CN101084305A - 胰岛的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供胰岛的分离方法，其包括如下工序：将含有蛋白酶抑制剂的保护液注入到离体的胰脏的胰管内的工序(1)；将注有保护液的胰脏分解的工序(3)；以及将该分解得到的胰组织用含有密度梯度剂的纯化溶液来纯化的工序(4)。此外，提供胰管内注入用保护液、二层法用胰脏保存液和胰岛纯化溶液。
Description
技术领域
本发明涉及胰岛移植中的重要技术的胰岛的分离方法。进一步涉及在胰岛的分离中能够很好地使用的胰管内注入用保护液、二层法用胰脏保存液及胰岛纯化溶液。
背景技术
对于处在不给与胰岛素就不能维持生命的、所谓的胰岛素依赖状态的1型糖尿病患者，胰岛移植技术备受社会的关注，主要在欧美，该技术正被确立为临床的治疗方法。
胰岛移植是将生物体内在调节血糖方面发挥中心作用的细胞集团的胰岛通过点滴注入到门静脉内的细胞组织移植。胰岛移植对接受移植者的侵袭小，被看成对于1型糖尿病患者来说是最近乎理想的治疗方法。
2000年，报道了在Canada Edmonton的Alberta大学，临床胰岛移植的治疗成功。自该报道以来，在4年多里，以欧美为中心进行了约300例的胰岛移植。这些胰岛移植以在Alberta大学确立的、所谓的“Edmonton Protocol”为基础来实施。
然而，在以往的技术中，即使在欧美进行的来自脑死亡供体的胰岛移植中，也不能得到稳定的胰岛收获量，所移植的胰岛有时也不能有效地发挥功能。进而，来自于较脑死亡供体条件差的心脏停止供体的胰岛移植在世界上几乎没有成功例，来自心脏停止供体的胰岛移植以往在事实上是不可能的。
为了提高胰岛移植的成功率，而且为了使来自于心脏停止供体的胰岛移植成功，大量移植适于移植的胰岛是重要的。因此，为了使适于移植的胰岛的收获量提高，强烈要求改善胰岛的分离技术。
另一方面，在移植医疗中，报道有向脏器移植后的脏器移植患者给予乌司他丁(Ulinastatin)或其替代物的方法(参照特开2002-20309号公报)。
此外，还报道有用于灌流或保存移植用脏器的溶液，在肺移植中确认了优异的效果(特开平6-40801号公报)。
然而，在胰岛移植、特别是胰岛的分离和纯化技术中，能够优选使用的方法尚不清楚。
发明内容
本发明的主要目的在于，提供能够使适于移植的胰岛的收获量提高的、胰岛的分离技术。
本发明人等以提高胰岛的收获量为主要目的，进行了各种研究，结果发现，通过使用特定的溶液和方法，适于移植的胰岛的收获量得到提高，进一步反复进行精心研究，从而完成了本发明。
即，本发明涉及下述的分离方法和溶液。
第1项是胰岛的分离方法，其包括如下工序：将含有蛋白酶抑制剂的保护液注入到离体的胰脏的胰管内的工序(1)；将酶溶液注入到该注有保护液的胰脏中，将胰脏分解的工序(3)；以及将该分解得到的胰组织用含有密度梯度剂的纯化溶液来纯化的工序(4)。
第2项是如第1项所述的分离方法，其中，在工序(1)中，以每1克脏器重量为约0.1～10ml的量将上述保护液注入到胰管内。
第3项是如第1项或第2项所述的分离方法，其中，含有蛋白酶抑制剂的保护液的钾浓度为约4～50mmol/L。
第3A项是如第1～3项中任一项所述的分离方法，其中，含有蛋白酶抑制剂的保护液进一步含有海藻糖。
第4项是如第1～3A项中任一项所述的分离方法，其中，进一步具有通过二层法保存注有保护液的胰脏的工序(2)。
换言之，胰岛的分离方法包括如下工序：将含有蛋白酶抑制剂的保护液注入到离体的胰脏的胰管内的工序(1)；通过二层法保存注有该保护液的胰脏的工序(2)；在保存后的胰脏中注入酶溶液，将胰脏分解的工序(3)；以及将该分解得到的胰组织用含有密度梯度剂的纯化溶液来纯化的工序(4)。
第5项是如第4项所述的分离方法，其中，工序(2)的二层法使用含有(i)全氟化碳(perfluorocarbon)液体和(ii)蛋白酶抑制剂的、钾浓度为约4～50mmol/L的保存液。
第5A项是如第5项所述的分离方法，其中，(ii)的保存液进一步含有海藻糖。
第6项是如第1～5A项中任一项所述的分离方法，其中，工序(4)中的纯化溶液进一步含有海藻糖。
第7项是如第1～6项中任一项所述的分离方法，其中，工序(4)中的密度梯度剂是碘克沙醇(Iodixanol)。
第8项是如第1～7项中任一项所述的分离方法，其中，工序(4)中的纯化溶液进一步含有蛋白酶抑制剂。
第8A项是如第1～8项中任一项所述的分离方法，其中，蛋白酶抑制剂是选自乌司他丁、甲磺酸加贝酯和甲磺酸萘莫司他中的一种以上。
第9项是含有蛋白酶抑制剂的胰管内注入用保护液。
换言之，将含有蛋白酶抑制剂的保护液在胰岛分离中注入到胰管内来使用的方法。
优选的是，蛋白酶抑制剂是选自乌司他丁、甲磺酸加贝酯和甲磺酸萘莫司他中的一种以上。
第10项是如第9项所述的保护液，其中，钾浓度为约4～50mmol/L。
第10A项是如第9项或第10项所述的保护液，其中，进一步含有海藻糖。
第11项是二层法用胰脏保存液，其中，含有蛋白酶抑制剂，钾浓度为约4～50mmol/L。
换言之，将含有蛋白酶抑制剂、钾浓度为约4～50mmol/L的保存液用于胰岛分离中利用二层法的胰脏保存的方法。
优选的是，蛋白酶抑制剂是选自乌司他丁、甲磺酸加贝酯和甲磺酸萘莫司他中的一种以上。
第11A项是如第11项所述的保存液，其中，进一步含有海藻糖。
第12项是含有密度梯度剂和海藻糖的胰岛的纯化溶液。
换言之，将含有密度梯度剂和海藻糖的溶液用于胰岛分离中的胰岛纯化的方法。
第13项是如第12项所述的纯化溶液，其中，密度梯度剂是碘克沙醇。
换言之，含有碘克沙醇和海藻糖的纯化溶液。
第14项是如第12项或第13项所述的纯化溶液，其中，进一步含有蛋白酶抑制剂。
换言之，如第12项或第13项所述的纯化溶液，其中，含有密度梯度剂、海藻糖和蛋白酶。
优选的是，蛋白酶抑制剂是选自乌司他丁、甲磺酸加贝酯和甲磺酸萘莫司他中的一种以上。
本发明进一步包括如下方式。
第15项是具有下述工序的胰岛的分离方法：
将含有胰蛋白酶抑制剂的组织保护或保存液注入到离体的胰脏的胰管内的工序(1)；
将胶原酶溶液注入到上述注有保护或保存液的胰脏中，使胰脏膨胀的工序(2)；
使该膨胀的胰脏内的溶液温度升高，将胶原酶活化，将胰组织分解的工序(3)；
将分解得到的胰组织回收的工序(4)；
从回收所得的胰组织中将胰岛分离，并纯化胰岛的工序(5)。
第16项是如第15项所述的分离方法，其中，上述工序(5)具有下述工序(5-1)～(5-3)：
在将密度梯度剂添加到组织保护或保存溶液而成的纯化溶液中，制作密度梯度的工序(5-1)；
在制成密度梯度的纯化溶液中，添加所回收得到的胰组织的工序(5-2)；
将添加有胰组织的纯化溶液离心分离，从胰组织中分离胰岛，将胰岛纯化的工序(5-3)。
第17项是如第16项所述的分离方法，其中，上述工序(5-1)是下述工序(5-1’)：
在将胰蛋白酶抑制剂和密度梯度剂添加到组织保护或保存溶液而成的纯化溶液中，制作密度梯度的工序(5-1’)。
第18项是如第16项或第17项所述的分离方法，其中，密度梯度剂是碘克沙醇。
第19项是如第15～18项中任一项所述的分离方法，其中，进一步具有下述工序：
将上述注有保护或保存液的胰脏保存在形成2层的容器中的工序(1-2)，所述2层为含有全氟化碳(perfluorocarbon)的层和含有含胰蛋白酶抑制剂的组织保护或保存液的层。
第20项是如第15～19项中任一项所述的分离方法，其中，胰蛋白酶抑制剂是乌司他丁。
第21项是如第15～20项中任一项所述的分离方法，其中，组织保护或保存液的钾浓度为约4～50mmol/L。
第22项是将碘克沙醇添加到钾浓度为4～50mmol/L的组织保护或保存液中而成的胰岛纯化溶液。
第23项是如第22项所述的纯化溶液，其中，进一步添加胰蛋白酶抑制剂。
第24项是如第23项所述的纯化溶液，其中，胰蛋白酶抑制剂是乌司他丁。
以下，对本发明进行更详细的说明。
1.胰岛的分离方法
本发明的胰岛的分离方法包括下述工序：将含有蛋白酶抑制剂的保护液注入到离体的胰脏的胰管内的工序(1)；将酶溶液注入到该注有保护液的胰脏中，将胰脏分解的工序(3)；将该分解得到的胰组织用含有密度梯度剂的纯化溶液来纯化的工序(4)。
此外，本发明还包括进一步含有下述工序的方法：通过二层法来保存注有保护液的胰脏的工序(2)。
I(1).将保护液注入到胰管内的工序
本发明的分离方法包括将含有蛋白酶抑制剂的保护液注入到从供体摘出的胰脏的胰管内的工序。由于在胰管内注入含有蛋白酶抑制剂的保护液，所以确实地保护胰组织，使适于移植的胰岛的收获量得到提高。
保护液向胰管内的注入量可以根据脏器的状态等进行适当设定，但每1克脏器重量为约0.1～10ml左右，优选为约0.1～2ml左右，进一步优选为约1～1.5ml左右。
注入该程度的量，能够将保护液确实地遍及到胰脏整体的胰管，在提高质量好的胰岛的收获量方面是优选的。
蛋白酶抑制剂可以适当选定，但从胰岛的收获量更优异的观点出发，特别优选选自乌司他丁、甲磺酸加贝酯和甲磺酸萘莫司他中的一种以上。
此外，从提高适于移植的胰岛的收获量的观点出发，优选保护液为低钾浓度。
具体而言，优选每1000ml保护液的钾浓度为4～50mM，特别优选为10～50mM左右。
此外，从提高适于移植的胰岛的收获量的观点出发，优选保护液含有海藻糖。
保护液注入的时刻可以适当设定，但优选尽量快，优选为胰脏离体后马上注入。
保护液的注入方法可以适当设定，例如，将导管插入离体的胰脏中，在利用泵进行的调节注入压的条件下，可以通过该导管进行注入。
插入的导管的数可以适当设定，优选为1根。由于设定为1根，所以能够减少注入到脏器内的溶液的漏液，能够更正确地进行液体的注入，还能够减少脏器的损伤。
I(2).通过二层法保存的工序
将保护液注入到胰管内之后的胰脏优选通过二层法来保存。
二层法可以如下进行：将全氟化碳液体和保存液装入容器内，形成二层后，将氧供给到容器内，在该容器中，将胰脏浸渍保存。全氟化碳液体与保存液的比例按体积比计为1∶1左右。氧的供给优选进行至少30分钟以上。
由于通过二层法保存胰脏，可以高度维持组织的生存力。
二层法中使用的保存液优选含有蛋白酶抑制剂。由于设定为含有蛋白酶抑制剂的保存液，所以能够使胰岛的收获量提高。
蛋白酶抑制剂可以适当选定，但从胰岛的收获量更优异的观点出发，特别优选选自乌司他丁、甲磺酸加贝酯和甲磺酸萘莫司他中的一种以上。
此外，保存液优选为低钾浓度。具体优选为4～50mmol/L左右，特别优选为10～50mmol/L左右。
由于保存液为低钾浓度，所以能够进一步使胰岛的收获量提高。
此外，保存液优选含有海藻糖。由于保存液含有海藻糖，所以能够进一步使胰岛的收获量提高。
I(3).分解胰脏的工序
注有保护液的胰脏或通过二层法保存的胰脏接着被分解胰组织。
分解、换言之为消化，例如，可以如下进行：将酶溶液注入到胰脏的胰管内，使胰脏膨胀之后，提高酶溶液的温度，从而使酶活化。
酶溶液的注入，例如可以如下进行：在使用泵调节注入压的条件下，将酶溶液注入到主胰管中。酶溶液的注入可以通过与注入保护液中所用的相同的导管来进行。
作为酶溶液，可以使用例如胶原酶溶液等。
将酶溶液注入到胰脏中之后，使用适当的装置使溶液的温度上升，从而可以开始分解。
例如，使用胶原酶溶液时，将膨胀而得的胰脏装入Ricordi腔中，用溶液填满用于分解的回路，制成封闭系统。用泵使溶液循环，使溶液的温度上升到体温附近、37℃左右。由于温度上升，注入到胰组织中的胶原酶活化，将形成细胞与细胞结合的组织的胶原酶溶解，从而分解胰组织。
分解的停止在如下时刻：原样保持构成胰岛的细胞凝聚的形态，只有胰外分泌腺组织从胰岛的周围解离的时刻。
分解的停止也可以通过降低溶液的温度来进行。此外，还可以通过添加血清蛋白、将酶灭活来进行。
例如，可以通过把回路设为开放系统，将含有人清蛋白的室温的溶液通过回路内来进行。由于室温的溶液通过，所以能够降低溶液的温度，还能够稀释酶，而且，由于加有血清蛋白，所以能够降低酶的活性。
停止分解之后，回收胰组织。所回收的胰组织优选在纯化之前用离心分离器进行离心洗净，进行浓缩处置。
I(4).纯化工序
纯化可以利用胰岛的比重比胰外分泌腺组织的比重轻的性质来进行。例如，在形成密度梯度、换言之形成比重浓度梯度的溶液中，添加经分解的胰组织，用比重离心沉淀法将胰岛和胰外分泌腺组织分离，从而可以进行胰岛的纯化。
例如，可以通过以下的步骤进行。
首先，在含有密度梯度剂的纯化溶液中，形成密度梯度。
接着，在形成密度梯度的纯化溶液中，添加经分解的胰组织。
接着，通过比重离心沉淀法，将添加有分解胰组织的纯化溶液离心分离。通过离心分离，将胰岛和外分泌腺组织分离，从回收的胰组织中分离胰岛。
密度梯度剂优选可以制作粘度低的溶液的物质。优选的密度梯度剂可以举出碘克沙醇(OptiprepTM)和N，N’-双(2，3-二羟基丙基)-5-[N-(2，3-二羟基丙基)乙酰胺]-2，4，6-三碘代-间苯二甲酰胺(NycodenzR)。
此外，纯化溶液优选进一步含有蛋白酶抑制剂。由于纯化溶液含有蛋白酶抑制剂，所以能够进一步提高胰岛的收获量。
密度梯度可以是连续密度梯度，也可以是非连续密度梯度，但从能够回收更多的胰岛的观点出发，优选连续密度梯度。
密度梯度可以根据公知方法适当形成。此外，还可以使用适当的装置，例如连续比重制作装置。
此外，对于纯化，也可以利用COBE2991那样的血球洗净装置。
例如，在COBE2991内，利用密度梯度剂制作密度梯度，向其中添加经洗净浓缩而得的分解胰组织，用连续比重离心沉淀法分离为胰岛和外分泌腺组织之后，可以采取COBE2991内的溶液的各部份。用显微镜检查分离后的液体，判定在哪部份中存在胰岛，将胰岛回收。
回收经纯化的胰岛后，一系列的分离操作结束。
II.胰管内注入用保护液
本发明的保护液可以在胰岛移植的胰岛分离中、注入到胰管内来使用。此外，本发明的保护液可以优选用作上述本发明的分离方法中的含有蛋白酶的保护液。
本发明的保护液可以通过将蛋白酶抑制剂添加到组织保护或保存液中来得到。
II-1.蛋白酶抑制剂
本发明中使用的蛋白酶抑制剂只要具有蛋白酶抑制活性，其由来和种类就不受特别限定，可以适当使用公知的物质，特别优选具有胰蛋白酶抑制活性的胰蛋白酶抑制剂。
蛋白酶抑制剂的例子包括选自乌司他丁(MiraclidTM)、4-[2-氨基乙基苯磺酰基]氟化物(AEBSF、PefablocTM)、甲磺酸加贝酯(FOYTM)、甲磺酸萘莫司他(FusanTM)中的一种以上。其中，从胰岛的收获量更优异的观点出发，优选使用选自乌司他丁、甲磺酸加贝酯和甲磺酸萘莫司他中的一种以上。此外，从具有抗炎作用的观点出发，优选乌司他丁和甲磺酸加贝酯。
蛋白酶抑制剂在保护液中的添加比例可以在发挥本发明效果的范围内根据抑制剂的种类来适当设定。蛋白酶抑制剂如果是乌司他丁，则每1升为10000～100000U左右，优选为50000～100000U左右。此外，如果是甲磺酸加贝酯，则每1升为100～10000mg左右，优选为500～2000mg左右。
II-2.组织保护或保存液
组织保护或保存液可以从用于保护或保存组织(包括脏器和细胞)的公知溶液中适当选择。
例如，可以使用Euro-Collins液、UW液(University of Wisconsin液)、ET-Kyoto液、Low-Potassium Dextran Glucose液、HTK溶液(CustodiolTM)等。
此外，可以举出具有下述组成的液体。
组织保护或保存液(例1)
钠(Na+)10～140mmol/L
钾(K+)4～140mmol/L
镁(Mg2+)0～4mmol/L
钙(Ca2+)0～2mmol/L
磷酸(H2PO4 -或HPO4 2-)12～65mmol/L
Cl-、HCO3 -、CO3 2-、有机酸或有机酸阴离子15～150mmol/L
羟乙基淀粉0～80g/L
海藻糖0～240mmol/L
组织保护或保存液(例2)
钠(Na+)10～140mmol/L
钾(K+)4～140mmol/L
羟乙基淀粉0～80g/L
谷胱甘肽0～10mmol/L
腺苷0～10mmol/L
乳糖酸盐(Lactobionate)0～140mmol/L
棉子糖(Raffinose)0～50g/L
组织保护或保存液(例3)
钠(Na+)80～120mmol/L
钾(K+)4～50mmol/L
葡糖酸盐15～150mmol/L
磷酸20～40mmol/L
海藻糖80～160mmol/L(27～55g/L)
羟乙基淀粉(HES)20～60g/L
Dibutyryl cAMP 0～10mmol/L
硝化甘油0～1g/L
在上述示例的组织保护或保存液中，特别优选使用ET-Kyoto液和例1或例3中记载的液体。
II-3.胰管内注入用保护液的方式
胰管内注入用保护液优选为低钾浓度。具体地说，优选每1000ml保护液的钾浓度为4～50mM，特别优选为10～50mM。
钾的浓度低时，不会使脉管痉挛，能够防止胰岛素从胰岛释放，能够使溶液快速到达组织的各处。可以更加提高胰管保护作用，能够使适于移植的胰岛的收获量提高。
此外，胰管内注入用保护液的渗透压优选为270～450mOsm/l，特别优选300～400mOsm/l。如果为该范围，则可以防止组织在保护或保存中发生膨胀或收缩。
此外，胰管内注入用保护液的pH优选为7～8左右，以防止细胞或组织的酸性分解等。
此外，胰管内注入用保护液优选含有海藻糖。由于含有海藻糖，所以对于胰管的保护作用更高，能够使胰岛的收获量提高。海藻糖存在有α，α-海藻糖、α，β-海藻糖和β，β-海藻糖这3种，可以使用任何一种，也可以使用它们的混合物。优选使用天然存在的α，α-海藻糖。
海藻糖的浓度在1000ml保护液中为0～400mmol，特别是50～240mmol，进一步为80～160mmol左右。
进而，胰管内注入用保护液只要无损本发明的效果，则可以进一步含有其他成分。作为其他成分，可以举出各种电解质、糖质、氨基酸、药物制剂、维生素等。
此外，还可以含有dibutyryl cAMP等AMP或ATP等细胞赋活剂、前列腺素、硝化甘油等血管扩张剂、抗生物质、腺苷、N-乙酰基-L-半胱氨酸、甘氨酸、抗坏血酸、谷酰胺、烟酰胺、谷胱甘肽、棉子糖等。
本发明的胰管内注入用保护液优选方式的例子包括至少以下述比例含有下述成分的液体：
钠80～120mmol/L
钾4～50mmol/L
葡糖酸盐15～150mmol/L
磷酸20～40mmol/L
海藻糖80～160mmol/L
羟乙基淀粉(HES)20～60g/L
乌司他丁10000～100000U/L
本发明的胰管内注入用保护液对胰管的保护作用高，能够原样维持组织的生存力，能够稳定而确实地保护组织，能够使适于移植的胰岛的收获量提高。
III.二层法用胰脏保存液
本发明的保存液在胰岛移植的胰岛分离中、可以使用于利用二层法的胰脏保存。此外，本发明的二层法用胰脏保存液可以优选用作上述本发明的胰岛分离方法中的二层法中使用的保存液。
本发明的保护液可以通过在低钾浓度的组织保护或保存液中添加蛋白酶抑制剂来得到。
作为蛋白酶抑制剂，可以使用上述II-1中记载的抑制剂。
此外，作为组织保护或保存液，在上述II-2中记载的液体中，可以使用低钾浓度的液体。特别优选使用ET-Kyoto液等。
III-2.-二层法用胰脏保存液的方式
蛋白酶抑制剂在保存液中的添加比例可以在发挥本发明效果的范围内根据抑制剂的种类来适当设定。
蛋白酶抑制剂如果是乌司他丁，则每1升为10000～100000U左右，优选为50000～100000U左右。此外，如果是甲磺酸加贝酯，则每1升为100～10000mg左右，优选为500～2000mg左右。
二层法用胰脏保存液的钾浓度为4～50mM左右，特别为10～50mM。
钾浓度低时，可以更加确切地发挥胰脏的保存作用，可以使适于移植的胰岛的收获量提高。
此外，保存液的渗透压为270～450mOsm/l，特别优选300～400mOsm/l。如果为该范围，则可以防止组织在保存中发生膨胀或收缩。
此外，保存液的pH优选为7～8左右，以防止细胞或组织的酸性分解等。
此外，保存液优选含有海藻糖。
海藻糖的浓度在1000ml保存液中优选为0～400mmol，特别优选50～240mmol，进一步优选为80～160mmol。由于含有海藻糖，所以对于胰脏的保护作用更高，能够使胰岛的收获量提高。
进而，只要无损本发明的效果，则保存液中可以进一步含有其他成分。作为其他成分，可以举出各种电解质、糖质、氨基酸、药物制剂、维生素等。
此外，还可以含有dibutyryl cAMP等AMP或ATP等细胞赋活剂、前列腺素、硝化甘油等血管扩张剂、抗生物质、腺苷、N-乙酰基-L-半胱氨酸、甘氨酸、抗坏血酸、谷酰胺、烟酰胺、谷胱甘肽、棉子糖等。
本发明的二层法用保存液优选方式的例子可以举出至少以下述比例含有下述成分的液体：
钠80～120mmol/L
钾4～50mmol/L
葡糖酸盐15～150mmol/L
磷酸20～40mmol/L
海藻糖80～160mmol/L
羟乙基淀粉(HES)20～60g/L
乌司他丁10000～100000U/L
由于使用本发明的保存液，胰脏的保护作用高，能够原样维持组织的生存力，能够确实地保存这些组织，能够使适于移植的胰岛的收获量显著提高。
IV.胰岛纯化溶液
在胰岛移植的胰岛分离中，胰岛的纯化中优选使用本发明的纯化溶液。此外，本发明的纯化溶液可以优选用作上述本发明的胰岛的分离方法中的纯化溶液。
本发明的纯化溶液可以通过在含有海藻糖的组织保护或保存液中添加密度梯度剂来得到。作为含有海藻糖的组织保护或保存液，在上述II-2的记载中，可以使用含有海藻糖的液体。特别优选使用ET-Kyoto液。
IV-1.密度梯度剂
密度梯度剂可以从用于调制溶液内的密度梯度的公知物质中来适当选择。特别是，密度梯度剂优选可以制成粘度低的溶液的物质。此外，优选内毒素水平低的物质。
优选的密度梯度剂可以举出碘克沙醇(OptiprepTM)和N，N’-双(2，3-二羟基丙基)-5-[N-(2，3-二羟基丙基)乙酰胺]-2，4，6-三碘代-间苯二甲酰胺(NycodenzR)。特别优选碘克沙醇，
通过使用这些物质作为密度梯度剂，可以得到粘度低的纯化溶液，可以加快纯化速度。进而，还可以制成内毒素水平低的溶液。
密度梯度剂相对于组织保护或保存液的混合比例，可以在纯化前测定胰组织的密度、并考虑密度梯度剂与组织保护或保存液的比重来适当设定。
IV-2.海藻糖
海藻糖存在有α，α-海藻糖、α，β-海藻糖和β，β-海藻糖这3种，可以使用任何一种，也可以使用它们的混合物。优选使用天然存在的α，α-海藻糖。
纯化溶液中的海藻糖的浓度为0～400mmol/L左右，特别是50～240mmol/L，进一步为80～160mmol/L左右。
IV-3.蛋白酶抑制剂
纯化溶液优选进一步含有蛋白酶抑制剂。作为蛋白酶抑制剂，可以使用上述II-1中记载的物质。从胰岛的收获量更优异的观点出发，特别优选使用选自乌司他丁、甲磺酸加贝酯和甲磺酸萘莫司他中的一种以上。
将蛋白酶抑制剂添加到纯化溶液中的情况下，添加比例可以在发挥本发明效果的范围内根据抑制剂的种类来适当设定。
蛋白酶抑制剂如果是乌司他丁，则每1升为10000～100000U左右，优选为50000～100000U左右。此外，如果是甲磺酸加贝酯，则每1升为100～10000mg左右，优选为500～2000mg左右。
IV-4.纯化溶液的方式
纯化溶液优选为低钾浓度，优选为4～50mmol/L左右，特别是10～50mmol/L左右。
纯化溶液优选为低粘度。特别是在测定温度为22℃的条件下，通过Brookfield法测得的粘度为5厘泊(cp)以下，优选3cp，特别优选2cp以下。
此外，只要无损本发明的效果，可以在纯化溶液中适当添加其他成分。其他成分包括例如腺苷、葡聚糖、肝素等。
优选的纯化溶液方式的例子可以举出至少以下述的比例含有下述成分的液体：
钠80～120mmol/L
钾4～50mmol/L
葡糖酸盐15～150mmol/L
磷酸20～40mmol/L
海藻糖80～160mmol/L
羟乙基淀粉(HES)20～60g/L
碘克沙醇100～500ml/L
含有蛋白酶抑制剂的纯化溶液优选的方式的例子可以举出至少以下述的比例含有下述成分的液体：
钠80～120mmol/L
钾4～50mmol/L
葡糖酸盐15～150mmol/L
磷酸20～40mmol/L
海藻糖80～160mmol/L
羟乙基淀粉(HES)20～60g/L
碘克沙醇100～500ml/L
乌司他丁10000～100000U/L
在胰岛移植的胰岛纯化中，以维持胰岛三维结构的方式来进行纯化是重要的，只要使用本发明的纯化溶液，就能够在确实地维持胰岛的三维结构的状态下使适于移植的胰岛的收获量提高。
V.胰岛移植
胰岛移植可以通过将通过上述一系列分离操作而得到的的胰岛注入到患者的门静脉中来实施。
经分离的胰岛在满足规定基准的情况下被判断为适于移植，而用于移植中。
从有效性的观点出发，要求判断移植中使用的胰岛在移植后是否作为胰岛发挥作用。进而，有必要极力排除病原体或有害物质等混入到受体中的危险性。
作为适于移植的分离胰岛的基准，具体而言，可以使用以下的基准。
·胰岛量≥4000 IE/kg(患者体重)
·纯度≥30％
·组织量≤10ml
·生存力≥70％
·内毒素≤5IE/kg(患者体重)
·革兰氏染色阴性
为了更有效地实施胰岛移植，胰岛量≥5000 IE/kg(患者体重)是更优选的。
被判断为适于移植的胰岛保存至患者(受体)准备好为止。然后，在患者准备好之后，通过点滴被注入到门静脉中。
本发明的胰岛分离技术可以根据需要附加胰岛移植和胰岛分离中的各种公知技术。
根据本发明，适于移植的胰岛的收获量得到提高，于是，根据本发明，可以提高纯化效率，还可以改善纯化速度。由此，可以大量移植质量好的胰岛，可以使移植后的胰岛更有效地发挥功能。
由于使用本发明的分离方法和溶液，可以提高胰岛移植的治疗成绩。
根据本发明的胰岛的分离方法，适于移植的胰岛的收获量增加。进而，还可以在更短的时间内高效地进行胰岛的分离。
本发明的分离方法具有如下特征：将含有蛋白酶抑制剂的保护液注入到胰管内。
由于将含有蛋白酶抑制剂的保护液注入到胰管内，所以在胰管内胰组织被确切地保护，适于移植的胰岛的收获量得到提高。
此外，本发明的分离方法还可包括利用二层法的胰脏的保存工序。优选通过使用含有(i)全氟化碳(perfluorocarbon)液体和(ii)蛋白酶抑制剂的、钾浓度为约4～50mmol/L的保存液的二层法来保存。由此，适于移植的胰岛的收获量显著提高。
进而，本发明的分离方法包括用含有密度梯度剂的纯化溶液来进行纯化的工序。优选用含有密度梯度剂和海藻糖的纯化溶液来进行纯化。更优选使用进一步含有蛋白酶抑制剂的纯化溶液来进行纯化。通过使用这样的纯化溶液，纯化效率得到提高，进而，适于移植的胰岛的细胞得到提高。
本发明的分离方法由于具有这样的特征，所以具有使适于移植的胰岛的收获量显著提高的特征。
此外，根据本发明，提供含有蛋白酶抑制剂的胰管内注入用保护液。该保护液对胰管的保护作用高，可以使胰岛收获量增加。
此外，根据本发明，提供含有蛋白酶抑制剂的、钾浓度为4～50mmol/L的二层法用胰脏保存液。该保存液对胰管的保护作用高，维持组织的生存力，确切地保护组织，使适于移植的胰岛的收获量提高。
此外，根据本发明，提供含有密度梯度剂和海藻糖的胰岛纯化溶液。进而，提供含有密度梯度剂、海藻糖和蛋白酶抑制剂的纯化溶液。这些纯化溶液可以提高纯化效率，还可以使适于移植的胰岛的收获量提高。进而，可以降低纯化溶液的粘度，加快纯化速度。进而，内毒素水平降低，可以使患者的危险性降低。
如此，本发明提供能够使适于移植的胰岛的收获量增加的胰岛的分离方法、胰管内注入用保护液、二层法用胰脏保存液和胰岛纯化溶液。
根据本发明，满足适合移植标准的胰岛的收获量提高，由此，能够使胰岛移植的成功率提高。进而，可以实现用以往的方法事实上不能实现的来自心脏停止供体的胰岛移植。
这样，本发明能够对胰岛素依赖状态糖尿病、特别是1型糖尿病患者提供更确实有效的治疗方法，在胰岛移植的临床实施方面作出巨大贡献。
附图说明
图1是表示将根据有无胰管保护的胰岛收获量进行比较研究而得的实验结果的图。图1A表示纯化前的胰岛收获量。图1B表示纯化后的胰岛收获量。IE/g表示每1克胰脏的收获量胰岛的平均个数。注入到胰管(-)表示没有将保护液注入到胰管内的情况，注入到胰管(+)表示将保护液注入到胰管内的情况。
图2是表示将根据二层法中使用的保存液的不同而对纯化后的胰岛收获量进行比较研究所得的实验结果的图。IE/pancreas表示从每一个胰脏中取得的胰岛的总收获量。PFC表示全氟化碳液体(PFC)，UW表示UW液，M-UW表示UW+乌司他丁液，ET-Kyoto表示ET-Kyoto液，M-Kyoto表示ET-KYOTO+乌司他丁液。
图3是表示比较每个方案后的猪胰岛分离中的胰岛收获量的结果的图。
图3A表示纯化前的结果。图3B表示纯化后的结果。IE/g表示每1克胰脏的收获量胰岛的平均个数。
图4：图4A是表示来自心脏停止供体的胰岛移植前后的6名患者的HbAlc值的变化的图。各患者的数据用不同的记号来区别。图4A的纵轴表示HbAlc相对于血红蛋白整体的比例。虚线表示正常上限值。
图4B表示胰高血糖素刺激试验中的C-肽值(平均值)。■表示基础值，□表示刺激后的值。
图5：图5A是表示在胰岛移植前后测定早餐前和晚餐前的血糖值而得的结果的图。图5A的两条虚线表示正常范围。◆表示早餐前的值，■表示晚餐前的值。
图5B是表示胰岛移植前后的患者每1天的胰岛素量的图。
具体实施方式
以下，为了使本发明更加明确，用实施例和实验例来进行说明，但本发明并不限于这些实施例。
材料和步骤
·材料
1(1)：保护液或保存液
使用UW液(ViaSpanTM、DuPont制)和ET-Kyoto液(KyotoSolution、Kyoto Biomedical Science公司)。
进而，在1升ET-Kyoto液中添加100000单位(U)的乌司他丁(Ulinastatin、MiraclidTM、持田制药株式会社)，调制ET-Kyoto+乌司他丁液(以下也称为M-Kyoto液)。
UW液、ET-Kyoto液和M-Kyoto液中含有的主要成分的组成和渗透压示于下述表1中。
表1
| UW液 | ET-Kyoto液 | M-Kyoto液 | |
| 钠(Na)(mol/L) | 29 | 100 | 100 |
| 钾(K)(mmmol/L) | 125 | 43.5 | 43.5 |
| 镁(Mg)(mol/L) | 5 | - | - |
| 葡糖酸盐(Glucouate)(mmol/L) | - | 100 | 100 |
| 磷酸(Phosphate)(mmol/L) | 25 | 25 | 25 |
| 硫酸(sul fate)(mmo l/L) | 5 | - | - |
| 乳糖酸盐(Lactobionate)(mmol/L) | 100 | - | - |
| 棉子糖(Raffinose)(mmol/L) | 30 | - | - |
| 海藻糖(Trehalosc)(mmol/L) | - | 120 | 120 |
| 腺苷(Adenosinc)(mmol/L) | 5 | - | - |
| 别嘌醇(Alloprinol)(mmol/L) | 1 | - | - |
| 谷胱甘肽(Glutathione)(mmol/L) | 3 | - | - |
| 羟乙基淀粉(HES)(g/L) | 50 | 30 | 30 |
| 乌司他丁(Ulinastatin)(×103U/L) | - | - | 100 |
| 渗透压(Osmorality)(m0sm) | 320 | 366 | 366 |
此外，在1升ET-Kyoto液中添加0.4～8mM的4-[2-氨基乙基]苯磺酰基]氟化物·HCL(AEBSF、PefablocTM、Roche制)，调制ET-Kyoto+Pefabloc液。
此外，在1升ET-Kyoto液中添加1000mg的甲磺酸加贝酯(Gabexate mesilate、FOYTM、小野药品工业制)，调制ET-Kyoto+FOY液。
1(2).纯化溶液
如下调制菲可液(Ficoll液)：混合浓度不同的2种菲可(FicollTM、Pharmacia公司制)溶液(用Hanks’溶液稀释而得的物质)，使得轻比重为约1.07-1.08，重比重为1.09-1.12。
此外，在ET-Kyoto液中混合60重量％的碘克沙醇(Iodixanol)水溶液(OptiPrepTM、AXIS-SHIELD公司制)，调制ET-Kyoto+碘克沙醇液(以下也称为I-Kyoto液)。
此外，在M-Kyoto液中混合60重量％的碘克沙醇水溶液(OptiPrepTM、AXIS-SHIELD公司制)，调制ET-Kyoto+乌司他丁+碘克沙醇液(以下也称为MI-Kyoto液)。此外，在ET-Kyoto液中混合4-[2-氨基乙基]苯磺酰基]氟化物·HCL(PefablocTM、Roche制)和60重量％的碘克沙醇水溶液(OptiPrepTM、AXIS-SHIELD公司制)，调制ET-Kyoto+Pefabloc+碘克沙醇液(Kyoto+AEBSF+Idx液)。
ET-KYOTO溶液的比重为约1.04，碘克沙醇溶液的比重为约1.32，将它们混合时，通过改变两种液体的比率来进行调制，使得轻比重为约1.07-1.08，重比重为1.09-1.12。
2.猪胰岛的分离步骤
猪胰岛的分离按照以下的步骤进行。
在京都市内的屠宰场获得猪的胰脏。获得胰脏后，(1)立即保存在通过二层法形成二层的容器中，或者，(2)在刚获得的胰脏中插入1根导管，通过导管将胰管将胰管保护液注入到该胰脏的主胰管中之后，迅速地保存在通过二层法形成PFC和保存液这二层的容器中。在(2)中，胰管保护液的注入量相对于1克胰重量为1ml。
在此，把从心脏停止到胰脏被浸在保存液中的时间定义为热缺血时间。从胰脏被浸在保存液中开始到胰脏分离开始的时间定义为冷缺血时间。
将上述用二层法保存而得的胰脏运送到京都大学的胰岛分离设施后，进行灭菌。
接着，将冷胶原酶溶液(Liberase HITM、Roche MolecularBiochemicals公司制)注入到该胰脏的主胰管中，回流溶液，使胰脏膨胀。
将该膨胀后的胰脏切分成九份之后，装入Ricordi腔(Ricordichamber)中。在该腔内，用溶液填满回路，制成封闭系统。边用泵使溶液循环，边使溶液的温度上升到37℃，将胶原酶活化，通过Ricordi腔使胶原酶溶液反复循环，进行胰组织的分解。原样保持构成胰岛的细胞凝聚的形态，只有胰外分泌腺组织从胰岛的周围解离的时刻，停止分解操作。
分解的停止如下进行：把回路制成开放系统，将含有人清蛋白的室温的溶液通过回路内，从而降低溶液的温度，将胶原酶灭活。
将室温的溶液通过回路内，停止分解之后，回收胰组织。
把从在Ricordi腔内设置胰脏到开始回收所分解得到的胰脏为止的时间当作第1相。
此外，把从回收开始到结束的时间当作第2相。
回收的胰组织用离心分离器进行离心洗净，收集浓缩。
在血球洗净装置(COBE2991 Cell Processor、Gambro公司)内，使用含有密度梯度剂的纯化溶液，形成连续比重浓度梯度。
接着，将上述洗净浓缩而得的胰组织添加到形成该密度梯度的溶液中。
使用连续比重离心沉淀法进行离心分离，使胰岛和胰外分泌腺组织分离，从胰组织中分离胰岛，进行纯化。其后，采取血球洗净装置内的溶液各部份，通过显微镜检查来判定在哪个部份中存在胰岛，回收胰岛。
3.评价方法
胰岛的收获量和纯度通过双硫腙(dithizone)染色来进行评价。胰岛收获量如下计算：双硫腙(dithizone)染色之后，从悬浊为200ml的溶液中取出100μl的样品，在显微镜下按大小计数。纯度(purity)用胰岛在含有胰岛、胰岛以外的外分泌组织、胰管等所有的整体中的比例来表示。
胰岛的大小(Islet size)为按大小计数的胰岛得平均值。
纯化效率为纯化后的胰岛数除以纯化前的胰岛数而得的值。
形态分(整体的形态学评价)如下：对于形状(平坦vs.球状)、边缘(粗糙vs.具有良好的圆形)、整体性(断片化vs.凝固/密集)、染色度(不均匀vs.均匀)和直径(全部＜100μlvs.＞10％＞200μl)，采用两名调查员进行评分，高质量地评价。将各个参数设定为从0到2，零为最低分，2为最高分。因此，胰岛分离的总计的最低分为0分，最高分为10分。作为优选的胰岛具有球状的、有良好圆形的、凝固或密集的、均匀被染色的、直径大的特征，来进行评分。
胰岛的生存力如下计算：使用吖啶橙(acridine orange)(10μmol/L)和碘化丙啶(propidium iodide)(15μmol/L)(AO/PI)染色，将生存的细胞和死的细胞同时可视化，进行评价。调查50个胰岛，视觉决定各自的生存力，接着计算它们的平均值。
刺激指数(Stimulation Index)由低葡萄糖浓度和高葡萄糖浓度中的胰岛素分泌的比率导出。
胰岛的功能根据Shapiro和Colleagues所写的方法，通过监测纯化胰岛对于糖负荷的胰岛素分泌反应来进行评价。简单地说，在37℃和5％CO2的环境下，将100个胰岛等同物(Islet Equivalents，IE)在CMRL溶液中进行培养，进而，用装有2.8mM醚或20mM醚和20mM葡萄糖的RPMI1640溶液(GIBCO BRL公司)在37℃和5％CO2的环境下进行培养2小时之后，采取上清，利用采用ELISA试剂盒(森永生化学工业株式会社)的抗原抗体反应来进行胰岛素值的测量。
由实施例和实验例得到的值用平均值和标准偏差(means±SE)表示。3组间用mean of ANOVA和Fisher’s PLSD post-hoc test来进行比较。P值为小于0.05的有意义值。
实施例1：关于胰管保护的研究
为了进行关于有无胰管保护的比较研究，在上述步骤中，取得胰脏之后，(1)立即用二层法保存(无胰管保护)，或者，(2)在刚取得后立即将保护液注入到胰脏的主胰管中之后，通过二层法进行保存(有胰管保护)，除此之外，用同样的步骤进行比较实验。
在该实验中，胰管保护液使用M-Kyoto液。二层法使用M-Kyoto液和PFC液。纯化溶液使用Ficoll溶液。
该实验中纯化前后的胰岛收获量示于图1(1A：纯化前、1B纯化后)和下述表中。IE/g为每1克胰脏的胰岛的平均个数。
表2
| 胰岛收获量(IE/g) | ||
| 纯化前 | 纯化后 | |
| 无胰管保护(-) | 6,889±749 | 3,662+320 |
| 有胰管保护(+) | 10,626±2153 | 4,807±1227 |
如表2所示，可知，即使在纯化前后，进行了胰管保护的情况(有胰管保护)与没有进行胰管保护的情况相比，胰岛收获量都有意义地高。
其他胰岛的特点示于下述表3中。
表3
| 无胰管保护(-) | 有胰管保护(+) | |
| 生存力 | 95.3±1.5 | 96.2±1.2 |
| 形态分 | 7.4±0.7 | 7.8±0.6 |
| 纯度(％) | 86.3±3.8 | 91.3±4.3 |
| 刺激指数 | 1.7±0.3 | 2.6±1.4 |
如表3所示，在其他胰岛的特点中，两组之间未见有意义的差异。
实施例2.关于二层法保存的比较研究
为了将二层法中使用的溶液的差异进行比较研究，将二层法中使用的溶液设为下述表4中所示的溶液之外，用同样的步骤，进行比较研究。此外，M-UW液是在1升UW液中添加100000单位(U)的乌司他丁而得到的。
实验按以下的步骤进行。
胰岛从重量为300到380g的近亲交配雄Lewis大鼠(ChaelesRlver Laboratories，Wilmington，MA)中分离。大鼠试验在京都大学大学院医学研究科审查委员会中获得承认。将共通的胆管用24规格导管(Baxter、Deerfield，IL)插入，固定，接着，系紧末端。整体取出胰脏、脾脏和十二指肠，保存在各溶液中。胰脏在4℃下保存6小时。胰岛使用Sawada(Transplantation.2003；75(12)：1965-1969)的改变法进行分离。保存后，将各胰使用将2mg/ml的胶原酶溶液(24mg of Servacollagenase；Serva，Heidelberg，Germany)装入到12mL的Hanks’平衡盐类溶液(HBSS)中而得的溶液来进行膨胀。去除脾脏和十二指肠，将胰脏用50mL的圆锥管在37℃下不振动地孵育22分钟。将分解得到的胰脏用UW溶液通过离心分离(150g、3分钟、8℃)洗净3次。接着，使用在M-Kyoto液中加有Iodixanol(OptiprepTM、Nycomed PharmaAS，Olso，Norway)的溶液，形成非连续密度梯度(1.030，1.095，1.105，1.125g/cm3)，进行纯化。所得胰岛收获量通过双硫腙(dithizone)染色来进行评价。
纯化后的胰岛收获量的结果示于图2和下述表4中。IE/pancreas表示从每一个胰脏中取出的胰岛的总收获量。
表4
| 二层法使用的溶液 | 纯化后的胰岛收获量(IE/pancreas) |
| UW/PFC | 522±133 |
| M-UW/PFC | 730±114 |
| ET-Kyoto/PFC | 700±116 |
| M-Kyoto/PFC | 1207±76 |
如表4和图2所示，可知，在二层法保存中使用M-Kyoto液时，纯化后的胰岛收获量显著增高。
实施例3：关于分离方案的研究
3-1.方案的概要
在上述猪胰岛分离步骤中，使用以下的3个分离方案来进行比较研究。
C1方案
·不进行向胰管内的保护液的注入。
·二层法使用UW液和全氟化碳液体(PFC)。
·纯化溶液使用菲可液。
C2方案
·向胰管注入保护液，进行胰管的保护。保护液使用M-Kyoto液。
·二层法使用M-Kyoto液和全氟化碳液体(PFC)。
·纯化溶液使用菲可液。
Kyoto方案
·在胰管中注入保护液，进行胰管的保护。保护液使用M-Kyoto液。
·二层法使用M-Kyoto液和全氟化碳液体(PFC)。
·纯化溶液使用I-Kyoto液。
各方案的特点示于下述表5中。
表5
| 方案 | 胰管保护 | 二层法中使用的溶液 | 纯化溶液 |
| C1方案 | 不注入保护液 | UW/PFC | 菲可(Ficcll) |
| C2方案 | 注入M-Kyoto液 | M-Kyoto液/PFC | 菲可(Ficcll) |
| Kyoto方案 | 注入M-Kyoto液 | M-Kyoto液/PFC | I-Kyoto液 |
3-2.方案的比较
3-2(1).分离过程的特点
各方案中的分离过程的特点示于表6中。
表6
| C1方案 | C2方案 | Kyoto方案 | |
| 胰脏的大小(g) | 104±13 | 105±8 | 104±8 |
| 操作时间(分钟) | 9±1 | 13±1 | 13±1 |
| 热缺血时间(分钟) | 19±1* | 24±2 | 25±1 |
| 冷缺血时间(分钟) | 148±9** | 120±0 | 120±0 |
| 第I相(分钟) | 13±1*** | 8±1 | 8±1 |
| 第II相(分钟) | 27±1 | 38±4 | 34±3 |
表中，*表示对于热缺血时间来说，C1方案比C2方案(P＜0.01)、
Kyoto方案(P＜0.01)有意义地短。
**表示对于冷缺血时间来说，C1方案比C2方案(P＜0.01)、Kyoto方案(P＜0.01)有意义地长。
***表示对于第I相来说，C1方案比C2方案(P＜0.02)、Kyoto方案(P＜0.01)有意义地长。
胰脏的大小和操作时间在3个方案间没有明显的差异。
C1方案由于没有胰管内注入工序，所以与其他方案相比，热缺血时间有意义地短。然而，由于必须插入导管，所以C1方案与其他方案相比，冷缺血时间有意义地长。
对于第1相来说，C1方案特别长。然而，第2相在3个方案间大致相同。
3-2(2)胰岛收获量
将各分离方案中纯化前后的胰岛收获量示于下述表7以及图3A和B中。IE/g为每1克胰脏的收获量胰岛的平均个数。
表7
| 胰岛收获量(IE/g) | ||
| 纯化前 | 纯化后 | |
| C1方案 | 4,809±454 IE/g | 2,486±394 IE/g |
| C2方案 | 8,846±904 IE/g | 3,527±795 IE/g |
| Kyoto方案 | 10,247±637 IE/g | 7,253±915 IE/g液 |
如表7和图3所示，对于纯化前的胰岛收获量来说，C2方案和Kyoto方案较C1方案为有意义的高值(图3A)。
对于纯化后的胰岛收获量来说，Kyoto方案较C1方案和C2方案有意义地高(图3B)。
3-2(3)胰岛的特点
分离后的胰岛的特点示于下述表8中。
表8
| C1方案 | C2方案 | Kyoto方案 | |
| 生存力(％) | 93±4 | 96±1 | 96±1 |
| 形态分 | 6.9±0.6 | 7.8±0.6 | 8.8±0.6* |
| 纯度(％) | 93±1 | 86±5 | 78±9 |
| 纯化效率(％) | 51±5 | 38±6 | 64±6** |
| 纯化前的胰岛的大小 (μm) | 146±16 | 152±16 | 176±12 |
| 纯化后的胰岛的大小 (μm) | 113±33 | 83±11 | 211±55*** |
| 刺激指数 | 1.4±0.9 | 1.4±0.4 | 1.6±0.3 |
表中，*表示对于形态分来说，Kyoto方案比C1方案(P＜0.03)有意义地高。
**表示对于纯化效率来说，Kyoto方案较C1方案(P＜0.05)和C2方案(P＜0.01)有意义地高。
***表示对于纯化后的胰岛的大小来说，Kyoto方案较C2方案(P＜0.04)有意义地大。
如表8所示，刺激指数、生存力、纯度和纯化前的胰岛的大小在3个方案间没有有意义的差。
然而，可知在形态分和纯化效率以及纯化后的胰岛的大小中，Kyoto方案的结果特别优异。
3-2(4).纯化速度
调查各分离方案中的纯化速度，结果为，在Kyoto方案中，能够将纯化溶液以60ml/min的速度运送到COBE2991 Cell Processor中。
另一方面，在使用菲可溶液作为纯化溶液的C1和C2方案中，纯化溶液的运送速度为10～20ml/min。
由该结果可知，使用碘克沙醇作为密度梯度剂时，胰岛的纯化速度能够加快3～6倍。认为使用了碘克沙醇的纯化溶液的粘度低是主要的原因。
实施例4.关于蛋白酶抑制剂的研究
为了研究蛋白酶抑制剂的种类，进一步进行了以下的试验。
除了将注入到主胰管中的保护液和采用二层法的保存液设为表9中所记载之外，通过与上述Kyoto方案相同的步骤来评价胰岛的收获量。
表9
| 保护液和保存液 | 胰岛收获量(IE/g) |
| ET-Kyoto液 | 2103 |
| ET-Kyoto+AEBSF液 | 3448 |
| M-Kyoto液(ET-Kyoto+乌司他丁液) | 7253 |
| ET-Kyoto+甲磺酸加贝酯液 | 7140 |
其结果可知，在注入到胰管中的保护液中添加有蛋白酶抑制剂时，胰岛的收获量得到提高。
特别是，蛋白酶抑制剂为乌司他丁和甲磺酸加贝酯时，胰岛的收获量得到显著提高。
此外，使用ET-Kyoto+甲磺酸加贝酯液体作为注入到主胰管中的保护液和利用二层法的保存液时，对于分离胰岛而言，纯度为89％，对于生存力而言，得到90％的值。
实施例5.关于纯化的研究
改变纯化溶液，进一步进行以下的研究。
在上述猪胰岛分离步骤中，除了将纯化溶液设为如表10所记载之外，与上述Kyoto方案同样地操作，用上述方法评价纯化效率。
表10
| 纯化溶液 | 纯化效率(％) |
| I-Kyoto液 | 64 |
| O-Kyoto+AEBSF液 | 70 |
| MI-Kyoto液(I-Kyoto+乌司他丁液) | 80 |
如表10所示，使用含有蛋白酶抑制剂的溶液作为纯化溶液时，纯化效率得到提高。
特别是，使用MI-Kyoto液时，换言之，使用乌司他丁作为蛋白酶抑制剂时，纯化效率得到显著提高。
此外，与使用I-Kyoto液的情况相同，使用MI-Kyoto液时，也能够以60ml/min的速度将纯化溶液运送到COBE2991 Cell Processor中。
实施例6：人胰岛分离
6-1.人胰岛分离步骤
除了下述方面以外，用与猪胰岛分离相同的步骤来进行人的胰岛分离。
从日本脏器移植网络的中日本支部和西日本支部，经过知情同意，从心脏停止后的供体获得13人份的人的胰脏。
为了急速冷却胰脏，从供体的腹股沟的血管插入导管，从心脏停止到摘出胰脏为止，从该导管注入冷乳酸林格氏液，进行回流。
接着，摘出胰脏，立即插入1根导管，将M-Kyoto液以每1克胰重量为1ml的量注入到主胰管中之后，迅速将胰脏浸渍在二层法保存容器中的保存液中，将胰脏运送到GMP水平的京都大学人胰岛分离设施(Center for Cell and Molecular Therapy)。二层法使用M-Kyoto液和全氟化碳液体(PFC)。
评价方法与上述猪胰岛分离中的方法相同。而且统计学的评价也与猪胰岛分离相同。
6-2.分离方案
在人胰岛分离中，在13例的2个例子中使用C2方案，在13例的11个例子中使用Kyoto方案。
6-3.人供体和胰脏的特点
供体的平均年龄为44±4岁。ICU滞留期间为11±3天。BMI为21±1kg/m2。胰脏的大小为87±6g。在全部供体中，看到血液生物化学值(average blood chemistry value)异常。
此外，热缺血时间为7±3分钟。冷缺血时间为256±18分钟。通过采用冷乳酸林格氏溶液的即时环流，热缺血时间在全部胰脏中为最小。而且冷缺血时间在全部胰脏中短6小时。
在2个方案间，供体条件以及热缺血时间和冷缺血时间没有有意义的差。
6-4.分离方案的评价
2个方案(C2方案、Kyoto方案)中的人胰岛分离的评价结果示于表11中。胰岛数(IE)表示胰岛的总收获量。
表11
| C2方案(N＝2) | Kyoto方案(N＝11) | |
| 纯化前胰岛数(1E) | 733,620±249,440 | 526,657±67,695 |
| 纯化后胰岛数(1E) | 339,480±14,905 | 410,376±42,412 |
| 纯化效率(％) | 51±15 | 81±5 |
| 纯度(％) | 50±10 | 51±6 |
| 生存力(％) | 94±6 | 97±1 |
| 形态分 | 9.0±1.0 | 9.8±0.1 |
| 组织量(ml) | 8.0±1.0 | 6.4±0.8 |
| 革兰氏染色阴性 | 2/2 | 11/11 |
| 内毒素(EU) | 14.4±11.0 | 8.7±3.6 |
| 适合移植基准 | 2/2 | 11/11 |
| 移植数 | 1/2 | 10/11 |
纯化前后的胰岛收获量在2个方案间没有有意义的差异。纯度、生存力、形态分在2个方案间也是同样的结果。
Kyoto方案的纯化效率是C2方案的1.6倍高。而且，Kyoto方案的内毒素水平低于C2方案。
对于纯化速度来说，在Kyoto方案中，能够将纯化溶液以60ml/min的速度运送到COBE2991 Cell Processor中。另一方面，C2方案中的速度是10～20ml/min。
由该结果可以确认，使用I-Kyoto液作为纯化溶液时，即使在人胰岛分离中胰岛的纯化速度也增快3～6倍。
进而，关于纯化溶液，进行以下的试验。
在上述人的胰岛分离中，除了将纯化溶液设为表12所记载之外，与Kyoto方案相同地操作，对纯化效率和胰岛的收获量进行评价。
表12
| 纯化溶液 | 纯化效率(％) | 胰岛的总收获量(IE) |
| I-Kyoto液 | 78 | 479409 |
| MI-Kyoto液 | 液84.2 | 544535 |
如表12所示，可知，使用含有蛋白酶抑制剂的溶液作为纯化溶液时，即使在人的胰岛分离中纯化效率也得到提高。还可知，胰岛的收获量也得到提高。
6-5.适于移植的基准
适于移植的基准依照Edmonton Protocol，设定如下。
·胰岛量≥5000IE/kg(患者体重)
·纯度≥30％
·组织量≤10ml
·生存力≥70％
·内毒素≤5 IE/kg(患者体重)
·革兰氏染色阴性
对于上述基准，除了胰岛量之外，13例全部满足适于移植的基准。
6-6.对于1型糖尿病患者的胰岛移植
将上述13例中的11例、即通过C2方案分离得到的胰岛1例以及用Kyoto方案分离得到的胰岛10例移植到6名1型糖尿病患者中。对于剩余的2例胰岛分离部分，冷冻保存。
在6人中，4名患者移植了来自多个供体的胰岛。2名患者移植了来自单一供体的胰岛。
胰岛移植后的评价用以下的方法进行。
在移植前后以天为单位评价血清血糖量、胰岛素必需量以及血红蛋白Alc(HbAlc)。以第1次移植30、60天后，第2次移植30天和60天的间隔进行胰高血糖素刺激试验。在胰高血糖素刺激试验中，即将注射1mg胰高血糖素之前和6分钟后进行C-肽测量用的采血。
6-7.胰岛移植后的评价
胰岛移植后，6名患者全部不发生因低血糖所致的意识消失，能够改善血中葡萄糖控制。此外，在全部的移植例中，可以确认基于C-肽测量的胰岛素分泌开始。
移植时的平均胰岛素量虽然为39.2±3.2单位，但减少到11.0±4.4单位(P＜0.0005)。2名患者缺乏胰岛素，其他2名患者的胰岛素量少于10单位，其他2名患者的胰岛素量也减少。
全部6名患者的HbAlc水平缓慢降低，在全部6名患者中，无论是单独供体或者是多个供体，HbAlc的水平从胰岛移植开始在3个月左右都达到正常(图4A)。
6名患者的平均HbAlc水平得到显著改善，从移植时的7.5±0.4％改善到5.1±0.2％(P＜0.0003)。
全部患者在移植前都具有不能检知程度的C-肽值(＜0.1ng/ml)，但移植后C-肽值变得明确。第1次移植后的C-肽值的基础值为0.29±0.06ng/mg，刺激后的值为0.52±0.11ng/ml(N＝6)(图4B)。C-肽值在第2次胰岛移植后，基础值和刺激后的值双方都较第1次得到显著改善。第2次移植后的C-肽值的基础值为0.75±0.12ng/ml(P＜0.01)，刺激后的值为1.45±0.26ng/ml(P＜0.005)(N＝3)(图4B)。
6-8.胰岛移植的临床经过
胰岛移植的临床实施依照上述Kyoto方案进行。而且，对于同一患者的第2次移植在约2个月后同样地进行。
第1次移植的胰岛收获量为354384 IE，第2次为474234 IE。
受体是36岁的女性，为22年的1型糖尿病，具有频繁的严重的低血糖发作情况和糖尿病性视网膜症的病史。
肾功能正常，肌酸酐为0.7ml/dl。除了使用20mg的basiliximab来代替daclizumab之外，依照Edmonton Protocol，在手术后第0天和第4天给予免疫抑制剂。
测定好的约2年前的约2个月间的早餐前和晚餐前的血糖值，以对照移植前的血糖值。
胰岛移植前的血糖值非常不稳定，为20mg/dl到400mg/dl的广度。
然而，第1次移植后，血糖值被维持在狭窄的范围内，落在50mg/dl到150mg/dl的狭窄范围(图5A)。
移植前的胰岛素必需量为30到40单位/天，但第1次移植后1个月内，胰岛素的服用量可以慢慢减少到10单位/天。进而，第2次移植后第20天可以完全停止，患者从而脱离了胰岛素服用(图5B)。
转氨酶值在第1次移植后暂时升高，但不会达到100mg/dl以上，在3周内恢复到正常值。肌酸酐值停在1.0mg/dl以下，BUN(blood ureanitrogen)在观察期间一直维持正常值。
由上述结果可知，根据本发明，可以确认胰岛的纯化效率得到提高，满足适于移植基准的胰岛的收获量得到提高。进而，可以确认，纯化速度得到提高，在短时间内能够有效地实施胰岛分离。
进而，可以确认，根据本发明能够得到从心脏停止供体获得质量都良好的胰岛。进而，可以确认，在来自人心脏停止供体的胰岛移植中可以得到良好的成绩。
Claims (15)
1、胰岛的分离方法，其包括如下工序：
将含有蛋白酶抑制剂的保护液注入到离体的胰脏的胰管内的工序(1)；
将酶溶液注入到该注有保护液的胰脏中，将胰脏分解的工序(3)；
以及将该分解得到的胰组织用含有密度梯度剂的纯化溶液来纯化的工序(4)。
2、如权利要求1所述的分离方法，其中，在工序(1)中，以每1克脏器重量为约0.1～10ml的量将所述保护液注入到胰管内。
3、如权利要求1所述的分离方法，其中，含有蛋白酶抑制剂的保护液的钾浓度为约4～50mmol/L。
4、如权利要求1所述的分离方法，其中，进一步具有通过二层法保存注有保护液的胰脏的工序(2)。
5、如权利要求4所述的分离方法，其中，工序(2)的二层法使用含有(i)全氟化碳(perfluorocarbon)溶液和(ii)蛋白酶抑制剂的、钾浓度为约4～50mmol/L的保存液。
6、如权利要求5所述的分离方法，其中，(ii)的保存液进一步含有海藻糖。
7、如权利要求1所述的分离方法，其中，工序(4)中的纯化溶液进一步含有海藻糖。
8、如权利要求1所述的分离方法，其中，工序(4)中的密度梯度剂是碘克沙醇。
9、如权利要求1所述的分离方法，其中，工序(4)中的纯化溶液进一步含有蛋白酶抑制剂。
10、胰管内注入用保护液，其中，含有蛋白酶抑制剂。
11、如权利要求10所述的保护液，其中，钾浓度为约4～50mmol/L。
12、二层法用胰脏保存液，其中，含有蛋白酶抑制剂，钾浓度为约4～50mmol/L。
13、胰岛的纯化溶液，其中，含有密度梯度剂和海藻糖。
14、如权利要求13所述的纯化溶液，其中，密度梯度剂是碘克沙醇。
15、如权利要求13所述的纯化溶液，其中，进一步含有蛋白酶抑制剂。
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