一种新生猪胰腺提取胰岛前的注射制剂
技术领域
本发明属于新生猪胰岛提取的技术领域,具体是涉及一种新生猪胰腺提取胰岛前的注射制剂。
背景技术
糖尿病是全球性的严重威胁人类的健康和生命的高发性代谢性疾病,其患病率在世界范围内呈明显上升趋势,根据2012年11月国际糖尿病联盟的统计数据显示,目前全球糖尿病患者约为3.66亿,预计到2030年将达到5.52亿;该数据同时还显示,中国糖尿病的患病率近10年就翻了近两倍,2010年,中国糖尿病患者的总数就已超过了9000万,成为了世界上第一糖尿病大国。而其中1型糖尿病患者还需要终生进行胰岛素治疗,30%左右的2型糖尿病患者病程达到20年以上也很可能发展成为胰岛素依赖型,这给患者的日常生活带来了极大的不便。
自Edmonton方案成功后,胰岛移植受到了世界的瞩目,在总结了全球胰岛移植研究成果的基础上改进了移植的方法和免疫抑制方案,为1型糖尿病病人带来了治愈的希望。(ShapiroA.M,Lakey J.R,Ryan E.A,et al.Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetesmellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen[J].N Engl J Med2000,343:230-238.)然而,胰岛移植治疗面临着人体胰岛组织来源有限的问题,其供给量远远不能满足临床的需要,所以人们积极寻找合适的替代品来解决移植细胞匮乏的问题。
研究发现(Colman A.Making new beta cells from stem cells[J].Semin Cell Dev Bio 2004,15(3):337-345.),猪胰岛素与人胰岛素的结构极其相似,仅仅只有一个非保守氨基酸的差异,人胰岛素的B30位是苏氨酸而猪胰岛素的是丙氨酸,但这并不影响胰岛素的长度,也不影响与受体结合时发挥正常的生理功能,而且猪胰岛素的生物活性也类似于人胰岛素,尤其是新生猪胰岛细胞的血糖调定点同人相近,猪的正常血糖值为100~140mg/dL(田岛嘉雄.试验动物学概论[M].第一版.山西科学教育出版社,1987:188-189.),而人类的正常血糖值为70~140mg/dL,两者差异不大。近些年来,研究人员通过移植猪的胰岛细胞于非人类灵长类动物实验中取得了显著的进步。2006年,三个不同的实验研究小组报道,于非人类灵长类动物实验中移植猪胰岛细胞后均能够较长时间的存活(超过6个月)并保持其正常的生理功能。(CardonaK,Korbutt G.S,Milas Z,et al.Long-term survival of neonatal porcine islets in nonhuman primatesby targeting costimulation pathways[J].Nat Med 2006,12:304-306.Dufrane D,Goebbels R.M,SaliezA,et al.Six-month survival of microencapsulated pig islets and alginate biocompatibility inprimates:proof of concept[J].Transplantation 2006,81:1345-1353.Hering B.J,Wijkstrom M,GrahamM.L,et al.Prolonged diabetes reversal after intraportal xenotransplantation of wild-typeporcine islets in immunosuppressed nonhuman primates[J].Nat Med 2006,12:301-303.)研究表明(Rajotte RV.Isolation and assessment of islet quality[J].Xenotransplantion2008;15:93-95.),只有新生猪和成年猪的胰岛细胞在异体移植中能够改善非人类灵长类动物的糖尿病。成体猪胰腺内虽含大量成熟的胰岛细胞,但其不易分离获取,而且成年猪的免疫原性高、可变性大的缺点严重影响了细胞移植后的功能(Dufrane D,D’Hoore W,Goebbels R.M,et al.Parameters favouring successful adult pig islet isolations for xenotransplantation inpig-to-primate models[J].Xenotransplantation 2006;13:204-214.),而新生猪的优势主要就在于:新生猪胰岛不但易于分离获取,而且具有潜在的增殖能力,免疫原性也较弱,并且还可在移植前进行培养纯化等。(Krickhahn M,Buhler C,Meyer T,et al.The morphology of is lets withinthe porcine donor pancreas determines the isolation result:successful isolation of pancreaticislets can now be achieved from young market pigs[J].Cell Transplant.2002,11(8):827-838.)迄今为止,猪已与人类共同生活了数千年,还未发现不可避免的共患疾病。而且,组织来源广泛,用猪的胰岛作移植物来源也不存在伦理方面的问题。因此,基于目前的研究实验证实,新生猪很可能是临床上胰岛细胞移植的候选供体(Dufrane D,Denis,Gianello,Pierre.Pig IsletXenotransplantation Into Non-human Primate Model[J].Transplantation 2008,86(6):753-760.)
Ryan(Ryan E.A,Lakey J.R,Rajotte RV,Korbutt GS,Kin T,Imes S,Rabinovitch A,Elliott JF,BigamD,Kneteman NM,Warnock GL,Larsen I,Shapiro AM.Clinical outcomes and insulin secretion after islettransplantation with the Edmonton protocol[J].Diabetes 2001;50:710-719.)等研究表明,根据目前现有的胰岛细胞分离及纯化技术来看,一般从一个胰腺中可以获得20,000-40,000IEQNICCs,而在糖尿病猴的胰岛移植中,为了达到血糖的平衡需要移植50,000 IEQ/kg新生猪胰岛(Nat Med 2006,12:304-306.Hering B.J,Wijkstrom M,Graham M.L,et al.Prolonged diabetesreversal after intraportal xenotransplantation of wild-type porcine islets in immunosuppressednonhuman primates[J].Nat Med 2006,12:301-303.)因此,从新生猪体内获取足够数量、活性及功能的胰岛细胞成为了治疗糖尿病的前提条件。为了提高移植的胰岛细胞的数量及活性,胰腺胰岛的分离技术就显得格外重要。2007年6月,国际胰岛细胞移植的首脑会议专家们主要针对Pig-to-Man的胰岛移植做了专题讨论,认为从猪的胰腺中分离胰岛在技术方面已逐渐成熟。国内外研究人员在改进分离胰岛技术方面也做了大量工作,但最终获取的胰岛细胞的数量及活性各有差异。胰腺是由内分泌部的胰岛和外分泌部的腺泡组织组成,其中胰岛仅占整个胰腺的1%-2%,散在地分布于胰腺腺泡实质中。在胰岛的分离过程中,胰腺的外分泌部会不可避免地遭到破坏,释放出大量的胰蛋白酶原及其他的一些消化酶原,这些酶原再通过一系列反应,最后形成胰蛋白酶而引起胰岛的破坏。因此,从手术开始取胰腺到胰岛分离整个操作过程中,应尽量缩短热缺血时间(从放血开始到胰腺被放入冷的保存溶液之间的时间),以减少胰腺外分泌组织分泌胰酶而引起胰腺组织的自溶,从而更好地维持胰岛的活性。换言之,制备胰岛细胞程序的合理性直接影响到所获得胰岛的数量及活性,从而最终影响胰岛移植的效果。因此,怎样提高胰岛细胞的得率并保护其活性,创建科学合理的胰腺取材方法成为必然。
发明内容
本发明的目的是提供一种注射制剂,使用后能够从新生猪胰腺得到稳定高产量的胰岛,该注射制剂丰富了新生猪胰腺的提取技术,也更好地遵从了动物福利原则。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的,
一种新生猪胰腺提取胰岛前的注射制剂,该注射制剂包括奥曲肽和低分子肝素钠。
奥曲肽的注射剂量为1-3μg/kg体重;低分子肝素钠的注射剂量为5-15IU/kg体重。
所述的低分子肝素钠平均分子量小于8000道尔顿。
奥曲肽和低分子肝素钠的注射浓度均为1mg/ml。
注射本发明的注射制剂进行新生猪胰腺提取胰岛的方法,具体包括以下步骤:
1.取胰腺前半小时至一小时先给新生猪注射奥曲肽和低分子肝素钠;
2.新生猪麻醉后先后于含洗涤剂的水、含84消毒液的水以及清水中各清洗一次;
3.将新生猪仰卧位固定、皮肤消毒后暴露腹部手术区;
4.无菌手术操作打开腹腔,充分暴露出胰腺并取尽胰腺,去除胰腺组织周围的包膜及结缔组织;
5.取出胰腺后,先后分别置于装有络合碘溶液及冷的D-Hank’s液的烧杯中洗涤后备用。
本发明的创新点如下:
1.胰腺是由内分泌部的胰岛和外分泌部的腺泡组织组成,其中胰岛仅占整个胰腺的1%-2%,散在地分布于胰腺腺泡实质中。在胰岛的分离过程中,胰腺的外分泌部会不可避免地遭到破坏,释放出大量的胰蛋白酶原及其他的一些消化酶原,这些酶原再通过一系列反应,最后形成胰蛋白酶而引起胰岛的破坏。本发明选用市售醋酸奥曲肽(分子式为C49H66N10O10S2·XC2H4O2,分子量为1019.26·x60.02)注射液注射至新生猪体内,是由于奥曲肽是一种人工合成的八肽环状化合物,具有与天然内源性生长抑素类似的作用,不仅可以抑制胰酶的分泌,同时还能抑制缩胆囊素一胰酶泌素的分泌,减少胰腺分泌,保护胰岛被蛋白酶消化,减少胰岛细胞损失,对胰腺实质细胞膜具有直接保护作用,从而改善了猪胰岛分离结果,降低了胰岛细胞的凋亡,提高了胰岛细胞的得率。
2.在取胰腺的手术过程中,胰腺中的静脉血管很容易堵塞形成血栓(如应激反应可引起),造成血液集中在胰腺中,而血红蛋白同时也释放并扩散到细胞外空间,继而造成了胰腺组织颜色的改变(熟练的技术人员一般可以通过主观观测胰腺颜色就可以判断胰腺是否有血栓形成),通常表现为褐色或紫色。取胰腺组织的过程中,血栓的形成以及血红蛋白的释放都会对胰岛细胞产生不利的影响,还有就是热缺血时间越长,对胰岛细胞的损伤也会越大,有研究表明,热缺血时间要是超过15分钟,就很难得到优良的胰岛产物。本发明选用市售低分子肝素钠注射液注射至新生猪体内,是由于低分子肝素钠(平均分子量小于8000道尔顿)具有抗Xa活性,可抑制体内、体外血栓和动静脉血栓的形成(体内凝血过程是一个生物放大过程,若能早起阻断它,只需少许抑制物即可),换句话说,注射低分子肝素钠注射液不仅可以抑制胰腺中的血管堵塞和血红蛋白的释放,维持了它的血液循环,同时也达到了缩短了热缺血时间的目的,最终提高了该胰腺消化后所获得的胰岛细胞的质量。
与现有技术相比,本发明的有益效果:
1.采用本发明注射制剂注射后所分离提取的胰腺组织在颜色上比现有技术分离提取的胰腺组织的颜色要淡些,说明胰腺没有出现血栓堵塞血管以及血红蛋白释放的现象而最终对胰岛产生不利影响。
2.采用本发明注射制剂注射后所得到的胰岛与现有技术得到的胰岛相比,形态更规整,胰岛细胞团的包膜相对更完整,得到的碎的胰岛细胞团的数目明显减少,胰岛大小也更均一,多在100-200μm之间,更适合移植。
3.采用本发明注射制剂注射后所得到的胰岛与现有技术得到的胰岛相比,数目明显增多,相同重量的胰腺组织得到的胰岛细胞的数量明显提高,胰岛的凋亡率明显下降,胰岛细胞的回收率明显提高。
本发明的优势总结如下:
1.相同重量的胰腺得到的胰岛细胞的数量明显提高。
2.胰岛的凋亡率下降,胰岛细胞的存活率提高。
3.胰岛的包膜完整,细胞团破碎减少,大小均一,多在100-200μm之间。
采用本发明注射制剂注射后得到的胰岛在大小和数量上相对现有技术来说更符合异种胰岛细胞移植临床要求,更适宜异种胰岛细胞移植手术。本发明所采用的猪均来源于中国原产猪,供体数量不受到限制,价格也便宜,这些都为猪胰岛供体的产业化及异种胰岛细胞移植治疗技术的推广打下了基础。
附图说明
图1显示了本发明与现有技术(即提取胰岛前不注射注射制剂)得到的胰岛细胞0天的效果对比图,放大倍数80×,图中标尺长度1000μm;
图2显示了本发明与现有技术得到的胰岛细胞培养一天后的效果对比图,放大倍数200×,图中标尺长度400μm;
图3显示了本发明与现有技术得到的胰岛细胞培养一天后经AO/PI染色后的效果对比图,放大倍数80×,图中标尺长度1000μm;
图4显示了本发明与现有技术,以及单独注射奥曲肽或低分子肝素钠得到的胰岛细胞培养一天后胰岛细胞存活率的效果对比图。
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明,而非限制本发明。
实施例1,注射本发明的注射制剂进行新生猪胰腺提取胰岛的方法
1.取胰腺前半小时至一小时先给新生猪注射奥曲肽和低分子肝素钠,注射剂量分别为1-3μg/kg体重和5-15IU/kg体重;
2.新生猪肌肉注射戊巴比妥钠使其麻醉;
3.新生猪先后于含洗涤剂的水、含84消毒液的水以及清水中各清洗一次,水温均控制在37℃左右;
4.将新生猪仰卧位固定在铺有中单的无菌托盘中,并于新生猪的手术区喷洒络合碘溶液;
5.将托盘置于无菌操作台中并铺上孔巾,暴露腹部手术区;
6.无菌手术操作,术者与助手先于上腹部剑突下正中线部位“+”字型切开腹部皮肤以及壁层腹膜以外的各层腹壁结构,随之打开腹腔;
7.使用止血钳夹住胃并向上翻起(注意动作轻柔不要夹破),充分暴露出胰腺;
8.动作轻柔的分离取尽胰腺(切忌损伤相邻胃和肠管),去除胰腺组织周围的包膜及结缔组织;
9.取出胰腺后,先后分别置于备有冰块的托盘内的三个烧杯中(分别装有络合碘溶液及冷的D-Hank’s液)洗涤后备用;
采用本发明的注射制剂进行注射后再提取新生猪的胰腺胰岛是进行新生猪胰岛移植治疗人糖尿病过程中获取胰岛的第一步,自新生猪提取胰腺后,再经过消化、培养检测等步骤后才可能获得理想的可供临床移植所需要的胰岛,在这些步骤中,胰腺胰岛一直处于缺血缺氧状态,受到多种不利因素的影响,这种不利状态持续的时间越长,对胰岛的损害则越大,所获得的胰岛的功能及活性就越差,移植疗效就会相应变差,所以以上所述的每一个步骤都很关键,每一个环节都显得异常重要,都需要尽可能地优化。本发明所包含的内容是根据大量的实践经验总结优化出来的,方法简便、迅速,能够迅速充分地暴露胰腺,短时间内就可将胰腺取干净,大大减少了胰酶的分泌,缩短了胰腺缺血时间,保护胰腺胰岛,减少缺血损伤,最终减少了胰腺胰岛的损失,有效地提高了胰岛的得率并保护其活性,具有很好的实用价值。
在具体实验过程中,我们进行了多次探索,尝试注射各种注射制剂,包括单独注射奥曲肽或低分子肝素钠,但效果并不显著(图4),结果均没有本发明的效果明显。
实施例2,新生猪胰腺的消化:
将置于冷的D-Hank’s液中的胰腺组织取出后称重,剪成约0.5~1mm3的组织小块,冲洗至液体清亮离心去上清后加入0.25mg/ml的V型胶原酶,置于37℃水浴箱中振荡消化5-12分钟,适度消化后快速用预冷的含猪血清的D-Hank’s液终止消化,并用该液以1000rpm×1min离心洗涤2-3次后获得胰岛细胞悬液。
实施例3,新生猪胰岛细胞的培养:
将胰岛细胞悬液加入至完全培养基的培养皿后置于37℃、5%CO2及95%空气培养箱内进行培养,培养基及培养皿于胰岛细胞分离后第1天更换,之后每隔1天换一次。
实施例4,胰岛细胞团计数:
收集培养的胰岛细胞,1000rpm离心1分钟,弃上清,定容至一定体积的细胞悬液,每次于细胞悬液中取出50μl的样品,镜下计数胰岛细胞团并重复取样3次,按下列公式计数胰岛:NICC=(3次胰岛数值之和/3)×[样本总量(ml)/50μl]。
实施例5,AO/PI染色:
试剂配置(10ml工作液)
吖啶橙AO(acridine orange,AO)能够进入正常细胞膜的细胞中,与DNA结合显绿色/黄绿色荧光,与RNA结合显桔红色荧光,而碘化丙啶PI(Propidium Iodide,PI)是一种核酸染料,它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜,但对凋亡中晚期的细胞和坏死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核染红,从而通过荧光显微镜观察细胞的染色情况来判断胰岛细胞的存活率。