CN102985532B - 胰岛的分离方法及用于保护胰岛组织的保护液 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种胰岛的分离方法及能够用于该方法的保护液，所述胰岛的分离方法包括下述工序：在摘出的胰脏的胰管内注入保存液的注入工序；将上述胰脏浸渍在浸渍液中进行保存的保存工序；破坏上述胰脏得到胰组织的消化工序；和将上述胰组织浸渍在纯化溶液中得到胰岛的纯化工序，其特征在于，上述消化工序包括：将含有消化酶的酶溶液注入上述胰脏的内部的酶注入步骤；使上述消化酶活化的消化开始步骤；使上述消化酶失活的消化停止步骤；和将已被破坏的胰组织回收的回收步骤，通过在上述消化开始步骤之前向体系中添加嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂，从而在开始上述消化开始步骤的时刻，使嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂存在于上述胰脏的内部，通过使用上述胰岛的分离方法及能够用于该方法的保护液，能够以高产量得到适合移植的形状及大小的胰岛。

Description

胰岛的分离方法及用于保护胰岛组织的保护液
技术领域
本发明涉及从胰脏分离能够移植的胰岛的方法及在该分离方法中用于保护胰岛组织的保护液。
背景技术
1型糖尿病的根治方法例如有从脑死亡者移植胰脏本身的胰脏移植。所述胰脏移植仅通过1次移植就能脱离胰岛素等，效果好。但是，外科手术复杂、而且伴随血液循环再建，也可能引起并发症，因此存在对患者身体造成很大负担的问题。因此，近年来，胰岛移植作为新的糖尿病根治方法受到关注。所谓胰岛移植，是将作为调节血糖的激素的胰岛素或胰高血糖素的分泌组织即胰岛从胰脏分离，将分离的胰岛从门静脉向肝脏移植的方法。被移植的胰岛成活在肝脏内的门静脉末端，由此分泌胰岛素。
现有的胰脏移植为伴有高侵袭性的外科处置，与此相对，该胰岛移植是在门静脉留置导管，按照静脉滴注的要领移植胰岛进行处置即可，因此与胰脏移植相比，患者身体的负担较轻并且安全。另外，胰岛移植与其他脏器移植不同，其为细胞移植的一种，因此能够将胰岛半永久地冷冻保存。进而，胰岛移植时还存在下述优点：即使发生排斥反应，由于移植的胰岛本身被吸收，所以也无需更换摘除细胞。
另一方面，胰岛移植存在下述缺点，即，由于从胰脏仅分离胰岛细胞在技术上的困难性，所以不能获得适合移植的充分产量的胰岛。结果，需要多次的移植才能实现胰岛素脱离，需要接受来自平均2.6人的供体的胰脏提供。因此，如何能够从胰脏更多地获得质量优异的胰岛成为课题。
为了解决该课题，一直以来研究了各种胰岛分离方法。例如，专利文献1中公开了特征在于将含有蛋白酶抑制剂的保护液预先注入胰管内的胰岛的分离方法。该胰岛的分离方法中的蛋白酶抑制剂用于提高胰岛的产量。
在现有的胰岛分离方法中，不能得到质量及产量充分的胰岛的原因如非专利文献1所公开的那样，是因为存在于胰脏内的来自胰外分泌腺的内源酶由于胰脏的摘出而被活化，损伤胰脏组织，之前的胰岛分离方法通过采取抑制内源酶活性的手段，以求改善胰岛的质量及产量。来自胰外分泌腺的酶有胰蛋白酶、来自胰的弹性蛋白酶、糜蛋白酶等，上述专利文献1中使用特异性抑制胰蛋白酶的乌司他丁。
专利文献1中指出，作为通过蛋白酶抑制剂适当地保护胰岛的组织的结果，胰岛的产量增大。但是，现有的方法在分离的过程中胰岛细胞被撕裂等、通常受到物理损伤，不能以必要的产量稳定地获得在移植后分泌充分的胰岛素的大小和形状的胰岛。另外，专利文献1中，用作蛋白酶抑制剂的乌司他丁是以人尿作为原料的生物来源制剂，也存在对于生物体的风险高、缺乏安全性的问题。
专利文献1：国际公开第2006/068226号
非专利文献1：TransplantationProceedings，2003，Vol.35，no.7，2455-7
发明内容
因此，本发明的目的在于提供一种胰岛的分离方法及用于保护胰岛组织的保护液，所述胰岛的分离方法能够以高产量获得适合移植的形状及大小的胰岛。
本发明人等在进行本发明时，新发现了若供体的嗜中性粒细胞事先浸润在摘出后的胰脏内，经过消化的工序，则其数量增加，并且从该嗜中性粒细胞释放的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶对胰岛造成损伤。因此，发明人等着眼于通过抑制所述嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的作用能有效地遏制胰岛的损伤，从而完成了本发明。
的作用能有效地遏制胰岛的损伤，从而完成了本发明。
本发明涉及以下内容。
[1]一种胰岛的分离方法，包括下述工序：
将摘出的胰脏破坏得到胰组织的消化工序；和
将上述胰组织浸渍在纯化溶液中得到胰岛的纯化工序，
其特征在于，上述消化工序包括下述步骤：
将含有消化酶的酶溶液注入上述胰脏的内部的酶注入步骤；
使上述消化酶活化的消化开始步骤；
使上述消化酶失活的消化停止步骤；和
将已被破坏的胰组织回收的回收步骤，
通过在上述消化开始步骤之前添加嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂，从而在开始上述消化开始步骤的时刻，使嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂存在于上述胰脏的内部，所述嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂不包括胰蛋白酶抑制剂的情况。
[2]如[1]所述的胰岛的分离方法，其特征在于，在上述消化工序之前，还包括向摘出的胰脏的胰管内注入保存液的注入工序及/或将上述胰脏浸渍在浸渍液中进行保存的保存工序。
[3]如[2]所述的胰岛的分离方法，其特征在于，上述保存液及上述浸渍液不含嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂。
[4]如[1]～[3]中任一项所述的胰岛的分离方法，其特征在于，上述嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂的添加通过向上述酶溶液中添加嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂来进行。
[5]如[1]～[3]中任一项所述的胰岛的分离方法，其特征在于，上述嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂的添加通过向上述酶溶液及上述纯化溶液中添加嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂来进行。
[6]如[2]所述的胰岛的分离方法，其特征在于，上述嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂的添加通过向上述保存液、上述浸渍液、上述酶溶液及上述纯化溶液的各个溶液中均添加嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂来进行。
[7]如[4]～[6]中任一项所述的胰岛的分离方法，其特征在于，上述保存液、上述浸渍液、上述酶溶液及上述纯化溶液中的上述嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂的浓度为2～200μM。
[8]一种保护液，用于保护上述胰组织免受由浸润在胰组织中的嗜中性粒细胞所释放出的弹性蛋白酶的作用，其特征在于，含有嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂，所述嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂不包括胰蛋白酶抑制剂的情况。
[9]如[8]所述的保护液，其特征在于，上述保护液中的上述嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂的浓度为2～200μM。
附图说明
此处，所谓保护液是指本发明的胰岛分离方法中使用的保存液、浸渍液、酶溶液或纯化溶液等中添加了嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂而得到的液体。
根据本发明，在胰岛的分离方法中，能够以高产量得到适合移植的形状及大小的胰岛。
[图1](a)～(d)为表示嗜中性粒细胞向胰脏的浸润程度的图。
[图2]为表示胰岛分离的各工序中的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶活性的图。
[图3]为表示嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂的最佳浓度的图。
[图4]为表示实施例及比较例中所示的胰岛分离方法的各工序中的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的活性的图。
[图5]为表示所得的胰岛的IEQ(IsletEquivalent)的图。
[图6]为表示所得的胰岛的分离指数(IsolationIndex)的图。
[图7]为表示所得的胰岛的纯度的图。
[图8]为表示所得的胰岛的长径分布的图。
具体实施方式
[图9](a)～(d)为所得胰岛的电子显微镜照片。
[图10]为表示所得胰岛的刺激指数(StimulationIndex)的图。
以下，说明本发明的胰岛分离方法。
本发明的胰岛分离方法包括：(1)向胰管内注入保存液的“注
入工序”；(2)使胰脏浸渍在浸渍液中进行保存的“保存工序”；(3)破坏胰脏的“消化工序”；(4)从破坏而得到的胰组织纯化胰岛的“纯化工序”。并且，消化工序包括以下操作步骤：将酶溶液注入胰脏的胰管内使其膨胀的“酶注入步骤”；开始消化使胰脏破坏的“消化开始步骤”；停止胰组织的进一步消化的步骤“消化停止步骤”；和将已被破坏的胰组织回收，任意地清洗及浓缩的“回收步骤”。上述步骤中，本发明的特征在于，至少在消化开始步骤的操作开始的时刻，使嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂存在于胰脏内部。
接下来，说明本发明的胰岛分离方法中的各工序。
(1)注入工序
作为胰岛分离方法的最初工序，将保存液注入胰管内。保存液的注入例如可以通过在胰管中插入导管来进行。此时，可以利用泵调节注入压。插入的导管的数量优选为1根。通过为1根，能够减少注入胰管内的溶液的漏液，也能将脏器的损伤控制在最小限。
保存液的渗透压为270～450mOsm/l，优选为300～400mOsm/l。渗透压在上述范围内时，在将保存液注入胰管内后，能够防止保存中胰组织膨胀或收缩。另外，为了防止细胞或组织的酸性分解等，保存液的pH优选为7～8左右。
注入胰管的保存液中含有脏器保存液。作为脏器保存液，可以从用于组织的保护或保存的公知的溶液中适当选择。例如，可以使用UW液、ET-Kyoto液、M-Kyoto液(M-Kyoto液是指在ET-Kyoto液中加入Miraclid(持田制药株式会社制，注册商标，通用名称：乌司他丁)而得到的液体)、HTK液、Euro-Collins液、Celsior液等，但并不限定于这些。特别优选使用ET-Kyoto液。
另外，本工序中的向胰管的注入可以使用在上述保存液中添加了嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂的溶液(称作保护液)。作为嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂，例如可以使用Elaspol(小野药品工业株式会社制，注册商标，通用名称：西维来司他)，但只要为具有抑制嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的作用的药剂即可，没有特别限定。
添加在保存液中的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂的量在发挥本发明效果的范围内，根据抑制剂的种类适当确定。例如，使用Elaspol时，每1L保存液的Elaspol含量为2～200μmol，优选为5～100μmol，更优选为20μmol。
另外，保存液中优选含有海藻糖。通过含有海藻糖，胰组织的保护作用进一步提高，因此能够得到更适合移植的胰岛。作为海藻糖，可以使用α，α-海藻糖、α，β-海藻糖及β，β-海藻糖、或它们的混合物。优选使用α，α-海藻糖。保存液中含有的海藻糖的浓度在1000ml保存液中为0～400mmol，优选为50～240mmol，特别优选为80～160mmol。
另外，保存液中含有的钾的浓度优选较低。具体而言，每1000ml保存液的钾浓度为4～50mM，优选为10～50mM。钾浓度低时，不会使胰脏的血管痉挛，能够使保存液快速地到达组织的各个角落。保存液遍布组织的各个角落，从而能够提高胰组织的保护作用。因此，保存液中含有的钾浓度较低能够得到更适合移植的胰岛。
只要不损害本发明的效果，则保存液中还可以进一步含有其他成分。作为其他成分，可以举出电解质、糖质、氨基酸、维生素、药剂等，但并不限定于这些。
(2)保存工序
作为胰岛分离方法中的第二个工序，将胰管内注入了保存液的胰脏浸渍在浸渍液中进行保存。保存方法可以利用使用脏器保存液单体的单纯浸渍法、或双层法。利用双层法进行保存的方法是在容器内放入全氟化碳液(PFC)及脏器保存液形成双层后，放入脏器，向容器内供给氧的同时保存脏器的方法。因此，本发明中的浸渍液在例如使用单纯浸渍法的情况下是指脏器保存液，在使用双层法的情况下是指PFC及脏器保存液，但并不限定于这些。如果是能够保存胰脏的溶液，就可以用作本发明的浸渍液。使用双层法时，全氟化碳液(PFC)和脏器保存液的比例以体积比计优选为1∶1左右。氧的供给优选进行至少30分钟以上。通过利用双层法保存胰脏，能够维持胰组织的生存能力在较高水平。
在从供体摘出胰脏的操作与从摘出的胰脏分离胰岛的操作之间存在时间间隔的情况下，需要该保存工序，但在没有时间间隔可立即转移到胰岛的分离操作的情况下也可以省略该工序。
作为使用的脏器保存液，例如可以举出UW液、ET-Kyoto液、M-Kyoto液、HTK液、Euro-Collins液、Celsior液等，但并不限定于这些。
另外，本工序中的保存中优选使用在上述浸渍液中添加了嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂的溶液(称作保护液)。不仅在注入工序中注入胰管内，在保存工序中也使用嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂，从而能够使嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂遍布胰组织。作为其结果，能够在广泛的范围内抑制嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的作用，能更有效地遏制胰岛的损伤。
作为此处使用的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂，例如可以举出Elaspol，但只要为具有阻碍中性粒细胞弹性蛋白酶的作用的药剂即可，没有特别限定。在使用Elaspol时，用于浸渍保存的液体中所含的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂的量相对于每1L浸渍液为2～200μmol，优选为5～100μmol，更优选为20μmol。
另外，脏器保存液中优选含有海藻糖。通过含有海藻糖，进一步提高对胰组织的保护作用，因此能够得到更适合移植的胰岛。作为海藻糖，可以使用α，α-海藻糖、α，β-海藻糖及β，β-海藻糖、或它们的混合物。优选使用α，α-海藻糖。脏器保存液中含有的海藻糖的浓度在1000ml脏器保存液中为0～400mmol，优选为50～240mmol，特别优选为80～160mmol。
另外，脏器保存液中含有的钾的浓度优选较低。具体而言，每1000ml脏器保存液的钾浓度为4～50mM，优选为10～50mM。钾浓度低时，能够在不使胰脏血管痉挛的情况下，适当保存脏器。因此，脏器保存液中含有的钾浓度较低能够得到更适合移植的胰岛。
只要不损害本发明的效果，则脏器保存液中还可以含有其他成分。作为其他成分，可以举出电解质、糖质、氨基酸、药剂、维生素等，但并不限定于这些。
脏器保存液的渗透压为270～450mOsm/l，优选为300～400mOsm/l。渗透压在上述范围内时，能够在脏器的保存中防止胰组织膨胀或收缩。另外，为了防止细胞或组织的酸性分解等，脏器保存液的pH优选为7～8左右。
(3)消化工序
作为胰岛分离方法的第三个工序，将消化酶注入胰脏内，破坏(消化)胰脏。具体而言，将具有破坏胰脏作用的酶溶液注入胰管内使胰脏膨胀后(以下称作“酶注入步骤”)，通过活化上述酶而破坏胰脏(以下称作“消化开始步骤”)。之后，通过使酶失活来停止消化(以下称作“消化停止步骤”)、将被破坏的胰组织回收(以下称作“回收步骤”)。
作为酶溶液，例如可以使用胶原酶溶液，但并不限定于此。胶原酶是具有将连接胰脏的组织之间的胶原分解的作用的酶。
另外，本工序中的向胰管的注入优选使用在酶溶液中添加了嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂的溶液(称作保护液)。通过在消化工序中使嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂存在，从而能够使胰组织和嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂充分地接触。因此，能够在广泛的范围内阻碍嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的作用，能够更有效地抑制胰岛的损伤。例如使用Elaspol作为嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂时，每1L保护液的Elaspol的含量为2～200μM，优选为5～100μM，更优选为20μM。
另外，省略(1)注入工序及/或(2)保存工序时，优选在该酶溶液中含有在之前(1)注入工序中说明的保存液。
酶注入步骤中的酶溶液向胰管内的注入可以利用与上述的保存液的注入相同的方法进行。
消化开始步骤中的酶的活化例如可以通过使体系的温度上升来进行。具体而言，将注入胶原酶而膨胀的胰脏放入腔室，用溶液充满用于消化的回路，形成封闭系统。之后，用泵使溶液循环，使溶液的温度上升至胶原酶活化的温度。由于温度的上升，浸润在胰组织中的胶原酶被活化，将形成结合细胞和细胞的组织的胶原溶解，破坏胰组织。胶原酶在37℃左右最活化。因此，使胶原酶作用破坏胰脏时，需要使体系的温度上升至37℃左右。
消化停止步骤在保持构成胰岛的细胞凝集的形态、且胰外分泌腺组织从胰岛的周围离解的时刻进行。消化的停止可以通过降低体系的温度来进行。或者，也可以通过加入血清蛋白使酶失活来进行。由血清蛋白的添加引起的失活例如可以使回路为开放系统，将含有人白蛋白的室温的溶液通过回路内而进行。通过将室温的溶液通过，由此体系的温度下降及由于酶的稀释使酶失活。另外，通过加入血清蛋白，使酶失活。
停止消化后，作为回收步骤，回收分解的胰组织。回收的胰组织优选在纯化之前用离心分离器离心洗涤，浓缩。
(4)纯化工序
作为胰岛分离方法的第四个工序，将在前述工序中回收的胰组织纯化。所谓纯化是将胰组织分离为胰岛和胰外分泌腺组织的工序。本工序操作使用含有密度梯度剂的纯化溶液进行。胰岛与胰外分泌腺组织相比比重较轻。利用这一点，在利用密度梯度剂形成了密度梯度的纯化溶液中放入被分解的胰组织，使用比重离心沉淀法将胰岛和胰外分泌腺组织分离。
密度梯度剂可以从用于在溶液内形成密度梯度的已知的密度梯度剂中适当选择。例如可以使用OptiPrep(Axis-Shield公司制，通用名称：iodixanol溶液)、Nycodenz(Axis-Shield公司制，通用名称：iodixanol粉末)等。此处使用的密度梯度剂优选能够制成粘度低的纯化溶液的物质。这是因为纯化溶液的粘度越低，越能快速地进行纯化。优选的粘度范围在测定温度22℃下、用布氏法测定时为5cp以下，优选为3cp以下，更优选为2cp以下。另外，使用的密度梯度剂优选内毒素水平低的物质。
纯化溶液通过将密度梯度剂添加在脏器保存液中而得到。此处使用的脏器保存液的定义如浸渍保存上述胰脏的工序中所述。上述列举的脏器保存液中，可以使用含有海藻糖的保存液，优选使用ET-Kyoto液。使用不含海藻糖的脏器保存液时，可以在纯化溶液中添加海藻糖。此时，可以使用α，α-海藻糖、α，β-海藻糖及β，β-海藻糖、或它们的混合物。优选使用α，α-海藻糖。纯化溶液中含有的海藻糖的浓度在1000ml纯化溶液中为0～400mmol，优选为50～240mmol，特别优选为80～160mmol。
另外，本工序操作中，优选使用在纯化溶液中添加了嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂的溶液(称作保护液)。在破坏胰脏之后，嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的活性也持续，可能产生细胞伤害。因此，优选在纯化工序中也使嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂存在，保护胰岛不受细胞伤害作用的影响。通过在纯化溶液中也添加嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂，能够得到损伤进一步减少的胰岛。使用Elaspol时，纯化溶液中含有的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的量在每1L纯化溶液中为2～200μmol，优选为5～100μmol，更优选为20μmol。
另外，只要不损害本发明的效果，则纯化溶液中可以进一步含有其他成分。作为其他成分，可以举出腺苷、葡聚糖、肝素等，但并不限定于这些。
对于密度梯度剂相对于脏器保存液的添加比例，在纯化前测定胰组织的密度，考虑密度梯度剂和脏器保存液的比重进行设定。
密度梯度可以利用公知的方法形成。另外，也可以使用如连续比重制作装置那样的装置形成密度梯度。密度梯度可以为连续密度梯度或非连续密度梯度的任一种，但从能够回收更多的胰岛的方面考虑，优选连续密度梯度。
上述纯化工序也可以使用如COBE2991那样的血细胞洗涤装置进行一系列的操作。使用COBE2991时，首先利用密度梯度剂在装置内形成密度梯度，在其中放入洗涤浓缩了的分解胰组织，利用连续比重离心沉淀法分离成胰岛和外分泌腺组织。之后，分区地收集装置内的溶液。用显微镜检查各个分区，判定在哪个分区存在胰岛，回收胰岛。
以上为各工序的操作的详细说明，但其中(1)注入工序及(2)保存工序是为了防止摘出的脏器经时劣化而进行的工序。因此，摘出胰脏后，立即进行胰岛的分离时，可以适当省略上述(1)及/或(2)工序。
另一方面，需要将脏器向远方搬运的情况等、脏器摘出操作和胰岛的分离操作之间存在时间间隔的情况下，需要必须经过(2)保存工序而不能省略。较优选经过(1)及(2)两工序。
嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂可以在所有的工序中使用，为了至少在进入(3)消化工序中的消化开始步骤的操作的时刻使胰脏内存在嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂，可以在各工序中添加嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂。例如，嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂可以限定为仅添加在(3)消化工序中的酶注入步骤中所注入的酶溶液中。另外，可以仅添加在消化工序的前工序即(2)保存工序中的浸渍液中，还可以仅添加在其前工序即(1)注入工序中的保存液中。
根据上述本发明的胰岛分离方法，与现有的方法相比，能够得到较大的胰岛。所得的胰岛没有缺损，与胰脏中本来的大小约为相同的程度，在患者中的存活率高，胰岛素分泌能力也高。从这些理由可以说越大的胰岛越适合移植。
进而，利用本发明的方法得到的胰岛在形状的方面也优异。如后述的实施例所示，若根据本发明的方法，则能够得到球状、密度高、胰组织未被破坏的胰岛。可以说这样的胰岛的胰岛素分泌能力高，适合移植。另外，根据本发明的方法得到的胰岛的纯度高。
另外，根据本发明的方法，通过将嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂等药剂的使用频率抑制在较少的水平，能够简化胰岛的分离操作，能效率良好地进行。
根据本发明，嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂在抑制胰脏的破坏时所释放出的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的作用，由此能够得到损伤少的适合移植的胰岛。即，根据本发明，能够以高产量得到适合移植的形状及大小的胰岛。
[实施例]
本发明首次发现将供体的嗜中性粒细胞浸润在摘出后的胰脏内，经过消化的工序时其数量增加，本发明基于上述新发现而完成。因此，最先说明发明人等的发现。图1为表示嗜中性粒细胞向胰组织的浸润程度的图，使用从小鼠体内摘出的胰脏进行以下实验。
首先，摘出小鼠胰脏，将在UW液或ET-Kyoto液中添加了IV型胶原酶而得到的溶液注入胰管内，使胰脏膨胀后，将胰组织的一部分回收。接着，通过在37℃下将膨胀后的胰脏培养15分钟，进行消化，消化后再次回收胰组织的一部分。将回收的胰组织使用苏木精-伊红(HE)进行染色，浸润在胰组织中的嗜中性粒细胞使用氯乙酸-ASD-萘酚酯酶进行染色。针对使用消化前的胰组织和进行过消化的胰组织得到的染色图像，比较两者。
图1中，左侧的(a)及(c)表示消化前的胰组织染色图像，右侧的(b)及(d)表示消化后的胰组织染色图像，用箭头表示的染色图像表示被活化的嗜中性粒细胞。另外，上层的(a)及(b)表示使用UW液的情况，下层的(c)及(d)表示使用ET-Kyoto液的情况。
由图1的(a)及(c)可知没有进行消化的胰组织、即消化工序前的正常的胰组织中没有浸润嗜中性粒细胞。另一方面，由图1的右侧的(b)及(d)可知在利用胶原酶破坏胰脏的消化工序后嗜中性粒细胞浸润，以及与消化前相比嗜中性粒细胞的数量增大。需要说明的是，图1的(a)和(b)、(c)和(d)中，分别使用相同的胰组织。因此，可以认为嗜中性粒细胞在摘出后的胰脏中已经存在，而且经过消化工序胰脏被破坏，由此更多的嗜中性粒细胞浸润在胰组织内。
嗜中性粒细胞被活化时释放嗜中性粒细胞弹性蛋白酶。嗜中性粒细胞弹性蛋白酶在内源性抑制物质作用的环境下作为消化·分解侵入生物体内的细菌等的酶，具有重要的作用，但已知由于某种原因该抑制物质的作用减弱时引起组织的损伤。因此，认为在胰岛的分离工序中嗜中性粒细胞被活化时，胰岛受到损伤。
因此，胰岛分离工序中的何种情形下嗜中性粒细胞被活化，各工序中的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的活性的调查结果示于图2。
实验使用小鼠进行。脏器保存液使用ET-Kyoto液。嗜中性粒细胞弹性蛋白酶活性如下进行测定：将含有由胰岛分离的各工序中得到的胰组织的悬浮液的上清液作为测定样品，在含有嗜中性粒细胞弹性蛋白酶特异性底物的反应液中于37℃下培养24小时，通过波长405nm处的吸光度测定反应液中游离的对硝基酰苯胺量。
此处，所谓“消化前”是指将具有破坏胰脏作用的胶原酶注入胰管内使胰脏膨胀的状态，即本发明中的酶注入步骤之后、且消化开始步骤之前。所谓“消化后”是指通过在膨胀后使胶原酶活化从而破坏胰脏后，使胶原酶失活，由此使消化停止的状态，即本发明中的消化停止步骤之后、且回收步骤之前。所谓“纯化前”是指使消化停止后回收、清洗胰组织的状态，即本发明中的回收步骤之后、且纯化工序之前。而且，所谓“纯化后”表示使用密度梯度剂将胰岛从胰外分泌腺组织分离的状态，即本发明中的纯化工序之后。
由该图可知，胰脏中的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的活性在“消化后”的时刻变得最高。另外，可知“纯化前”的时刻、即经历胰组织的洗涤操作后的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的活性下降，并且在经过纯化工序的“纯化后”的时刻，嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的活性进一步下降。也就是说，可以预测胰岛在“消化后”的时刻受到损伤最多，因此，认为通过防止该时刻的损伤，能够有效地得到质量优异的胰岛。
本发明基于上述发现完成，其特征在于，至少在进入消化工序中的消化开始步骤的操作的时刻，使嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂存在于胰脏内部。
对于本发明的分离方法中使用的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂的浓度，将细胞伤害性指标即LDH(lactatedehydrogenase；乳酸脱氢酶)的细胞外漏出作为指标，如下进行研究。
首先，在0.31～10μg/mL的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶存在下培养小鼠胰岛，经过一定时间后回收培养上清液。接着，将培养上清液回收后的小鼠胰岛匀浆，回收胰岛悬浮液。回收的培养上清液及胰岛悬浮液中含有的LDH的测定通过使用LDH测定试剂盒测定562nm处的吸光度来进行。嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂的最佳浓度的研究如下进行：在各种浓度的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶存在下培养小鼠胰岛时，添加2～200μM的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂西维来司他，同样地测定LDH量。细胞伤害性是用百分率(％)表示的、培养上清液中含有的LDH量相对于培养上清液中含有的LDH量和胰岛悬浮液中含有的LDH量的总和的比。
结果示于图3。图中的纵轴是指细胞伤害的程度，数字越大，意味着受到的细胞伤害越大。横轴为嗜中性粒细胞弹性蛋白酶浓度。由图3可知随着嗜中性粒细胞弹性蛋白酶浓度变高，胰岛细胞受到伤害。此时，若添加2μM、20μM、200μM的西维来司他，则在20μM西维来司他存在下最能抑制胰岛细胞的伤害。因此，可知嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂的最佳浓度为20μM。
接下来，利用实施例具体说明本发明。这些实施例作为一个例子给出，本发明并不限定于这些实施例。
实施例1及比较例1～3所示的胰岛的分离方法中，均使用出生后9周龄以后(体重20～22g)的C57BL/6N小鼠。作为分离的顺序，采用省略(1)注入工序及(2)保存工序、在(3)消化工序之后进行(4)纯化工序的胰岛的分离方法。各例中，使在消化工序中使用的保存液的成分变化来进行。另外，测定各工序中的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶活性。分别测定通过这些方法得到的各胰岛的个数、形状、大小、胰岛素分泌能力。以下给出其详细内容。
<实施例1：S-Kyoto>
首先，在ET-Kyoto液中添加Elaspol(小野药品工业株式会社制，注册商标，通用名称：西维来司他)，使终浓度为20μM，事先制备保护液(以下称作S-Kyoto液)。
在麻醉下，将上述小鼠于下腹部进行约1cm的皮肤横切，以V字切口剖开肌层。接着，将小肠及大肠转移到体外后，切开腹侧的横隔膜，用剪子切开心脏，使其在胸腔内失血死亡。剥离胰管后，用注射器(带30G针)将胰管穿刺，注入约3～5ml在作为消化酶的IV型胶原酶中添加了上述制备的保护液而得到的溶液，由此使胰脏膨胀。从十二指肠、小肠、大肠、脾脏切离膨胀的胰脏，移入50ml锥形管，冰冷却，将装入有胰脏的管放入37℃温浴槽中，由此开始消化。将管在上述温浴漕中培养约15分钟，由此促进消化。之后，在装入有胰脏的管中加入低温的上述保护液混悬，由此停止消化。进而，通过离心操作洗涤含有胰组织的悬浮液，进行浓缩。最后，作为纯化工序，在作为纯化溶液的OptiPrep(Axis-Shield公司制，通用名称：iodixanol溶液)中添加上述保护液，由此制成25％、22.5％、20％、11.1％的溶液，使各浓度的溶液重层，形成非连续密度梯度。接着，在加入含有回收的胰组织的悬浮液之后进行离心分离，回收含有胰岛的分区，由此进行纯化。
<比较例1：ET-Kyoto>
比较例1采用ET-Kyoto液(不添加Elaspol)代替实施例1的保护液。作为纯化溶液，采用ET-Kyoto液中添加了OptiPrep的溶液。除此之外的操作与实施例1同样地进行。
<比较例2：M-Kyoto>
比较例2使用ET-Kyoto液中添加了Miraclid(持田制药株式会社，注册商标，通用名称：乌司他丁)而得到的溶液(以下称作M-Kyoto)代替实施例1的保护液。作为纯化溶液，采用ET-Kyoto液中添加了OptiPrep和Miraclid而得到的溶液。相对于ET-Kyoto液1L，添加100,000单位的Miraclid。除此之外的操作与实施例1同样地进行。
<比较例3：UW>
比较例3采用ViaSpan(Bristol-MyersSquibb制，注册商标，通用名称：UW液)代替实施例1的保护液。纯化溶液采用ViaSpan。除此之外的操作与实施例1同样地进行。
(1)关于嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的活性时期及使用液
测定实施例及比较例中进行的分离方法的各工序中的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的活性。测定的时期为“消化前”、“消化后”、“纯化前”、和“纯化后”这4点。此处，所谓“消化前”是指将具有破坏胰脏作用的胶原酶注入胰管内使胰脏膨胀的状态，即本发明中的酶注入步骤之后、且消化开始步骤之前。所谓“消化后”是指通过在膨胀后使胶原酶活化从而破坏胰脏后，使胶原酶失活，由此停止消化的状态，即本发明中的消化停止步骤之后、且回收步骤之前。所谓“纯化前”是指在停止消化后洗涤胰组织的状态，即本发明中的回收步骤之后、且纯化工序之前。而且，所谓“纯化后”表示使用密度梯度剂将胰岛从胰外分泌腺组织分离的状态，即本发明中的纯化工序之后。
嗜中性粒细胞弹性蛋白酶活性的具体的测定按以下顺序进行。将含有胰组织的悬浮液的上清液作为测定样品，在含有嗜中性粒细胞弹性蛋白酶特异性底物的反应液中、于37℃下培养24小时，通过波长405nm处的吸光度测定反应液中游离的对硝基酰苯胺量。此时，作为嗜中性粒细胞弹性蛋白酶特异性底物，使用N-甲氧基琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Val-对硝基酰苯胺，由利用已知浓度的对硝基酰苯胺制作的标准曲线算出对硝基酰苯胺量，作为嗜中性粒细胞弹性蛋白酶活性。
结果示于图4。实施例1及比较例1～3的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶活性在消化前均为100μM左右。在消化后，嗜中性粒细胞弹性蛋白酶活性也均从300μM同程度地上升至400μM，但纯化后的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶活性下降，均比消化前低。另外，对于消化后的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶活性，实施例1最低，接下来比较例2低，比较例1和比较例3同程度为最高。图4中，从消化前到消化后嗜中性粒细胞弹性蛋白酶活性上升，表示由于胰组织的消化，嗜中性粒细胞被活化。另外，对于纯化前的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶活性，实施例1为最低，接下来依次为比较例2、比较例1、比较例3。认为实施例1的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶活性最低是嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂的作用。进而，观察嗜中性粒细胞弹性蛋白酶活性值的变动，可以说消化后和纯化前的变动表现得最大，嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂的作用在消化后最能被发挥。
由以上结果可知，使嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的活性不持续而立即遏制的效果最强的是实施例1的保护液。
(3)关于IEQ、分离指数(IsolationIndex)、纯度、胰岛尺寸的分布
通过测量使用实施例1及比较例1至3中所示的方法得到的胰岛的个数、长径及面积，计算这些指标。所谓IEQ是IsletEquivalents(胰岛当量)的简称，表示将直径为150μm的胰岛规定为1的、胰岛的体积的国际单位。分离胰岛的个数如下测定：从含有胰岛细胞的液体1mL中提取50μL，测量用双硫腙进行染色的胰岛的个数，将该值的20倍作为分离胰岛的个数。胰岛的长径及面积通过使用荧光显微镜VHAnalyzer(KEYENCE公司)的图像分析进行测定。使用IEQ及胰岛的个数，且使用“分离指数＝IEQ/胰岛的个数”表示的计算式算出分离指数。使用由图像分析得到的面积，且使用“纯度＝用双硫腙进行染色的面积/全面积”表示的计算式算出纯度。对于胰岛尺寸的分布，以用图像分析得到的胰岛的长径为基准，分成50μm～100μm、100μm～150μm、150μm～200μm、200μm～250μm、250μm～300μm、300μm～350μm、350μm以上，算出各分布在整个胰岛个数中所占的比例。
图5表示所得胰岛的IEQ。根据图5可知，实施例1与比较例1及比较例3相比IEQ显著提高。
图6表示所得胰岛的分离指数。根据图6可知，实施例1与比较例1及比较例3相比分离指数显著提高。
图7表示所得胰岛的纯度。根据图7可知，实施例1与比较例3相比纯度显著提高。
图8表示所得胰岛的长径分布。根据图8可知，实施例1的情况与比较例相比，150μm以下的小胰岛很少。进而，实施例1的情况与比较例相比，250μm～350μm的胰岛多，并且能够得到350μm以上的胰岛。除实施例以外，能够得到350μm以上的胰岛的只有比较例2，从这一点也可知与比较例相比，实施例中能够以高产量得到较大的胰岛。
(4)关于形状
图9表示所得胰岛的照片。图9的(a)～(d)为电子显微镜下的照片。图9中，(a)表示比较例3，(b)表示比较例1，(c)表示比较例2，(d)表示实施例1。根据图9可知，实施例1中得到的胰岛与比较例的胰岛相比具有良好的圆形、密集的结构，被破坏的组织少。实施例1及比较例1～比较例3中得到的胰岛的形状与消化后的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶活性的结果一致。因此，可以认为实施例1中，由于嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂的作用，胰组织的损伤被抑制。
(5)关于刺激指数(StimulationIndex)
图10表示所得胰岛的刺激指数。此处，所谓刺激指数是表示胰岛的分泌能力的指标。胰岛分离与实施例1进行相同的操作。在37℃条件下，将实施例1及比较例1～比较例3中得到的各30个胰岛培养24小时后，在低葡萄糖或高葡萄糖浓度条件下进行一定时间的培养，测定培养上清液中的胰岛素浓度。刺激指数由低葡萄糖浓度和高葡萄糖浓度下的胰岛素分泌能力的比率算出。根据图10可知，实施例1与比较例1及比较例3相比刺激指数显著提高。由此可知实施例1中得到的胰岛与比较例1及比较例3中得到的胰岛相比，对葡萄糖刺激应答的胰岛素分泌良好。
产业上的可利用性
根据本发明的胰岛的分离方法，能够以高产量得到适合移植的形状及大小的胰岛，可以期待应用于糖尿病的治疗。
详细地且参照特定的实施方式说明了本发明，但本领域技术人员可知，在不脱离本发明的主旨和范围的情况下可以加入各种变更和修正。
本申请要求基于2010年7月13日提出申请的日本专利申请(日本特愿2010-159053)的优先权，将其内容作为参照引入本说明书中。所有被引用的参照作为内容引入。

Claims (11)

1.一种胰岛的分离方法，包括下述工序：
将摘出后的胰脏破坏得到胰组织的消化工序；和
将所述胰组织浸渍在纯化溶液中得到胰岛的纯化工序，
其特征在于，所述消化工序包括下述步骤：
将含有消化酶的酶溶液注入所述胰脏的内部的酶注入步骤；
使所述消化酶活化的消化开始步骤；
使所述消化酶失活的消化停止步骤；和
将已被破坏的胰组织回收的回收步骤，
通过在所述消化开始步骤之前添加嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂，从而在开始所述消化开始步骤的时刻，使嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂存在于所述胰脏的内部，所述嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂不包括胰蛋白酶抑制剂的情况。
2.如权利要求1所述的胰岛的分离方法，其特征在于，在所述消化工序之前还包括向摘出后的胰脏的胰管内注入保存液的注入工序及/或将所述胰脏浸渍在浸渍液中进行保存的保存工序。
3.如权利要求2所述的胰岛的分离方法，其特征在于，所述保存液及所述浸渍液不含嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂。
4.如权利要求1～3中任一项所述的胰岛的分离方法，其特征在于，所述嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂的添加通过向所述酶溶液中添加嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂来进行。
5.如权利要求1～3中任一项所述的胰岛的分离方法，其特征在于，所述嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂的添加通过向所述酶溶液及所述纯化溶液中添加嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂来进行。
6.如权利要求2所述的胰岛的分离方法，其特征在于，所述嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂的添加通过向所述保存液、所述浸渍液、所述酶溶液及所述纯化溶液的各个溶液中均添加嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂来进行。
7.如权利要求4所述的胰岛的分离方法，其特征在于，所述酶溶液中的所述嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂的浓度为2～200μM。
8.如权利要求5所述的胰岛的分离方法，其特征在于，所述酶溶液及所述纯化溶液中的所述嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂的浓度为2～200μM。
9.如权利要求6所述的胰岛的分离方法，其特征在于，所述保存液、所述浸渍液、所述酶溶液及所述纯化溶液中的所述嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂的浓度为2～200μM。
10.一种用于保护胰组织免受由浸润在所述胰组织中的嗜中性粒细胞所释放出的弹性蛋白酶的作用的方法，所述方法使用下述保护液，所述保护液含有嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂，所述嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂不包括胰蛋白酶抑制剂的情况。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述保护液中的所述嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂的浓度为2～200μM。
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