CN110438064A - 一种改良型人胰岛细胞培养基的制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞培养技术领域，具体是一种改良型人胰岛细胞培养基及其制备方法和应用，所述的培养基是以CMRL1066培养基为基础培养基，添加体积百分比10％～20％的人血白蛋白、50‑80mg/L的盐酸川穹嗪，5‑8μmol/L的ITS‑G，3‑5mmol/L的尼克酰胺，50‑100mg/L甲磺酸加贝酯，1‑2mmol/L的S‑腺苷甲硫氨酸，0.5‑1mmol/L的N‑乙酰‑L‑半胱氨酸，300‑600mg/L的谷胱甘肽和20‑40U/L的人胰岛素。本发明可用于体外培养胰岛细胞并维持其活性。

Description

一种改良型人胰岛细胞培养基的制备及其应用

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体地说，是一种改良型人胰岛细胞培养基的制备及其应用。

背景技术

目前中国的糖尿病人数目已攀居世界首位，根据2017年发表在JAMA杂志的统计数据显示，中国成人糖尿病患病率达11.6％，另外有50.1％的成人处于糖尿病前期(LiminWang,Pei Gao,Mei Zhang,et al.Prevalence and Ethnic Pattern of Diabetes andPrediabetes in China in 2013.JAMA2017,317(24):2515-2523)。糖尿病是由于胰岛素分泌障碍或胰岛素抵抗引起的糖代谢紊乱，或导致一系列血管病变与神经损伤发生，进而引起肢体坏死、失明、肾衰竭等一系列并发症，威胁患者生命。虽然采用胰岛素强化治疗方案或使用胰岛素泵在一定程度上可以改善患者的糖代谢水平，但并不能有效的逆转其并发症，寻找新的治疗手段是当前糖尿病研究的前沿课题。

胰岛移植是治疗糖尿病的一种有效方法。虽然早期因为技术原因导致胰岛移植效果不佳，但2000年，加拿大的Shapiro小组提出了Edmonton方案(Shapiro AM,Ricordi C,etal.International trial of the Edmonton protocol for islet transplantation.TheNew England Journal of Medicine 2006,355(13):1318-1330)，在改良免疫抑制剂方案的同时采用多供体来源的胰岛进行移植，取得了连续7例胰岛移植的成功，患者完全脱离胰岛素治疗达1年以上，标志着临床胰岛移植技术的成熟。

在Edmonton方案中，建议胰岛分离纯化立即选择移植，但是由于：①用于胰岛分离的胰腺冷缺血时间不能＞8小时；②患者胰岛回输前6小时需要注射抗排异药物抑制免疫功能；③胰岛经皮经肝胰岛细胞移植术需要2～3小时的术前准备时间。在具体临床实践中，常常需要将胰岛培养一段时间后再进行移植。

胰岛培养后再移植有一定的优点：①其最大的优势就是可以为移植前免疫抑制剂的使用和术前准备争取足够的时间；②此外胰岛培养可以有更加充裕的时间来评估分离胰岛的质量，包括糖刺激实验、无菌检测等，增加移植的成功率；③胰岛培养可以显著降低移植物中CD45+的淋巴细胞比例，降低组织因子(TF)的含量，减少移植后IP-10等趋化因子的分泌，从而降低胰岛移植物的免疫源性，降低移植物失功的风险。

尽管如此，胰岛培养的劣势在具体临床应用中也十分明显。目前临床中对于移植胰岛的纯度为≥50％，其中含有一定比例的外分泌腺细胞，在培养过程中这些细胞产生消化酶会损伤胰岛细胞，降低细胞回收率。虽然有移植中心采用22℃～24℃的培养条件来降低消化酶的活力，提高胰岛回收率，但低温培养下的胰岛会发生脱颗粒、对糖刺激敏感性下降。对现有人胰岛培养体系进行优化，在抑制外分泌腺细胞毒性作用的同时，进一步提高胰岛活力和培养后回收效率，是临床中亟待解决的问题。

中国专利文献CN103695367A公开了一种改良的新生猪胰岛细胞培养基及其使用方法。在HAM’S F10培养基中添加细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、人碱性成纤维细胞生长因子hFGF-β、血管内皮生长因子VEGF、胰岛素样生长因子R3-IGF-1、人表皮生长因子hEGF、肝细胞生长因子hHGF、猪血清、亚硒酸钠、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、1-甲基3-异丁基黄嘌呤、烟碱、皮质醇、青霉素、链霉素。该培养基能使细胞凋亡下降，回收率增加；培养细胞有敏感葡萄糖刺激应答，功能比一般培养的胰岛细胞要成熟；相同量的胰岛细胞胰岛素分泌量增加；胰岛β细胞活力增加；胰岛细胞团破碎减少，细胞团包膜完整，更适于移植。与本发明相比，该专利缺乏临床转化前景：本发明所使用的试剂均为临床中的可用于人体注射的药物，更为安全，该专利所使用的细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、乙醇胺、亚硒酸钠等缺乏临床制剂，仅可应用于实验研究，无法进入临床转化；该专利中使用的转铁蛋白、猪血清等制剂有引起的人畜共患病的风险。此外，猪胰岛和人胰岛之间存在物种差异和生理特性的不同，例如猪容易破碎，而人胰岛通常包膜完整，不易碎片化，该发明在猪胰岛培养中的优点并不能简单平移到人胰岛培养中。

中国专利文献CN104928233A公开了一种胰岛样细胞的培养液及培养方法。在基础培养液中添加转铁蛋白、牛血清白蛋白、纤粘连蛋白、硒酸、孕酮、丙酮酸钠、胰岛素和PDX-1。与本发明相比，该专利主要用于胰岛前体细胞的扩增，而不能用于原代胰岛细胞的临床级培养；其中含有的牛血清白蛋白、纤粘连蛋白、硒酸等同样缺乏临床级药物，无法满足临床转化需求。

发明内容

本发明的目的在于基于目前主流的胰岛培养基进行了进一步改良，提供一种可以抑制外分泌腺细胞活性、提高胰岛活力与培养回收率的培养基。

本发明的第一方面，提供一种改良型人胰岛细胞培养基，其基础培养基为目前广泛应用于胰岛细胞培养的CMRL1066培养基，在此基础上添加体积百分比10％～20％的人血白蛋白、50-80mg/L的盐酸川穹嗪，5-8μmol/L的ITS-G，3-5mmol/L的尼克酰胺，50-100mg/L甲磺酸加贝酯，1-2mmol/L的S-腺苷甲硫氨酸，0.5-1mmol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸，300-600mg/L的谷胱甘肽和20-40U/L的人胰岛素。

进一步的，所述的CMRL1066培养基，为CIT改良型，购自Corning，货号为98-304-CV。该培养基为GMP级，可直接用于临床胰岛回输。

进一步的，所述的人血白蛋的体积百分比10～20％；根据胰岛纯度对白蛋白体积分数进行调整，当胰岛纯度＞70％时，优选为10％；当胰岛纯度在50％～70％区间中时，优选为15％；当胰岛纯度为30％～50％时，优选为20％。白蛋白的添加可以为胰岛细胞在培养过程中提供营养，中和外分泌腺细胞所产生的消化酶，并保持胶体渗透压的稳定。缺乏人血白蛋白或添加量过少不利于维持胶体渗透压稳定，外分泌腺细胞产生的消化酶也会对胰岛产生破坏；添加过多则会造成胶体渗透压偏高，并会影响CMRL1066的缓冲能力，不利于胰岛活性。

进一步的，所述的盐酸川穹嗪为50-80mg/L；更优选为62.5mg/L。盐酸川穹嗪是重要的钙离子拮抗剂，可以减少缺血再灌注中Ca²⁺积聚引起的损伤；减少细胞团中淋巴细胞释放的细胞因子对胰岛损伤；川穹嗪也可有提高红细胞和血小板表面电荷，阻断组织因子(TF)TF引起的血栓形成，减少胰岛回输中的损伤。川穹嗪的添加对于胰岛培养过程中胰岛活性的影响至关重要，可以有效保护胰岛活性并减少胰岛输注后经血液介导的炎症反应(IBMIR)。但川穹嗪的添加不易超过80mg/L，否则可能对早期胰岛素分泌产生不利影响。

进一步的，所述的ITS-G为5-8μmol/L；更优选为6.37μmol/L。ITS-G全称为胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂，是一种非贴壁细胞的生长补充剂，可以降低培养细胞对白蛋白浓度的需求，提高细胞活力。ITS-G的添加有利于胰岛细胞培养过程中对培养基营养成分的摄取，并可以提高培养胰岛对糖刺激的反应性，防止长期培养(＞48小时)过程中胰岛发生脱颗粒。

进一步的，所述的尼克酰胺为3-5mmol/L；更优选为4.21mmol/L。尼克酰胺可以抑制细胞坏死过程，显著降低组织因子的表达，进而减少胰岛回输后的胰岛IBMIR反应。尼克酰胺添加量不足会导致胰岛TF的表达增强，导致回输后IBMIR反应增强，胰岛丢失增加。虽然尼克酰胺是一种较为安全的B族维生素，但大剂量使用是会产生肝毒性，所以最高添加量不应超过5mmol/L。

进一步的，所述的甲磺酸加贝酯为50-100mg/L；根据胰岛纯度对使用量进行调整，当胰岛纯度＞70％时，优选为50mg/L；当胰岛纯度在50％～70％区间中时，优选为75mg/L；当胰岛纯度为30％～50％时，优选为100mg/L。甲磺酸加贝酯是一种非肽类蛋白的抑制剂，可抑制胰蛋白酶、激肽释放酶、纤维蛋白溶酶、凝血酶等蛋白酶的活性，从而抑制外分泌腺细胞分泌物造成的胰岛损失。不添加甲磺酸加贝酯，会导致培养过程中外分泌腺细胞分泌物对胰岛细胞产生损伤，严重影响胰岛细胞活力。

进一步的，所述的谷胱甘肽为300-600mg/L；更优选为470mg/L。谷胱甘肽可以在胰岛培养早期通过抗氧化作用减轻胰岛损伤。

进一步的，所述的N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)为0.5-1mmol/L；更优选为0.8mmol/L。N-乙酰-L-半胱氨酸可以将细胞外的胱氨酸还原为半胱氨酸，并作为巯基来源发挥抗氧化作用减轻胰岛损伤，也可以促进谷胱甘肽的合成。N-乙酰-L-半胱氨酸主要在胰岛培养的中前期发挥抗氧化作用。

进一步的，所述的S-腺苷甲硫氨酸为1-2mmol/L；更优选为1.75mmol/L。。S-腺苷甲硫氨酸可以显著减低淋巴细胞细胞因子的分泌，减少胰岛的固有免疫损伤；并可以通过转甲基作用生成抗氧化物质谷胱甘肽。虽然培养基中也添加了谷胱甘肽，因为谷胱甘肽极易发生氧化，添加的谷胱甘肽仅能在在培养早期保护胰岛细胞免受氧化应激损伤，而添加的S-腺苷甲硫氨酸可以在培养中晚期(12小时～72小时)持续维持内源性谷胱甘肽的产生，较好保护胰岛活性。

进一步的，所述的人胰岛素为20-40U/L；更优选为30U/L。在培养体系中添加胰岛素可以增加细胞对营养物质的摄取，同时降低胰岛细胞自分泌水平，降低其代谢速率。不添加胰岛素会导致长时间(＞48小时)培养时胰岛发生脱颗粒化。

本发明的第二方面，提供一种改良型人胰岛细胞培养基的制备方法，是在CMRL1066培养基中添加体积百分比10％～20％的人血白蛋白、50-80mg/L的盐酸川穹嗪，5-8μmol/L的ITS-G，3-5mmol/L的尼克酰胺，50-100mg/L甲磺酸加贝酯，1-2mmol/L的S-腺苷甲硫氨酸，0.5-1mmol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸，300-600mg/L的谷胱甘肽和20-40U/L的人胰岛素。

本发明的第三方面，提供一种如上所述的改良型人胰岛细胞培养基在体外胰岛细胞培养中的应用。

本发明相比于传统培养基的优势在于：

1、可以在37℃条件下培养胰岛细胞，显著抑制外分泌腺细胞分泌消化酶的毒性，提高胰岛活力；

2、提高细胞回收效率；

3、相同条件下，经本发明的培养体系所培养的胰岛细胞对糖刺激实验更加敏感。

附图说明

图1是不同培养条件下连续培养24小时胰岛当量变化，其中新鲜分离的胰岛为对照。

图2是不同培养条件下胰岛糖刺激指数的变化。

图3是不同培养条件下，胰岛体内功能的研究。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、细胞生物学和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中有完整的描述：例如，《分子克隆实验指南》第4版(2017年)；《精编细胞生物学实验指南》(2007年)；《精编免疫学实验指南》(2010年)。或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。

本发明所采用的胰岛分离，严格按照美国临床胰岛移植(clinical islettransplantation，CIT)网站所公布的方案进行(https://citregistry.org/)。本发明应用过程涉及人体原代胰岛细胞，已经过海军军医大学伦理委员会批准，并于中国临床试验注册中心备案。

除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1：一例成人70％纯度胰岛培养结果

1.实验方法：

(1)胰腺捐献人男，28岁，血型O，因车祸脑死亡。摘取胰腺后主胰管插管灌注UW液20mL。冰上保存运至GMP实验室，冷缺血时间3小时。

(2)胰腺经碘酊消毒、HBSS漂洗3遍后，冰上灌注消化酶Liberase MTF至胰腺充分膨胀，在此过程中修剪去除胰周脂肪与浅表层大血管。

(3)灌注完成后，将胰腺切成10段，利用Ricordi Chamber系统进行循环灌注消化。

(4)消化完成后收集细胞，使用COBE2991细胞淘洗机建立连续密度梯度，分离胰岛细胞。

(5)所获取的纯度＞50％的细胞用于胰岛移植。剩余细胞用HBSS洗涤3次，充分去除密度梯度液。

(6)使用collagenase P进一步消化剩余细胞10min，使用COBE2991细胞淘洗机建立连续密度梯度，分离残留的胰岛细胞。

(7)DTZ染色后，分析分离细胞的当量与纯度。

(8)将上述细胞悬液按10000IEQ(1个IEQ相当于直径为150μm的胰岛)每份加入到3mL对应的培养基中(改良培养基或CMRL1066)，种植于6孔板中，37℃或22℃培养24小时，DTZ染色后镜检并计数。

2.实验结果：

本次分离的胰岛纯度为70％，胰岛当量为113027IEQ。10000IEQ胰岛细胞加入到4mL对应的培养基中(改良培养基或CMRL1066)，种植于6孔板中，37℃或22℃培养24小时。经DTZ染色计数，结果提示改良型培养基经过24小时培养可以回收90％以上的胰岛(图1)，优于传统的CMRL1066培养基。

实施例2：不同培养条件对胰岛糖刺激系数的影响

1.实验方法：

葡萄糖刺激胰岛素分泌实验体外评估胰岛功能。将经过24小时培养的200IEQ胰岛在低糖(2.8mM)或高糖(25mM)的RPMI1640培养基中培养2小时并收集培养上清，ELISA检测上清中胰岛素分泌量。通过计算高糖上清与低糖上清中胰岛素比值得到葡萄糖刺激指数。

2.实验结果：

分别将200IEQ胰岛经低糖或高糖刺激，ELISA检测上清中胰岛素分泌量并计算糖刺激指数，结果表明改良培养基培养的胰岛在高糖刺激后具有更高的糖刺激指数(15.36±0.84vs.0.24±0.43，n＝3，p＝0.0029，图2.)

实施例3：不同培养条件对胰岛体内功能的影响

1.实验方法：

使用100mg/kg剂量腹腔注射诱导糖尿病裸鼠，使其血糖浓度＞16.7mmol/L。将约1000IEQ人胰岛移植到糖尿病裸鼠左肾包膜下，在移植后20天内，每2天测一次空腹血糖，空腹血糖水平＜7.1mmol/L定义为血糖正常。

2.实验结果：

将1000IEQ的胰岛移植到STZ诱导的糖尿病裸鼠的肾包膜下，连续监测血糖变化。结果表明大瓶法纯化胰岛有更高的治愈率，且功能恢复更快(图3)。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (10)

1.一种改良型人胰岛细胞培养基，其特征在于，以CMRL1066培养基为基础培养基，添加体积百分比10％～20％的人血白蛋白、50-80mg/L的盐酸川穹嗪，5-8μmol/L的ITS-G，3-5mmol/L的尼克酰胺，50-100mg/L甲磺酸加贝酯，1-2mmol/L的S-腺苷甲硫氨酸，0.5-1mmol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸，300-600mg/L的谷胱甘肽和20-40U/L的人胰岛素。

2.根据权利要求1所述的改良型人胰岛细胞培养基，其特征在于，所述的盐酸川穹嗪为62.5mg/L。

3.根据权利要求1所述的改良型人胰岛细胞培养基，其特征在于，所述的ITS-G为6.37μmol/L。

4.根据权利要求1所述的改良型人胰岛细胞培养基，其特征在于，所述的尼克酰胺为4.21mmol/L。

5.根据权利要求1所述的改良型人胰岛细胞培养基，其特征在于，所述的谷胱甘肽为470mg/L。

6.根据权利要求1所述的改良型人胰岛细胞培养基，其特征在于，所述的N-乙酰-L-半胱氨酸为0.8mmol/L。

7.根据权利要求1所述的改良型人胰岛细胞培养基，其特征在于，所述的S-腺苷甲硫氨酸为1.75mmol/L。

8.根据权利要求1所述的改良型人胰岛细胞培养基，其特征在于，所述的人胰岛素为30U/L。

9.一种改良型人胰岛细胞培养基的制备方法，其特征在于，是在CMRL1066培养基中添加体积百分比10％～20％的人血白蛋白、50-80mg/L的盐酸川穹嗪，5-8μmol/L的ITS-G，3-5mmol/L的尼克酰胺，50-100mg/L甲磺酸加贝酯，1-2mmol/L的S-腺苷甲硫氨酸，0.5-1mmol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸，300-600mg/L的谷胱甘肽和20-40U/L的人胰岛素。

10.一种如权利要求1-8任一所述的改良型人胰岛细胞培养基在体外胰岛细胞培养中的应用。