포함하는 것이 바람직하다. 이 단백질분해효소 저해제를 포함하는 보존액을 사용함으로써 소도 수량을 향상시킬 수 있다.

상기 단백질분해효소 저해제는 적절히 선정할 수 있으나, 우리나스타틴, 메실산 가벡세이트 및 메실산 나파모스타트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상이 더 많은 소도 수량을 얻을 수 있는 점에서 특히 적합하다.

상기 보존액은 저칼륨 농도인 것이 바람직하다. 구체적으로 4~50 mmol/L 정도, 특히 10~50 mmol/L 정도인 것이 바람직하다.

저칼륨 농도의 보존액의 사용은 수득할 수 있는 소도의 수량을 더욱 증가시킬 수 있다.

게다가 보존액은 트레할로스를 더 포함하는 것이 바람직하다. 트레할로스를 포함한 보존액의 사용은 수득할 수 있는 소도의 수량을 더욱 증가시킬 수 있다.

I(3). 췌장을 분해하는 단계

보호액이 주입된 췌장 또는 2층법에 의해 보존된 췌장은 다음으로 췌장 조직 을 분해시킨다.

분해(degradation) 즉, 소화(digestion)는 예를 들면 효소 용액을 췌장의 췌관 내에 주입하여 췌장을 팽화시킨 후, 효소 용액의 온도를 상승시켜 효소를 활성화시킴으로써 수행될 수 있다.

효소 용액의 주입은 예를 들면 펌프를 이용해 주입 압력을 조절하면서 효소 용액을 주췌관에 주입함으로써 수행될 수 있다. 상기 효소 용액은 보호액 주입에 사용된 것과 같은 카테터를 통해 주입시킬 수 있다.

효소 용액으로서는 예를 들면 콜라게나제 용액 등을 사용할 수 있다.

췌장에 효소 용액을 주입한 후, 적절한 장치를 이용하여 용액의 온도를 상승시킴으로써 분해를 개시할 수 있다.

예를 들면 콜라게나제 용액을 이용하는 경우, 팽화된 췌장을 리코르디 챔버(Ricordi chamber)에 넣고 분해 회로를 용액으로 채운 후 폐쇄계로 한다. 용액을 펌프로 순환시켜 용액의 온도를 체온 근처인 37 ℃ 정도로 상승시킨다. 온도가 상승하면 췌장 조직 내에 주입된 콜라게나제가 활성화되어 그 결과 세포와 세포를 결합하고 있는 조직을 형성하는 콜라겐의 용해를 통해 췌장 조직이 분해된다.

분해는 소도를 구성하는 세포가 응집하고 있는 형태를 유지한 채 소도의 주위로부터 췌외분비선 조직만이 소도의 주위로부터 해리하는 시점에서 정지된다.

용액의 온도를 내림으로써 분해를 정지시킬 수 있다. 또한, 혈청 단백질을 첨가하여 효소를 비활성화시킴으로써 분해를 정지시킬 수 있다.

예를 들면 회로를 개방계로 변환시켜 사람 알부민을 포함하는 실온 용액을 회로 내에 통하게 함으로써 분해를 정지시킬 수 있다. 실온 용액의 통과는 용액의 온도를 낮출 수 있고, 또한 효소를 희석시킬 수 있다. 또한, 혈청 단백질을 첨가함으로써 효소의 활성을 저하시킬 수 있다.

분해가 정지된 후에는 췌장 조직을 회수한다. 상기 회수한 췌장 조직은 정제하기 전에 원심분리기로 원심 세척 및 농축하는 것이 바람직하다.

I(4). 정제 단계

정제는 소도가 췌외분비선 조직에 비해 더 가벼운 비중을 갖는다는 사실을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들면 밀도구배 즉, 비중농도구배가 형성된 용액 내에 분해된 췌장 조직을 첨가하여 밀도구배원심법(density gradient and centrifugation)에서 소도를 췌외분비선조직으로부터 분리함으로써, 소도를 정제할 수 있다.

예를 들면 하기와 같은 순서로 수행될 수 있다.

우선, 밀도구배제를 포함하는 정제액 내에 밀도구배를 형성시킨다.

다음으로, 밀도구배가 형성된 정제액 내에 분해된 췌장 조직을 첨가한다.

다음으로, 분해된 췌장 조직이 첨가된 정제액을 밀도구배원심법에 의해 원심분리한다. 이 원심분리에 의해 소도를 외분비선조직으로부터 분리하고, 상기 소도는 회수된 췌장 조직으로부터 분리된다.

밀도구배제는 저점도 용액을 형성할 수 있는 것이 바람직하다. 적합한 밀도구배제로는 요딕사놀(Optiprep^TM) 및 N,N′-비스(2,3-디하이드록시프로필)-5-[N-(2,3-디하이드록시프로필)아세토아마이도]-2,4,6-트리요오도-이소프탈아마이드)(N, N′-Bis(2,3-dihydroxypropyl)-5-〔N-(2,3-dihydroxypropyl)acetoamido〕-2,4,6-triiodo-isophthalamide)(Nycodenz^®)를 포함한다.

또한, 정제액은 부가적으로 단백질분해효소 저해제를 포함하는 것이 바람직하다. 단백질분해효소 저해제를 포함하는 정제액은 소도의 수량을 더욱 향상시킬 수 있다.

밀도구배는 연속 밀도구배 또는 비연속 밀도구배일 수 있으나, 연속 밀도구배가 더욱 많은 소도를 회수할 수 있기 때문에 바람직하다.

상기 밀도구배는 적절한 공지의 방법으로 형성시킬 수 있다. 또한, 연속 비중 형성 장치와 같은 적절한 장치를 이용할 수 있다.

또한, COBE2991와 같은 혈구 세척 장치도 정제에 이용될 수 있다.

예를 들면 밀도구배제를 이용하여 COBE2991 내에 밀도구배를 형성하고, 세척 및 농축 후 상기 분해된 췌장 조직을 첨가하고, 연속밀도구배원심법에 의해 소도를 외분비선조직으로부터 분리한 후, COBE2991 내에서 용액을 각각의 분획으로 회수할 수 있다. 분리 후에 상기 용액의 세균 조사를 수행하여 소도를 포함하는 분획을 판정한 후 소도를 회수한다.

이러한 정제된 췌장 소도의 회수로 인해 일련의 분리 단계가 종료된다.

Ⅱ. 췌관 내 주입용 보호액

소도 이식을 위해 소도를 분리하는 동안 본 발명의 보호액을 췌관 내에 주입하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 보호액은 상술한 본 발명의 분리방법에 있어서 단백질분해효소 저해제를 포함하는 보호액으로서 매우 적합하게 이용될 수 있다.

본 발명의 보호액은 단백질분해효소 저해제를 조직 보호액 또는 보존액에 첨가함으로써 얻을 수 있다.

Ⅱ-1. 단백질분해효소 저해제

본 발명에서 사용되는 단백질분해효소 저해제는 단백질분해효소 저해 활성을 갖는 것이면 그 유래 및 종류는 특별히 한정되지 않는다. 공지된 단백질분해효소 저해제를 적합하게 사용할 수 있으나, 트립신 저해 활성을 갖는 트립신 저해제가 더욱 바람직하다.

단백질분해효소 저해제의 예로는 우리나스타틴(Miraclid^TM), 4-[2-아미노에틸벤젠설포닐]플루오라이드(AEBSF, Pefabloc^TM), 메실산 가벡세이트(FOY^TM) 및 메실산 나파모스타트(Fusan^TM)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상을 포함한다. 이 중, 우리나스타틴, 메실산 가벡세이트 및 메실산 나파모스타트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상을 사용하는 것이 소도 수량을 더욱 향상시키는 관점에서 바람직하다. 또한, 우리나스타틴이 및 메실산 가벡세이트는 항염증 활성에 있어서도 바람직하다.

보호액에 첨가하는 단백질분해효소 저해제의 첨가 속도는 본 발명의 효과를 달성하는 범위 내에서 저해제의 종류에 따라 적절하게 설정할 수 있다. 단백질분해효소 저해제가 우리나스타틴인 경우에는 상기 첨가 속도는 10,000~100,000 U/L 정도, 바람직하게는 50,000~100,000 U/L 정도이다. 상기 단백질분해효소 저해제가 메실산 가벡세이트일 경우에는 100~10000 mg/L 정도, 바람직하게는 500~2000 mg/L 정도이다.

Ⅱ-2. 조직 보호액 또는 보존액

조직 보호액 또는 보존액은 조직(장기 및 세포 포함)의 보호 또는 보존을 위하여 사용되는 공지의 용액으로부터 적절히 선택할 수 있다.

예를 들면, 유로-콜린스 용액(Euro－Collins solution), UW 용액(University of Wisconsin solution), ET-Kyoto 용액, LPDG 용액(Low-Potassium Dextran Glucose solution), HTK 용액(Custodiol^TM) 등을 사용할 수 있다.

또한, 일실시예로서 하기와 같은 조성을 갖는 용액이 제공될 수 있다.

조직 보호액 또는 보존액(예 1)

나트륨(Na⁺) 10~140 mmol/L

칼륨(K⁺) 4~140 mmol/L

마그네슘(Mg^{2 +}) 0~4 mmol/L

칼슘(Ca^{2 +}) 0~2 mmol/L

인산(H₂PO₄ ^- 또는 HPO₄ ^{2 -}) 12~65 mmol/L

Cl^-, HCO₃ ^- , CO₃ ^{2 -}, 유기산 또는 유기산 음이온 15~150 mmol/L

히드록시에틸 전분 0~80 g/L

트레할로스 0~240 mmol/L

조직 보호액 또는 보존액(예 2)

나트륨(Na⁺) 10~140 mmol/L

칼륨(K⁺) 4~140 mmol/L

히드록시에틸 전분 0~80 g/L

글루타치온　 0~10 mmol/L

아데노신　　 0~10 mmol/L

락토비오네이트(Lactobionate) 0~140 mmol/L

라피노오스(Raffinose) 0~50 g/L

조직 보호액 또는 보존액(예 3)

나트륨(Na⁺) 80~120 mmol/L

칼륨(K⁺) 4~50 mmol/L

글루콘산염(gluconate) 15~150 mmol/L

인산염(phosphate) 20~40 mmol/L

트레할로스　 80~160 mmol/L(27~55 g/L)

히드록시에틸 전분(HES) 20~60 g/L

디부티릴 cAMP 0~10 mmol/L

니트로글리세린 0~1 g/L

상기 실시예로서 제공된 조직 보호액 또는 보존액 중, ET-Kyoto 용액, 실시예 1 또는 실시예 3의 용액이 더욱 바람직하다.

Ⅱ-3. 췌관 내 주입용 보호액의 실시형태

췌관 내 주입용 보호액은 저칼륨농도인 것이 바람직하다. 구체적으로, 보호액 1000 mL 당 칼륨 농도가 4~50 mM인 것이 바람직하며, 10~50 mM인 것이 더욱 바람직하다.

저칼륨농도의 사용은 혈관 경련(vasospasm)의 유발을 피할 수 있으며, 이에 의해 상기 소도로부터의 인슐린 방출을 방지할 수가 있어 상기 용액을 조직의 구석구석까지 신속하게 퍼지게 하는 것이 가능하다. 이는 췌관 보호 작용을 더욱 상승시킬 수 있어 이식가능한 췌장 소도의 수량을 향상시킬 수 있다.

상기 췌관 내 주입용 보호액의 삼투압은 270~450 mOsm/L인 것이 바람직하며, 300~400 mOsm/L인 것이 더욱 바람직하다. 상기 범위 내에서 조직을 보호 또는 보존하는 동안 조직의 팽화 또는 수축을 막을 수 있다.

상기 췌관 내 주입용 보호액의 pH는 세포 및 조직의 산성 분해 방지 등을 위하여 약 7~8 정도인 것이 바람직하다.

상기 췌관 내 주입용 보호액은 트레할로스를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 트레할로스의 존재는 췌관의 보호 작용을 부가적으로 증가시켜 이에 의하여 소도의 수량을 향상시킬 수 있다. 트레할로스에는 세가지 형태 즉, α,α－트레할로스, α,β－트레할로스 및 β,β－트레할로스가 존재하며, 이들 중 어느 하나 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다. 천연에 존재하는 α,α－트레할로스가 바람직하게 사용된다.

트레할로스의 농도는 보호액 1000 mL 당 약 0~400 mmol, 바람직하게는 50~240 mmol, 더욱 바람직하게는 80~160 mmol 정도이다.

또한, 췌관 내 주입용 보호액은 본 발명의 효과를 감소시키지 않는 한, 다른 성분들을 포함할 수 있다. 이러한 다른 성분으로는 각종 전해질, 당질, 아미노산, 약물, 비타민 등을 들 수 있다.

나아가, 췌관 내 주입용 보호액은 AMP(예컨대 디부티릴 cAMP) 또는 ATP와 같은 세포 활성제, 프로스타글란딘(prostaglandin) 또는 니트로글리세린과 같은 혈관확장제(vasodilator), 항생 물질, 아데노신, N-아세틸-L-시스테인, 글라이신, 아스코르빈산, 글루타민, 니코틴아마이드(nicotinamide), 글루타치온(glutathione), 라피노오스(raffinose) 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 췌관 내 주입용 보호액의 바람직한 실시형태의 일례로 적어도 하기와 같은 성분을 아래와 같은 비율로 포함한다：

나트륨　 80~120 mmol/L

칼륨　 4~50 mmol/L

글루콘산염(gluconate) 15~150 mmol/L

인산염(phosphate) 20~40 mmol/L

트레할로스　 80~160 mmol/L

히드록시에틸 전분(HES) 20~60 g/L

우리나스타틴　 10,000~100,000 U/L

본 발명에 따른 췌관 내 주입용 보호액은 췌관 보호 작용이 높고, 조직의 생존력을 유지시킬 수 있으며, 조직을 안정화시키고 충분히 보호할 수 있어 그 결과 이식가능한 소도의 수량을 증가시킬 수 있다.

Ⅲ. 2층법용 췌장 보존액

본 발명에 따른 보존액은 소도 이식용 소도를 분리하는 동안 2층법에 의한 췌장 보존을 위해 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 2층법용 췌장 보존액은 상술한 췌장 소도의 분리방법에 있어서 2층법에 사용되는 보존액으로서 매우 적합하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 보호액은 단백질분해효소 저해제를 저칼륨 농도의 조직 보호액 또는 보존액에 첨가함으로써 얻을 수 있다.

단백질분해효소 저해제로서는 상기 Ⅱ-1에 나타낸 저해제를 사용할 수 있다.

또한, 조직 보호액 또는 보존액으로서는 상기 Ⅱ-2에 나타낸 용액 중 저칼륨농도의 용액을 사용할 수 있다. ET-Kyoto 용액이 더욱 바람직하다.

Ⅲ-2. 2층법용 췌장 보존액의 실시형태

상기 보존액에 첨가되는 단백질분해효소 저해제의 첨가량은 본 발명의 효과를 달성하는 범위 내에서 저해제의 종류에 따라 적절하게 설정할 수 있다.

상기 단백질분해효소 저해제가 우리나스타틴인 경우에는 상기 첨가량은 10,000~100,000 U/L 정도, 바람직하게는 50,000~100,000 U/L 정도이다. 상기 단백질분해효소 저해제가 메실산 가벡세이트일 경우에는 100~10000 mg/L 정도, 바람직하게는 500~2000 mg/L 정도이다.

2층법용 췌장 보존액의 칼륨 농도는 4~50 mM 정도, 바람직하게는 10~50 mM이다.

저칼륨농도의 사용은 췌장의 보존 작용을 훨씬 더 충분히 제공하여 이로 인해 이식가능한 소도의 수량을 향상시킬 수 있다.

상기 보존액의 삼투압은 270~450 mOsm/L인 것이 바람직하며, 300~400 mOsm/L인 것이 더욱 바람직하다. 상기 범위 내에서 조직이 보존중에 팽화 또는 수축하는 것을 막을 수 있다.

상기 보존액의 pH는 세포나 조직의 산성 분해 방지 등을 위해 약 7~8 정도인 것이 바람직하다.

상기 보존액은 트레할로스를 포함하는 것이 바람직하다.

트레할로스의 농도는 보호액 1000 mL 당 약 0~400 mmol, 바람직하게는 50~240 mmol, 더욱 바람직하게는 80~160 mmol 정도이다. 트레할로스의 존재는 췌장 보호 작용을 부가적으로 상승시켜, 이에 의해 소도의 수량을 향상시킬 수 있다.

또한, 췌관 내 주입용 보호액은 본 발명의 효과를 감소시키지 않는 한, 다른 성분들을 포함할 수 있다. 이러한 다른 성분으로는 각종 전해질, 당질, 아미노산, 약물, 비타민 등을 들 수 있다.

나아가, 췌관 내 주입용 보호액은 AMP(예컨대 디부티릴 cAMP) 또는 ATP와 같은 세포 활성제, 프로스타글란딘(prostaglandin) 또는 니트로글리세린과 같은 혈관확장제(vasodilator), 항생 물질, 아데노신, N-아세틸-L-시스테인, 글라이신, 아스코르빈산, 글루타민, 니코틴아마이드(nicotinamide), 글루타치온(glutathione), 라피노오스(raffinose) 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 2층법용 보존액의 바람직한 실시형태의 일례로 적어도 하기와 같은 성분을 아래와 같은 비율로 포함한다：

나트륨　 80~120 mmol/L

칼륨　 4~50 mmol/L

글루콘산염(gluconate) 15~150 mmol/L

인산염(phospate) 20~40 mmol/L

트레할로스　 80~160 mmol/L

히드록시에틸 전분(HES) 20~60 g/L

우리나스타틴　 10,000~100,000 U/L

본 발명에 따른 보존액은 췌관 보호 작용이 높고, 조직의 생존력을 그대로 유지시킬 수 있으며, 이의 조직을 충분히 보호할 수 있어 그 결과 이식가능한 소도의 수량을 현저하게 향상시킬 수 있다.

IV . 소도 정제액

본 발명의 정제액은 소도를 이식하는 동안 소도 분리에 있어서 소도 정제용으로 매우 적합하다. 또한, 본 발명에 따른 정제액은 상술한 본 발명에 따른 소도 분리방법에 있어서 정제액으로서의 용도에 매우 적합하다.

본 발명에 따른 정제액은 밀도구배제를 트레할로스를 포함하는 조직 보호액 또는 보존액에 첨가함으로써 얻을 수 있다. 트레할로스를 포함하는 조직 보호액 또는 보존액으로서는 상기 Ⅱ-2에 나타낸 용액 중 트레할로스를 포함하는 용액을 사용할 수 있다. ET-Kyoto 용액의 사용이 더욱 바람직하다.

IV -1. 밀도구배제

밀도구배제는 용액 내 밀도구배의 제조에 사용되는 공지의 밀도구배제로부터 적절히 선택할 수 있다. 밀도구배제는 저점도 용액을 형성할 수 있는 것이 바람직하다.

적합한 밀도구배제로는 요딕사놀(Optiprep^TM) 및 N,N′-비스(2,3-디하이드록시프로필)-5-[N-(2,3-디하이드록시프로필)아세토아마이도]-2,4,6-트리요오도-이소프탈아마이드)(N, N′-Bis(2,3-dihydroxypropyl)-5-〔N-(2,3-dihydroxypropyl) acetoamido〕-2, 4,6-triiodo-isophthalamide)(Nycodenz^®)를 포함한다.

이들을 상기 밀도구배제로서 이용하는 것은 저점도 정제액을 얻을 수 있어 정제 속도를 촉진시킬 수 있다. 또한, 이들은 낮은 내독소 수준(endotoxin level)을 갖는 용액을 제공할 수 있다.

조직 보호액 또는 보존액에 대한 상기 밀도구배제의 혼합 비율은 정제 전에 췌장 조직의 밀도를 측정하여 밀도구배제와 조직 보호액 또는 보존액의 비중을 고려함으로써 적절하게 설정할 수 있다.

IV -2. 트레할로스

트레할로스에는 세가지 형태 즉, α,α－트레할로스, α,β－트레할로스 및 β,β－트레할로스가 존재하며, 이들 중 어느 하나 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다. 천연에 존재하는 α,α－트레할로스가 바람직하게 사용된다.

정제액에 있어서, 트레할로스의 농도는 약 0~400 mmol, 바람직하게는 50~240 mmol, 더욱 바람직하게는 80~160 mmol 정도이다.

IV -3. 단백질분해효소 저해제

또한, 정제액은 단백질분해효소 저해제를 포함하는 것이 바람직하다. 이러한 단백질분해효소 저해제로서는 상기 Ⅱ-1에 나타낸 단백질분해효소 저해제를 사용할 수 있다. 구체적으로 우리나스타틴, 메실산 가벡세이트 및 메실산 나파모스타트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상을 사용하는 것이 소도 수량을 더욱 향상시키는 관점에서 바람직하다.

정제액에 첨가되는 단백질분해효소 저해제에 있어서, 첨가 속도는 본 발명의 효과를 달성하는 범위 내에서 저해제의 종류에 따라 적절하게 설정할 수 있다.

단백질분해효소 저해제가 우리나스타틴인 경우에는 상기 첨가 속도는 10,000~100,000 U/L 정도, 바람직하게는 50,000~100,000 U/L 정도이다. 상기 단백질분해효소 저해제가 메실산 가벡세이트일 경우에는 100~10000 mg/L 정도, 바람직하게는 500~2000 mg/L 정도이다.

IV -4. 정제액의 실시형태

상기 정제액은 바람직하게 저칼륨농도를 가지며, 상기 농도는 약 4~50 mmol/L 정도인 것이 바람직하고, 약 10~50 mmol/L정도인 것이 더욱 바람직하다.

상기 정제액은 저점도를 갖는 것이 바람직하다. 구체적으로 측정 온도 22 ℃에서 브룩필드(Brookfield)법에 의해 측정되는 점도는 5 센티포아즈(cp) 이하, 바람직하게는 3 cp 이하, 더욱 바람직하게는 2 cp 이하인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 효과를 감소시키지 않는 한, 상기 정제액에 다른 성분들을 적절하게 첨가할 수 있다. 이러한 다른 성분으로는 예를 들면 아데노신, 덱스트란(dextran), 헤파린 등이 포함된다.

정제액의 바람직한 일실시형태의 예로는 적어도 하기와 같은 성분을 아래와 같은 비율로 포함하는 용액을 들 수 있다：

나트륨　 80~120 mmol/L

칼륨　 4~50 mmol/L

글루콘산염(gluconate)　 15~150 mmol/L

인산염(phospate) 20~40 mmol/L

트레할로스　 80~160 mmol/L

히드록시에틸 전분(HES) 20~60 g/L

요딕사놀　 100~500 ml/L　　　　　

단백질분해효소 저해제를 포함하는 정제액의 바람직한 일실시형태의 예로는 적어도 하기와 같은 성분을 아래와 같은 비율로 포함하는 용액을 들 수 있다：

나트륨　 80~120 mmol/L

칼륨　 4~50 mmol/L

글루콘산염(gluconate) 15~150 mmol/L

인산염(phospate) 20~40 mmol/L

트레할로스 80~160 mmol/L

히드록시에틸 전분(HES) 20~60 g/L

요딕사놀 100~500 ml/L　　

우리나스타틴　 10,000~100,000 U/L

이식을 위한 소도 정제에 있어서, 상기 소도의 3차원 구조가 유지되는 방식으로 소도 정제가 수행되는 것이 중요하다. 본 발명에 따른 정제액을 사용하면 소도의 3차원 구조가 적절히 유지된 상태로 이식가능한 소도의 수량을 향상시킬 수 있다.

V. 소도 이식

소도 이식은 상술한 일련의 분리 단계에 의하여 얻은 소도를 환자의 문맥에 주입함으로써 수행될 수 있다.

분리된 소도가 규정의 기준을 만족시킬 경우에 이식에 적합하다고 판단되어 이식에 사용된다.

효능의 관점에서, 이식에 이용되는 소도가 이식 후 소도로서의 기능을 할지 어떨지에 대하여 판정하는 것이 요구된다. 또한, 수증자 내에 병원체, 유해 물질 등이 유발되는 위험성은 가능한 최대한 배제될 것이다.

구체적으로 이식에 적합한 분리된 소도를 위해 하기의 기준이 이용된다.

·소도 수량 ≥ 4,000 IE/kg(환자 체중)

·순도 ≥ 30 %

·조직 부피 ≤ 10 ml

·생존력 ≥ 70 %

·내독성 ≤ 5 IE/kg(환자 체중)

·그람 염색(Gram stain) 음성

소도 이식을 더욱 효과적으로 수행하기 위해서는 소도 수량 ≥ 5,000 IE/kg(환자 체중)인 것이 더욱 적절하다.

이식에 적합하다고 평가된 소도는 환자(수증자)가 준비될 때까지 보존된다. 일단 환자가 준비되면, 문맥 내로 주입함으로써 투여가 수행된다.

필요하다면 소도 이식을 위한 본 발명에 다른 기술에 소도 이식 및 소도 분리에 대한 다양한 공지 기술들을 첨가할 수 있다.

본 발명은 이식가능한 소도의 수량을 증가시킨다. 또한 본 발명은 정제 효율을 높일 수 있어 정제 속도도 향상시킬 수 있다. 이는 질이 좋은 소도를 많이 이식하는 것을 가능하게 하여 이식 후 더욱 효과적인 소도 기능성을 가져올 수 있다.

본 발명에 따른 분리방법 및 용액의 사용은 소도 이식의 임상 결과를 향상시킬 수 있다.

발명의 효과

본 발명의 소도의 분리방법은 이식가능한 소도의 수량을 증가시킨다. 또한, 소도 분리를 훨씬 짧은 기간 내에 효율적으로 수행하는 것도 가능하다.

본 발명의 소도 분리방법은 단백질분해효소 저해제를 포함하는 보호액을 췌관 내에 주입하는 것을 특징으로 한다.

이러한 췌관 내에 단백질분해효소 저해제를 포함하는 보호액을 주입하는 것은 췌관 내 췌장 조직을 잘 보호하여 이로 인해 이식가능한 소도의 수량을 향상시킨다.

또한, 본 발명의 분리방법은 2층법을 이용하여 췌장의 보존시키는 단계를 포함할 수 있다. 2층법을 이용한 보존은 바람직하게는 (i) 과불화탄소용액, 및 (ⅱ) 단백질분해효소 저해제를 포함하고 칼륨 농도가 4~50 mmol/L인 보존액을 사용하여 수행된다. 이는 이식가능한 소도의 수량에 있어서 현저한 향상을 제공한다.

나아가, 본 발명의 분리방법은 밀도구배제를 포함하는 정제액을 사용하여 정제하는 단계를 더 포함한다. 정제는 밀도구배제 및 트레할로스를 포함하는 정제액을 사용하여 수행하는 것이 바람직하다. 상기 정제는 단백질분해효소 저해제를 더 포함하는 정제액을 사용하여 수행하는 것이 더욱 바람직하다. 이들 정제액의 사용은 정제 효율을 증가시키고 이식에 맞는 소도의 세포를 향상시킨다.

본 발명의 분리방법은 상술한 성질을 갖기 때문에 이러한 능력에 의해 이식가능한 소도의 수량을 현저하게 향상시키는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 단백질분해효소 저해제를 포함하는 췌관 내 주입용 보호액을 제공된다. 상기 보호액은 췌관에서 높은 보호 효과를 가지며, 이에 의해 소도 수량을 증가시킨다.

나아가, 본 발명은 2층법용 췌장 보존액을 제공하며, 상기 보존액은 단백질분해효소 저해제를 포함하고, 칼륨 농도가 4~50 mmol/L이다. 상기 보존액은 췌장의 보호 작용이 높고 조직의 생존력을 유지하고 조직의 완전한 보호를 제공하여 이식가능한 소도의 수량을 향상시킨다.

또한, 본 발명은 밀도구배제 및 트레할로스를 포함하는 소도 정제액을 제공한다. 나아가 본 발명은 밀도구배제, 트레할로스 및 단백질분해효소 저해제를 포함하는 정제액을 제공한다. 이들 정제액은 정제 효율을 높여 이식가능한 소도의 수량을 향상시킬 수 있다. 이들 정제액의 한층 낮아진 점도는 정제 속도를 증가시킬 수 있다. 게다가, 이들은 낮은 내독성 수준이므로 환자의 위험성을 낮출 수 있다.

따라서, 본 발명은 이식가능한 소도의 수량을 증가시킬 수 있는 소도 분리방법, 췌관 내 주입용 보호액, 2층법용 췌장 보존액 및 소도 정제액을 제공한다.

본 발명은 이식 적합 기준을 만족시키는 소도의 수량을 증가시켜 그 결과 소도 이식의 성공율을 증가시킬 수 있다. 게다가, 종래 방법으로는 사실상 불가능했던 심장정지 기증자로부터의 췌장 소도 이식을 실현 가능하도록 만든다.

이와 같이, 본 발명은 인슐린 의존형 당뇨병, 특히 1형 당뇨병 환자를 위하여 더욱 효과적이고 더욱 확실한 치료법을 제공할 수 있어 소도 이식의 임상 실시에 크게 공헌한다.

도 1은 췌관 보호의 유무에 의한 소도 수량을 비교한 실험의 결과를 나타낸다. 도 1A은 정제 전의 소도 수량을 나타낸다. 도 1B는 정제 후의 소도 수량을 나타낸다. IE/g는 췌장 1 g 당 소도 수량의 평균 개수를 나타낸다. Ductal injection(-)는 췌관 내에 보호액을 주입하지 않은 경우, Ductal injection(+)는 췌관 내에 보호액을 주입한 경우를 나타낸다.

도 2는 2층법에서 보존액의 차이에 의한 정제 후의 소도 수량을 비교한 실험의 결과를 나타낸다. IE/pancreas는 췌장 1개로부터 수득되는 소도의 총 수량을 나타낸다. PFC는 과불화탄소용액(PFC)을 나타내고; UW는 UW 용액을 나타내고; M－UW는 UW 용액과 우리나스타틴 용액의 혼합 용액을 나타내고; ET－Kyoto는 ET－Kyoto 용액을 나타내며; M－Kyoto는 ET－Kyoto 용액과 우리나스타틴 용액의 혼합용액을 나타낸다.

도 3은 돼지 췌장 소도 분리에 있어서, 각 프로토콜(protocol)을 비교한 소도 수량의 결과를 나타낸다. 도 3A는 정제 전의 결과를 나타낸다. 도 3B는 정제 후의 결과를 나타낸다. IE/g는 췌장 1 g 당 소도 수량의 평균 개수를 나타낸다.

도 4A는 심장정지 기증자로부터의 췌장 소도 이식 전후의 환자 6명의 HbAlc 값의 변화를 나타낸다. 각 환자의 데이터를 다른 기호로 나타낸다. 도 4A의 세로축은 총 헤모글로빈에 대한 HbAlc의 비율을 나타낸다. 점선은 정상값의 상한치를 나타낸다.

도 4B는 글루카곤 자극 시험에 있어서의 C-펩타이드 값(평균값)을 나타낸다. ■는 기본값을 나타내고, □는 자극 후의 값을 나타낸다.

도 5A는 아침식사 전 및 저녁식사 전의 혈당값을 소도 이식 전후로 측정한 결과를 나타낸다. 도 5A의 2개의 점선은 정상 범위를 나타낸다. ◆는 아침식사 전, ■은 저녁식사 전의 값을 나타낸다.

도 5B는 소도 이식 전후에 있어서의 환자의 1일 인슐린 양을 나타낸다.

발명의 실시를 위한 최선의 형태

이하, 본 발명을 더욱 명확하게 하기 위해서, 실시예 및 실험예를 이용하여 설명한다. 그러나 본 발명은 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

물질 및 방법

1. 물질

1(1)：보호액 및 보존액

UW 용액(ViaSpan^TM, 듀퐁사(DuPont)제) 및 ET-Kyoto 용액(Kyoto Solution, Kyto Biomedical Science Co., Ltd.)을 사용하였다.

ET-Kyoto 용액 1 L에 100,000 단위체(U)의 우리나스타틴(Mira clid^TM, 모치다 제약 주식회사(Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.))을 첨가하여 ET－Kyoto＋우리나스타틴 용액(이하, M-Kyoto 용액이라 한다)을 제조하였다.

UW 용액, ET-Kyoto 용액 및 M-Kyoto 용액에 포함된 주성분의 조성 및 삼투압을 하기 표 1에 나타내었다.

	UW 용액	ET-Kyoto 용액	M-Kyoto 용액
나트륨 (Na) (mmol/L)	29	100	100
칼륨 (K) (mmol/L)	125	43.5	43.5
마그네슘 (Mg) (mmol/L)	5	-	-
글루콘산염 (mmol/L)	-	100	100
인산염 (mmol/L)	25	25	25
황산염 (mmol/L)	5	-	-
락토비오네이트 (mmol/L)	100	-	-
라피노오스 (mmol/L)	30	-	-
트레할로스 (mmol/L)	-	120	120
아데노신 (mmol/L)	5	-	-
알로프리놀 (Alloprinol) (mmol/L)	1	-	-
글루타치온 (mmol/L)	3	-	-
히드록시 에틸 전분(HES) (mmol/L)	50	30	30
우리나스타틴 (×103 U/L)	-		100
삼투압 (mOsm)	320	366	366

ET-Kyoto 용액 1 L에 0.4~8 mM의 4-[2-아미노에틸벤젠설포닐]플루오라이드·HCl(AEBSF, Pefabloc^TM, 로체사(Roche)제)를 첨가하여 ET－Kyoto＋Pefabloc 용액을 제조하였다.

ET-Kyoto 용액 1 L에 1000 mg의 메실산 가벡세이트(Gabexate mesilate, FOY^TM, 오노 약품공업(Ono Pharmaceutical Co., Ltd.)제)를 첨가하여 ET－Kyoto＋FOY 용액을 제조하였다.

1(2). 정제액

Ficoll 용액은 농도가 다른 2 종류의 피콜 용액(Ficoll^TM, Pharmacia Corporation)(행크 용액(Hanks' solution)으로 희석)을 혼합함으로써 가벼운 비중이 약 1.07-1.08, 무거운 비중이 1.09-1.12가 되도록 제조하였다.

ET-Kyoto 용액에 60 중량%의 요딕사놀(Iodixanol) 수용액(OptiPrep^TM, AXIS-SHIELD사제)을 혼합하여 ET-Kyoto＋요딕사놀 용액(이하, I-Kyoto액이라고 한다)을 제조하였다.

M-Kyoto 용액에 60 중량%의 요딕사놀 수용액(OptiPrep^TM, AXIS-SHIELD사제)을 혼합하여 ET－Kyoto＋우리나스타틴＋요딕사놀 용액(이하, MI-Kyoto 용액이라고 한다)을 제조하였다. ET－Kyoto액에 4-[2-아미노에틸벤젠설포닐]플루오라이드·HCl(Pefabloc^TM, 로체사제) 및 60 중량%의 요딕사놀 수용액(OptiPrep^TM, AXIS-SHIELD 사제)을 혼합하여 ET－Kyoto＋Pefabloc＋요딕사놀 용액(Kyoto＋AEBSF＋Idx 용액)을 제조하였다.

ET-Kyoto 용액의 비중은 약 1.04이고, 요딕사놀 용액의 비중은 약 1.32이며, 이들을 혼합하는 경우에는 양쪽 용액의 비율을 바꿈으로써 가벼운 비중이 약 1.07-1.08, 무거운 비중이 1.09-1.12가 되도록 제조하였다.

2. 돼지 소도 분리 절차

돼지 소도를 하기의 절차를 따라 분리하였다.

돼지의 췌장 조직을 교토 시내의 도살장에서 획득하였다. 췌장을 획득한 후, (1) 상기 췌장을 즉시 2층법에 의해 2층이 형성된 용기 내에 보존시키거나 (2) 획득한 각 췌장 내에 카테터를 삽입하고 상기 카테터를 통해 췌관 보호액을 상기 췌장의 주췌관에 주입한 후, 즉시 2층법에 의해 PFC와 보존액의 2층이 형성된 용기 내에 보존시켰다. (2)에서 주입된 췌관 보호액의 부피는 췌장 중량 1 g 당 1 ml로 하였다.

여기서, 상기 췌장을 심장정지로부터 보존액에 담글때 까지의 시간을 온소혈시간(warm ischemic time)으로 정의한다. 상기 췌장을 보존액에 담글때부터 소도 분리를 시작할 때까지의 시간을 냉소혈시간(cold ischemic time)으로 정의한다.

상기 2층법에 의해 보존된 췌장을 교토 대학의 소도 분리 시설에 옮긴 후, 살균하였다.

이후, 상기 췌장의 주췌관에 냉 콜라게나제 용액(Liberase HI^TM, Roche Molecular　Biochemicals사제)을 주입하고 용액을 환류시켜 췌장을 팽화시켰다.

상기 팽화된 췌장을 9개의 조각으로 분리한 후 리코르디 챔버(Ricordi chamber)에 넣었다. 상기 챔버 내에서 회로를 용액으로 채워 폐쇄계로 하였다. 이후, 상기 용액을 펌프로 순환시키면서 용액의 온도를 37 ℃ 정도로 상승시켜 콜라게나제를 활성화시키고, 리코르디 챔버를 통해 콜라게나제 용액을 반복 순환시켜 췌장 조직을 분해시켰다. 소도를 구성하는 세포가 응집된 상태 그대로 유지되는 동안 소도 주위로부터 췌외분비선조직만 분해되는 시점에서 분해 과정을 정지시켰다.

분해를 정지시키기 위해, 회로를 개방시켜 사람 알부민을 포함하는 실온의 용액을 회로를 통해 통과시킴으로써 용액의 온도를 내려 콜라게나제를 비활성화시켰다.

실온의 용액을 회로를 통해 통과시킴으로써 분해를 정지시킨 후 췌장 조직을 회수하였다.

리코르디 챔버 내에 췌장을 넣고 분해된 췌장의 회수가 시작될 때까지의 시간을 제1상으로 하였다.

또한, 회수의 시작으로부터 종료까지의 시간을 제2상으로 하였다.

회수된 췌장 조직을 원심분리기로 원심 세척하고 모아 농축하였다.

밀도구배제를 포함하는 정제액을 이용하여 혈구 세척 장치(COBE2991 세포 프로세서, 감브로 주식회사(Gambro BCT)) 내에서 연속 밀도구배를 형성하였다.

그 다음으로, 밀도구배가 형성된 용액에 상기 세척 및 농축된 췌장 조직을 첨가하였다.

췌외분비선조직으로부터 소도를 분리하기 위해 연속밀도구배원심법을 이용하여 원심분리를 수행함으로써 췌장 조직으로부터 소도를 분리하는 정제를 수행하였다. 이후, 혈구 세척 장치 내에서 용액을 각 분획으로 채취하여 세균 검사에 의해 어느 분획에 소도가 존재하는지를 판정하여 소도를 회수하였다.

3. 평가방법

소도의 수량과 순도는 디티존(dithizone) 염색에 의해 평가하였다. 디티존 염색 후, 200 ml의 현탁액으로부터 100 ㎕의 시료를 취해 현미경에서 크기별로 소도 수량을 세었다. 순도는 소도, 소도 이외의 외분비조직, 췌관 등의 모든 성분을 포함하는 전체 질량에 대한 소도의 비율로 얻었다.

소도의 크기는 크기별로 세어진 소도를 평균화하여 얻었다.

정제 효율은 정제 후의 소도의 수량을 정제 전의 소도의 수량으로 나누어 얻었다.

형태학상 점수(morphological score)(전체 형태학적인 평가)는 두 명의 검사관이 하기 경우에 따른 점수를 매겨 질적으로 평가하였다: 모양(평면 대 구형), 가장자리(불규칙 대 양호한 원형), 전체성(단편화 대 덩어리/밀집), 염색도(불균일 대 균일) 및 직경(모두 ＜ 100 ㎕ 대 ＞ 10% ＞200 ㎕). 각각의 파라미터(parameter)를 0에서 2까지 설정하고 최저점을 O점으로, 최고점을 2점으로 하였다. 따라서, 소도 분리에 대한 총점의 최저점은 0점이며, 최고점은 10점이다. 바람직한 소도로서 구형, 가장자리가 양호한 원형, 덩어리 또는 밀집형, 균일하게 염색된 것, 및 직경이 큰 소도를 특징으로 하여 점수화하였다.

소도의 생존력은 아크리딘오렌지(acridine orange)(10 μmol/L)와 프로피디움요오드(propidium iodide)(15 μmol/L)(AO/PI) 염색을 이용하여 생존 및 죽은 세포를 동시에 가시화하여 평가하였다. 50개의 소도를 조사하여 각각의 생존력을 시각적으로 결정하여 이의 평균을 계산하였다.

자극 지수(Stimulation Index)는 저글루코오스 농도와 고글루코오스 농도에 있어서의 인슐린 분비의 비로부터 계산하였다.

소도의 기능은 Shapiro 및 Colleagues법에 따라 당부하(glucose tolerance)에 대한 정제된 소도의 인슐린 분비 반응을 모니터링 함으로써 평가하였다. 간단히 말하면, 100개의 소도 동등물(Islet Equivalents, IE)을 37 ℃에서로 5% CO₂의 환경에서 CMRL 용액으로 배양한 다음 2.8 mM의 에테르 또는 20 mM의 에테르 및 20 mM의 글루코오스를 포함하는 RPMI1640 용액(GIBCO BRL사)에서 37 ℃, 5% CO₂의 환경에서 2시간 동안 배양하고, 상청액을 채취하여 항원 항체 반응을 이용한 ELISA 키트(모리나가 생화학공업 주식회사)로 인슐린 값을 측정하였다.

실시예 및 실험예에서 얻은 값은 평균 및 표준 편차(평균값+SE)를 사용하여 보고되었다. 아노바 및 피셔의 PLSD post-hoc 테스트(ANOVA and Fisher's PLSD post-hoc test)의 평균값을 사용하여 세 그룹을 비교하였다. P 값은 0.05 미만을 유의적으로 하였다.

실시예 1. 췌관 보호의 관찰

췌관 보호의 유무에 관한 비교 관찰을 수행하기 위하여, 상술한 절차대로 비교 실험을 수행하였다. 상기 절차는 췌장을 획득한 후 (1) 즉시 2층법에 의해 보존시킴(췌관 보호 없음) 또는 (2) 취득 후 곧바로 췌장의 주췌관에 보호액을 주입한 후, 2층법에 의해 보존시킴(췌관 보호 포함)을 제외하고는 동일하게 수행되었다.

상기 실험에 있어서, 췌관 보호액으로서 M-Kyoto 용액을 사용하였다. 또한, 2층법에서는 M-Kyoto 용액 및 PFC 용액을 사용하였다. 나아가, 정제액으로서 Ficoll 용액을 사용하였다.

상기 실험에 있어서, 정제 전후에 얻은 소도 수량을 도 1(1A：정제 전, 1B: 정제 후) 및 하기 표에 나타내었다. IE/g는 췌장 1 g 당 소도의 평균 개수이다.

	소도 수량 (IE/g)
	정제 전	정제 후
췌관 보호 없음(-)	6,889±749	3,662±320
췌관 보호 포함(+)	10,626±2153	4807±1227

표 2에 나타낸 바와 같이, 정제 전후 모두 췌관 보호를 실시했을 경우(췌관 보호 포함)가 췌관 보호를 실시하지 않았던 경우에 비해 소도 수량이 훨씬 더 높음을 알 수 있다.

상기 소도의 다른 특성들을 하기 표 3에 나타내었다.

	췌관 보호 없음(-)	췌관 보호 포함(+)
생존력(viability)	95.3±1.5	96.2±1.2
형태학상 점수	7.4±0.7	7.8±0.6
순도 (%)	86.3±3.8	91.3±4.3
자극 지수	1.7±0.3	2.6±1.4

표 3에 나타낸 바와 같이, 소도의 다른 특성에 대하여 두 그룹 사이에 유의한 차이가 없었다.

실시예 2. 2층법 보존에 관한 비교 관찰

2층법에 있어서 사용하는 용액의 차이에 대한 비교 관찰을 수행하기 위하여, 2층법용 용액을 하기 표 4의 다른 용액을 사용하는 것을 제외하고는 동일한 절차로 비교 관찰을 수행하였다. M-UW 용액은 UW 용액 1 L에 100,000 단위체(U)의 우리나스타틴을 첨가하여 얻었다.

실험은 하기 절차를 이용하여 수행하였다.

췌장 소도를 300~380 g의 근친 교배 수컷 루이스 래트(Chaeles River Laboratories, Wilmington, MA)로부터 분리하였다. 래트 시험은 교토 대학 대학원 의학 연구과 심사 위원회에서 승인을 받았다. 공통의 담관을 24 게이지 카테터(Baxter, Deerfield, IL)를 사용하여 삽입하고 고정한 다음 말단을 고정시켰다. 췌장, 비장, 및 십이지장을 제거하고, 각 용액에 보존시켰다. 췌장은 4 ℃에서 6시간 동안 보존하였다. 소도를 Sawada의 변형된 방법(Transplantation. 2003;75(12):1965-1969)을 이용하여 분리하였다. 보존 후, 각 췌장을 2 mg/mL의 콜라게나제 용액(24 mg Serva collagenase; Serva, Heidelberg, 독일)을 12 mL의 행크 평형 염류 용액(HBSS)에 용해시킨 용액을 이용하여 팽화하였다. 비장 및 십이지장을 제거하고 췌장을 50 mL의 원추 튜브에서 교반없이 37 ℃에서 22분 동안 배양시켰다. 분해된 췌장을 UW 용액으로 원심분리(150 g, 3분 , 8 ℃)에 의해 3번 세척하였다. 그 다음으로 M-Kyoto 용액에 요딕사놀(Optiprep^TM, Nycomed　Pharma AS, Olso, Norway)을 첨가한 용액을 사용하여 비연속 밀도구배(1.030, 1.095, 1.105, 1.125 g/cm³)를 형성시켜 정제하였다. 그 결과로 얻은 소도 수량을 디티존 염색에 의해 평가하였다.

정제 후의 소도 수량의 결과를 도 2 및 하기 표 4에 나타내었다. IE/pancreas는 각 췌장으로부터 수득한 소도의 총 수량을 나타낸다.

2층법에 사용된 용액	정제 후 소도 수량 (IE/pancreas)
UW/PFC	622±133
M-UW/PFC	730±114
ET-Kyoto/PFC	700±116
M-Kyoto/PFC	1207±76

표 4 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 2층법 보존에 대해 M-Kyoto 용액을 사용할 경우, 정제 후의 소도 수량이 현저하게 높아지는 것을 알 수 있었다.

실시예 3：분리 프로토콜( Isolation Protocol )에 관한 관찰

3-1. 프로토콜의 개요

상술한 돼지 췌장 소도 분리 절차에 있어서, 하기 3개의 분리 프로토콜을 이용해 비교 관찰을 수행하였다.

C1 프로토콜

·췌관 내에 보호액의 주입을 수행하지 않았다.

·2층법에 있어서, UW 용액 및 과불화탄소용액(PFC)을 사용하였다.

·정제액은 피콜 용액(Ficoll solution)을 사용하였다.

C2 프로토콜

·췌관에 보호액을 주입하여 췌관의 보호를 수행하였다. 보호액은 M-Kyoto 용액을 사용하였다.

·2층법에 있어서, M-Kyoto 용액 및 과불화탄소용액(PFC)을 사용하였다.

·정제액은 피콜 용액을 사용하였다.

교토 프로토콜

·췌관에 보호액을 주입하여 췌관의 보호를 수행하였다. 보호액은 M-Kyoto 용액을 사용하였다

·2층법에 있어서, M-Kyoto 용액 및 과불화탄소용액(PFC)을 사용하였다.

·정제액은 I-Kyoto 용액을 사용하였다.

각 프로토콜의 특징을 하기 표 5에 나타내었다.

프로토콜	췌관 보호	2층법에 사용된 용액	정제액
C1 프로토콜	보호액 주입 안함	UW/PFC	피콜
C2 프로토콜	M-Kyoto 용액 주입	M-Kyoto 용액/PFC	피콜
C3 프로토콜	M-Kyoto 용액 주입	M-Kyoto 용액/PFC	I-Kyoto 용액

3-2. 프로토콜의 비교

3-2(1). 분리 과정의 특징

각 프로토콜에 있어서 분리 과정의 특징을 표 6에 나타내었다.

	C1 프로토콜	C2 프로토콜	교토 프로토콜
췌장 크기 (g)	104±13	105±8	104±8
수행 시간 (분)	9±1	13±1	13±1
온소혈시간 (분)	19±1*	24±2	25±1
냉소혈시간 (분)	148±9**	120±0	120±0
제1상 기간 (분)	13±1***	8±1	8±1
제2상 기간 (분)	27±1	38±4	34±3

표에서 *은 C1 프로토콜의 온소혈시간이 C2 프로토콜(P＜0.01), 교토 프로토콜(P＜0.01)보다 유의적으로 짧음을 나타낸다.

표에서 **은 C1 프로토콜의 냉소혈시간이 C2 프로토콜(P＜0.01), 교토 프로토콜(P＜0.01)보다 유의적으로 짧음을 나타낸다.

표에서 ***은 C1 프로토콜의 제1상이 C2 프로토콜(P＜0.02), 교토 프로토콜(P＜0.01)보다 유의적으로 긴 것을 나타낸다.

세 그룹간의 췌장의 크기 및 수행 시간은 유의적인 차이가 없었다.

C1 프로토콜은 췌관 내 주입 단계가 결여되어 있기 때문에 다른 프로토콜보다 온소혈시간이 유의적으로 짧았다. 그러나, C1 프로토콜은 카테터의 삽입이 필요하기 때문에 냉소혈시간은 다른 프로토콜보다 유의적으로 길었다.

제1상은 C1 프로토콜이 특히 길었다. 그러나, 제2상은 세 그룹이 거의 같았다.

3-2(2) 소도 수량

각 분리 프로토콜에 있어서의 정제 전후의 소도 수량을 하기 표 7, 및 도 3A과 도 3B에 나타내었다. IE/g는 췌장 1 g 당 소도 수량의 평균 개수이다.

	소도 수량(IE/g)
	정제 전	정제 후
C1 프로토콜	4,809±454 IE/g	2,486±394 IE/g
C2 프로토콜	8,846±904 IE/g	3,527±795 IE/g
교토 프로토콜	10,247±637 IE/g	7,253±915 IE/g

표 7 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 정제 전의 소도 수량은 C2 프로토콜과 교토 프로토콜이 C1 프로토콜보다 유의적으로 높았다(도 3A).

또한, 정제 후의 소도 수량은 교토 프로토콜이 C1 프로토콜 및 C2 프로토콜보다 유의적으로 높았다(도 3B).

3-2(3) 췌장 소도의 특징

분리한 췌장 소도의 특징을 하기 표 8에 나타내었다.

	C1 프로토콜	C2 프로토콜		교토 프로토콜
생존력(viability) (%)	93±4	96±1		96±1
형태학적 점수	6.9±0.6	7.8±0.6		8.8±0.6*
순도 (%)	93±1	86±5		78±9
정제 효율 (%)	51±5	38±6		64±6**
정제 전 소도 크기 (㎛)	146±16	152±16		176±12
정제 후 소도 크기 (㎛)	113±33	83±11		211±55***
자극 지수	1.4±0.9	1.4±0.4		1.6±0.3

표에서 *은 교토 프로토콜이 C1 프로토콜(P<0.03)보다 형태학적 점수가 유의적으로 더 높음을 나타낸다.

표에서 **은 교토 프로토콜이 C1 프로토콜(P<0.05) 및 C2 프로토콜(P<0.01)보다 정제 효율이 유의적으로 더 높음을 나타낸다.

표에서 ***은 교토 프로토콜이 C2 프로토콜(P<0.04)보다 정제 후의 소도 크기가 유의적으로 더 큰 것을 나타낸다.

표 8에 나타낸 바와 같이, 자극 지수, 생존력, 순도 및 정제전의 췌장 소도의 크기에 있어서는 세 프로토콜 간에 유의적인 차이가 없었다.

그러나, 형태학적 점수, 정제 효율 및 정제 후의 췌장 소도의 크기에 있어서는 교토 프로토콜의 결과가 특별히 뛰어난 것을 알 수 있었다.

3-2(4). 정제 속도

각 분리 프로토콜에 있어서의 정제 속도를 조사하였다. 그 결과, 교토 프로토콜에서 정제액을 60 ml/min의 속도로 COBE2991 셀 프로세서에 운반할 수 있었다.

한편, 정제액으로서 피콜 용액을 사용한 C1 프로토콜 및 C2 프로토콜에서는 정제액의 운반 속도가 10~20 ml/min이었다.

이 결과는 밀도구배제로서 요딕사놀을 사용하는 경우, 소도의 정제의 속도가 3~6 배 빨라지는 것을 나타내었다. 이 결과는 정제액으로 요딕사놀을 사용할 경우 정제액의 낮은 점도가 주요인이라고 여겨진다.

실시예 4. 단백질분해효소 저해제에 관한 관찰

단백질분해효소 저해제의 형태를 조사하기 위해서 하기 실험을 수행하였다.

주췌관에 주입하는 보호액 및 2층법에 사용되는 보존액을 표 9에 기재된 용액을 사용하는 것을 제외하고는 상기 교토 프로토콜과 같은 절차로 소도의 수량을 평가하였다.

보호액 및 보존액	소도 수량 (IE/g)
ET-Kyoto 용액	2103
ET-Kyoto+AEBSF 용액	3448
M-Kyoto 용액 (ET-Kyoto+우리나스타틴 용액)	7253
ET-Kyoto+메실산 가벡세이트	7140

그 결과, 췌관에 주입하는 보호액에 단백질분해효소 저해제를 첨가했을 경우, 소도의 수량이 향상하는 것을 알 수 있었다.

또한 단백질분해효소 저해제가 우리나스타틴 또는 메실산 가벡세이트일 경우에 소도 수량이 상당히 증가함을 알 수 있었다.

나아가, 주췌관에 주입하는 보호액 및 2층법에 사용되는 보존액으로서 ET-Kyoto+메실산 가벡세이트 용액을 사용했을 경우에는 분리된 소도의 순도가 89%, 생존력이 90%의 값을 얻었다.

실시예 5：정제에 관한 관찰

다른 정제액을 사용하여 하기에 따라 관찰을 더 수행하였다.

상기 돼지 췌장 소도 분리 절차에 있어서, 정제액을 표 10에 기재된 용액을사용하는 것을 제외하고는 상술한 교토 프로토콜과 동일한 방법으로 수행하고 상술한 방법에 의해 정제 효율을 평가하였다.

정제액	정제 효율 (%)
I-Kyoto 용액	64
I-Kyoto+AEBSF 용액	70
MI-Kyoto 용액(I-Kyoto+우리나스타틴 용액)	80

표 10에 나타낸 바와 같이, 정제액으로서 단백질분해효소 저해제를 포함하는 용액을 사용하는 경우 정제 효율이 향상되는 것을 알 수 있었다.

특히, MI-Kyoto 용액을 사용했을 경우 즉, 단백질분해효소 저해제로서 우리나스타틴을 사용하는 경우에는 정제 효율이 상당히 향상하는 것을 알았다.

또한, I-Kyoto 용액을 사용하는 경우와 같이, MI-Kyoto 용액을 사용하는 경우에도 정제액을 60 ml/min의 속도로 COBE2991 셀 프로세서에 운반할 수 있었다.

실시예 6：사람 췌장 소도 분리

6-1. 사람 췌장 소도 분리 절차

하기에 기재된 사항을 제외하고는 돼지 췌장 소도 분리와 같은 절차로 사람의 췌장 소도 분리를 실시하였다.

13 인분의 사람의 췌장을 일본 장기이식 네트워크의 중일본 지부 및 서일본 지부에서 설명과 동의를 거쳐 심장정지 후의 기증자로부터 적출하였다.

기증자의 서경부(inquinal region)의 혈관을 통하여 췌장을 급속히 냉각하기 위해 카테터를 삽입하고 심장이 정지하고 나서 췌장을 분리할 때까지 이 카테터를 통해 냉 젖산링겔액(cold lactated Ringer;s solution)을 주입하고 환류시켰다.

그 다음으로 췌장을 분리하고 즉시 카네터를 삽입한 후, M-Kyoto 용액을 췌장 중량 1 g 당 1 ml의 양으로 주췌관에 주입하였다. 이후 신속하게 췌장을 2층법 보존 용기중의 보존액에 침지시켰다. 다음으로 췌장을 교토 대학에 있는 GMP등급 췌장 소도 분리 시설(GMP-grade Center for Cell and Molecular Therapy)에 운반하였다. 2층법에는 M-Kyoto 용액과 과불화탄소액(PFC)을 사용하였다.

평가방법은 상기 돼지 췌장 소도 분리에 있어서의 방법과 같았다. 또한 통계학적 평가도 돼지 췌장 소도 분리와 동일한 방법으로 수행하였다.

6-2. 분리 프로토콜

사람 췌장 소도 분리는 C2 프로토콜 13례중 2예에 의거하여, 교토 프로토콜 13예중 11예에 의거하여 수행하였다 　　　

6-3. 사람 기증자 및 췌장의 특징

기증자의 평균 연령은 44±4세이었다. ICU 체류 기간은 11±3일이었다. BMI는 21±1 kg/m²이었다. 췌장의 크기는 87±6 g이었다. 모든 기증자의 평균 혈액 화학값(average blood chemistry value)에 있어서 이상(abnormality)이 관찰되었다.

온소혈시간은 7±3분이었다. 냉소혈시간은 256±18분이었다. 모든 췌장의 온소혈시간은 냉 젖산링겔액을 사용한 즉각적인 환류에 의해 최적화되었다. 또한 상기 냉소혈시간은 모든 경우에서 6시간 미만이었다.

　　　기증자 조건, 온소혈시간 및 냉소혈시간에 있어서는 두 프로토콜간에 유의적인 차이가 없었다.　　

6-4. 분리 프로토콜의 평가

두 프로토콜(C2 프로토콜, 교토 프로토콜)에 있어서, 사람 췌장 소도 분리의 평가 결과를 표 11에 나타내었다. 소도 수량(IE)은 소도의 총수량을 나타낸다.

	C2 프로토콜 (N=2)	교토 프로토콜 (N=11)
정제 전 소도 수량 (IE)	733,620±249,440	526,657±67,695
정제 후 소도 수량 (IE)	339,480±14,905	410,376±42,412
정제 효율 (%)	51±15	81±5
순도 (%)	50±10	51±6
생존력 (%)	94±6	97±1
형태학적 점수	9.0±1.0	9.8±0.1
조직 부피 (mL)	8.0±1.0	6.4±0.8
그람 염색 음성	2/2	11/11
내독성 (EU)	14.4±11.0	8.7±3.6
이식 기준 적합성	2/2	11/11
이식수	1/2	10/11

정제 전후의 소도 수량은 두 프로토콜간에 유의적인 차이는 없었다. 두 프로토콜간에 순도, 생존력, 형태학적 점수도 같은 결과를 얻었다.

정제 효율은 교토 프로토콜이 C2 프로토콜보다 1.6배 높았다. 또한, 내독성 수준은 교토 프로토콜이 C2 프로토콜보다 낮았다.

정제 속도는 교토 프로토콜에서는 정제액을 60 ml/min의 속도로 COBE2991 셀 프로세서에 운반할 수가 있었다. 한편, C2 프로토콜에 있어서의 속도는 10~20 ml/min였다.

이런 결과를 기반으로 정제액으로서 I-Kyoto 용액을 사용하는 경우에 소도의 정제 속도가 3~6 배 더 빠른 것을 사람 췌장 소도 분리에 있어서도 확인할 수 있었다.

또한, 정제액에 관하여 하기 실험을 수행하였다.

상술한 사람 췌장 소도 분리에 있어서, 정제액을 표 12에 기재된 용액을 사용하는 것을 제외하고는 교토 프로토콜과 동일한 방법으로 수행하여 정제 효율 및 소도의 수량을 평가하였다.

정제액	정제 효율 (%)	총 소도 수량 (IE)
I-Kyoto 용액	78	479409
MI-Kyoto 용액	84.2	544535

표 12에 나타낸 바와 같이, 정제액으로서 단백질분해효소 저해제를 포함하는 용액을 사용하는 경우, 사람 췌장 소도 분리에 대해 정제 효율이 향상하는 것을 알 수 있었다. 또한, 소도의 수량도 향상되는 것을 알 수 있었다.

6-5. 이식 적합 기준

이식 적합 기준은 에드몬톤 프로토콜에 기초로 하여 하기와 같이 설정하였다.

·소도 수량 ≥ 5,000 IE/kg(환자 체중)

·순도 ≥ 30 %

·조직량 ≤ 10 mL

·생존력 ≥ 70 %

·내독성 ≤ 5 IE/kg(환자 체중)

·그람 염색 음성

상기 기준에 관하여 소도 수량을 제외한 13개의 모든 경우에 이식 적합 기준을 만족하였다.

6-6. 1형 당뇨병 환자에 대한 소도 이식

상술한 13개의 예 중 11 예 즉, C2 프로토콜에 따라 분리된 소도의 1개의 예 및 교토 프로토콜에 따라 분리된 소도의 10개의 예를 6명의 1형 당뇨병 환자에게 이식하였다. 나머지의 2 경우의 분리된 소도는 동결 보존하였다.

6명 중 4명의 환자는 복수의 기증자로부터 소도를 받아 이식하였다. 2명의 환자는 1명의 기증자로부터 소도를 받아 이식하였다.

소도 이식 후의 평가는 하기의 방법을 이용하여 수행하였다.

혈청 혈당치, 인슐린 필요량 및 헤모글로빈 A1c(HbAlc)를 이식 전후로 매일 평가하였다. 또한 글루카곤 자극 시험을 이식 전에, 첫번째 이식 후 30, 60일 후, 두번째 이식 후 30일과 60일의 간격으로 수행하였다. 글루카곤 자극 시험에 있어서, 1 mg의 글루카곤 주사 직전 및 주사 후 6 분후에 C-펩타이드 측정용으로 채혈을 실시하였다.

6-7. 소도 이식 후의 평가

소도 이식 후, 환자 6명 모두 저혈당에 의한 의식 소실이 없었으며, 혈중 글루코오스 조절 능력이 개선되었다. 또한, 인슐린 분비의 개시가 C-펩타이드 측정을 기반으로 한 모든 이식에서 확인되었다.

이식시 평균 인슐린 양은 39.2±3.2 단위체였으나, 체감 양은 11.0±4.4 단위체였다(P<0.0005). 2명의 환자는 인슐린 투여가 필요 없는 상태가 되고(insulin free); 다른 2명의 환자는 인슐린의 양이 10 단위체 미만으로 감소되며; 다른 2명의 환자도 인슐린의 양이 감소되었다.

단독 기증자 또는 복수 기증자에 상관없이 6명의 환자 모두 HbAlc 값은 점차적으로 감소하여 췌장 소도 이식으로부터 약 3개월 이후에는 HbAlc 값이 정상치에 도달하였다(도 4A).

6명의 환자의 평균 HbAlc 값은 현저하게 개선되어 이식시의 7.5±0.4%로부터 5.1±0.2%까지 개선되었다(P<0.0003).

모든 환자가 이식 전에는 검지할 수 없는 정도의 C-펩타이드 값(＜ 0.1 ng/ml)을 가지고 있었지만, 이식 후에는 C-펩타이드 값이 검출될 수 있었다. C-펩타이드 값에 관하여는 첫번째 이식 후의 C-펩타이드 값은 기본값이 0.29±0.06 ng/ml, 자극 후의 값이 0.52±0.11 ng/ml(N=6)였다(도 4B). 두번째 소도 이식 후에는 기본값 및 자극 후의 값이 모두 첫번째보다 상당히 향상되었다. 두번째 이식 후의 C-펩타이드 값은 기본값이 0.75±0.12 ng/ml(P<0.01), 자극 후의 값이 1.45±0.26 ng/ml(P<0.005)(N=3)이었다(도 4B).

6-8. 췌장 소도 이식의 임상실험

상술한 교토 프로토콜에 따라 소도 이식의 임상실험을 수행하였다. 또한, 동환자에 대한 두번째 이식을 약 2개월 후에 동일한 방법으로 수행하였다.

첫번째 이식의 소도 수량은 354,384 IE, 두번째는 474,234 IE이었다.

수증자는 36세 여성으로 22년간 1형 당뇨병을 갖고 있으며, 자주 저혈당 발작의 경험이 있고 당뇨병성 망막증의 병력이 있었다.

신장 기능은 정상적이며 크레아티닌 등급은 0.7 mg/dl였다. 다클리주맙(daclizumab) 대신에 바실릭시맙(basiliximab) 20 mg를 사용하는 것을 제외하고는 에드몬톤 프로토콜에 따라 면역 억제제를 수술 후 0 일째와 4 일째에 투여하였다.

이식 전 혈당치의 대조군을 제공하기 위하여, 이전 약 2년 동안 약 2개월 간격으로 아침 식사 전과 저녁 식사 전의 혈당치를 측정해 두었다.

소도 이식 전의 혈당치는 매우 불안정하고, 20 mg/dl로부터 400 mg/dl의 폭넓은 범위에 있었다.

그러나, 첫번째 이식 후, 혈당치는 좁은 범위 내로 유지되었으며, 50 mg/dl로부터 150 mg/dl의 좁은 범위로 자리잡았다(도 5A).

이식 전의 인슐린 필요량은 30~40 unit/일이었지만, 첫번째 이식 후 1개월 후에 인슐린 복용량을 10 unit/일까지 서서히 감소시킬 수 있었다. 또한, 두번째 이식 후 20 일째에는 완전하게 멈출 수 있어 환자는 인슐린을 투여하지 않는 상태에 이르렀다(도 5B).

트랜스아미나아제 수치(trandsminase value)는 첫번째 이식 후 일시적으로 상승했지만, 100 mg/dl를 초과하지는 않았으며 3주 이내에 정상치에 돌아왔다. 크레아티닌 수치(creatine value)는 1.0 mg/dl 이하로 유지되었으며, BUN(blood urea nitrogen)은 전체 관찰 기간 동안 정상치로 유지되었다.

상기 결과로부터 본 발명은 소도의 정제 효율을 증가시키고, 이식 적합 기준을 만족시키는 소도의 수량을 증가시킴을 확인할 수 있다. 또한, 본 발명은 정제 속도를 향상시키고, 소도 분리를 단시간에 효율적으로 수행할 수 있음을 확인할 수 있다.

나아가, 본 발명은 심장정지 기증자로부터 질량 및 수량 모두 양호한 췌장 소도를 수득할 수 있음을 확인할 수 있다. 또한, 본 발명은 심장정지 기증자로부터 소도 이식에 대한 성공률을 높일 수 있음을 확인할 수 있다.

Claims (15)

1. 적출한 췌장의 췌관 내에 단백질분해효소 저해제를 포함하는 보호액을 주입하는 단계(단계 1);

   상기 보호액이 주입된 췌장 내에 효소 용액을 주입하여 췌장을 분해하는 단계(단계 3); 및

   상기 분해된 췌장 조직을 밀도구배제(dnesity gradient reagent)를 포함하는 정제액을 이용하여 정제하는 단계(단계 4)를 포함하는 췌장 소도의 분리방법.
2. 제1항에 있어서, 단계 1의 보호액은 장기 중량 1 g 당 0.1~10 ml의 양으로 췌관 내에 주입되는 분리방법.
3. 제1항에 있어서, 단백질분해효소 저해제를 포함하는 보호액의 칼륨 농도는 4~50 mmol/L인 분리방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 단계 1에서 보호액이 주입된 췌장을 2층법(two-layer method)으로 보존시키는 단계(단계 2)를 더 포함하는 분리방법.
5. 제4항에 있어서, 단계 2의 2층법은 (i) 과불화탄소(perfluorocarbon)용액 및 (ⅱ) 단백질분해효소 저해제를 포함하고, 칼륨 농도가 4~50 mmol/L인 보존액을 이용하는 2층법인 분리방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 보존액은 트레할로스를 더 포함하는 분리방법.
7. 제1항에 있어서, 단계 4의 정제액은 트레할로스를 더 포함하는 분리방법.
8. 제1항에 있어서, 단계 4의 밀도구배제는 요딕사놀인 분리방법.
9. 제1항에 있어서, 단계 4의 정제액은 단백질분해효소 저해제를 더 포함하는 분리방법.
10. 제1항의 췌장 소도의 분리방법에 이용되고, 단백질분해효소 저해제를 포함하는 췌관 내 주입용 보호액.
11. 제10항에 있어서, 칼륨 농도가 4~50 mmol/L인 보호액.
12. 단백질분해효소 저해제를 포함하고, 칼륨 농도가 4~50 mmol/L인 2층법용 췌장 보존액.
13. 밀도구배제 및 트레할로스를 포함하는 췌장 소도의 정제액에 있어서, 상기 밀도구배제가 요딕사놀인 췌장 소도의 정제액.
14. 제13항에 있어서, 단백질분해효소 저해제를 더 포함하는 정제액.
15. 삭제

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